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CN105924238A - 一种微生物复合肥及其制备 - Google Patents

一种微生物复合肥及其制备 Download PDF

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CN105924238A
CN105924238A CN201610248607.0A CN201610248607A CN105924238A CN 105924238 A CN105924238 A CN 105924238A CN 201610248607 A CN201610248607 A CN 201610248607A CN 105924238 A CN105924238 A CN 105924238A
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CN
China
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culture
lactobacillus plantarum
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cgmcc
strain
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CN201610248607.0A
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李秉京
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Yiwu Jinyu Information Technology Co Ltd
Original Assignee
Yiwu Jinyu Information Technology Co Ltd
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    • C05F11/00—Other organic fertilisers
    • C05F11/08—Organic fertilisers containing added bacterial cultures, mycelia or the like
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C05—FERTILISERS; MANUFACTURE THEREOF
    • C05G—MIXTURES OF FERTILISERS COVERED INDIVIDUALLY BY DIFFERENT SUBCLASSES OF CLASS C05; MIXTURES OF ONE OR MORE FERTILISERS WITH MATERIALS NOT HAVING A SPECIFIC FERTILISING ACTIVITY, e.g. PESTICIDES, SOIL-CONDITIONERS, WETTING AGENTS; FERTILISERS CHARACTERISED BY THEIR FORM
    • C05G3/00—Mixtures of one or more fertilisers with additives not having a specially fertilising activity
    • C05G3/80—Soil conditioners
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Abstract

本发明公开了一种微生物复合肥，重量份数组成为：植物乳杆菌混合菌剂8‑20份,混合曲霉培养物10‑20份，枯草芽孢杆菌培养物8‑15。本产品使用方法简单，每亩地使用量0.2‑0.5公斤，成本仅为80‑100元/亩，拌种或生长期灌水前地表喷洒。

Description

一种微生物复合肥及其制备
技术领域
本发明涉及一种复合肥，属于农用肥料技术领域。
背景技术
微生物肥的功效发挥主要是通过对传统化肥、有机肥的增效作用，对土壤的改良活化作用，以及微生物的生理作用等方式来实现的。因此，微生物肥料就有了化肥、有机肥、有益生物菌的多种肥力和功效，是活化肥料养分、提高肥料效果、改良作物品质、促进农业增产增效的理想肥料。微生物肥料是活体肥料，它的作用主要靠它含有的大量有益微生物的生命活动来完成。只有当这些有益微生物的生命活动来完成。只有当这些有益微生物处于旺盛的繁殖和新陈代谢的情况下，物质转化和有益代谢产物才能不断形成。因此，微生物肥料中有益微生物的种类、生命活动是否旺盛是其有效性的基础，而不像其它肥料是以氮、磷、钾等主要元素的形式和多少为基础。正因为微生物肥料是活制剂，所以其肥效与活菌数量、强度及周围环境条件密切相关，包括温度、水分、酸碱度、营养条件及原生活在土壤中土著微生物排斥作用都有一定影响。
一株产耐高温α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌,申请号：201310566374.5.本发明公开了一株产耐高温α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌，所述枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)Li-2013-02于2013年7月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCCNo.7926。该菌株产耐高温α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌Li-2010经紫外线-氯化锂-硫酸二乙酯复合诱变筛选获得，该菌株具有强耐酸、耐热性，产酶活力高的特点，应用前景非常广阔。一株高产纤维素酶的黑曲霉.申请号：201310571925.7.本发明公开了一株高产纤维素酶的黑曲霉，本发明属于黑曲霉领域，特别涉及高产纤维素酶的黑曲霉菌株。本发明所提供的黑曲霉(Aspergillusniger)，该菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.7927。发酵罐实验跟踪的各项性能指标表明，该菌株代谢正常，产纤维素酶能力强，是一株优良的纤维素酶高产菌株。
由于我国长期在微生物肥料方面研究缺乏投入，使得我国的微生物肥料产业依然存在整体水平不高、技术创新不足、产品质量与应用效果表现欠稳定的问题。在农业可持续发展已成为人类共识的今天，这些问题成了微生物肥行业函待打通的“瓶颈”。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种微生物复合肥：
重量份数组成为：植物乳杆菌混合菌剂8-20份,混合曲霉培养物10-20份，枯草芽孢杆菌培养物8-15；
所述混合曲霉培养物的组成及重量份数如下:黑曲霉培养物5-9份，泡盛曲霉培养物1-3份；
所述黑曲霉(Aspergillus niger)为CGMCC NO.7927。
植物乳杆菌混合菌剂组成及重量份数如下:植物乳杆菌CGMCC 9405菌粉1-2份,植物乳杆菌CGMCC 11763菌粉5-8份；
所述枯草芽孢杆菌培养物制备：从斜面转接培养枯草芽孢杆菌，逐级扩培后的种子液转接入发酵罐中，发酵完毕发酵液经过板框过滤、干燥后获得枯草芽孢杆菌培养物。
植物乳杆菌剂的制备方法：从斜面转接培养植物乳杆菌，逐级扩培后的种子液转接入发酵罐中，发酵完毕发酵液经低温负压真空浓缩到原体积的45％，得到菌浓缩液。添加载体：向浓缩液中添加混合好的载体，混合均匀；浓缩液与载体的重量比为0.5-0.6:1，载体组成为：CaCO3 20-30份，糊精10-15份。流化床干燥，干燥温度50℃。
泡盛曲霉培养物制备：菌种培养，固体发酵培养：孢子液接种到米曲霉固态发酵培养料中，26-33℃培养至菌丝长满培养料，低温流化床干燥，粉碎干燥物。
黑曲霉培养物制备：菌种培养，采用常见固体发酵培养方法制备：孢子液接种到固态发酵培养料中，26-33℃培养至菌丝长满培养料，干燥，粉碎干燥物。
有益效果
本发明的肥料能够增强作物的抗旱能力。本发明的肥料由复合微生物发酵而成，能够改善土壤的微生态环境，为农作物的生长提供有益条件。本发明的肥料能够改良土壤。肥料中有益微生物能产生糖类物质，占土壤有机质的0.1％，与植物粘液，矿物胚体和有机胶体结合在一起，可以改善土壤团粒结构，增强土壤的物理性能和减少土壤颗粒的损失，在一定的条件下，还能参与腐殖质形成。所以施用微生物肥料能改善土壤物理性状，有利于提高土壤肥力。
本产品使用方法简单，每亩地使用量0.2-0.5公斤，成本仅为80-100元/亩，拌种或生长期灌水前地表喷洒。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
本发明中植物乳杆菌CGMCC 9405菌株特点如下：在显微镜下观察，该菌株为短杆状，革兰氏染色呈阳性，无鞭毛，不产芽孢；在固体培养基上，该菌菌落为白色，表面光滑，致密，形态为圆形，边缘较整齐。
理化特征为：过氧化氢酶(-)，明胶液化(-)，吲哚实验(+)，运动性(-)，发酵产气(-)，亚硝酸盐还原(-)，发酵产气(-)，产硫化氢气体(-)，pH4.0MRS培养基中生长(+)。
本发明植物乳杆菌采用下述流程进行选育：
原始出发菌种→试管活化→硫酸二乙酯(DES)诱变→亚硝基胍(NTG)诱变→等离子体诱变→平板初筛→摇瓶复筛→传代稳定性试验。
本发明所采用的出发菌株在MRS葡萄糖培养基中，其乳酸的生产速率为1.5g/L/d,当培养基pH为3.5时几乎停止生长，对亚硝酸钠的分解速率为0.34mg/h/kg白菜。出发菌株为李政采集于宁夏盐池县育肥羊场的青储饲料，采集时间2013年9月15日。
为了提高其乳酸生产速率、耐酸能力和亚硝酸盐的分解速率，依次采用DES和NTG技术对该菌种进行诱变，诱变后菌株采用MRS碳酸钙平板进行初筛，然后采用500mL摇瓶发酵，生物传感器分析仪对高产菌进行复筛，选育优良的植物乳杆菌菌株，然后做传代实验，评价其遗传稳定性。
植物乳杆菌tlj-2014遗传稳定性结果表明：经过连续传代十次，各项性能指标都比较稳定，遗传性较好，性状没有回复，因此把植物乳杆菌tlj-2014作为选育得到的目的菌株。
经验证发现：该诱变菌株的乳酸生产速率可以达到35g/L/d，该菌株经过71小时发酵后乳酸浓度达到95g/L；能够在pH为1.80的条件下存活。降解亚硝酸盐速度快，分解能力达到9.8mg/h/kg(自然发酵过程亚硝酸盐积累的速率大约为1.1mg/h/kg)，能够耐1％胆盐。
因此采用该菌种生产泡菜，整个发酵过程中亚硝酸盐浓度在5mg/kg以下，远低于国家标准GB2714-2003中规定的含量(20mg/kg)。
植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)tlj-2014，该菌株已于2014年7月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号,邮编：100101)，保藏号为CGMCC NO.9405。
1.DES诱变选育
1)在超净台上取试管斜面上的植物乳杆菌L一环，接入装有50mL培养基MRS(无琼脂，葡萄糖 20g/L)培养基的250mL三角瓶中，200rpm，37℃培养12h左右，使菌体处于对数生长前期。
2)取5mL菌液，5000rpm离心10min收集菌体，用生理盐水洗涤2次。
3)用pH7.0磷酸缓冲液稀释成107个/mL菌悬液。
4)取32mL pH7.0的磷酸钾缓冲液、8mL菌悬液、0.4mL DES在预先放入转子的150mL三角瓶中充分混合，使DES最终浓度为1％(v/v)。
5)在37℃摇床中150rpm反应30min，取1mL混合液，加入0.5mL 25％Na2S2O3溶液中止反应。
6)适当稀释，取最后稀释度的菌液0.2mL，涂布于碳酸钙筛选培养基(含100g/L葡萄糖的碳酸钙MRS培养基)平皿中。在37℃培养2～3天后，采用影印法将该筛选平板的菌株转印到pH为1.5、1.8和2.0的LPHMRS培养基(低pH值改性MRS培养基)上和亚硝酸钠筛选培养基(单一氮源为2g/L亚硝酸钠的改性MRS筛选培养基)上。
7)在37℃培养2～3天后，挑选菌落较大，分别能在LPHMRS培养基、亚硝酸钠筛选培养基上生长并且在碳酸钙筛选培养基上。经初步筛选，挑取出的菌落命名为植物乳杆菌L1。
2.亚硝基胍诱变
1)在超净台上取试管斜面上的植物乳杆菌L1一环，接入装有50mL培养基MRS(无琼脂)培养基(葡萄糖浓度为60g/L)的250mL三角瓶中，200rpm，37℃培养12h左右，使菌体处于对数生长前期。
2)取5mL菌液5000rpm离心10min收集菌体，用生理盐水洗涤2次。
3)用pH6.0磷酸缓冲液稀释成107个/mL菌悬液。
4)取10mL菌悬液转移至100mL三角瓶中，加入10mg的NTG，配制成终浓度为10mg/mL的NTG溶液，并加入4-5滴丙酮，以利于NTG溶解。
5)在37℃下200rpm振荡反应30min，5000rpm离心10min收集菌体，用无菌生理盐水洗涤数次，中止反应。
6)适当稀释，取最后稀释度的菌液0.2mL，涂布于碳酸钙筛选培养基(含100g/L葡萄糖的碳酸钙MRS培养基)平皿中。在37℃培养2～3天后，采用影印法将该筛选平板的菌株转印到pH为1.5、1.8和2.0的LPHMRS培养基(低pH值改性MRS培养基)上和亚硝酸钠筛选培养基(单一氮源为2g/L亚硝酸钠的改性MRS筛选培养基)上。
7)挑选菌株方法：挑选菌落较大，分别能在LPHMRS培养基、亚硝酸钠筛选培养基上生长并且在碳酸钙筛选培养基上。经初步筛选，挑取100支符合以上条件的菌落。
3.摇瓶复筛
1)在超净台上分别取各试管斜面上的植物乳杆菌一环，接入装有50mL培养基MRS(无琼脂)培养基(葡萄糖浓度为100g/L)的250mL三角瓶中，200rpm，37℃培养15h左右，使菌体处于 对数生长中期。
2)分别取5mL菌液，接入装有50mL碳酸钙筛选液体培养基(含250g/L葡萄糖的碳酸钙MRS培养基)平皿中、pH为1.5、1.8和2.0的LPHMRS液体培养基(低pH值改性MRS培养基)和亚硝酸钠液体筛选培养基(单一氮源为2g/L亚硝酸钠的改性MRS筛选培养基)上(注：采用250mL三角瓶)。200rpm，37℃培养3-4天，每天分别检测碳酸钙筛选液体培养基中L-乳酸产生速率、LPHMRS液体培养基中的生物量和亚硝酸钠液体筛选培养基中亚硝酸盐的消耗速率。发酵结束后，比较100株菌种的碳酸钙筛选液体培养基中L-乳酸产生速率、LPHMRS液体培养基中的生物量和亚硝酸钠液体筛选培养基中亚硝酸盐的消耗速率。
3)选择兼具高L-乳酸产生速率、耐受低pH(该菌种仅能在最低为pH1.8的培养基中生长)和亚硝酸盐的消耗速率高的菌株，将其命名为L2菌。
4.遗传稳定性试验
将L2菌在斜面上连续十次传代，并用摇瓶复筛的方法检测每次传代后的发酵情况。实验发现，在斜面上连续十次传代，该菌种性状没有明显变化，各项性能指标都正常，说明该菌种的遗传稳定性较强。菌株命名为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)tlj-2014。
5.5L发酵罐试验
1)取斜面上的植物乳杆菌L2一环，接入装有50mL培养基MRS(无琼脂)(葡萄糖浓度为150g/L)培养基的250mL三角瓶中，200rpm，37℃培养12h左右，使菌体处于对数生长中期。
2)将对数期的菌种接入装有3L MRS液体培养基(初始葡萄糖为150g/L)的5L发酵罐中。接种量为10％，37℃下100rpm培养8小时，对数前期溶氧控制10％(通气0.5L/min)，后期厌氧培养63小时。发酵结束后，植物乳杆菌L2的乳酸产量达到95g/L。这样的产乳酸速率利于泡菜的快速发酵。
3)将对数期的菌种接入装有3L pH为1.8的LPHMRS液体培养基(初始葡萄糖为50g/L)的5L发酵罐中。接种量为10％，37℃下100rpm培养8小时，对数前期溶氧控制10％(通气0.5L/min)，后期厌氧，整个过程用0.5mol/L的氢氧化钠将发酵液pH控制在1.8，总培养时间为48小时。发酵结束后，检测植物乳杆菌L2的生物量为2.5g/L，说明植物乳杆菌L2能够在pH1.8的环境中生存。
4)将对数期的菌种接入装有3L亚硝酸钠液体筛选培养基(单一氮源为2g/L亚硝酸钠的改性MRS筛选培养基)的5L发酵罐中。接种量为10％，37℃下100rpm培养8小时，对数前期溶氧控制10％(通气0.5L/min)，后期厌氧，发酵过程根据亚硝酸盐的消耗速率流加20g/L的亚硝酸钠溶液，培养2-3天。发酵结束后，计算发酵过程植物乳杆菌L2对亚硝酸钠的降解速率。结果发现：在该条件下，L2对亚硝酸钠的降解速率可以达到563mg/h/L。
5)将对数期的菌种10mL接入装有2kg预处理过的白菜中，按照传统泡菜方法进行加工，每12小时测定泡菜中的亚硝酸盐含量。结果发现，在整个发酵过程中，L2菌对亚硝酸钠的分解速率为9.8mg/h/kg白菜。泡菜中的亚硝酸钠含量始终低于5mg/kg，远低于国家标准GB2714-2003中规定的含量(20mg/kg)。
发明所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)XH于2015年11月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC NO.11763，保藏地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所，邮编：100101。
植物乳杆菌益生特性如下：
本发明所提供的植物乳杆菌CGMCC NO.11763经实验发现能够在pH为1.50的条件下存活，在1％胆盐培养4小时后仍处于存活状态；植物乳杆菌CGMCC NO.11763降解亚硝酸盐速度快，分解能力达到10.9mg/h/kg，该菌种在生产泡菜时，整个发酵过程中亚硝酸盐浓度在4.8mg/kg以下；CGMCC NO.11763在发酵60h小时后，对胆固醇降解率可达到64.76％。CGMCC NO.11763黏附能力测定的自凝集率为95.71％。
CGMCC NO.11763对胆固醇降解能力研究和测定：
取1ml CGMCC NO.11763母液接种于10mL的MRS胆固醇液体培养基(胆固醇含量0.1mg/ml,pH 6.2)中，37℃的恒温静置分别培养20h、40h、60h备用，以接入1mL无菌水的MRS胆固醇培养基为对照，取以上培养不同时间的菌液样品及对照液各1ml,9000r/min，4℃下离心10min，得到发酵上清液，邻苯二甲醛法测定上清液中胆固醇含量(具体为：取各上清液0.1ml于相应的试管中,加冰醋酸0.3ml,1mg/ml的邻苯二甲醛0.15ml，缓缓加入浓硫酸1.0ml，混合均匀。室温静置10min，于550nm下测吸光值)。每一处理3个重复，以同样方法制作胆固醇标准曲线，计算上清液中胆固醇含量及降解率,结果见表1。可知，CGMCC NO.11763对胆固醇有很好的降解作用，在发酵60h小时后，降解率可达到64.76％。
表1对胆固醇的降解情况
降解时间(h) 0 20h 40h 60h
胆固醇含量(mg/ml) 0.2273±0.0058 0.1356±0.0018 0.1011±0.0094 0.801±0.0231
胆固醇降解率％ 40.34％ 55.52％ 64.76％
CGMCC NO.11763菌株的耐胆盐试验：
取CGMCCNO.11763菌液1mL接种菌种于含有不同胆盐(含量梯度为0.0％、0.2％、0.4％、0.6％、0.8％、1％)的10mL MRS液体培养基(PH＝6.4)，置于37℃下分别培养0、2、4h，每个处理3个重复。各取1ml样品菌液于9ml生理盐水中混匀，制备稀释度溶液，取0.1ml稀释液于MRS中涂布，于37℃生化培养箱中倒置培养48小时(每个稀释度做3个平行)记录计算平板上的菌数个数。结果见表2。可知该菌在胆盐浓度为1％处理4h后菌的生长量依然达到0.59±0.92×107(cfu/ml)，有很好的耐胆盐能力。
表2耐胆盐能力检测[(±s)×107cfu/ml]
CGMCC NO.11763菌株的耐酸试验
取CGMCC NO.11763母液按1ml接种菌种于不同pH值(pH梯度为1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0)的10mL MRS液体培养基，置于37℃下分别培养0、2、4h，每一处理3个重复。各取1ml样品菌液于9ml生理盐水中混匀，制备稀释溶液，取0.1ml稀释液于MRS中涂布，于37℃生化培养箱中倒置培养48小时(每个稀释度做3个平行)记录平板上的菌落个数。结果见表3。说明该菌具有很强的耐酸能力。
表3耐酸能力检测[(±s)×107cfu/ml]
CGMCC NO.11763菌株的黏附能力测定
培养CGMCC NO.11763(MRS液体培养基)、大肠杆菌DH5α(LB液体培养基)24h得发酵液，分别置于3000r/min、4℃下离心10min，收集菌泥，分别用pH＝7.0的无菌磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤菌泥2次(即在菌落中加入PBS，震荡混合均匀后，置于3000r/min、4℃下离心10min，收集菌体)。自凝集率(％)：用无菌的PBS将菌泥CGMCC NO.11763制成在波长600nm处的吸光值为0.4±0.1(A 0)的悬浮菌液及菌悬液,静置24h后测定吸光值A 24，自凝集率(％)公式为(A 0—A 24)/A 0。；他凝集率(％)：将CGMCC NO.11763和大肠杆菌DH5α的悬菌液调节成在波长600nm处的吸光值为0.6±0.1(A 0)的混合悬浮菌液。静置24H后测定吸光值A 24，他凝集率(％)公式为(A 0—A 24)/A 0。测 定结果见表4，可知CGMCC NO.11763的自凝集率为95.71％，有很强的黏附能力。
表4黏附能力表
菌株生理特性
所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)XH于2015年11月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC NO.11763，保藏地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所，邮编：100101。
该菌株特点如下：在显微镜下观察，该菌株为短杆状，革兰氏染色呈阳性，无鞭毛，不产芽孢；在固体培养基上，该菌菌落为白色，表面光滑，致密，形态为圆形，边缘较整齐。
理化特征为：过氧化氢酶(-)，明胶液化(-)，吲哚实验(+)，运动性(-)，发酵产气(-)，亚硝酸盐还原(-)，发酵产气(-)，产硫化氢气体(-)，pH4.0MRS培养基中生长(+)。经过生理生化鉴定为为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，命名为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)XH。
菌株能够在57℃下生长良好，葡萄糖耐受能力为275g/L。
本发明植物乳杆菌由采集人李建树，从新疆维吾尔族老乡家中酸奶中分离得到，采集时间2015年6月2日。
5L发酵罐试验
(1)取斜面上的植物乳杆菌CGMCC NO.11763一环，接入装有50mL培养基MRS(无琼脂)(葡萄糖浓度为150g/L)培养基的250mL三角瓶中，200rpm，37℃培养12h左右，使菌体处于对数生长中期。
(2)将对数期的菌种接入装有3L MRS液体培养基(初始葡萄糖为150g/L)的5L发酵罐中。接种量为10％，37℃下100rpm培养8小时，对数前期溶氧控制10％(通气0.5L/min)，后期厌氧培养63小时。发酵结束后，植物乳杆菌CGMCC NO.11763的乳酸产量达到110g/L。这样的产乳酸速率利于泡菜的快速发酵。
(4)将对数期的菌种接入装有3L亚硝酸钠液体筛选培养基(单一氮源为2g/L亚硝酸钠的改性MRS筛选培养基)的5L发酵罐中。接种量为10％，37℃下100rpm培养8小时，对数前期溶氧控制10％(通气0.5L/min)，后期厌氧，发酵过程根据亚硝酸盐的消耗速率流加20g/L的亚硝酸钠溶液，培养2-3天。发酵结束后，计算发酵过程植物乳杆菌CGMCC NO.11763 对亚硝酸钠的降解速率。结果发现：在该条件下，XH对亚硝酸钠的降解速率可以达到653mg/h/L。
(5)将对数期的菌种10mL接入装有2kg预处理过的白菜中，按照传统泡菜方法进行加工，每12小时测定泡菜中的亚硝酸盐含量。结果发现，在整个发酵过程中，XH菌对亚硝酸钠的分解速率为10.9mg/h/kg白菜。泡菜中的亚硝酸钠含量始终低于4.8mg/kg，远低于国家标准GB2714-2003中规定的含量(20mg/kg)。
本发明提供的黑曲霉菌株(Aspergillus niger)Li-2013-03是由实验室保藏的一株产纤维素酶产的黑曲霉(Aspergillus niger)Li-2010经多轮亚硝基胍诱变，然后对突变株逐级筛选淘汰，最后对优良菌株经发酵性能测试筛选得到产高活力纤维素酶的黑曲霉菌株(Aspergillus niger)Li-2013-03。
本发明提供的产高活力纤维素酶的菌株具体为黑曲霉(Aspergillus niger)Li-2013-03。该菌株已于2013年7月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号,邮编100101)，保藏号为CGMCC NO.7927。
产高活力纤维素酶菌株的筛选方法，包括以下步骤：
1)斜面培养：将原始黑曲霉菌株(Aspergillus niger)Li-2010划线接种斜面培养基，30℃培养2～3d，直至菌丝体成熟、产大量黑色孢子。所述斜面培养基组成如下：12OBrix麦芽汁l000mL，pH值自然，121℃灭菌20min；
2)孢子悬液制备(以下步骤均在无菌条件下操作)：向试管斜面加入15mL无菌水，把孢子刮下，用滤纸过滤，将滤过液倒入已灭菌、并加有5-10粒无菌玻璃珠的150mL三角瓶中，将三角瓶放入摇床振荡10-15min，使孢子分散。
3)亚硝基胍(NTG)诱变
A.用无菌水将孢子悬浮液调节为稀释成106-107个/mL。
B.取10mL菌悬液转移至100mL三角瓶中，加入10mg的NTG，配制成终浓度为10mg/mL的NTG溶液，并加入4-5滴丙酮，以利于NTG溶解。
C.在30℃下200rpm振荡反应30min，5000rpm离心10min收集菌体，用无菌生理盐水洗涤数次，中止反应。
D.适当稀释将孢子浓度调节为103个/mL，取最后稀释度的菌液0.2mL，稀释涂布于纤维素-刚果红平板筛选培养基上。在30℃培养2～3天后挑取透明圈/菌落直径较大的菌株200支。(所述纤维素-刚果红平板筛选培养基组成如下：纤维素粉10g、刚果红0.2g、 硫酸铵5g、硫酸镁0.25g、磷酸二氢钾1g、氯化钠0.1g、明胶2g、琼脂20g、自来水定容1000mL，pH值5-6，121℃灭菌20min)。
E.复筛：将获得的200株菌分别用无菌牙签接种于斜面培养基，30℃培养至孢子铺满斜面。分别将孢子以无菌水洗下接种于装有50mL复筛培养基的250mL三角瓶中进行发酵，接种量10％(v/v)，30℃、100r/min培养96h，分别测定各菌株的纤维素酶活性。(所述复筛培养基组成如下：纤维素粉50g、硫酸铵5g、硫酸镁0.25g、磷酸二氢钾1g、氯化钠0.1g、自来水定容1000mL，pH值5-6，121℃灭菌20min)。选取纤维素酶酶活力最高的菌株进行放大实验。
4)遗传稳定性试验
将Li-2013-03菌株在斜面上连续十次传代，并用摇瓶复筛的方法检测每次传代后的发酵情况。实验发现，在斜面上连续十次传代，该菌种性状没有明显变化，各项性能指标都正常，说明该菌种的遗传稳定性较强。
5)放大试验
①种子培养：将纤维素酶酶活力最高的菌株Aspergillus niger Li-2013-03接入500mL三角瓶中，种子培养基装量100毫升，30℃、150rpm摇床培养72-96h。
③种子罐培养：将种子液以10％(v/v)接种量接入装有7.5L发酵液的10L发酵罐中，控制pH值恒定为6.0±0.2，培养温度30±0.1℃，搅拌速度300rpm，通风量(v/v)1:0.8-1.2,培养时间96h，溶解氧20-30％。所述发酵培养基组成为：纤维素粉100g、硫酸铵5g、硫酸镁0.25g、磷酸二氢钾1g、氯化钠0.1g、自来水定容1000mL，pH值5-6，121℃灭菌20min。
发酵结束后，取发酵上清液(粗酶液)进行酶活力检测经测定，菌株Aspergillus niger Li-2013-03的外切β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和滤纸酶活力分别达到620U/mL、1289U/mL、456U/mL和732U/mL，分别比出发菌株Aspergillus nigerLi-2010提高了9.21倍、7.43倍、8.15倍和10.31倍。
本发明提供的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Li-2013-02。该菌株已于2013年7月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCC No.7926。
所述菌株特点如下：
所述菌株在固体平板上菌落颜色为乳白色，表面干燥不透明，边缘整齐，为具有运动性的好氧菌。镜检为长杆状，革兰氏染色呈阳性。该菌可利用柠檬酸盐，硝酸还原、V-P实验成阳性。
所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Li-2013-02由一株保藏于本实验室的产耐高 温α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌Li-2013经紫外线-氯化锂-硫酸二乙酯复合诱变筛选获得，具体筛选步骤如下：
(1)菌悬液的制备
将在平板划线分离后长出的Li-2013单菌落接入种子培养基中，100r/min，40℃培养12h后，取1mL培养液离心后用生理盐水洗涤两次，并重悬与9mL生理盐水中。
(2)紫外线-氯化锂-硫酸二乙酯复合诱变
将菌悬液置于无菌平板中，在距离为30cm，功率15w的紫外灯下搅拌照射100s。将经过照射的菌液经梯度稀释后涂布于氯化锂平板，并以未经紫外照射的菌液稀释涂平板做对照。将上述涂布均匀的平板，用黑色的布或报纸包好，置40℃培养48h，在长出菌落的平板上筛选出水解圈与菌落直径比值最大者挑至斜面保存，纯化后配制成菌悬液，经梯度稀释后与硫酸二乙酯原液充分混合，并于40℃震荡处理40min，将处理过的菌液经梯度稀释后涂布于氯化锂平板。
(3)高产菌种的初筛
将上述涂布均匀的平板，置40℃培养48h，在长出菌落的平板上初筛出水解圈与菌落直径比值较大者挑至斜面保存，纯化后获得三株菌Li-2013-01，Li-2013-02,Li-2013-03
(4)摇瓶发酵复筛
将获得的三株菌Li-2013-01，Li-2013-02,Li-2013-03在含有30mL发酵培养基的250mL摇瓶中进行摇瓶发酵，种子接种量10％(V/V)，40℃、100r/min培养72h，离心取发酵上清液制得粗酶液。
(5)酶活测定
酶活单位的定义：1mL粗酶液，于105℃、pH 4.2条件下，1min液化1mg可溶性淀粉，即为1个酶活力单位，以U/mL表示。
经测定，菌株Li-2013-02,为稳定的最高产菌株，且酶活达到30000U/mL，比原始菌株酶活提高1.6倍。
所述氯化锂平板：淀粉1％，蛋白胨1％，(NH)2SO40.4％，K2HPO40.8％，CaCl20.2％，氯化锂0.9％，琼脂2％。
所述的种子培养基：酵母粉0.5％，蛋白胨1％，可溶性淀粉1％，NaCl 1％。
所述的发酵培养基：玉米粉5％～15％，豆饼粉4％～10％，(NH)2SO40.4％，K2HPO40.8％，CaCl20.2％。
所述的摇瓶培养条件：该菌在含有30mL发酵培养基的250mL摇瓶中，接种量10％(V/V)，100r/min、40℃发酵培养72h。
由菌株Li-2013-02发酵获得了一种耐高温的α-淀粉酶，其酶学性质如下：
(1)该酶温度适应范围较宽，最适作用温度在105-115℃之间，且在110℃以下保存的温度稳定性较好，而115℃以上保存长时间温度稳定性较差。
(2)该酶最适反应pH值为4.2。在pH值3.0-7.0之间均有较高酶活力，在pH值为3.0时酶活完全稳定。
(3)酶活性：由本发明所提供的突变株Li-2013-02,制备的耐高温α-淀粉酶酶活力为30000-35000U/ml。
1、本发明使用紫外线-氯化锂-硫酸二乙酯复合诱变的方法获得了一株高产耐高温α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌Li-2013-02，该菌株具有强耐酸、耐热性，产酶活力高的特点。
2、有该菌株生产所得的耐高温α-淀粉酶酶活力高达30000-35000u/ml,；适用温度范围为25-115℃，最适反应温度110℃，在110℃酶活完全稳定；适用反应pH值范围为3.0-7.0，在pH值为3.0时酶活完全稳定，最适反应pH值为4.2，比现有的耐高温α-淀粉酶酶活力高，酶作用最适pH值范围宽泛，耐温度高，特别适合反应温度高、液化工艺与糖化工艺并存的工业化需求。
实施例1
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种微生物复合肥：
重量份数组成为：植物乳杆菌混合菌剂16份,混合曲霉培养物18份，枯草芽孢杆菌培养物10；
所述混合曲霉培养物的组成及重量份数如下:黑曲霉培养物9份，泡盛曲霉培养物1份；
所述黑曲霉(Aspergillus niger)为CGMCC NO.7927。
植物乳杆菌混合菌剂组成及重量份数如下:植物乳杆菌CGMCC 9405菌粉2份,植物乳杆菌CGMCC 11763菌粉7份；
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis subsp)CGMCC7926
泡盛曲霉(Aspergillus awamori)CGMCC3.6484
泡盛曲霉菌剂的制备方法：
技术方案如下：
斜面菌种活化培养：将泡盛曲霉斜面菌种转接到斜面培养基上，27℃培养3天。
固体一级种子培养：挑取泡盛曲霉斜面菌种接入装有100克培养基的500毫升三角瓶中进行种子培养，30℃培养3天即可。
固体二级种子培养：将上述培养好的固体一级种子搅拌为碎块后加入装有1000克培养基 的5000毫升三角瓶中进行种子培养，培养条件：30℃培养3天即可。
固体发酵培养：将二级摇瓶种子粉碎，加入装有灭菌培养基的发酵池或托盘中混合均匀后培养，曲料培养温度控制在26-35℃，湿度80-90％，每隔10小时翻料一次，培养时间5-7天；固体曲料的培养采用常用曲料培养技术；待培养料长满菌丝即可结束培养，培养基预先经高温蒸煮灭菌处理，灭菌条件控制温度121℃，时间1小时。
干燥粉碎：发酵结束培养料在流化床或其他干燥设备上进行干燥，干燥温度控制在60℃，干燥到水分含量在10％以下，然后将固体培养料进行粉碎，物料粉碎孔径在60目以上。
培养基组成：固体原料:麸皮80％,豆饼粉10％,玉米淀粉10％，添加等量自来水；初始pH自然。
枯草芽孢杆菌培养物的制备方法：
1.发酵液的获得：采用斜面菌种逐级扩培获得枯草芽孢杆菌发酵液；
(1)一级种子培养：将枯草芽孢杆菌斜面菌种接入500毫升摇瓶中，培养基装量100毫升，旋转式摇床180转/分，培养温度30℃，培养时间24小时；
(2)二级种子培养：将一级种子按照10％的接种量接入500毫升二级种子摇瓶中，培养条件与一级种子相同；
(3)三级种子培养：将二级种子以10％接种量接入5000毫升三级种子摇瓶中，培养基装量1000毫升，旋转式摇床100转/分，培养温度30℃，培养时间24小时；
(4)一级种子罐培养：将三级种子以10％接种量接入总容积为150L的一级种子罐，发酵培养基装量100L，培养温度28℃，搅拌速度100转/分，通风量(V/V)1:0.5,罐压0.05Mpa,培养时间24小时；
(5)发酵培养：将一级种子罐菌种以10％接种量接入总容积为1.5吨二级种子罐，发酵培养基装量1吨，培养条件培养温度28℃，搅拌速度100转/分，通风量(V/V)1:0.5,罐压0.05Mpa,培养时间24小时。
培养基组成：葡萄糖6％,酵母提取物1％,蛋白胨0.2％，CaCO31％,pH6.8。
植物乳杆菌剂的制备方法：
(1)一级种子培养：将植物乳杆菌菌种接入500毫升摇瓶中，培养基装量100毫升，培养温度30℃，培养时间24小时；
(2)二级种子培养：将一级种子按照10％的接种量接入500毫升二级种子摇瓶中，培养条件与一级种子相同；
(3)三级种子培养：将二级种子以10％接种量接入5000毫升三级种子摇瓶中，培养基装量1000毫升，培养温度30℃，培养时间24小时；
(4)一级种子罐培养：将三级种子以5％接种量接入总容积为150L的一级种子罐，发酵培养基装量100L，培养温度30℃，罐压0.05Mpa,培养时间18小时；
(5)发酵罐培养：将一级种子罐菌种以5％接种量接入总容积为3吨二级种子罐，发酵培养基装量2吨，培养条件培养温度30℃，罐压0.05Mpa,培养时间22小时。发酵完毕发酵液经低温负压真空浓缩到原体积的45％，得到菌浓缩液。添加载体：向浓缩液中添加混合好的载体，混合均匀；浓缩液与载体的重量比为0.5:1，载体组成为：CaCO3 25份，糊精12份。流化床干燥，干燥温度50℃。
培养基组成为：酪蛋白胨1％,牛肉提取物1％,酵母提取物0.5％,葡萄糖0.5％,乙酸钠0.5％,柠檬酸二胺0.2％,Tween 80 0.1％,K2HPO4 0.2％,MgSO4.7H2O 0.02％,MnSO4.H2O 0.005％,CaCO3 2％,琼脂1.5％,pH6.8。
实施例2
基本同实施例1
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种微生物复合肥：
重量份数组成为：植物乳杆菌混合菌剂20份,混合曲霉培养物10份，枯草芽孢杆菌培养物8；
所述混合曲霉培养物的组成及重量份数如下:黑曲霉培养物6份，泡盛曲霉培养物2份；
所述黑曲霉(Aspergillus niger)为CGMCC NO.7927。
植物乳杆菌混合菌剂组成及重量份数如下:植物乳杆菌CGMCC 9405菌粉2份,植物乳杆菌CGMCC 11763菌粉5份；
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis subsp)CGMCC7926
泡盛曲霉(Aspergillus awamori)CGMCC3.6484
产品效果实验
试验地的选择与试验设计：试验于2015年在宁夏盐池县进行。
试验田旱地田种植玉米10亩，分别在种植时使用本发明产品每亩0.3公斤，出苗1个月左右通过锄地松土方式使用发明产品0.2公斤，对照组使用市售微生物肥料。
发明产品使用玉米地玉米产量达到290公斤，对照组达到110公斤。

Claims (8)

1.一种微生物复合肥，重量份数组成为：植物乳杆菌混合菌剂8-20份,混合曲霉培养物10-20份，枯草芽孢杆菌培养物8-15。
2.如权利要求1所述一种微生物复合肥，其特征在于，所述混合曲霉培养物的组成及重量份数如下:黑曲霉培养物5-9份，泡盛曲霉培养物1-3份。
3.如权利要求2所述一种微生物复合肥，其特征在于，所述黑曲霉(Aspergillus niger)为CGMCC NO.7927。
4.如权利要求1所述一种微生物复合肥，其特征在于，植物乳杆菌混合菌剂组成及重量份数如下:植物乳杆菌CGMCC 9405菌粉1-2份,植物乳杆菌CGMCC 11763菌粉5-8份。
5.如权利要求1-4任一所述一种微生物复合肥，一种微生物复合肥：重量份数组成为：植物乳杆菌混合菌剂16份,混合曲霉培养物18份，枯草芽孢杆菌培养物10份。
6.如权利要求5所述一种微生物复合肥，其特征在于，所述混合曲霉培养物的组成及重量份数如下:黑曲霉培养物9份，泡盛曲霉培养物1份；所述黑曲霉(Aspergillusniger)为CGMCC NO.7927。
7.如权利要求5所述一种微生物复合肥，其特征在于，植物乳杆菌混合菌剂组成及重量份数如下:植物乳杆菌CGMCC 9405菌粉2份,植物乳杆菌CGMCC 11763菌粉7份。
8.如权利要求5所述一种微生物复合肥，其特征在于，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilissubsp)CGMCC7926，泡盛曲霉(Aspergillus awamori)CGMCC3.6484。
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