CN103773720B - 一种微生物肥料的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种微生物肥料的制备方法，属于农用肥料技术领域，所述微生物肥料的生产方法，是将黑曲霉培养物、解磷巨大芽孢杆菌、植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌按比例混合为微生物肥料。本发明的肥料通过复合微生物发酵的方法制成，能够改善土壤的微生态环境，为农作物的生长提供有益条件。解磷巨大芽孢杆菌能分解土壤中的有机磷成为植物可利用的速效磷；本发明使用的黑曲霉具有产高活力纤维素酶的特性，纤维素酶有利于土壤有机质的分解，腐殖质的形成和碳素营养的释放。每亩土地使用本发明的肥料的量为50-100克，是目前国内外使用量较少的微生物肥料之一。<pb pnum="1" />

Description

一种微生物肥料的制备方法

技术领域

本发明涉及一种生物肥加工方法，属于农用肥料技术领域，特别涉及一种微生物肥料的制备方法。

背景技术

现有的生物肥料大多是单一性的生物肥料。如：固氮菌肥，主要由具有固氮作用的细菌和真菌组成；又如：磷细菌，其功能是分解土壤中的有机磷，使之变为易于被植物吸收的磷素；再如：钾细菌，其功能是分解土壤中的钾化合物，使之成为能被植物吸收利用的速效钾。这些肥料在单独使用时均能发挥各自作用，部分满足植物对氮，磷，钾三要素的需要。它们不会产生长期使用化肥所造成的土壤板结现象。但其不足在于：单独使用上述三类生物肥料只能解决植物所需营养的一个方面，且成本较高，用量大，同时，将三者配合使用，又因难于做到比例适当而造成施肥量的不足或浪费。长期使用单一的或复合的生物肥料的实践证明，它们只能替代化肥的30%以下。

而目前市场上的农用微生物菌剂主要为单一的微生物菌种，难以还原微生态结构，同时普通菌种和农作物的协同作用弱，不利如提高植物抗逆性和根系营养吸收，例如公布号为CN103374528A的专利申请，公开了一种采用黑曲霉制备的能够高效解磷的微生物菌剂，利用了黑曲霉对难溶性磷酸盐具有较强的转化能力，并能将含磷的有机化合物（如植素等）分解成能被植物吸收利用的可溶性磷的特性。又例如公布号为CN102888356A的专利申请，公开了一种利用枯草芽孢杆菌制备微生物肥料的方法及其应用。虽然目前市场上已出现一些复合微生物菌剂，但其或者功能单一，或者其使用方法受到限制，使用后的作物增产效果还不能达到令人满意，所以目前仍需要开发适用于多种施用途径、具有综合功能和良好增产效果的复合微生物菌剂或肥料。

由于我国长期在微生物肥料方面研究缺乏投入，使得我国的微生物肥料产业依然存在整体水平不高、技术创新不足、产品质量与应用效果表现欠稳定的问题。在农业可持续发展已成为人类共识的今天，这些问题成了微生物肥行业函待打通的“瓶颈”。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种微生物肥料的制备方法。

一种生产微生物肥料的方法，将黑曲霉培养物、解磷巨大芽孢杆菌、植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌按比例混合为微生物肥料，所述微生物肥料的重量份数组成为：黑曲霉培养物18-26份、解磷巨大芽孢杆菌3-5份、植物乳杆菌剂10-20份，枯草芽孢杆菌菌剂25-36份。

枯草芽孢杆菌剂培养制备：从斜面转接培养枯草芽孢杆菌，逐级扩培后的种子液转接入发酵罐中，发酵完毕发酵液经分离干燥后获得枯草芽孢杆菌剂。

植物乳杆菌剂的制备方法：从斜面转接培养植物乳杆菌，逐级扩培后的种子液转接入发酵罐中，发酵完毕发酵液经低温负压真空浓缩到原体积的45%，得到菌浓缩液。添加载体：向浓缩液中添加混合好的载体，混合均匀；浓缩液与载体的重量比为0.5-0.7:1，载体组成为：CaCO₃20-40份，糊精10-20份。流化床干燥，干燥温度50℃。

黑曲霉培养物制备：菌种培养，固体发酵培养：孢子液接种到固态发酵培养料中，26-35℃培养至菌丝长满培养料，低温流化床干燥，粉碎干燥物。

本发明采用的菌种如下：

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis subsp）CGMCC7926

植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）CGMCC7928

黑曲霉（Aspergillus niger）CGMCC NO.7927

上述三种菌种的保藏单位是中国普通微生物菌种保藏管理中心。地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号；邮编：100101

解磷巨大芽孢杆菌剂由沧州旺发生物技术研究所提供，地址：中国河北沧州市运河区解放西路颐和国际商务中心A座1区807-812。

有益效果

本发明的肥料由复合微生物发酵而成，能够改善土壤的微生态环境，为农作物的生长提供有益条件。

解磷巨大芽孢杆菌是芽抱杆菌属（Bacillus）中的一个种。运动，形成荚膜，好氧。从葡萄糖产酸，也常从阿拉伯糖和甘露醇产酸。水解淀粉，不产生卵磷脂酶，VP阴性。能分解土壤中的有机磷成为植物可利用的速效磷。

在生物肥料工业上，黑曲霉具有裂解大分子有机物和难溶无机物，便于作物吸收利用，改善土壤结构，增强土壤肥力，提高作物产量的效果。黑曲霉具有解磷的特性，可以利用固定态、吸附态的磷，有效缓解土壤中缺磷的现状，而且对提高磷肥利用率，减少磷肥的使用所造成的环境污染。

本发明使用的黑曲霉还具有产高活力纤维素酶的特性，纤维素酶有利于土壤有机质的分解，腐殖质的形成和碳素营养的释放，用在果类作物上，能使果肉细嫩清脆，果汁丰富，口感良好。

实验表明，使用本品可提高粮食产量8-30%，提高蔬菜产量10-40%，还可改善蔬菜、粮食的品质和风味。每亩土地使用本发明的肥料的量为50-100克，是目前国内外使用量较少的微生物肥料之一。在本发明微生物肥料中加入120倍的自来水和6倍的尿素，在22℃以上45℃以下的水温中活化28小时，然后连同化肥（按照上年使用量的50%）洒入土壤中。最好作基肥，每年使用1-3次。

具体实施方式

除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的反应条件、分离提取条件进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

下面的实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）Li-2013-02，该菌株已于2013年7月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏号为CGMCC No.7926。

所述菌株特性是产耐高温α-淀粉酶的酶活力高，耐热、耐酸性强。

所述菌株制备的耐高温α-淀粉酶酶活力为30000-35000u/ml；适用温度范围为105-115℃，最适反应温度110℃，在110℃酶活完全稳定；适用反应pH值范围为3.0-7.0，在pH值为3.0时酶活完全稳定，最适反应pH值为4.2。

所述菌株特点如下：

所述菌株在固体平板上菌落颜色为乳白色，表面干燥不透明，边缘整齐，为具有运动性的好氧菌。镜检为长杆状，革兰氏染色呈阳性。该菌可利用柠檬酸盐，硝酸还原、V-P实验成阳性。

所述枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）Li-2013-02由一株产耐高温α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌Li-2013经紫外线-氯化锂-硫酸二乙酯复合诱变筛选获得，具体筛选步骤如下：

（1）菌悬液的制备

将在平板划线分离后长出的Li-2013单菌落接入种子培养基中，100r/min，40℃培养12h后，取1mL培养液离心后用生理盐水洗涤两次，并重悬与9mL生理盐水中。

（2）紫外线-氯化锂-硫酸二乙酯复合诱变

将菌悬液置于无菌平板中，在距离为30cm，功率15w的紫外灯下搅拌照射100s。将经过照射的菌液经梯度稀释后涂布于氯化锂平板，并以未经紫外照射的菌液稀释涂平板做对照。将上述涂布均匀的平板，用黑色的布或报纸包好，置40℃培养48h，在长出菌落的平板上筛选出水解圈与菌落直径比值最大者挑至斜面保存，纯化后配制成菌悬液，经梯度稀释后与硫酸二乙酯原液充分混合，并于40℃震荡处理40min，将处理过的菌液经梯度稀释后涂布于氯化锂平板。

（3）高产菌种的初筛

将上述涂布均匀的平板，置40℃培养48h，在长出菌落的平板上初筛出水解圈与菌落直径比值较大者挑至斜面保存，纯化后获得三株菌Li-2013-01，Li-2013-02,Li-2013-03。

（4）摇瓶发酵复筛

将获得的三株菌Li-2013-01，Li-2013-02,Li-2013-03在含有30mL发酵培养基的250mL摇瓶中进行摇瓶发酵，种子接种量10％(V/V)，40℃、100r/min培养72h，离心取发酵上清液制得粗酶液。

（5）酶活测定

酶活单位的定义：1mL粗酶液，于105℃、pH4.2条件下，1min液化1mg可溶性淀粉，即为1个酶活力单位，以U/mL表示。

经测定，菌株Li-2013-02,为稳定的最高产菌株，且酶活达到30000U/mL。

所述氯化锂平板：淀粉1%，蛋白胨1%，(NH)₂SO₄0.4％，K₂HPO₄0.8％，CaCl₂0.2％，氯化锂0.9%，琼脂2%。

所述的种子培养基：酵母粉0.5％，蛋白胨1％，可溶性淀粉1％，NaCl1％。

所述的发酵培养基：玉米粉5％-15％，豆饼粉4％-10％，(NH)₂SO₄0.4％，K₂HPO₄0.8％，CaCl₂0.2％。

所述的摇瓶培养条件：该菌在含有30mL发酵培养基的250mL摇瓶中，接种量10％(V/V)，100r/min、40℃发酵培养72h。

所述耐高温的α-淀粉酶，其酶学性质如下：

(1)该酶温度适应范围较宽，最适作用温度在100-110℃之间，且在110℃以下保存的，温度稳定性较好，而110℃以上保存长时间温度稳定性较差。

(2)该酶最适反应pH值为4.2。在pH值3.0-7.0之间均有较高酶活力，在pH值为3.0时酶活完全稳定。

（3）酶活性：由本发明所提供的突变株Li-2013-02,制备的耐高温α-淀粉酶酶活力为30000-35000U/ml。

本发明所提供的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）Li-2013-01,该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.7928，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。保藏日期2013年7月15日。该菌株特点如下：在显微镜下观察，该菌株为短杆状，革兰氏染色呈阳性，无边毛，不产芽孢；在固体培养基上，该菌菌落为白色，表面光滑，致密，形态为圆形，边缘较整齐。理化特征为：过氧化氢酶（-），明胶液化（-），吲哚实验（+），运动性（-），发酵产气（-），亚硝酸盐还原（-），发酵产气（-），产硫化氢气体（-），pH4.5MRS培养基中生长（+）。

本发明植物乳杆菌采用下述流程进行选育：

原始出发菌种→试管活化→硫酸二乙酯（DES）诱变→平板初筛→亚硝基胍（NTG）诱变→平板初筛→摇瓶复筛→传代稳定性试验。

原始出发菌种为CICC20242，购于中国工业微生物菌种保藏管理中心。

本发明所采用的原始菌株在木聚糖培养基中，乳酸的产量为12.5g/L。为了提高其乳酸产量，依次采用DES和NTG对该菌种进行诱变，诱变采用MRS碳酸钙平板进行初筛，然后采用500mL摇瓶发酵，生物传感器分析仪对高产菌进行复筛，选育优良的植物乳杆菌菌株，然后做传代实验，评价其遗传稳定性。

菌株CGMCC No.7928遗传稳定性结果表明：经过连续传代十次，各项性能指标都比较稳定，遗传性较好，性状没有回复，因此把菌株CGMCC No.7928作为选育得到的目的菌株。

将目的菌株CGMCC No.7928做10L发酵罐实验，结果表明：发酵72h后，以木聚糖为碳源，植物乳杆菌CGMCC No.7928的乳酸浓度可以达到57g/L，与出发菌株相比提高了356%。

将目的菌株CGMCC No.7928做10L发酵罐实验，结果表明：发酵72h后，以葡萄糖为碳源，植物乳杆菌CGMCC No.7928的乳酸浓度可以达到68g/L。

具体过程如下：

培养基：

液体MRS木聚糖培养基（牛肉膏2g、蛋白胨10g、酵母膏5g、木聚糖20g、乙酸钠5g、柠檬酸铵2g、磷酸氢二钾2g、七水硫酸镁0.2g、七水硫酸锰0.05g，逐一溶解后，自来水定容1000mL，调节pH7.0-7.2）；MRS木聚糖筛选固体培养基（牛肉膏2g、蛋白胨10g、酵母膏5g、木聚糖90g、乙酸钠5g、柠檬酸铵2g、磷酸氢二钾2g、七水硫酸镁0.2g、七水硫酸锰0.05g，逐一溶解后，自来水定容1000mL，调节pH7.0-7.2，加入20g琼脂）。

1.硫酸二乙酯（DES）诱变选育

1)在超净台上取试管斜面上的植物乳杆菌一环，接入装有50mL液体MRS木聚糖培养基的250mL三角瓶中，200rpm，40℃培养12h左右，使菌体处于对数生长前期。

2)取5mL菌液，5000rpm离心10min收集菌体，用生理盐水洗涤2次。

3)用pH7.0磷酸缓冲液稀释成107个/mL菌悬液。

4)取32mLpH7.0的磷酸钾缓冲液、8mL菌悬液、0.4mLDES在预先放入转子的150mL三角瓶中充分混合，使DES最终浓度为1%（v/v）。

5)在30℃摇床中150rpm反应30min，取1mL混合液，加入0.5mL25%Na₂S₂O₃溶液中止反应。

6)稀释涂布于含90g/L木聚糖的MRS木聚糖筛选固体培养基平皿中。在40℃培养2～3天后挑取透明圈/菌落直径最大的菌株，标号为DES菌。

2.亚硝基胍诱变

1)在超净台上取试管斜面上的植物乳杆菌DES一环，接入装有50mL液体MRS木聚糖培养基的250mL三角瓶中，200rpm，40℃培养12h左右，使菌体处于对数生长前期。

2)取5mL菌液5000rpm离心10min收集菌体，用生理盐水洗涤2次。

3)用pH6.0磷酸缓冲液稀释成107个/mL菌悬液。

4)取10mL菌悬液转移至100mL三角瓶中，加入10mg的NTG，配制成终浓度为10mg/mL的NTG溶液，并加入4-5滴丙酮，以利于NTG溶解。

5)在30℃下200rpm振荡反应30min，5000rpm离心10min收集菌体，用无菌生理盐水洗涤数次，中止反应。

6)适当稀释，取最后稀释度的菌液0.2mL，稀释涂布于含90g/L木聚糖的MRS木聚糖筛选固体培养基平皿中。在40℃培养2～3天后挑取透明圈/菌落直径较大的菌株150支。

3.摇瓶复筛

1)在超净台上分别取各试管斜面上的植物乳杆菌一环，接入装有50mL液体MRS木聚糖培养基的250mL三角瓶中，200rpm，40℃培养3-4天，每天检测葡萄糖浓度和L-乳酸浓度变化。发酵结束后，比较150株菌种的木聚糖消耗速率和乳酸产生速率、乳酸的转化率以及杂酸含量。

2)选择木聚糖代谢速率快、乳酸浓度高、转化率高以及杂酸含量少的菌种为最终菌种，命名为Li菌。

4.遗传稳定性试验

将Li-2013-01菌株在斜面上连续十次传代，并用摇瓶复筛的方法检测每次传代后的发酵情况。实验发现，在斜面上连续十次传代，该菌种性状没有明显变化，各项性能指标都正常，说明该菌种的遗传稳定性较强。

本发明提供的黑曲霉Aspergillus niger Li-2013-03是由天津工业大学实验室保藏的一株产纤维素酶的黑曲霉Aspergillus niger Li-2010经亚硝基胍多轮诱变筛选，然后对优良菌株经发酵性能测试筛选得到产高活力纤维素酶的黑曲霉菌株Aspergillus nigerLi-2013-03。

本发明提供的产高活力纤维素酶的菌株具体为黑曲霉Aspergillus niger Li-2013-03。该菌株已于2013年7月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101），保藏号为CGMCCNO.7927。

本发明黑曲霉菌株Aspergillus niger Li-2013-03(CGMCC No.7927)具有以下微生物学特征：

1、形态学特征：

黑曲霉菌株CGMCC No.7927，生物学形态为包括分生孢子、胞梗、顶囊、产胞结构等几部分。分生孢子头球形至辐射形，直径150-450μm，分生孢子梗发生于基质。胞梗茎1000-3000(长度)×12-20(直径)μm，黄色或黄褐色，壁平滑；顶囊球形或近似球形，直径45-75μm，表面全面可育；产胞结构双层，梗基10-20(长度)×4.5-7.0(直径)μm，瓶梗6-10(长度)×2.5-3.5(直径)μm，分生孢子球形或近球形，直径3-4.5μm，褐色，壁粗糙。

2、培养学特征：

菌株在麦芽汁琼脂培养基上生长迅速，28℃4天孢子可铺满斜面；质地丝绒状或稍带絮状；分生孢子结构大量，褐黑色，无渗出液；菌落反面略带黄色。

3、生理生化特征：

黑曲霉菌株CGMCC No.7927可在玉米秸秆、稻草、木屑、马铃薯、玉米粉、可溶性淀粉、糖蜜等碳源上生长，最适pH范围5-6，最适生长温度范围28-33℃，最适产酶温度范围28-30℃。

本发明黑曲霉菌株CGMCC No.7927的筛选技术路线为：出发菌株→斜面培养→孢子悬液的制备→诱变处理→平板分离→初筛→复筛→遗传稳定性测定→扩大实验（发酵性能测定）。

按诱变筛选方案，对突变株逐级筛选淘汰，最后对优良菌株经发酵性能测试筛选，得到一株高产酶性能菌株黑曲霉菌Aspergillus niger Li-2013-03，发酵96小时后纤维素酶的外切β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和滤纸酶活力分别达到620U/mL、1289U/mL、456U/mL和732U/mL。

28℃发酵4天直径75mm，发酵液纤维素酶的的外切β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和滤纸酶活力分别达到620U/mL、1289U/mL、456U/mL和732U/mL，分别比出发菌株提高了9.21倍、7.43倍、8.15倍和10.31倍。

产高活力纤维素酶菌株的筛选方法，包括以下步骤：

1)斜面培养：将原始黑曲霉菌株Aspergillus niger Li-2010划线接种斜面培养基，30℃培养2～3d，直至菌丝体成熟、产大量黑色孢子。所述斜面培养基组成如下：12OBrix麦芽汁l000mL，pH值自然，121℃灭菌20min；

2)孢子悬液制备（以下步骤均在无菌条件下操作）：向试管斜面加入15mL无菌水，把孢子刮下，用滤纸过滤，将滤过液倒入已灭菌、并加有5-10粒无菌玻璃珠的150mL三角瓶中，将三角瓶放入摇床振荡10-15min，使孢子分散。

3)亚硝基胍（NTG）诱变

①用无菌水将孢子悬浮液调节为稀释成106-107个/mL。

②取10mL菌悬液转移至100mL三角瓶中，加入10mg的NTG，配制成终浓度为10mg/mL的NTG溶液，并加入4-5滴丙酮，以利于NTG溶解。

③在30℃下200rpm振荡反应30min，5000rpm离心10min收集菌体，用无菌生理盐水洗涤数次，中止反应。

④适当稀释将孢子浓度调节为103个/mL，取最后稀释度的菌液0.2mL，稀释涂布于纤维素-刚果红平板筛选培养基上。在30℃培养2～3天后挑取透明圈/菌落直径较大的菌株200支。（所述纤维素-刚果红平板筛选培养基组成如下：纤维素粉10g、刚果红0.2g、硫酸铵5g、硫酸镁0.25g、磷酸二氢钾1g、氯化钠0.1g、明胶2g、琼脂20g、自来水定容1000mL，pH值5-6，121℃灭菌20min）。

⑤复筛：将获得的200株菌分别用无菌牙签接种于斜面培养基，30℃培养至孢子铺满斜面。分别将孢子以无菌水洗下接种于装有50mL复筛培养基的250mL三角瓶中进行发酵，接种量10％（v/v），30℃、100r/min培养96h，分别测定各菌株的纤维素酶活性。（所述复筛培养基组成如下：纤维素粉50g、硫酸铵5g、硫酸镁0.25g、磷酸二氢钾1g、氯化钠0.1g、自来水定容1000mL，pH值5-6，121℃灭菌20min）。选取纤维素酶酶活力最高的菌株进行放大实验。

4)遗传稳定性试验

将Li-2013-03菌株在斜面上连续十次传代，并用摇瓶复筛的方法检测每次传代后的发酵情况。实验发现，在斜面上连续十次传代，该菌种性状没有明显变化，各项性能指标都正常，说明该菌种的遗传稳定性较强。

5)放大试验

①种子培养：将纤维素酶酶活力最高的菌株Aspergillus niger Li-2013-03接入500mL三角瓶中，种子培养基装量100毫升，30℃、150rpm摇床培养72-96h。

②种子罐培养：将种子液以10%（v/v）接种量接入装有7.5L发酵液的10L发酵罐中，控制pH值恒定为6.0±0.2，培养温度30±0.1℃，搅拌速度300rpm，通风量（v/v）1:0.8-1.2,培养时间96h，溶解氧20-30%。所述发酵培养基组成为：纤维素粉100g、硫酸铵5g、硫酸镁0.25g、磷酸二氢钾1g、氯化钠0.1g、自来水定容1000mL，pH值5-6，121℃灭菌20min。

发酵结束后，取发酵上清液（粗酶液）进行酶活力检测经测定，菌株Aspergillus nigerLi-2013-03的外切β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和滤纸酶活力分别达到620U/mL、1289U/mL、456U/mL和732U/mL，分别比出发菌株Aspergillus niger Li-2010提高了9.21倍、7.43倍、8.15倍和10.31倍。

实施例2

一种微生物肥料，重量份数组成为：黑曲霉培养物20份、解磷巨大芽孢杆菌4份、植物乳杆菌剂15份，枯草芽孢杆菌菌剂30份。

枯草芽孢杆菌剂的制备方法：

发酵液的获得：采用斜面菌种逐级扩培获得枯草芽孢杆菌发酵液；

（1）一级种子培养：将枯草芽孢杆菌斜面菌种接入500毫升摇瓶中，培养基装量100毫升，旋转式摇床180转/分，培养温度30℃，培养时间24小时；

（2）二级种子培养：将一级种子按照10%的接种量接入500毫升二级种子摇瓶中，培养条件与一级种子相同；

（3）三级种子培养：将二级种子以10%接种量接入5000毫升三级种子摇瓶中，培养基装量1000毫升，旋转式摇床100转/分，培养温度30℃，培养时间24小时；

（4）一级种子罐培养：将三级种子以10%接种量接入总容积为150L的一级种子罐，发酵培养基装量100L，培养温度28℃，搅拌速度100转/分，通风量（V/V）1:0.5,罐压0.05MPa,培养时间24小时；

（5）发酵培养：将一级种子罐菌种以10%接种量接入总容积为1.5吨二级种子罐，发酵培养基装量1吨，培养条件培养温度28℃，搅拌速度100转/分，通风量（V/V）1:0.5,罐压0.05MPa,培养时间24小时。发酵液采用常规离心冷冻干燥方法获得枯草芽孢杆菌剂。

培养基组成：葡萄糖6%,酵母提取物1%,蛋白胨0.2%，CaCO₃1%,pH6.8。

植物乳杆菌剂的制备方法：

（1）一级种子培养：将植物乳杆菌菌种接入500毫升摇瓶中，培养基装量100毫升，培养温度30℃，培养时间24小时；

（2）二级种子培养：将一级种子按照10%的接种量接入500毫升二级种子摇瓶中，培养条件与一级种子相同；

（3）三级种子培养：将二级种子以10%接种量接入5000毫升三级种子摇瓶中，培养基装量1000毫升，培养温度30℃，培养时间24小时；

（4）一级种子罐培养：将三级种子以5%接种量接入总容积为150L的一级种子罐，发酵培养基装量100L，培养温度30℃，罐压0.05MPa,培养时间18小时；

（5）发酵罐培养：将一级种子罐菌种以5%接种量接入总容积为3吨二级种子罐，发酵培养基装量2吨，培养条件培养温度30℃，罐压0.05MPa,培养时间22小时。发酵完毕发酵液经低温负压真空浓缩到原体积的45%，得到菌浓缩液。添加载体：向浓缩液中添加混合好的载体，混合均匀；浓缩液与载体的重量比为0.5:1，载体组成为：CaCO₃25份，糊精12份,流化床干燥，干燥温度50℃。

培养基组成为：酪蛋白胨1%,牛肉提取物1%,酵母提取物0.5%,葡萄糖0.5%,乙酸钠0.5%,柠檬酸二胺0.2%,Tween800.1%,K₂HPO₄0.2%,MgSO₄.7H₂O0.02%,MnSO₄.H₂O0.005%,CaCO₃2%,琼脂1.5%,pH6.8。

黑曲霉培养物的制备方法：

斜面菌种活化培养：将黑曲霉斜面菌种转接到斜面培养基上，27℃培养3天。

固体一级种子培养：挑取黑曲霉斜面菌种接入装有100克培养基的500毫升三角瓶中进行种子培养，30℃培养3天即可。

固体二级种子培养：将上述培养好的固体一级种子搅拌为碎块后加入装有1000克培养基的5000毫升三角瓶中进行种子培养，培养条件：30℃培养3天即可。

固体发酵培养：将二级摇瓶种子粉碎，加入装有灭菌培养基的发酵池或托盘中混合均匀后培养，曲料培养温度控制在26-35℃，湿度80-90%，每隔10小时翻料一次，培养时间5-7天；固体曲料的培养采用常用曲料培养技术；待培养料长满菌丝即可结束培养，培养基预先经高温蒸煮灭菌处理，灭菌条件控制温度121℃，时间1小时。

干燥粉碎：发酵结束培养料在流化床或其他干燥设备上进行干燥，干燥温度控制在60℃，干燥到水分含量在10%以下，然后将固体培养料进行粉碎，物料粉碎孔径在60目以上。

培养基组成：固体原料:麸皮70%,粉碎的作物秸秆15%,豆饼粉5%,玉米淀粉10%，添加等量自来水；初始pH自然。

实施例3

一种微生物肥料，重量份数组成为：黑曲霉培养物22份、解磷巨大芽孢杆菌3份、植物乳杆菌剂18份，枯草芽孢杆菌菌剂32份。

一种生产微生物肥料的方法，将黑曲霉培养物、解磷巨大芽抱杆菌、植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌按比例组合为微生物肥料。

枯草芽孢杆菌剂培养制备：从斜面转接培养枯草芽孢杆菌，逐级扩培后的种子液转接入发酵罐中，发酵完毕发酵液经过板框过滤、干燥后获得枯草芽孢杆菌培养物。

植物乳杆菌剂的制备：从斜面转接培养植物乳杆菌，逐级扩培后的种子液转接入发酵罐中，发酵完毕发酵液经低温负压真空浓缩到原体积的45%，得到菌浓缩液。添加载体：向浓缩液中添加混合好的载体，混合均匀；浓缩液与载体的重量比为0.6:1，载体组成为：CaCO330份，糊精16份。流化床干燥，干燥温度50℃。

黑曲霉培养物制备：菌种培养，固体发酵培养：孢子液接种到固态发酵培养料中，30℃培养至菌丝长满培养料，低温流化床35℃干燥，粉碎干燥物。

实施例4

产品效果实验

试验地的选择与试验设计：试验于2012年3月27日—10月30日在宁夏盐池县花马池镇八堡村进行。

试验田达到田种植玉米10亩，分别在种植时使用本发明产品每亩0.1公斤，出苗1个月左右通过锄地松土方式使用发明产品0.6公斤，对照组使用常规肥料。

发明产品使用玉米地玉米产量达到680公斤，对照组达到490公斤；该地块在第2年种植春小麦，春小麦产量达到了410公斤，比对照组单产提高了21%。且试验田土壤结构良好，无大块和板结。

Claims (5)

1.一种微生物肥料的制备方法，包括如下步骤：将黑曲霉培养物、解磷巨大芽孢杆菌、植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌按比例混合为微生物肥料；

所述微生物肥料的重量份数组成为：黑曲霉培养物18-26份、解磷巨大芽孢杆菌3-5份、植物乳杆菌剂10-20份，枯草芽孢杆菌菌剂25-36份；所述枯草芽孢杆菌保藏号为CGMCCNo.7926，所述黑曲霉保藏编号为CGMCC NO.7927，所述植物乳杆菌保藏编号为CGMCC No.7928；

所述枯草芽孢杆菌剂的制备方法如下：采用斜面菌种逐级扩培获得枯草芽孢杆菌发酵液，发酵液分离干燥获得；

植物乳杆菌剂的制备方法如下：从斜面转接培养植物乳杆菌，逐级扩培后的种子液转接入发酵罐中，发酵完毕发酵液经低温负压真空浓缩到原体积的45%，得到菌浓缩液；添加载体：向浓缩液中添加混合好的载体，混合均匀；浓缩液与载体的重量比为0.5-0.7:1，载体组成为：CaCO₃20-40份，糊精10-20份；流化床干燥，干燥温度50℃；

所述黑曲霉培养物的制备方法如下：固体发酵培养结束培养料在流化床或其他干燥设备上进行干燥，干燥温度控制在60℃，干燥到水分含量在10%以下，然后将固体培养料进行粉碎，物料粉碎孔径在60目以上。

2.根据权利要求1所述的一种微生物肥料的制备方法，其特征在于，微生物肥料重量份数组成为：黑曲霉培养物20份、解磷巨大芽孢杆菌4份、植物乳杆菌剂15份，枯草芽孢杆菌菌剂30份。

3.根据权利要求2所述的一种微生物肥料的制备方法，其特征在于，枯草芽孢杆菌剂的制备方法如下：

发酵液的获得：采用斜面菌种逐级扩培获得枯草芽孢杆菌发酵液；

（1）一级种子培养：将枯草芽孢杆菌斜面菌种接入500毫升摇瓶中，培养基装量100毫升，旋转式摇床180转/分，培养温度30℃，培养时间24小时；

（2）二级种子培养：将一级种子按照10%的接种量接入500毫升二级种子摇瓶中，培养条件与一级种子相同；

（3）三级种子培养：将二级种子以10%接种量接入5000毫升三级种子摇瓶中，培养基装量1000毫升，旋转式摇床100转/分，培养温度30℃，培养时间24小时；

（4）一级种子罐培养：将三级种子以10%接种量接入总容积为150L的一级种子罐，发酵培养基装量100L，培养温度28℃，搅拌速度100转/分，通风量（V/V）1:0.5,罐压0.05MPa,培养时间24小时；

（5）发酵培养：将一级种子罐菌种以10%接种量接入总容积为1.5吨二级种子罐，发酵培养基装量1吨，培养条件培养温度28℃，搅拌速度100转/分，通风量（V/V）1:0.5,罐压0.05MPa,培养时间24小时；发酵液采用常规离心冷冻干燥方法获得枯草芽孢杆菌剂；

培养基组成：葡萄糖6%,酵母提取物1%,蛋白胨0.2%，CaCO₃1%,pH6.8；

植物乳杆菌剂的制备方法如下：

（1）一级种子培养：将植物乳杆菌菌种接入500毫升摇瓶中，培养基装量100毫升，培养温度30℃，培养时间24小时；

（2）二级种子培养：将一级种子按照10%的接种量接入500毫升二级种子摇瓶中，培养条件与一级种子相同；

（3）三级种子培养：将二级种子以10%接种量接入5000毫升三级种子摇瓶中，培养基装量1000毫升，培养温度30℃，培养时间24小时；

（4）一级种子罐培养：将三级种子以5%接种量接入总容积为150L的一级种子罐，发酵培养基装量100L，培养温度30℃，罐压0.05MPa,培养时间18小时；

（5）发酵罐培养：将一级种子罐菌种以5%接种量接入总容积为3吨二级种子罐，发酵培养基装量2吨，培养条件培养温度30℃，罐压0.05MPa,培养时间22小时；发酵完毕发酵液经低温负压真空浓缩到原体积的45%，得到菌浓缩液；添加载体：向浓缩液中添加混合好的载体，混合均匀；浓缩液与载体的重量比为0.5:1，载体组成为：CaCO₃25份，糊精12份,流化床干燥，干燥温度50℃；

培养基组成为：酪蛋白胨1%,牛肉提取物1%,酵母提取物0.5%,葡萄糖0.5%,乙酸钠0.5%,柠檬酸二胺0.2%,Tween800.1%,K₂HPO₄0.2%,MgSO₄.7H₂O0.02%,MnSO₄.H₂O0.005%,CaCO₃2%,琼脂1.5%,pH6.8；

黑曲霉培养物的制备方法如下：

斜面菌种活化培养：将黑曲霉斜面菌种转接到斜面培养基上，27℃培养3天；

固体一级种子培养：挑取黑曲霉斜面菌种接入装有100克培养基的500毫升三角瓶中进行种子培养，30℃培养3天即可；

固体二级种子培养：将上述培养好的固体一级种子搅拌为碎块后加入装有1000克培养基的5000毫升三角瓶中进行种子培养，培养条件：30℃培养3天即可；

固体发酵培养：将二级摇瓶种子粉碎，加入装有灭菌培养基的发酵池或托盘中混合均匀后培养，曲料培养温度控制在26-35℃，湿度80-90%，每隔10小时翻料一次，培养时间5-7天；固体曲料的培养采用常用曲料培养技术；待培养料长满菌丝即可结束培养，培养基预先经高温蒸煮灭菌处理，灭菌条件控制温度121℃，时间1小时；

干燥粉碎：发酵结束培养料在流化床或其他干燥设备上进行干燥，干燥温度控制在60℃，干燥到水分含量在10%以下，然后将固体培养料进行粉碎，物料粉碎孔径在60目以上；

培养基组成：固体原料:麸皮70%,粉碎的作物秸秆15%,豆饼粉5%,玉米淀粉10%，添加等量自来水；初始pH自然。

4.根据权利要求1所述的一种微生物肥料的制备方法，其特征在于，微生物肥料重量份数组成为：黑曲霉培养物22份、解磷巨大芽孢杆菌3份、植物乳杆菌剂18份，枯草芽孢杆菌菌剂32份。

5.根据权利要求4所述的一种微生物肥料的制备方法，其特征在于，植物乳杆菌剂的制备方法如下：从斜面转接培养植物乳杆菌，逐级扩培后的种子液转接入发酵罐中，发酵完毕发酵液经低温负压真空浓缩到原体积的45%，得到菌浓缩液；添加载体：向浓缩液中添加混合好的载体，混合均匀；浓缩液与载体的重量比为0.6:1，载体组成为：CaCO330份，糊精16份；流化床干燥，干燥温度50℃。