[go: up one dir, main page]

CN105899666B - 糖修饰的核酸分子 - Google Patents

糖修饰的核酸分子 Download PDF

Info

Publication number
CN105899666B
CN105899666B CN201580003755.XA CN201580003755A CN105899666B CN 105899666 B CN105899666 B CN 105899666B CN 201580003755 A CN201580003755 A CN 201580003755A CN 105899666 B CN105899666 B CN 105899666B
Authority
CN
China
Prior art keywords
nucleoside
nucleic acid
molecule
rna
cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201580003755.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN105899666A (zh
Inventor
T·卡雷尔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Baseclick GmbH
Original Assignee
Baseclick GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Baseclick GmbH filed Critical Baseclick GmbH
Publication of CN105899666A publication Critical patent/CN105899666A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105899666B publication Critical patent/CN105899666B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8218—Antisense, co-suppression, viral induced gene silencing [VIGS], post-transcriptional induced gene silencing [PTGS]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/02—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with ribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8206—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by physical or chemical, i.e. non-biological, means, e.g. electroporation, PEG mediated
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C12N2310/141—MicroRNAs, miRNAs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

本发明涉及使用缀合物转染细胞，该缀合物包含至少一个糖残基和至少一个选自核酸、核苷和核苷酸的核苷组分。该缀合物适于以高效率转染原核和真核细胞，例如植物细胞或包括人细胞在内的哺乳动物细胞。因此,为治疗分子提供了新的递送载体，所述治疗分子包括反义分子、siRNA分子、miRNA分子、antagomirs或这样的分子的前体以及所述的治疗性的核苷或核苷酸。进一步提供了用于发展展示特定性状的新的植物品系的方便的策略。

Description

糖修饰的核酸分子
本发明涉及使用包含至少一个糖残基和至少一种选自核酸、核苷和核苷酸的核苷组分的缀合物转染细胞。该缀合物适用于高效转染原核和真核细胞，例如植物细胞或哺乳动物细胞，包括人细胞。因此，为治疗分子提供了新的递送载体，所述治疗分子包括转录物、信使RNA、反义分子、siRNA分子、miRNA分子、antagomirs或这样的分子的前体以及所述的治疗性的核苷或核苷酸。进一步提供了用于发展展示特殊的性状的新的植物品系的方便的策略。
RNA干扰是强有力的工具，其利用短的RNA双链来抑制特定的蛋白质在细胞中的形成(1-3)。本质上，所述的沉默RNA分子是通过切酶复合体切割，由较大的转录物产生的(4)。然而对于生物技术应用，所述的RNA分子(siRNA)是以化学方法制备和施用的。在最近的十年，使用siRNA作为治疗剂的思想(5)受到强烈地追求，但是所述的主要障碍：RNA双链体的差的细胞摄取不能被克服(6)。目前，不同的RNA递送系统例如纳米颗粒(7，8)、脂质体(9，10)或聚阳离子聚合物(11)处于密集的研究之下。尽管在所述领域有实质性进展，然而，所述的经常还很高的毒性(12-14)和低的细胞的特异性代表了还没有被解决的问题。
最近，受体介导的细胞内吞作用已经逐渐成为备选的递送策略(16-25)，其允许把所述的siRNA靶向特殊细胞类型。所述的方法要求把所述的siRNA连接到与细胞类型特异性的受体结合的配体。这引发内化作用加工，导致RNA-配体缀合物的摄取。目前，采用胆固醇修饰的RNA最成功地实施了所述的策略(24)。
PCT/EP2013/064610(通过引文把它的公开内容并入本文中)描述了缀合物，其中使多不饱和脂肪酸残基(例如花生四烯酸残基)与核苷组分共价结合。这些缀合物特别地可用于与其中存在大麻素受体的细胞接触。特别是，可以使用该缀合物转染神经元细胞和免疫细胞。然而，仍然需要转染敏感细胞以及特别到目前为止难以转染的那些细胞的方便的策略。
在本发明中发现，采用糖修饰的寡核苷酸可以使存在于原核和真核细胞两者的细胞膜中的糖转运蛋白被有效地靶向。相应的受体介导的策略可以被成功地用于转染多种敏感细胞。
本发明的第一个方面是包含糖残基和至少一种核苷组分的缀合物在转染细胞中的用途。
术语”缀合物”也包括盐，特别是药学上可接受的盐，例如与无机的或有机的酸或碱的加成盐，正如本领域公知的那样。.
根据本发明优选的方面，所述的缀合物包含糖残基和与其共价结合的至少一种核苷组分。根据另一个方面，根据本发明使用的缀合物可以包含至少一种核苷组分和与其非共价结合的糖修饰的化合物。术语”糖修饰的化合物”是指包含至少一个糖残基并且能够与核苷组分非共价结合(例如经由静电相互作用)的任何化合物。糖修饰的化合物的实例是聚阳离子物质，例如包含至少一个糖残基的阳离子型聚合物或阳离子型脂质体，其可以与聚阴离子核酸分子形成离子型缀合物。所述的糖残基可以与所述的化合物共价或非共价连接。
用于本发明中的缀合物包含至少一个糖残基，特别地1-10个，更特别地1-5个糖残基。甚至更特别地，所述的缀合物包含1或2个糖残基。最特别地，所述的缀合物包含1个糖残基。如果所述的缀合物包含超过一个糖残基，则所述的糖残基可能是相同的或不同的。
与所述的糖残基相连的所述的核苷组分可以选自核酸、核苷和核苷酸。
在更具体的实施方式中，与所述的糖残基相连的所述的核苷组分是核酸分子，更特别地是RNA分子。
所述的缀合物包含至少一个核苷组分，特别地包含1-25，更特别地包含2-20或2-10，并且甚至更特别地包含2-8，即2、3、4、5、6、7或8个核苷组分。如果所述的缀合物包含超过一个核苷组分，则所述的核苷组分可以是相同的或不同的。
在一种实施方式中，所述的缀合物可以包含:
(i)一个糖残基和一个核苷组分，例如一个核酸分子，
(ii)多个糖基和一个核苷组分，例如一个核酸分子，
(iii)一个糖残基和多个核苷组分，例如多个核酸分子，或
(iv)多个糖残基和多个核苷组分，例如多个核酸分子。
在更具体的实施方式中，所述的缀合物包含1个糖残基和2-20，特别是2-8，即2、3、4、5、6、7或8个核苷组分。
在一种实施方式中，所述的缀合物可以具有线型结构。因此，核苷组分可以被连接成直链，其中糖残基可以存在于所述的链之内、在所述的链的一端或在所述的链的两端。
在另一种实施方式中，所述的缀合物具有分支结构，其中核苷组分经由分枝的接头(例如树枝状的接头)与糖残基结合。
术语“糖残基”包括单糖、二糖和寡糖。单糖残基的实例是葡萄糖、甘露糖、半乳糖、核糖、阿拉伯糖、果糖、岩藻糖和唾液酸。二糖包括例如蔗糖、乳糖、海藻糖和麦芽糖。按照本发明，能被作为糖残基使用的寡糖包括线性的、分枝的或环状的寡糖。所述的寡糖典型地包含小数目(三至九)的单糖单元。环状的寡糖的特别优选的实例是环糊精。
可以使所述的糖残基与至少一种核苷组分共价结合。优选地，使所述的糖残基经由接头与所述的至少一种核苷组分结合。所述的接头可以是线性的或分枝的接头并且通常具有2-50个原子的链长，包括碳原子以及特别是杂原子(例如S、N和/或O-原子)在内。
例如，所述的接头可以是线性的接头，例如包含至少一个(例如1-10个，特别地2-5个以及更特别地3个)C1-C3烯化氧基团(特别地氧化乙烯基团)的接头。
备选地，所述的接头可以是分枝的，例如树枝状的接头。
可以经由已知的接头技术，把所述的糖残基连接到所述的至少一种核苷组分。然而优选地，所述的连接涉及Click反应，例如在叠氮化物和炔基团之间、在受限的链烯(例如降冰片烯)和腈亚胺、腈氧化物或四嗪之间，从而导致由所述的Click反应形成的环状基团，特别地1,2,3-三唑基团。
在一种具体的实施方式，根据本发明使用的所述的缀合物由通式(Ia)或(Ib)表示:
Fn—(Lm-N)r (Ia)
Fn—(Lm-N)r—Lm-Fn (Ib)
其中F是糖残基，
L是接头，
N是核苷组分，其选自核酸、核苷和核苷酸，
n是1-10，优选地1–5，更优选地为1的整数，，
m是0或1，
r是1-25，优选地2-20以及更优选地2-8的整数。
在这个实施方式中，所述的缀合物可以由结构例如下列的结构代表:
F—L—N
F—(L—N)r
其中F、L、N和r如上文定义，
F—L*—(N)r
其中L*是分枝的接头，并且F、N和r如上文定义，
F—(L—N)r—L—F
其中F、L、N和r如上文定义。
在另一种实施方式中，所述的缀合物可以包含与所述的至少一种核苷组分共价结合的另一受体配体。所述的另一受体配体是不同于糖残基的化合物，例如叶酸、胆固醇、激素或多不饱和脂肪酸残基，特别是花生四烯酸残基，例如花生四烯酸乙醇胺。
在这个实施方式，所述的缀合物可以由具有所述的通式(II)的结构代表:
Fn—(Lm—N)r—Lm—Zs (II)
其中
F是糖残基，
L是接头，
n是1-10，优选地1-5，更加优选地为1的整数，
m是0或，
N是核苷组分，其选自核酸、核苷和核苷酸，
r是1-25，优选地2-20以及更优选地2-8的整数，
Z是另一受体配体，并且
s是1-10，优选地1-5，更加优选地为1的整数。
在这个实施方式中，所述的缀合物可以由结构例如下列的结构代表:
F—L—N—Z
F—(L—N)r—L—Z
其中F、L、N、Z和r如上文定义，
F—L*—(N)r—L—Z
L*是分枝的接头，并且F、L、N、Z和r如上文定义。
用于本发明中的所述的缀合物包含至少一种选自核酸、核苷和核苷酸的核苷组分。
术语”核酸”包括单链的和双链的核酸分子，例如DNA分子或RNA分子以及其类似物。核酸的类似物是包含至少一个如下所述的修饰的结构单元的核酸分子。
在一种实施方式中，所述的核酸分子是可以包含至少一个修饰的结构单元的DNA分子。术语“DNA分子”包括单链或双链DNA分子。在双链DNA分子中，所述的单条链可以以分开的分子存在或经由单链环或经由异质的接头被共价连接。
术语“DNA分子”包括由天然的DNA结构单元(即2’-脱氧核糖核苷酸结构单元)组成的分子以及包含至少一个修饰的结构单元的分子。
在进一步的实施方式中，所述的核酸分子是RNA分子，其可以包含至少一个修饰的结构单元。术语“RNA分子”包括单链或双链RNA分子，其中双链RNA分子可以具有至少一个突出端，例如至少一个3’-突出端。在双链RNA分子中，所述的单条链可以以分开的分子形式存在或经由单链环或经由异质的接头被共价连接。
术语“RNA分子”包括由天然的RNA结构单元(即2’-核糖核苷酸结构单元)组成的分子以及包含至少一个修饰的结构单元的分子。
修饰的结构单元可以选自糖-、主链-和/或核碱基-修饰的结构单元。糖-修饰的脱氧核糖核苷酸包含不同于脱氧核糖的糖基团，例如修饰的脱氧核糖基团，其中所述的2’-氢基团被选自下列的基团替代:OH、R、OR、卤素、SH、SR、NH2、NHR、NR2或CN，其中R是C1-C6烷基或烷氧基或C2-C6烯基或炔基，并且卤素是F、Cl、Br、I。2’-H修饰的具体实例是2’-F和2’-O甲基。糖-修饰的核糖核苷酸包含不同于核糖的糖基团，例如修饰的核糖基团，其中所述的2’-OH基团被选自下列的基团替代:H、R、OR、卤素、SH、SR、NH2、NHR、NR2或CN，其中R是C1-C6烷基或烷氧基或C2-C6烯基或炔基，并且卤素是F、Cl、Br、I。2’-OH修饰的具体实例是2’-F和2’-O甲基。在主链-修饰的结构单元中，所述的连接相邻结构单元的磷酸酯基团可以被修饰的连接基团(例如硫代磷酸酯基团)替代。在核碱基-修饰的结构单元中，可以存在非天然发生的核碱基代替天然发生的核碱基。嘌呤或嘧啶核碱基的相应的类似物是本领域熟知的。应该注意到以上所述修饰可以组合。
所述的核酸分子优选地选自适于药物应用的核酸分子，特别地选自反义分子或能够介导RNA干扰的RNA分子，例如siRNA分子或其前体。更多的合适的RNA分子包括miRNA分子、antagomirs、核酶以及其前体。也优选RNA-转录物，例如特别是mRNA。
术语“核苷组分”也包括核苷或核苷酸以及其类似物。核苷是包含核碱基和糖基团的化合物。核苷酸化合物是包含核碱基、糖基团和磷酸酯基的化合物。本发明也包括糖-、磷酸酯-和核碱基-修饰的化合物，特别是适于治疗癌症和/或病毒感染的核苷或核苷酸类似物治疗剂，例如AZT、阿昔洛韦、更昔洛韦、伐昔洛韦、吉西他滨、阿糖胞苷等等。
可以经由所述的分子的核碱基、糖或磷酸基，使所述的核苷组分与所述的糖残基相连。如果所述的化合物是核酸，可以经由存在于所述的核酸分子中的结构单元，特别地经由末端结构单元，即位于核酸链的5’-或3’-端的结构单元，使所述的核苷组分连接。在优选的实施方案中，所述的连接经由存在于核酸分子(特别是RNA分子)中的修饰的末端核碱基发生。根据特别优选的实施方案，所述的糖残基与所述的RNA转录物(例如特别是mRNA)的5’-或3’-末端结构单元共价结合。这些缀合物被证明是尤其适于转染植物细胞并且赋予目的植物任何期望的性状。
在优选的实施方案中，所述的与所述的糖残基的共价连接可以被连接到存在于所述的核苷组分中的核碱基，例如DNA或RNA分子的结构单元的核碱基，例如连接到嘌呤碱基的位置8或嘧啶碱基的位置5。
核酸分子，例如DNA或RNA分子通常具有从5、10、12、15或18个结构单元到多达25、30、50或100个结构单元或更多的长度。可以通过化学合成或通过酶促法，从核酸模板(例如通过转录、通过RNA聚合酶催化的(例如通过T3、T7或SP6RNA聚合酶)，或通过DNA复制或通过反转录)制备所述的核酸分子。优选地，在化学合成或酶催化合成期间掺入结构单元，其包含官能团，例如Click官能团，例如末端炔基团或叠氮基、受限的烯烃基团(例如降冰片烯基团)、腈氧化物基团、腈亚胺基团或四嗪基团。在具体的实施方式中，掺入了通过包括末端炔基团(任选地经由接头)而被修饰的结构单元。把Click修饰的结构单元引入核酸分子中的方法被描述在WO2006/117161和WO2008/052775中，通过引文把它们的内容掺入本文中。可以按照已知的方法，使所述的核苷组分上的所述官能团和与所述的多不饱和脂肪酸残基相连的互补的官能团偶联。优选地，通过例如Click反应，采用互补的Click功能性反应基(例如叠氮基)进行所述的偶联。
备选地，可以在固相合成期间，按照标准方法，例如使用亚磷酰胺结构单元，把与所述的糖残基相连的修饰的核酸结构单元引入核酸(例如RNA)分子中。
可以从具有通式(V)的试剂制备根据本发明使用的缀合物:
Fn—(L’)m-(RG1)r (V)
其中F、n、m和r如上文定义，
L’是接头，并且
RG1是反应基，特别是Click-反应基，例如叠氮基(或炔基团)。
用于生产根据本发明使用的核酸缀合物的另一试剂由通式(VI)表示:
BB—(L)m—Fn (VI)
其中F、L、n和m如上文定义，并且
BB是用于合成核酸分子的结构单元，例如三磷酸核苷，或适于固相合成的结构单元，例如亚磷酰胺。
本发明的进一个的方面是生产缀合物的方法，其中使糖残基与RNA转录物(例如mRNA)的3’-或5’-端共价结合，所说的方法包括:
(i)使所述的试剂(V)与至少一种修饰的核苷组分(VII)偶联
(N’)r—(L”)m–RG2 (VII)
其中N’是RNA分子，例如mRNA分子，
L”是接头，
r和m如上文定义，
RG2是能够与RG1起反应的反应基，特别是Click反应基，例如炔基团(或叠氮基)，从而形成所述的缀合物，或
(ii)使所述的试剂(V)与至少一种修饰的核酸结构单元(VIII)偶联
BB—(L”)m—RG2 (VIII)
其中BB是用于合成RNA分子的结构单元，
L”是接头，
m是0或1，并且
RG2如上文定义，
从而形成所述的试剂(VI)，并且把所述的试剂(VI)掺入RNA分子中，例如通过化学合成或酶促合成，从而形成所述的缀合物。
本发明的进一步的方面涉及在细胞或有机体中介导靶特异性的核酸修饰的方法，其包括下列所述的步骤:
(a)使细胞或有机体与本发明所述的缀合物在其中可以发生靶特异性的核酸修饰的条件下接触，并且
(b)介导靶特异性的核酸修饰，它是通过所述的缀合物的所述的核苷组分朝向靶核酸进行的。
接触步骤(a)可以包括把所述的缀合物引入靶细胞(例如分离的靶细胞)中，该细胞可以存在于细胞培养物、单细胞的微生物或靶细胞或在多细胞生物之内的许多靶细胞中。所述的靶细胞优选地是真核细胞，特别是哺乳动物细胞，包括人细胞或植物细胞。所述的靶有机体优选地是植物或哺乳动物有机体，例如人有机体。所述的引入到有机体可以包括肠胃外施用，例如通过注射或输注、跨粘膜施用或透皮施用。在转染植物细胞情况下，意外地发现:如果所述的缀合物被添加到所述的植物的根上，包含糖残基以及与其共价结合的核苷组分的所述的缀合物被植物摄取。因此，把缀合物引入植物中可以包括向所述的根施用所述的缀合物。
介导步骤(b)优选地包括抑制靶核酸，例如当使用siRNA缀合物时，通过RNA干扰，或者当使用反义分子缀合物时，通过抑制mRNA转录，或者通过使用治疗性的核苷/核苷酸缀合物来抑制病毒或肿瘤细胞的复制。
优选地通过受体介导的胞吞作用，更优选地通过糖转运蛋白介导的细胞内吞作用，向靶细胞中引入所述的缀合物。因此，可以在缺乏递送载体和/或转染试剂的情况下，把所述的缀合物引入所述的靶中。
在一种实施方式中，所述的缀合物被用于在体外转染细胞，特别是用于转染植物细胞或哺乳动物细胞，包含在体外转染人细胞。
在另一种优选的实施方案中，所述的缀合物被用于在体外或者在体内转染植物细胞。
已经令人惊奇地发现:本发明所述的缀合物特别适于转染表达糖转运蛋白缀合物的植物细胞。可以成功地把缀合物引入植物细胞中，所述缀合物中糖残基与单链或双链RNA分子(例如mRNA或反义RNA)的5’-或3’-端共价结合。
进一步，其中在上文中描述的，糖修饰的化合物与单链或双链RNA分子非共价结合的缀合物已经显示特别适于转染植物细胞。例如，可以使用包含单链或双链RNA分子和糖修饰的化合物的非共价的缀合物，优选离子型缀合物。
在进一步的实施方式中，本发明所述的缀合物用于医学，特别是人医学，但是也用于兽医学。因此，本发明也提供包含如上所述缀合物作为活性成分以及合适的载体的药物组合物。为了诊断性的或治疗性的应用，所述的药物组合物可以呈溶液的形式，例如用于输注或注射的溶液、乳膏、油膏、片剂、混悬剂等等。可以以任何合适的方式，例如通过肠胃外施用，例如注射或输注，通过跨粘膜应用，或通过透皮应用，或通过口服、局部、鼻、直肠用药等等，来施用所述的组合物。
所述的药物组合物可以包含非微囊剂型(例如无递送载体，例如脂质体和/或无转染试剂)的所述的缀合物作为活化剂。
所述的缀合物可以被用来在细胞或有机体中下调基因，例如病毒的基因或与细胞的疾病相关联的基因，例如致癌基因，或与自身免疫或变态反应病相关联的基因。优选的细胞靶基因是例如所述的syk基因，它是编码脾酪氨酸激酶(SYK)的与自身免疫或变态反应病相关联的基因，它参与IgE依赖性的炎性信号传导级联。所述的人SYK直向同源物被描述在UniProt P 43405中，所述的鼠SYK直向同源物被描述在UniProt P 48025中。进一步优选的靶基因是所述的APP基因，其编码所述的淀粉状蛋白前体蛋白(APP)。所述的人APP直向同源物被描述在UniProt P 05067中。APP被β-或γ分泌酶切割成与阿尔茨海默氏病的发展相关联的神经毒性的片段。优选病毒靶基因是编码所述的单负病毒目的病毒例如埃博拉病毒、麻疹病毒和狂犬病病毒的所述N或P蛋白质的基因。
本发明的进一步的方面是转染细胞(优选地植物细胞)的方法，包括使细胞暴露于如在上文中描述的缀合物。所述的使植物细胞暴露于在本文中定义的缀合物的步骤优选地包括把所述的缀合物添加到植物的根部。能够观察到所述的缀合物然后被所述的植物摄取并且被所述的根转运。特别是，使用本发明所述的方法，可以成功地把其中糖残基与单链或双链RNA分子(例如mRNA或反义RNA)的所述的3’-或5’-端共价结合的缀合物引入植物细胞中。
进一步，在上文中描述的其中糖修饰的化合物与单链或双链RNA分子非共价结合的缀合物已经显示特别适于转染植物细胞。例如，可以使用单链或双链RNA分子和糖修饰的化合物的非共价的(例如离子型)缀合物。因此本发明提供用于发展展示特定的性状的新的植物系的方便的策略。
将会通过下列附图和实施例更详细地描绘本发明。
附图说明
图1
糖修饰的siRNA的化学结构和序列。作为比较实施例，显示了花生四烯酸乙醇胺修饰的siRNA。
图2
葡萄糖修饰的siRNA向植物细胞的递送。添加到拟南芥的根上的葡萄糖修饰的siRNA被所述的植物摄取并且被沿着所述的根转运(Alexa＝Alexa
Figure BDA0001041038240000111
647,LifeTechnologies)。
图3
糖修饰的试剂的合成。所述的反应方案显示葡萄糖叠氮化物(A)和三葡萄糖叠氮化物的制备。
图4
通过铜(I)-催化的叠氮化物-炔环加成作用(CuAAC)合成葡萄糖修饰的siRNA。
图5
在采用针对海肾萤光素酶的葡萄糖修饰的siRNA双链体处理后，与具有花生四烯酸乙醇胺修饰的相同的siRNA(AEA-siRA)相比，在RBL-2H3细胞中海肾萤光素酶的相对表达。在具有11.1mM葡萄糖的培养基中(黑色)或在无葡萄糖的培养基中(绿色)培养所述的细胞。
图6
使用T7RNA聚合酶和γ-葡萄糖标记的GTP的体外转录标记实验的原理。
图7
使用T4RNA连接酶的RNA的区域选择性的化学-酶促标记。
实施例
1.RNA-糖缀合物的合成
如在图4中描述的那样，进行所述的糖修饰的RNA链的合成。所述的合成的中心要素是所述的在炔修饰的RNA链和所述相应的葡萄糖叠氮化物1之间的Cu-催化的炔-叠氮化物click反应(34-39)。为了比较葡萄糖修饰的RNA与其他系统，click方法也用于制备使用三葡萄糖单叠氮化物2制备三葡萄糖-RNA缀合物以及采用所述的β-环糊精单叠氮化物3制备β-环糊精修饰的RNA链。进一步，作为比较实施例，通过使用花生四烯酸乙醇胺单叠氮化物(AEA)4，制备了花生四烯酸乙醇胺修饰的RNA链。各自的糖残基以及花生四烯酸乙醇胺单叠氮化物被显示在图1中。在所有的情形中，在所述的RNA链和所述的各自的配体之间引入短的乙二醇间隔区。在所有的情形中，在RNA链和各自的配体之间引入短的乙二醇间隔基。所述的Click技术确保所述的糖或花生四烯酸乙醇胺分子与RNA的有效连接。另外，所述的方法确保在更难以靠近所述的siRNA双链体的3’-端处有效率的缀合。3’-修饰的siRNA链典型地被所述的RNAi机器(41)更好地容忍。为了实现所述的3’-端连接，在RNA合成期间使用了在C5具有辛二英(octadiine)柄的脱氧尿苷亚磷酰胺。
所述的葡萄糖叠氮化物和三葡萄糖叠氮化物的合成被显示在图3中。在第一步中，为了制备所述的葡萄糖叠氮化物1，使用2’-溴乙醇把乙二醇间隔区引入被保护的葡萄糖衍生物中。在随后的步骤中，在将所述的葡萄糖衍生物去保护而得到葡萄糖叠氮化物1以前，引入叠氮化物官能度。为了合成所述的三葡萄糖叠氮化物，首先从季戊四醇和炔丙基溴制备分枝的接头。随后，在保护所述的剩余醇官能度之后，把三份葡萄糖叠氮化物添加到Click反应在中。将所述的醇官能度去保护并且引入另一种叠氮化物官能度，最后得到所述的三葡萄糖叠氮化物2。
随后使所述的叠氮化物以优良的产率发生click反应而得到包含炔的RNA有义链，如图4中所示。在HPLC提纯之后，使所述的糖修饰的RNA与所述的反义反链杂交而获得在图1中描述的siRNA双链体。
2.RNA-糖缀合物向细胞中的递送
为了显现所述的RNA双链体向活细胞中的递送，最初使所述的糖修饰的RNA有义链与包含荧光素标记(Alexa＝Alexa
Figure BDA0001041038240000131
647，Life Technologies)的反义链杂交。
采用拟南芥细胞研究了所述的葡萄糖修饰的RNA双链体的摄取。把葡萄糖修饰的siRNA添加到拟南芥的根上。在图2中描述的共焦显微术研究显示未修饰的siRNA像期望的那样不能进入所述的细胞。然而，在各自的细胞内容易检测到葡萄糖修饰的siRNA，这证明了摄取和沿着所述的根的转运。用修饰的dsDNA也观察到相同的结果(没有显示)。
为了证明所述的递送的siRNA分子展示所期望的RNAi效果，使用市场上可获得的双萤光素酶报道基因测定法。把包含两种萤光素酶(海肾和萤火虫)的质粒转染到所述的细胞中。通过靶向所述的海肾萤光素酶的表达评价了RNAi，而所述的荧光虫萤光素酶充当内标。为了这些研究，使用了无进一步荧光素修饰的葡萄糖修饰的siRNA。采用未修饰的RNA双链体(没有葡萄糖，没有荧光素)的起始控制实验显示所述的海肾表达不受影响。相比之下，在两种细胞系中都观察到在配体修饰的siRNA存在时海肾表达的剂量依赖性沉默(图5)。最主要的，即使相对低数量的siRNA-配体缀合物也已经显示相当大的效果。
其次评价了与所述的花生四烯酸乙醇胺-siRNA缀合物相比，所述的葡萄糖修饰的siRNA的沉默效力。这个比较的结果被描述在图5中。令人惊奇地，所述的新的葡萄糖修饰的siRNA总是比所述的花生四烯酸乙醇胺体系显著更有效，其确立葡萄糖和其它糖残基作为强大的新的递送工具。
3.使用γ-标记的核苷酸的5’-RNA标记
为了在所述的5’-端标记RNA-转录物，首先在39聚体处制备了带有所述的T7启动子序列的DNA模板，随后制备了短的编码的转录物。这允许不依赖引物的RNA聚合反应，其产生21聚体RNA转录物。由于所述的聚合酶的从头初始化，所述的第一次使用的RNA核苷酸在所述的转录物中仍然充当三磷酸酯，提供了独特的5’-糖标记的转录产物。因为所述的T7RNA聚合酶通常开始于CCn-序列，其产生G-启动转录物，采用葡萄糖-标记的GTP进行所述的实验。尽管存在所述的葡萄糖残基，但是所述的T7-RNA聚合酶接受所述的标记的三磷酸酯并且继续所述的转录加工，以提供所述的期望的葡萄糖标记的产物。
下列编码T7启动子序列和21聚体转录物的编码和模板链是从Metabion购买的。
编码:5’-dATAATACGACTCACTATAGGC
模板:3’-dTATTATGCTGAGTGATATCCGGAAAGTGATGAGGATGGA-5’
在转录之前，在热循环仪(来自Eppendorf的Mastercycler Personal)中把所述的链退火。因此，在缓冲液(100mm NaCl,25mm Tris-HCl,pH＝7.6，在25℃)中，施加下列温度梯度:95℃持续4分钟，随后以2℃/分钟冷却到4℃，把20μm的编码链与20μm的模板链退火。
在0.2mL PCR管中以20μL设置进行体外转录。在转录缓冲液(40mM HEPES pH＝7.4,6mM MgCl2,2mM,10mM DTT)中，向40pmol的所述的杂交的DNA模板中添加400μM ATP、CTP、UTP、20-80μM GTP(对于所述的对照，400μM)和400μM葡萄糖标记的GTP 7d。通过添加一个单位T7RNA聚合酶(New England Biolabs)启动所述的反应，小心地混合，然后在37℃温育。在5个小时之后，通过添加一个体积RNA负荷染料(47.5％甲酰胺，0.01％SDS，0.01％溴酚蓝，0.005％二甲苯蓝，0.5mM EDTA)停止所述的转录，并且在20％变性聚丙烯酰胺凝胶(7M尿素,35mA,1000V)上分析20μL的每个样品，并且使用LAS-3000成像系统(Raytest)显现。为了显现RNA转录物，施加SYBR绿II染色。
4.使用T4RNA连接酶的3’-RNA标记
在ATP的存在下，T4RNA连接酶催化胞嘧啶核苷3’,5’-二磷酸向单链RNA的3’-OH的转移。
因此，可以使单链RNA分子在T4RNA连接酶和ATP存在下与在磷酸基处携带炔部分的标记的胞嘧啶核苷3’，5’-二磷酸反应。随后与叠氮化物修饰的糖残基的click反应(正如在图1中显示的那样)允许制备3’-修饰的单链RNA分子，如图7中显示的那样。
参考文献
(1)Fire,A.Z.Angew.Chem.Int.Ed.2007,46,6966-6984.
(2)Elbashir,S.M.；Harborth,J.；Lendeckel,W.；Yalcin,A.；Weber,K.；Tuschl,T.Nature 2001,411,494-498.
(3)Mello,C.C.Angew.Chem.Int.Ed.2007,46,6985-6994.
(4)Bernstein,E.；Caudy,A.A.；Hammond,S.M.；Hannon,G.J.Nature 2001,409,363-366.
(5)Castanotto,D.；Rossi,J.J.Nature 2009,457,426-433.
(6)Tiemann,K.；Rossi,J.J.EMBO Mol.Med.2009,1,142-151.
(7)Davis,M.E.；Zuckerman,J.E.；Choi,C.H.J.；Seligson,D.；Tolcher,A.；Alabi,C.A.；Yen,Y.；Heidel,J.D.；Ribas,A.Nature 2010,464,1067-1070.
(8)Baigude,H.；McCarroll,J.；Yang,C.S.；Swain,P.M.；Rana,T.M.ACSChem.Biol.2007,2,237-241.
(9)Zimmermann,T.S.；Lee,A.C.H.；Akinc,A.；Bramlage,B.；Bumcrot,D.；Fedoruk,M.N.；Harborth,J.；Heyes,J.A.；Jeffs,L.B.；John,M.；Judge,A.D.；Lam,K.；McClintock,K.；Nechev,L.V.；Palmer,L.R.；Racie,T.；
Figure BDA0001041038240000161
I.；Seiffert,S.；Shanmugam,S.；Sood,V.；Soutschek,J.；Toudjarska,I.；Wheat,A.J.；Yaworski,E.；Zedalis,W.；Koteliansky,V.；Manoharan,M.；Vornlocher,H.-P.；MacLachlan,I.Nature2006,441,111-114.
(10)Spagnou,S.；Miller,A.D.；Keller,M.Biochemistry 2004,43,13348-13356.
(11)Urban-Klein,B.；Werth,S.；Abuharbeid,S.；Czubayko,F.；Aigner,A.GeneTher.2004,12,461-466.
(12)Lv,H.；Zhang,S.；Wang,B.；Cui,S.；Yan,J.J.Control.Release 2006,114,100-109.
(13)Ma,Z.；Li,J.；He,F.；Wilson,A.；Pitt,B.；Li,S.Biochem.Biophys.Res.Commun.2005,330,755-759.
(14)Akhtar,S.；Benter,I.Adv.Drug Deliv.Rev.2007,59,164-182.
(15)Kurreck,J.Angew.Chem.Int.Ed.2009,48,1378.
(16)Nakagawa,O.；Ming,X.；Huang,L.；Juliano,R.L.J.Am.Chem.Soc.2010,132,8848-8849.
(17)Alam,M.R.；Dixit,V.；Kang,H.；Li,Z.B.；Chen,X.；Trejo,J.；Fisher,M.；Juliano,R.L.Nuc.Acids Res.2008,36,2764-2776.
(18)Alam,M.R.；Ming,X.；Dixit,V.；Fisher,M.；Chen,X.；Juliano,R.L.Oligonucleotides 2010,20,103-109.
(19)Ming,X.；Alam,M.R.；Fisher,M.；Yan,Y.；Chen,X.；Juliano,R.L.Nucl.AcidsRes.2010,38,6567-6576.
(20)Oishi,M.；Nagasaki,Y.；Itaka,K.；Nishiyama,N.；Kataoka,K.J.Am.Chem.Soc.2005,127,1624-1625.
(21)Leamon,C.P.；Low,P.S.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1991,88,5572-5576.
(22)McNamara,J.O.；Andrechek,E.R.；Wang,Y.；Viles,K.D.；Rempel,R.E.；Gilboa,E.；Sullenger,B.A.；Giangrande,P.H.Nat.Biotech.2006,24,1005-1015.
(23)Lorenz,C.；Hadwiger,P.；John,M.；Vornlocher,H.P.；Unverzagt,C.Bioorg.Med.Chem.Lett.2004,14,4975-4977.
(24)Soutschek,J.；Akinc,A.；Bramlage,B.；Charisse,K.；Constien,R.；Donoghue,M.；Elbashir,S.；Geick,A.；Hadwiger,P.；Harborth,J.；John,M.；Kesavan,V.；Lavine,G.；Pandey,R.K.；Racie,T.；Rajeev,K.G.；Rohl,I.；Toudjarska,I.；Wang,G.；Wuschko,S.；Bumcrot,D.；Koteliansky,V.；Limmer,S.；Manoharan,M.；Vornlocher,H.-P.Nature 2004,432,173-178.
(25)Nishina,K.；Unno,T.；Uno,Y.；Kubodera,T.；Kanouchi,T.；Mizusawa,H.；Yokota,T.Mol.Ther.2008,16,734-740.
(26)Godfray,J.；Estibeiro,P.Expert Opin.Ther.Targets 2003,7,363-376.
(27)Wood,M.J.A.；Trülzsch,B.；Abdelgany,A.；Beeson,D.Hum.Mol.Genet.2003,12,R279-R284.
(28)Filion,M.C.；Phillips,N.C.Biochim.Biophys.Acta,Biomembr.1997,1329,345-356.
(29)Pertwee,R.G.Pharmacol.Ther.1997,74,129-180.
(30)Devane,W.A.；Hanus,L.；Breuer,A.；Pertwee,R.G.；Stevenson,L.A.；Griffin,G.；Gibson,D.；Mandelbaum,A.；Etinger,A.；Mechoulam,R.Science 1992,258,1946-1949.
(31)McFarland,M.J.；Porter,A.C.；Rakhshan,F.R.；Rawat,D.S.；Gibbs,R.A.；Barker,E.L.J.Biol.Chem.2004,279,41991-41997.
(32)McFarland,M.J.；Barker,E.L.Pharmacol.Ther.2004,104,117-135.
(33)Glaser,S.T.；Kaczocha,M.；Deutsch,D.G.Life Sci.2005,77,1584-1604.
(34)Burley,G.A.；Gierlich,J.；Mofid,M.R.；Nir,S.T.H.；Eichen,Y.；Carell,T.J.Am.Chem.Soc.2006,128,1398.
(35)Gierlich,J.；Burley,G.A.；Gramlich,P.M.E.；Hammond,D.M.；Carell,T.Org.Lett.2006,8,3639.
(36)Gramlich,P.M.E.；Warncke,S.；Gierlich,J.；Carell,T.Angew.Chem.Int.Ed.2008,47,3442.
(37)El-Sagheer,A.H.；Brown,T.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2010,107,15329-15334.
(38)Aigner,M.；Hartl,M.；Fauster,K.；Steger,J.；Bister,K.；Micura,R.ChemBioChem 2011,12,47-51.
(39)Paredes,E.；Das,S.R.ChemBioChem 2011,12,125-131.
(40)Xia,W.；Low,P.S.J.Med.Chem.2010,53,6811-6824.
(41)Wang,Y.；Juranek,S.；Li,H.；Sheng,G.；Wardle,G.S.；Tuschl,T.；Patel,D.J.Nature 2009,461,754-761.
(42)Ross,T.L.；Honer,M.；Lam,P.Y.H.；Mindt,T.L.；Groehn,V.；Schibli,R.；Schubiger,P.A.；Ametamey,S.M.Bioconjugate Chem.2008,19,2462-2470.
(43)Facci,L.；Daltoso,R.；Romanello,S.；Buriani,A.；Skaper,S.D.；Leon,A.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1995,92,3376-3380.
(44)Rakhshan,F.；Day,T.A.；Blakely,R.D.；Barker,E.L.J.Pharmacol.Exp.Ther.2000,292,960-967.
(45)Wong,B.R.；Grossbard,E.B.；Payan,D.G.；Masuda,E.S.ExpertOpin.Investig.Drugs 2004,13,743-762.
(46)Ulanova,M.；Duta,F.；Puttagunta,L.；Schreiber,A.D.；Befus,A.D.ExpertOpin.Ther.Targets 2005,9,901-921.
(47)Sanderson,M.P.；Gelling,S.J.；Rippmann,J.F.；Schnapp,A.Cell.Immunol.2010,262,28-34.
(48)Martin,B.R.；J.Pharmacol.Exp.Ther.2002,301,790-796.
(49)S.Munro,K.L.Thomas,M.Abu-Shaar,Nature 1993,365,61-65
(50)A.B.Lynn,M.Herkenham,J.Pharmacol.Exp.Ther.,1994,268,1612-1623.
(51)L.Facci,R.Dal Toso,S.Romanello,A.Buriani,S.D.Skaper,A.Leon,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1995,92,3376-3380.
(52)L.A.Matsuda,S.J.Lolait,M.J.Brownstein,A.C.Young,T.I.Bonner,Nature1990,346,561-564.
(53)M.Herkenham,A.B.Lynn,B.R.de Costa,E.K.Richfield,Brain Res.1991,547,267-274.
(54)B.F.Thomas,X.Wie,B.R.Martin,J.Pharmacol.Exp.Ther.1992,263,1383-1390.
(55)T.M.Westlake,A.C.Howlett,T.I.Bonner,L.A.Matsuda,M.Herkenham,Neuroscience 1994,63,637-652.
Figure IDA0001041038290000011

Claims (19)

1.包含至少一个单糖残基和至少一个核苷组分的缀合物转染表达糖转运蛋白的细胞中的体外用途，其中所述单糖残基通过接头共价结合到核苷组分的核碱基，其中所述的接头包含由叠氮化物和炔基团之间，或由降冰片烯和腈亚胺、腈氧化物或四嗪之间的Click反应形成的环状基团，且其中所述的核苷组分选自核酸、核苷和核苷酸。
2.权利要求1的用途，其中所述的细胞是植物细胞或哺乳动物细胞。
3.权利要求1的用途，其中所述的细胞是人细胞。
4.权利要求1-3中任意一项所述的用途，其中所述的核酸是RNA分子。
5.权利要求4的用途，其中所述RNA分子是任选地具有至少一个3’-突出端的单链RNA分子或双链RNA分子。
6.权利要求5的用途，其中所述双链RNA分子是siRNA分子。
7.权利要求1-3中任意一项所述的用途，其中所述的核苷组分是包含至少一个修饰的结构单元的核酸分子。
8.权利要求1-3中任意一项所述的用途，其中所述的核苷组分经由存在于核酸分子中的末端结构单元，与所述的单糖残基相连。
9.权利要求1-3中任意一项所述的用途，其中所述的单糖残基选自葡萄糖、甘露糖、半乳糖、核糖、阿拉伯糖、果糖、岩藻糖或唾液酸。
10.权利要求1-3中任意一项所述的用途，其中所述的缀合物包含:
(i)一个单糖残基和一个核苷组分，
(ii)多个单糖残基和一个核苷组分，
(iii)一个单糖残基和多个核苷组分，或
(iv)多个单糖残基和多个核苷组分。
11.权利要求10的用途，其中所述核苷组分是核酸分子。
12.权利要求1-3中任意一项所述的用途，其中所述的缀合物包含单糖残基，其与RNA转录物的3’-或5’-端共价结合。
13.权利要求12的用途，其中所述RNA转录物是mRNA。
14.权利要求1-3中任意一项所述的用途，其中所述的接头包含由炔和叠氮化物之间的Click反应形成的1,2,3-三唑基团。
15.权利要求1-3中任意一项所述的用途，用于转染植物细胞。
16.权利要求1-3中任意一项所述的用途，用于下调基因。
17.权利要求16的用途，其中所述基因是病毒的基因或与细胞疾病相关联的基因。
18.权利要求16的用途，其中所述基因是癌基因或与自身免疫病相关联的基因。
19.权利要求1的用途，其中所述细胞为人细胞，所述核酸为siRNA分子，所述单糖残基选自葡萄糖、甘露糖、半乳糖、核糖、阿拉伯糖、果糖、岩藻糖和唾液酸，并且所述的接头包含由炔和叠氮化物之间的Click反应形成的1,2,3-三唑基团。
CN201580003755.XA 2014-01-15 2015-01-15 糖修饰的核酸分子 Active CN105899666B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP14151255 2014-01-15
EP14151255.8 2014-01-15
PCT/EP2015/050685 WO2015107115A1 (en) 2014-01-15 2015-01-15 Saccharide-modified nucleic acid molecules

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105899666A CN105899666A (zh) 2016-08-24
CN105899666B true CN105899666B (zh) 2020-10-09

Family

ID=49989536

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201580003755.XA Active CN105899666B (zh) 2014-01-15 2015-01-15 糖修饰的核酸分子

Country Status (14)

Country Link
US (1) US10751425B2 (zh)
EP (1) EP3094731B1 (zh)
JP (1) JP6584412B2 (zh)
CN (1) CN105899666B (zh)
BR (1) BR112016014162A2 (zh)
DK (1) DK3094731T3 (zh)
ES (1) ES2742102T3 (zh)
HR (1) HRP20191471T1 (zh)
HU (1) HUE045086T2 (zh)
LT (1) LT3094731T (zh)
PL (1) PL3094731T3 (zh)
PT (1) PT3094731T (zh)
SI (1) SI3094731T1 (zh)
WO (1) WO2015107115A1 (zh)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015088990A1 (en) 2013-12-09 2015-06-18 Durect Corporation Pharmaceutically active agent complexes, polymer complexes, and compositions and methods involving the same
AU2017272862A1 (en) 2016-06-02 2019-01-17 Sanofi Conjugates of a pharmaceutical agent and a moiety capable of binding to a glucose sensing protein
EP3554551A1 (en) * 2016-12-14 2019-10-23 University College Cork-National University of Ireland, Cork Cyclodextrin conjugates
KR20200103750A (ko) 2017-12-21 2020-09-02 바제클리크 게엠베하 클릭-변형된 mRNA
IL276687B2 (en) * 2018-02-17 2024-08-01 Arrowhead Pharmaceuticals Inc Trialkyne linkers and methods of using them
US12065458B2 (en) 2018-02-17 2024-08-20 Arrowhead Pharmaceuticals, Inc. Trialkyne linking agents and methods of use
AU2020324543A1 (en) * 2019-08-05 2022-03-03 Polyplus Transfection Compositions for transfecting a nucleic acid molecule into a cell comprising triazole compounds grafted to a cationic polymer, and their applications
CN111041025B (zh) 2019-12-17 2021-06-18 深圳市瑞吉生物科技有限公司 基于结合N-乙酰半乳糖胺多肽的mRNA靶向分子及其制备方法
CN112111524B (zh) * 2020-01-10 2024-02-27 深圳瑞吉生物科技有限公司 mRNA-GalNAc靶向分子的制备方法及其体内递送系统和应用
CN111744019B (zh) 2020-07-01 2023-08-04 深圳瑞吉生物科技有限公司 基于甘露糖的mRNA靶向递送系统及其应用
AU2021369744B2 (en) * 2020-10-30 2024-07-11 Tod SPEER Oligonucleotide-based therapeutics and uses thereof
JP2024514954A (ja) * 2021-04-23 2024-04-03 ガナ バイオ， インコーポレイテッド グリカン修飾核酸、調製方法、及び治療的使用
CA3232387A1 (en) * 2021-09-13 2023-03-16 Ganna Bio, Inc. Glycan conjugate compositions and methods
AU2023279271A1 (en) * 2022-05-30 2024-11-28 Nurexone Biologic Ltd. Compositions and methods for loading extracellular vesicles
CN115487308B (zh) * 2022-09-29 2024-09-27 北京大学 反义核酸糖基缀合物及其制备方法和在肝癌治疗中的应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101238141A (zh) * 2005-05-02 2008-08-06 巴斯福股份公司 灵敏检测分析物的新标记策略

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007044012A (ja) * 2005-08-12 2007-02-22 Konan Gakuen 葉の水分蒸散を調節する方法、及び植物の耐乾燥性を向上させる方法
WO2009024977A2 (en) * 2007-08-20 2009-02-26 Protalix Ltd. Saccharide-containing protein conjugates and uses thereof
EP2231195B1 (en) * 2007-12-04 2017-03-29 Arbutus Biopharma Corporation Targeting lipids

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101238141A (zh) * 2005-05-02 2008-08-06 巴斯福股份公司 灵敏检测分析物的新标记策略

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Versatile Site-Specific Conjugation of Small Molecules to siRNA Using Click Chemistry;Takeshi Yamada et al.;《J. Org. Chem.》;20110207;第76卷(第5期);摘要，图2，方案5 *

Also Published As

Publication number Publication date
HUE045086T2 (hu) 2019-12-30
BR112016014162A2 (pt) 2018-01-09
JP6584412B2 (ja) 2019-10-02
LT3094731T (lt) 2019-10-25
CN105899666A (zh) 2016-08-24
US10751425B2 (en) 2020-08-25
DK3094731T3 (da) 2019-08-05
EP3094731A1 (en) 2016-11-23
EP3094731B1 (en) 2019-07-17
US20160333364A1 (en) 2016-11-17
WO2015107115A1 (en) 2015-07-23
JP2017504322A (ja) 2017-02-09
PT3094731T (pt) 2019-09-04
PL3094731T3 (pl) 2019-10-31
ES2742102T3 (es) 2020-02-13
HRP20191471T1 (hr) 2019-11-15
SI3094731T1 (sl) 2019-10-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105899666B (zh) 糖修饰的核酸分子
EP2872180B1 (en) Anandamide-modified nucleic acid molecules
AU2022283737B2 (en) Defined multi-conjugate oligonucleotides
EP3569711B1 (en) Ligand-modified double-stranded nucleic acids
KR102776167B1 (ko) 감소된 신장 청소율을 갖는 다중결합 올리고뉴클레오티드
CN105907756A (zh) 延长的dicer酶底物和特异性抑制基因表达的方法
US20150329862A1 (en) Gene Silencing by Single-Stranded Polynucleotides
CN115135765A (zh) 用于免疫治疗的靶向含布罗莫结构域之蛋白4(brd4)的经化学修饰的寡核苷酸
Shah Theranostic Applications of siRNA Bioconjugates in Cancer Detection and Treatment
TW202438085A (zh) 寡核苷酸片段及其用於製備rnai藥劑之方法
Bogojeski Synthesis and Characterization of Novel Self-Delivering Amino Acid-RNA Conjugates for the Development of Potent siRNA Prodrugs
Malek-Adamian Synthesis of Novel 2′, 4′-Modified Nucleoside Analogues and Their Properties in Oligonucleotides and Nanoparticle Development for Targeted Delivery to Glioblastoma Multiformes Drr-Expressing Cells
Alagia Modulation of the RNAi pathway by chemically modified siRNA molecules
Kiviniemi Studies on Intrachain Conjugation, Hybridization and Invasion of Oligonucleotides
Postdoc et al. Session VI

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20180625

Address after: German spirit

Applicant after: Thomas Karel

Address before: Ludwigshafen, Germany

Applicant before: BASF SE

TA01 Transfer of patent application right
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20181210

Address after: Neurid, Germany

Applicant after: Baseclick GmbH

Address before: German spirit

Applicant before: Thomas Karel

TA01 Transfer of patent application right
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant