CN105899498B - 用于合成吲哚胺2，3-双加氧酶抑制剂的方法 - Google Patents

Abstract

本申请涉及用于制备4‑({2‑[(氨基磺酰基)氨基]乙基}氨基)‑N‑(3‑溴‑4‑氟苯基)‑N′‑羟基‑1，2，5‑噁二唑‑3‑甲脒的方法和中间体，所述4‑({2‑[(氨基磺酰基)氨基]乙基}氨基)‑N‑(3‑溴‑4‑氟苯基)‑N′‑羟基‑1，2，5‑噁二唑‑3‑甲脒为适用于治疗癌症和其他病症的吲哚胺2，3‑双加氧酶抑制剂。

Description

用于合成吲哚胺2，3-双加氧酶抑制剂的方法

本申请要求2013年11月8日提交的美国临时申请号61/901,689的优先权益，所述临时申请以引用的方式整体并入本文。

发明领域

本申请涉及用于制备4-({2-[(氨基磺酰基)氨基]乙基}氨基)-N-(3-溴-4-氟苯基)-N′-羟基-1，2，5-噁二唑-3-甲脒的方法和中间体，所述4-({2-[(氨基磺酰基)氨基]乙基}氨基)-N-(3-溴-4-氟苯基)-N′-羟基-1，2，5-噁二唑-3-甲脒为适用于治疗癌症和其他病症的吲哚胺2，3-双加氧酶抑制剂。

发明背景

色氨酸(Trp)为蛋白质、烟酸和神经递质5-羟基色胺(血清素)的生物合成所需的必需氨基酸。酶吲哚胺2，3-双加氧酶(也称为INDO或IDO)催化在L-色氨酸降解为N-甲酰基-犬尿氨酸的过程中的第一个且速率限制步骤。在人类细胞中，由IDO活性引起的Trp耗尽为主要的γ干扰素(IFN-γ)诱导性抗微生物效应机制。IFN-γ刺激会诱导IDO活化，其导致Trp耗尽，由此阻止Trp依赖性细胞内病原体生长，诸如弓虫(Toxoplasma gondii)和沙眼披衣菌(Chlamydia trachomatis)。IDO活性也对许多肿瘤细胞具有抗增殖效应，并且已在同种异体肿瘤排斥期间活体内观察到IDO诱导，这指示此酶在肿瘤排斥过程中的可能作用(Daubener等人，1999，Adv.Exp.Med.Biol.，467：517-24；Taylor等人，1991，FASEB J.，5：2516-22)。

已观察到与外周血液淋巴细胞(PBL)共培养的海拉细胞通过上调IDO活性来获得免疫抑制表型。认为在用白介素-2(IL2)处理后PBL增殖的减少由肿瘤细胞响应于PBL分泌IFNG而而释放的IDO引起。此效应通过用特异性IDO抑制剂1-甲基-色氨酸(1MT)处理而逆转。已提出，肿瘤细胞中的IDO活性可用于减小抗肿瘤反应(Logan等人，2002，Immunology，105：478-87)。

近来，Trp耗尽的免疫调节作用已获得更多关注。若干证据表明，IDO参与诱导免疫耐受。哺乳动物妊娠、肿瘤抗性、慢性感染和自身免疫疾病的研究已显示，表达IDO的细胞可抑制T细胞反应并且促进耐受性。已在与细胞免疫活化有关的疾病和病症，诸如感染、恶性肿瘤、自身免疫疾病和AIDS中，以及在妊娠期间观察到Trp分解代谢加速。例如，已在自身免疫疾病中观察到IFN水平增加和尿Trp代谢物水平提高；已假设，在自身免疫疾病中发生的全身性或局部Trp耗尽可导致这些疾病的恶化和消瘦症状。支持此假设，在从关节炎关节的滑液分离的细胞中观察到高水平的IDO。人类免疫缺乏病毒(HIV)患者中IFN也升高且IFN水平增加与恶化的预后相关。因此，已提出IDO由HIV感染长期诱导并且通过机会性感染进一步增加，并且Trp的慢性损失会起始造成AIDS患者的恶病质、痴呆和腹泻以及可能存在的免疫抑制的机制(Brown等人，1991，Adv.Exp.Med.Biol.，294：425-35)。为此，近来已显示IDO抑制作用可提高小鼠HIV模型中病毒特异性T细胞的水平并且伴随地降低病毒感染的巨噬细胞的数目(Portula等人，2005，Blood，106：2382-90)。

认为IDO在预防子宫内的胎儿排斥的免疫抑制过程中起作用。超过40年以前，观察到在妊娠期间，遗传不同的哺乳动物胚体会活下来，而不管组织移植免疫学将预测的结果如何(Medawar，1953，Symp.Soc.Exp.Biol.7：320-38)。母体与胎儿的解剖分离和胎儿的抗原未成熟无法充分解释胎儿同种异体移植物存活。近来已关注母体的免疫耐受性。因为在正常妊娠期间IDO由人类合胞体滋养细胞表达并且全身性色氨酸浓度降低，所以假设在母体-胎儿界面处的IDO表达为预防胎儿同种异体移植物的免疫排斥所必需。为了测试此假设，将怀孕小鼠(携带同基因型或同种异体胎儿)暴露于1MT，并且观察到所有同种异体胚体的快速、T细胞诱导的排斥。因此，通过使色氨酸分解代谢，哺乳动物胚体看来抑制T细胞活性并且自身防御以免于排斥，并且在鼠类妊娠期间阻断色氨酸分解代谢会允许母体T细胞引起胎儿同种异体移植排斥(Munn等人，1998，Science，281：1191-3)。

基于IDO所致的色氨酸分解的肿瘤样免疫抗性机制的其他证据源于以下观察结果：大多数人类肿瘤组成性地表达IDO，并且免疫原小鼠肿瘤细胞表达IDO会预防免疫前小鼠排斥所述细胞。此效应伴随有肿瘤位点处特异性T细胞积聚的缺乏并且可通过在不存在显著毒性的情况下用IDO抑制剂全身性治疗小鼠而部分地逆转。因此，建议癌症患者的治疗性疫苗接种的功效可能通过伴随性施用IDO抑制剂而改良(Uyttenhove等人，2003，NatureMed.，9：1269-74)。还已显示，IDO抑制剂1-MT可与化学治疗剂协同作用以减少小鼠中的肿瘤生长，表明IDO抑制作用还可增强常规细胞毒性疗法的抗肿瘤活性(Muller等人，2005，Nature Med.，11：312-9)。

一种导致针对肿瘤的免疫无反应性的机制可为由致耐受性宿主APC呈现肿瘤抗原。还已描述人类IDO表达性抗原呈现细胞(APC)的子集，其共表达CD123(IL3RA)和CCR6并且抑制T细胞增殖。成熟和未成熟CD123阳性树突细胞均抑制T细胞活性，并且此IDO抑制活性由1MT阻断(Munn等人，2002，Science，297：1867-70)。还已证实，小鼠肿瘤引流淋巴结(TDLN)含有浆细胞样树突细胞(pDC)的子集，其组成性地表达免疫抑制水平的IDO。尽管活体外仅包含0.5％的淋巴结细胞，但这些pDC有效地抑制对pDC自身所呈现的抗原的T细胞反应并且也以显性方式抑制对非抑制性APC所呈现的第三方抗原的T细胞反应。在pDC群体内，大多数功能性IDO介导的抑制因子活性与共表达B谱系标记CD19的新颖pDC子集隔离。因此，假设TDLN中IDO介导的pDC抑制作用产生局部微环境，所述微环境有效地抑制宿主抗肿瘤T细胞反应(Munn等人，2004，J.Clin.Invest.，114(2)：280-90)。

IDO使色氨酸、血清素和抑黑素的吲哚部分降解，并且起始神经活性和免疫调节代谢物(统称为犬尿氨酸)的产生。通过局部地耗尽色氨酸并增加促凋亡犬尿氨酸，由树突细胞(DC)表达的IDO可极大地影响T细胞增殖和存活。DC中的IDO诱导可能为由调节T细胞驱动的缺失耐受性的常见机制。因为可预期此类致耐受性反应在多种病理生理条件下操作，所以色氨酸代谢和犬尿氨酸产生可能表示在免疫系统与神经系统之间的决定性共同问题(Grohmann等人，2003，Trends Immunol.，24：242-8)。在持久免疫活化的状态下，游离血清Trp的可用性减少并且由于血清素产生减少，血清素激导性功能也可受到影响(Wirleitner等人，2003，Curr.Med.Chem.，10：1581-91)。

有趣的是，已观察到施用干扰素-α会诱导神经精神副作用，诸如抑郁症状和认知功能改变。对血清素能神经传递的直接影响可导致这些副作用。此外，因为IDO活化导致色氨酸水平降低，故血清素(5-HT)的前体IDO可通过降低中枢5-HT合成而在这些神经精神副作用中起作用。此外，犬尿氨酸代谢物，诸如3-羟基-犬尿氨酸(3-OH-KYN)和喹啉酸(QUIN)对脑功能具有毒性作用。3-OH-KYN能够通过增加活性氧物质(ROS)的产生而产生氧化应激，并且QUIN可产生海马N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体的过度刺激，由此导致细胞凋亡和海马萎缩。ROS过度产生和由NMDA过度刺激所致的海马萎缩均已与抑郁相关(Wichers和Maes，2004，J.Psychiatry Neurosci.，29：11-17)。因此，IDO活性可在抑郁中起作用。

正在开发小分子IDO抑制剂以治疗或预防IDO相关疾病，诸如上文所述的那些。例如，噁二唑和其他杂环IDO抑制剂报导于US 2006/0258719和US 2007/0185165中。PCT公开案WO 99/29310报导了用于改变T细胞介导的免疫性的方法，其包括使用IDO抑制剂诸如1-甲基-DL-色氨酸、p-(3-苯并呋喃基)-DL-丙氨酸、p-[3-苯并(b)噻吩基]-DL-丙氨酸和6-硝基-L-色氨酸来改变色氨酸和色氨酸代谢物的局部细胞外浓度(Munn，1999)。制备用于增强或降低T细胞耐受性的抗原呈现细胞的方法报导于WO 03/087347中，也作为欧洲专利1501918公开(Munn，2003)。具有吲哚胺-2，3-双加氧酶(IDO)抑制活性的化合物也报导于WO2004/094409中；并且美国专利申请公开案号2004/0234623涉及通过施用吲哚胺-2，3-双加氧酶抑制剂与其他治疗方法的组合来治疗患有癌症或感染的个体的方法。

根据指示IDO在免疫抑制、肿瘤抗性和/或排斥、慢性感染、HIV感染、AIDS(包括其表现形式，诸如恶病质、痴呆和腹泻)、自身免疫疾病或病症(诸如类风湿性关节炎)和免疫耐受性以及预防子宫内胎儿排斥中的作用的实验数据，旨在通过抑制IDO活性来抑制色氨酸降解的治疗剂为需要的。当T细胞通过妊娠、恶性肿瘤或诸如HIV的病毒抑制时，IDO抑制剂可用于活化T细胞并且因此增强T细胞活化。IDO抑制作用也可为用于患有神经或神经精神疾病或病症(诸如抑郁)的患者的重要治疗策略。

由于IDO抑制剂的适用性，需要开发用于制备IDO抑制剂的新方法。本申请涉及此需要和其他需要。

发明内容

具有式I的化合物4-({2-[(氨基磺酰基)氨基]乙基}氨基)-N-(3-溴-4-氟苯基)-N′-羟基-1，2，5-噁二唑-3-甲脒：

为酶吲哚胺2，3-双加氧酶(也称为IDO)的抑制剂。所述式I化合物以及其制备和用途已描述于美国专利号8,088,803中，所述专利以引用的方式整体并入本文中。本文提供的中间体和方法有助于满足当前对于开发用于治疗严重疾病的IDO抑制剂的需要。

本申请尤其提供用于制备式I化合物的中间体和方法：

因此，本申请提供一种方法，其包括使式F5化合物：

与式F6的醛反应：

以提供式F7化合物：

其中Pg¹定义如下。

本申请还提供一种方法，其包括使式F15化合物：

与式F5化合物反应以提供式F16化合物：

其中R¹和R³定义如下。

本申请还提供一种方法，其包括使式F17化合物：

与式F5化合物反应以提供式F18化合物：

其中R⁴定义如下。

详述

虽然某些方法步骤说明于下文所示的方案中，但意图的是个别方法步骤可单独地或以任何组合来要求(例如，在方案I中，步骤E、F、G、H和I可单独地或组合要求)。并不意图所述方法限于具有下文方案中的各个和每个步骤的总体方法。

相应地，用于制备式I化合物的一般方案描述于方案1中。

方案1

因此，本申请提供一种方法，其包括使式F5化合物：

与式F6醛反应：

其中Pg¹为氨基保护基，以提供式F7化合物：

氨基保护基Pg¹可用于在执行所需转化时防止氨基的不需要的反应。氨基保护基允许容易地共价连接至氮原子以及从所述氮原子选择性裂解。合适的“氨基保护基”，诸如烷氧羰基(诸如乙氧羰基、叔丁氧羰基(Boc)、苯甲氧羰基(Cbz)、9-芴基甲氧羰基(Fmoc)及其类似基团)、酰基(诸如乙酰基(Ac)、苯甲酰基(Bz)及其类似基团)、磺酰基(诸如甲磺酰基、三氟甲磺酰基及其类似基团)、芳基烷基(诸如苯甲基、4-甲氧基苯甲基、二苯基甲基、三苯基甲基(三苯甲基)及其类似基团)、烯基烷基(诸如烯丙基、异戊二烯基及其类似基团)、二芳基亚甲基(诸如(C₆H₅)₂C＝N及其类似基团)以及甲硅烷基(诸如叔丁基二甲基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基及其类似基团)为本领域技术人员已知。氨基保护基的化学可见于Wuts和Greene，Greene’s Protective Groups in Organic Synthesis，第4版，第696-926页，John Wiley&Sons：New York，2006中，其以引用的方式整体并入本文中。

在一些实施方案中，Pg¹为乙氧羰基、叔丁氧羰基、苯甲氧羰基或9-芴基甲氧羰基。

在一些实施方案中，Pg¹为C_1-6烷氧羰基。

在一些实施方案中，Pg¹为叔丁氧羰基。

用于步骤E的适当溶剂包括但不限于甲醇或四氢呋喃(THF)、乙腈及其类似物。还可使用卤化烃溶剂(即，卤化烷烃，诸如二氯甲烷、氯仿、二氯乙烷或四氯乙烷)。

在一些实施方案中，所述反应在包含四氢呋喃的溶剂组分中执行。如本文所用，溶剂组分可指一种溶剂或溶剂混合物。在一些实施方案中，溶剂组分为有机溶剂。在一些实施方案中，所述反应在包含卤化烃溶剂的溶剂组分中执行。在一些实施方案中，所述卤化烃溶剂为二氯甲烷。

在一些实施方案中，所述反应在包含乙腈的溶剂组分中执行。

在一些实施方案中，所述反应在包含二氯甲烷和乙腈的溶剂组分中执行。

在一些实施方案中，所述反应在还原剂存在下执行。

还原剂可为任何能够将有机化合物还原为较低氧化态的化合物。还原通常涉及添加氢原子或从基团移除氧原子。例如，诸如F6的醛可在式F5的胺存在下(步骤E，方案1)通过添加呈氢气(H₂)形式的氢或使用氢化物试剂(诸如NaB(OAc)₃H、NaBH₄、LiAlH₄及其类似物)；使用三苯膦；或使用碘化钠、氯三甲基硅烷和甲醇的组合来还原。在一些实施方案中，此步骤可在酸(诸如三氟乙酸)存在下在酸性条件下执行。在一些实施方案中，此步骤可在约-15℃至约30℃，例如约-15℃至约0℃、约-5℃至约5℃、约-5℃至约0℃或约0℃至约45℃的温度下执行。

在一些实施方案中，所述还原剂为硼氢化物还原剂(例如NaB(OAc)₃H、NaBH₄或其他含硼氢化物还原剂)。

在一些实施方案中，所述硼氢化物还原剂为三乙酰氧基硼氢化钠。

在一些实施方案中，所述反应在三氟乙酸存在下执行。

在一些实施方案中，所述方法还包括使所述式F7化合物脱保护以提供式F8化合物：

适用于此步骤F的氨基脱保护剂为本领域技术人员已知，诸如Wuts和Greene(上文)中的那些。具体地说，上文所述的氨基保护基可便利地使用多种可用氨基脱保护剂来移除，所述氨基脱保护剂特定用于上文所提及的各种基团而不影响所述化合物的其他所需部分。叔丁氧羰基可例如通过用酸(诸如盐酸、三氟乙酸、甲苯磺酸及其类似物)；已知产生酸的试剂的组合(例如，乙酰氯和甲醇的混合物)或路易斯酸(例如BF₃·Et₂O)处理而从氮原子移除(例如，水解)。苯甲氧羰基可例如通过用氢和催化剂(诸如钯/碳)处理而从氮原子移除(例如，氢解)。

在一些实施方案中，氨基脱保护剂为三氟乙酸。在一些实施方案中，氨基脱保护剂含有三氟乙酸和＞0.5体积％的水，例如＞1.0体积％的水、＞1.5体积％的水、＞2.0体积％的水、约2体积％至约10体积％的水、约10体积％至约20体积％的水或约20体积％至约50体积％的水。在一些实施方案中，氨基脱保护剂可为三氟乙酸和水呈约98∶2的体积比的混合物。在一些实施方案中，氨基脱保护剂可为盐酸，任选地处于溶剂(例如水、THF、二噁烷、乙酸乙酯等)中。在一些实施方案中，溶剂组分为乙酸乙酯。在一些实施方案中，氨基脱保护剂可为盐酸，任选地处于溶剂，诸如醇(例如异丙醇、甲醇或乙醇)中。也可使用卤化烃溶剂(例如二氯甲烷、氯仿、二氯乙烷或四氯乙烷)。在一些实施方案中，盐酸和式F7化合物的摩尔比为约6.0、约5.0、约4.0、约3.0、约2.0、约1.0或约1.1。在一些实施方案中，步骤F可在约-10℃至约60℃，例如约-10℃至约0℃、约0℃至约25℃、约25℃至约45℃或约45℃至约60℃的温度下执行。

在一些实施方案中，所述脱保护包括使式F7化合物与盐酸反应。

在一些实施方案中，所述脱保护包括使式F7化合物与盐酸在包含异丙醇的溶剂组分中反应。

在一些实施方案中，所述脱保护包括使式F7化合物与盐酸在包含卤化烃溶剂的溶剂组分中反应。

在一些实施方案中，所述卤化烃溶剂为二氯甲烷。

在一些实施方案中，本发明还包括使所述式F8化合物与Pg²-NH-SO₂-X在有机碱存在下反应以提供式F9化合物：

其中：

Pg²为氨基保护基；并且

X为卤基。

在一些实施方案中，可制备Pg²-NH-SO₂Cl并且将其立即用于与式F8化合物反应。保护基Pg²可选自本领域已知用于保护胺或磺酰胺(诸如上文针对Pg¹所述的那些)的任何保护基。在一些实施方案中，Pg²可为烷氧羰基(诸如叔丁氧羰基)。

适当溶剂包括但不限于卤化烃溶剂，诸如二氯甲烷及其类似物。有机碱可为用于中和在式F8化合物与受保护氨基-磺酰氯的反应期间产生的HCl的任何碱。有机碱可包括无环叔胺，诸如三(C_1-6)烷基胺(三乙胺、二异丙基乙胺(DIPEA)及其类似物)；环状叔胺(例如，N-甲基哌啶、1，4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷(DABCO)及其类似物)。在一些实施方案中，有机碱可为三乙胺。在一些实施方案中，此步骤可在约-15℃至约60℃，例如约-15℃至约0℃、约0℃至约25℃、约25℃至约45℃或约45℃至约60℃的温度下执行。

在此类实施方案中，Pg²-NH-5O₂Cl可通过醇(诸如乙醇、叔丁醇及其类似物)与氯磺酰基异氰酸酯(ClS(O)₂NCO)的反应获得。

在一些实施方案中，Pg²为乙氧羰基、叔丁氧羰基、苯甲氧羰基或9-芴基甲氧羰基。

在一些实施方案中，Pg²为C_1-6烷氧羰基。

在一些实施方案中，Pg²为叔丁氧羰基。

在一些实施方案中，所述反应在包含卤化烃溶剂的溶剂组分中执行。

在一些实施方案中，所述卤化烃溶剂为二氯甲烷。

在一些实施方案中，所述有机碱包括三(C_1-6)烷基胺。

在一些实施方案中，所述有机碱为三乙胺。

在一些实施方案中，X为氯。

在一些实施方案中，本发明还包括使所述式F9化合物脱保护以提供式F10化合物：

在一些实施方案中，合适的脱保护剂可包括上文所述用于使式F7化合物脱保护的那些。

在一些实施方案中，所述脱保护包括使式F9化合物与盐酸反应。在一些实施方案中，所述脱保护包括使式F9化合物与盐酸在包含醇的溶剂组分中反应。在一些实施方案中，所述醇为乙醇。在一些实施方案中，所述脱保护包括使式F9化合物与盐酸在包含乙酸乙酯的溶剂组分中反应。

在一些实施方案中，本发明还包括使所述式F10化合物与碱反应以提供式I化合物：

任选地在溶剂中，碱可用于转化F10中的噁二唑酮环(例如，水解)以揭示式I化合物中的胺肟(步骤I，方案1)。以噁二唑酮形式保护胺肟可适用于防止羟基或胺肟整体的不良反应。碱可为无机碱，诸如碱金属氢氧化物(例如NaOH、LiOH、KOH、Mg(OH)₂等)；或有机碱，诸如无环胺(例如，三乙胺、二异丙基乙胺(DIPEA)等)或环状胺(例如，吡咯烷、哌啶等)。碱可以树脂(例如及其类似物)形式获得。在一些其他实施方案中，碱可以水溶液形式提供(例如，约0.5N溶液、约1N溶液、约1.5N溶液、约2.5N溶液、约3N至约5N溶液、约5N至约10N溶液)。在一些实施方案中，碱可为碱金属氢氧化物(例如，氢氧化钠)。在一些实施方案中，碱可为2N NaOH水溶液。在一些实施方案中，溶剂可为乙醇或四氢呋喃(THF)。在一些实施方案中，溶剂可为乙醇和水的混合物。在一些实施方案中，式F10化合物与碱反应以提供式I化合物可在约-10℃至约60℃，例如约-10℃至约20℃、约0℃至约30℃、约0℃至约10℃或约0℃至约5℃的温度下执行。

在一些实施方案中，所述碱包括碱金属氢氧化物。

在一些实施方案中，所述碱金属氢氧化物为氢氧化钠。

在一些实施方案中，所述反应在包含四氢呋喃、水和乙醇的溶剂组分中执行。

在一些实施方案中，式F5化合物可以方案2中所示的步骤次序获得。中间体4-氨基-N′-羟基-1，2，5-噁二唑-3-甲脒F2的制备已描述于J.Heterocycl.Chem.(1965)，2，253(其以引用的方式整体并入本文中)中，并且其转化为氯肟F3已描述于Synth.Commun.(1988)，18，1427(其以引用的方式整体并入本文中)中。在一些实施方案中，式F3的氯肟可任选地在溶剂(诸如水)中偶合于3-溴-4-氟苯胺，随后添加碳酸氢钠，以提供式F4的胺肟。F4化合物的胺肟官能基可接着使用N，N-羰基二咪唑(DCI)在溶剂(诸如乙酸乙酯、二噁烷、THF及其类似物)中，在诸如约50℃、约60℃、约70℃、约80℃、约90℃或约100℃的高温下转化为噁二唑酮或式F5。

方案2

或者，式F10化合物可通过方案3中所描绘的步骤次序获得。

方案3

在一些实施方案中，本申请提供一种方法，其包括使式F15化合物：

与式F5化合物反应：

以提供式F16化合物：

其中：

各R¹独立地为氨基保护基；并且

R³为C_1-6烷基或苯甲基。

在一些实施方案中，R¹为C_2-4烯基-C_1-3烷基或苯基-C_1-3烷基，其中所述苯基-C_1-3烷基任选地被1、2或3个独立地选择的C_1-4烷氧基取代。

在一些实施方案中，R¹为C_2-4烯基-C_1-3烷基或苯基-C_1-3烷基，其中所述苯基-C_1-3烷基任选地被1、2或3个甲氧基取代。

在一些实施方案中，R¹为烯丙基。

在一些实施方案中，R¹为4-甲氧基苯甲基。

在一些实施方案中，R³为C_1-6烷基。

在一些实施方案中，R³为叔丁基。

在一些实施方案中，R³为C_1-4烷基。

在一些实施方案中，R³为丁基。

优选地，所述反应在还原剂存在下执行。还原剂可为任何能够将有机化合物还原为较低氧化态的化合物。在一些实施方案中，还原剂可为在催化剂存在下的氢气或氢化物试剂(诸如NaB(OAc)₃H、NaBH₄、LiAlH₄及其类似物)；使用三苯膦；或使用碘化钠、氯三甲基硅烷和甲醇的组合。在一些实施方案中，此步骤可在酸(诸如三氟乙酸)存在下执行。用于此步骤的合适溶剂包括异丙醇、THF、二噁烷或其类似物。在一些实施方案中，此步骤可在约-15℃至约30℃，例如约-15℃至约0℃、约-5℃至约5℃、约-5℃至约0℃、约0至5℃或约0℃至约45℃的温度下执行。

在一些实施方案中，所述反应在包含四氢呋喃的溶剂组分中执行。

在一些实施方案中，所述反应在还原剂存在下执行。

在一些实施方案中，所述还原剂为硼氢化物还原剂。

在一些实施方案中，所述硼氢化物还原剂为三乙酰氧基硼氢化钠。

在一些实施方案中，所述反应在三氟乙酸存在下执行。

在一些实施方案中，本发明还包括使所述式F16化合物脱保护以提供式F10化合物：

处理化合物F16以用NH₂置换R¹N可通过本领域技术人员已知用于使特定氨基保护基脱保护的方法，诸如Wuts和Greene，Greene′s Protective Groups in OrganicSynthesis，第4版，第696-926页，John Wiley&Sons：New York，2006中的那些方法来完成。在一些实施方案中，当R¹为烯丙基时，脱保护剂可为钯催化剂(例如Pd(Ph₃P)₄、Pd/C或Pd(dba)DPPB)。在一些实施方案中，当R¹为4-甲氧基苯甲基时，脱保护剂可包括有机酸(诸如三氟乙酸或甲磺酸及其类似物)；无机酸(诸如盐酸)；氢和钯；或液氨中的钠。所述脱保护可在约30℃至约90℃，例如约50℃至约100℃或约60℃至约80℃的温度下执行。

在一些实施方案中，所述脱保护包括使式F16化合物与三氟乙酸反应。

在一些实施方案中，所述脱保护包括使式F16化合物与盐酸反应。

化合物F15可通过三步骤方法(步骤J、K和L)由氯磺酰基异氰酸酯制备，如方案4中所示。

方案4

相应地，本申请还提供一种方法，其中所述式F15化合物通过如下方法获得，所述方法包括用还原剂处理式F14化合物：

以提供所述式F15化合物；其中R²为C_1-4烷基；并且R³定义如上。

在一些实施方案中，R²为甲基。

在一些实施方案中，R²为乙基。

在一些实施方案中，所述还原可用二异丁基氢化铝(DIBAL-H)进行。合适的溶剂包括卤化烃溶剂，诸如二氯甲烷、氯仿、二氯乙烷、四氯乙烷及其类似物。在一些实施方案中，所述还原可在约室温，例如约-80℃至约30℃、约-78℃至约0℃、约0℃至约30℃或约25℃至约30℃下执行。

在一些实施方案中，所述处理在卤化烃溶剂中执行。

在一些实施方案中，所述卤化烃溶剂为二氯甲烷。

在一些实施方案中，所述还原剂为二异丁基氢化铝。

在一些实施方案中，所述式F14化合物通过如下方法获得，所述方法包括用一种或多种独立地选择的氨基保护剂保护式F13化合物：

以提供式F14化合物。

F14上的保护基R¹可选自本领域已知的各种氨基保护基(上文)。在一些实施方案中，氨基保护剂为烯丙基溴或4-甲氧基苯甲基氯。

在一些实施方案中，所述一种或多种氨基保护剂选自烯丙基溴和4-甲氧基苯甲基氯。

在一些实施方案中，所述保护在碱存在下执行。

在一些实施方案中，所述碱为碳酸钾。

在一些实施方案中，所述保护在包含乙腈的溶剂组分中执行。

在一些实施方案中，F13化合物的制备可通过用醇R³OH(其中R³定义如上)和甘氨酸酯H₂NCH₂CO₂R²(其中R²为C_1-4烷基)处理氯磺酰基异氰酸酯来获得。在一些实施方案中，此步骤J在有机酸(诸如乙酸、苯甲酸、三氟乙酸)存在下进行。用于此步骤的合适溶剂包括二氯甲烷、氯仿、二氯乙烷、四氯乙烷及其类似物。

在一些实施方案中，本申请提供一种式F13化合物：

其中：

R²为C_1-4烷基；并且

R³为C_1-6烷基或苯甲基。

在一些实施方案中，R²为甲基。

在一些实施方案中，R²为乙基。

在一些实施方案中，R³为C_1-6烷基。

在一些实施方案中，R³为叔丁基。

在一些实施方案中，式F13化合物为2-((N-(叔丁氧羰基)氨磺酰基)氨基)乙酸乙酯：

在一些实施方案中，本发明还提供一种式F14化合物：

其中：

各R¹独立地为氨基保护基；

R²为C_1-4烷基；并且

R³为C_1-6烷基或苯甲基。

在一些实施方案中，R¹为C_2-4烯基-C_1-3烷基或苯基-C_1-3烷基，其中所述苯基-C_1-3烷基任选地被1、2或3个独立地选择的C_1-4烷氧基取代。

在一些实施方案中，R¹为烯丙基。

在一些实施方案中，R¹为4-甲氧基苯甲基。

在一些实施方案中，R²为甲基。

在一些实施方案中，R²为乙基。

在一些实施方案中，R³为C_1-6烷基。

在一些实施方案中，R³为叔丁基。

在一些实施方案中，R³为C_1-4烷基。

在一些实施方案中，R³为丁基。

在一些实施方案中，R³为C_1-4烷基。

在一些实施方案中，R³为丁基。

在一些实施方案中，式F14化合物为2-(烯丙基(N-烯丙基-N-(叔丁氧羰基)氨磺酰基)氨基)乙酸乙酯：

在一些实施方案中，式F14化合物为2-(4-甲氧基苯甲基(N-4-甲氧基苯甲基-N-(叔丁氧羰基)氨磺酰基)氨基)乙酸乙酯：

在一些实施方案中，本申请提供一种式F15化合物：

其中：

R³为C_1-6烷基或苯甲基；并且

各R¹独立地为氨基保护基。

在一些实施方案中，R¹为C_2-4烯基-C_1-3烷基或苯基-C_1-3烷基，其中所述苯基-C_1-3烷基任选地被1、2或3个独立地选择的C_1-4烷氧基取代。

在一些实施方案中，R¹为烯丙基。

在一些实施方案中，R¹为4-甲氧基苯甲基。

在一些实施方案中，R³为C_1-6烷基。

在一些实施方案中，R³为叔丁基。

在一些实施方案中，式F15化合物为烯丙基{[烯丙基(2-氧代乙基)氨基]磺酰基}氨基甲酸叔丁酯：

在一些实施方案中，式F15化合物为(4-甲氧基苯甲基){[(4-甲氧基苯甲基)(2-氧代乙基)氨基]磺酰基}氨基甲酸叔丁酯：

在一些实施方案中，本发明提供一种式F16化合物：

其中R³为C_1-6烷基或苯甲基并且各R¹独立地为氨基保护基。

在一些实施方案中，R¹为C_2-4烯基-C_1-3烷基或苯基-C_1-3烷基，其中所述苯基-C_1-3烷基任选地被1、2或3个独立地选择的C_1-4烷氧基取代。

在一些实施方案中，R¹为烯丙基。

在一些实施方案中，R¹为4-甲氧基苯甲基。

在一些实施方案中，R³为C_1-6烷基。

在一些实施方案中，R³为叔丁基。

在一些实施方案中，R³为C_1-4烷基。

在一些实施方案中，R³为丁基。

在一些实施方案中，式F16化合物为烯丙基(N-烯丙基-N-(2-(4-(4-(3-溴-4-氟苯基)-5-氧代-4，5-二氢-1，2，4-噁二唑-3-基)-1，2，5-噁二唑-3-基氨基)乙基)氨磺酰基)氨基甲酸叔丁酯：

在一些实施方案中，式F16化合物为(4-甲氧基苯甲基)-(N-(4-甲氧基苯甲基)-N-(2-(4-(4-(3-溴-4-氟苯基)-5-氧代-4，5-二氢-1，2，4-噁二唑-3-基)-1，2，5-噁二唑-3-基氨基)乙基)氨磺酰基)氨基甲酸叔丁酯：

方案5描绘一种用于制备式F10化合物的替代途径。

方案5

本申请还提供一种方法，其包括使式F17化合物：

其中R⁴为C_1-6烷基、C_1-6卤代烷基、苯甲基或9H-芴-9-基甲基，与式F5化合物反应：

以提供式F18化合物：

在一些实施方案中，R⁴为叔丁基。

在一些实施方案中，R⁴为苯甲基。

在一些实施方案中，R⁴为乙基。

在一些实施方案中，R⁴为C_1-3卤代烷基。

在一些实施方案中，R⁴为2，2，2-三氯乙基。

在一些实施方案中，R⁴为9H-芴-9-基甲基。

在此步骤Q中，化合物F18可在一些实施方案中通过使F17与式F5的胺化合物在还原剂存在下反应来制备。

在一些实施方案中，所述反应在还原剂存在下进行。

还原剂可为任何能够例如通过使用有机硅烷，诸如三(C_1-3烷基)硅烷(例如三乙基硅烷)；元素氢或使用氢化物试剂(诸如NaB(OAc)₃H、NaBH₄、LiAlH₄及其类似物)；使用三苯膦；或使用碘化钠、氯三甲基硅烷和甲醇的组合将有机化合物还原为较低氧化态的化合物。在一些实施方案中，此步骤可在酸(诸如三氟乙酸)存在下执行。合适的溶剂包括但不限于卤化烃溶剂(例如，二氯甲烷、氯仿、二氯乙烷或四氯乙烷)。在一些实施方案中，卤化烃溶剂为1，2-二氯乙烷。

在一些实施方案中，所述还原剂为有机硅烷。

在一些实施方案中，所述还原剂为三(C_1-3烷基)硅烷。

在一些实施方案中，所述还原剂为三乙基硅烷。

在一些实施方案中，所述反应在有机酸存在下进行。

在一些实施方案中，所述有机酸为三氟乙酸。

在一些实施方案中，所述有机酸为甲磺酸。

在一些实施方案中，所述反应在包含卤化烃溶剂的溶剂组分中执行。

在一些实施方案中，所述卤化烃溶剂为二氯甲烷。

在一些实施方案中，所述卤化烃溶剂为1，2-二氯乙烷。

在一些实施方案中，所述方法还包括使所述式F18化合物脱保护以提供式F10化合物：

在一些实施方案中，用于使特定胺保护基(诸如氨基甲酸酯基)脱保护的方法为本领域技术人员已知，诸如Wuts和Greene，Greene′s Protective Groups in OrganicSynthesis，第4版，第696-926页，John Wiley&Sons：New York，2006中的那些方法。例如，叔丁氧羰基(例如，当R⁴为叔丁基时)可例如通过用酸(诸如盐酸、三氟乙酸、甲苯磺酸及其类似物)；已知产生酸的试剂的组合(例如，乙酰氯和甲醇的混合物)；或路易斯酸(例如BF₃·Et₂O)处理而从氮原子移除(例如，水解)。苯甲氧羰基(例如，当R⁴为苯甲基时)可例如通过用氢和催化剂(诸如钯/碳)处理而自氮原子移除(例如，氢解)。甲氧羰基和乙氧羰基(即，当R⁴为甲基或乙基时)可通过用无机碱(诸如KOH或K₂CO₃)；试剂的组合(例如，乙酰氯、碘化钠和乙腈的混合物)处理；或通过用酸(例如HBr、AcOH)处理而移除。2，2，2-三氯乙氧羰基可例如通过用催化剂(例如Zn/AcOH或Cd/AcOH)处理而移除。用于此步骤的合适溶剂包括但不限于甲醇或四氢呋喃(THF)、乙腈及其类似物。在一些实施方案中，所述处理在约30℃至约90℃，例如约50℃至约100℃或约60℃至约80℃的温度下执行。

在一些实施方案中，所述脱保护包括使式F18化合物与锌在乙酸存在下反应。

在一些实施方案中，所述脱保护在包含四氢呋喃的溶剂组分中执行。

在一些实施方案中，所述方法还包括使所述式F10化合物与碱反应以提供式I化合物：

在一些实施方案中，所述碱包括碱金属氢氧化物。

在一些实施方案中，所述碱金属氢氧化物为氢氧化钠。

在一些实施方案中，所述反应在包含四氢呋喃、水和乙醇的溶剂组分中执行。

在一些实施方案中，所述方法还包括使所述式F18化合物转化为式I化合物：

其中所述转化包括将式F18化合物与碱组合以形成第一混合物。在一些实施方案中，所述碱为N，N-双(2-氨基乙基)乙烷-1，2-二胺。

在一些实施方案中，所述转化还包括将酸添加到所述第一混合物中。在一些实施方案中，所述酸为强酸水溶液。在一些实施方案中，所述强酸水溶液为盐酸水溶液。

在一些实施方案中，所述转化在包含四氢呋喃和乙酸乙酯的溶剂组分中执行。

本申请还提供一种方法，其包括：

i)使式F19化合物：

与式F5化合物：

在三乙基硅烷和甲磺酸存在下反应以提供式F20化合物：

以及

ii)使所述式F20化合物转化为式I化合物：

其中所述转化包括将所述式F20化合物与N，N-双(2-氨基乙基)乙烷-1，2-二胺。在一些实施方案中，所述转化还包括在所述组合之后添加盐酸水溶液。

化合物F17可通过一步法(步骤P)由氯磺酰基异氰酸酯制备，如方案6中所示。

方案6

在一些实施方案中，式F17化合物的制备可通过用2，2-二甲氧基乙胺和醇R⁴OH(R⁴定义如上)任选地在溶剂(例如，卤化烃溶剂，诸如二氯甲烷、氯仿、二氯乙烷、四氯乙烷)中处理氯磺酰基异氰酸酯而获得。在一些实施方案中，此步骤在碱存在下进行。碱可为有机碱，诸如无环胺(例如，三乙胺、二异丙基乙胺(DIPEA)等)或环状胺(例如，吡咯烷、哌啶等)；或无机碱，诸如强碱(例如NaOH、LiOH、KOH、Mg(OH)₂等)。在一些实施方案中，所述反应在溶剂，例如卤化烃溶剂，诸如二氯甲烷、氯仿、二氯乙烷或四氯乙烷中进行。

在一些实施方案中，本申请还提供一种式F17化合物：

其中R⁴为C_1-6烷基、C_1-6卤代烷基或苯甲基。

在一些实施方案中，R⁴为叔丁基。

在一些实施方案中，R⁴为苯甲基。

在一些实施方案中，R⁴为乙基。

在一些实施方案中，R⁴为C_1-3卤代烷基。

在一些实施方案中，R⁴为2，2，2-三氯乙基。

在一些实施方案中，R⁴为9H-芴-9-基甲基。

在一些实施方案中，式F17化合物为N-(2，2-二甲氧基乙基)氨磺酰基氨基甲酸叔丁酯。

在一些实施方案中，式F17化合物为N-(2，2-二甲氧基乙基)氨磺酰基氨基甲酸苯甲酯。

在一些实施方案中，式F17化合物为N-(2，2-二甲氧基乙基)氨磺酰基氨基甲酸乙酯。

在一些实施方案中，式F17化合物为N-(2，2-二甲氧基乙基)氨磺酰基氨基甲酸2，2，2-三氯乙酯。

在一些实施方案中，式F17化合物为N-(2，2-二甲氧基乙基)氨磺酰基氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯。

在一些实施方案中，本申请还提供一种式F18化合物：

其中R⁴为C_1-6烷基、C_1-6卤代烷基或苯甲基。

在一些实施方案中，R⁴为叔丁基。

在一些实施方案中，R⁴为苯甲基。

在一些实施方案中，R⁴为乙基。

在一些实施方案中，R⁴为C_1-3卤代烷基。

在一些实施方案中，R⁴为2，2，2-三氯乙基。

在一些实施方案中，R⁴为9H-芴-9-基甲基。

在一些实施方案中，式F18化合物为({[2-({[4-(3-溴-4-氟苯基)-5-氧代-4，5-二氢-1，2，4-噁二唑-3-基]-1，2，5-噁二唑-3-基}氨基)乙基]氨基}磺酰基)氨基甲酸苯甲酯：

在一些实施方案中，式F18化合物为({[2-({[4-(3-溴-4-氟苯基)-5-氧代-4，5-二氢-1，2，4-噁二唑-3-基]-1，2，5-噁二唑-3-基}氨基)乙基]氨基}磺酰基)氨基甲酸乙酯：

在一些实施方案中，式F18化合物为({[2-({[4-(3-溴-4-氟苯基)-5-氧代-4，5-二氢-1，2，4-噁二唑-3-基]-1，2，5-噁二唑-3-基}氨基)乙基]氨基}磺酰基)氨基甲酸2，2，2-三氯乙酯：

在一些实施方案中，式F18化合物为N-(2-((4-(4-(3-溴-4-氟苯基)-5-氧代-4，5-二氢-1，2，4-噁二唑-3-基)-1，2，5-噁二唑-3-基)氨基)乙基)氨磺酰基氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯：

如本文所用，术语“烷基”在单独或与额外部分术语一起使用时是指具有1至6个碳原子、1至4个碳原子或1至3个碳原子的直链或支链、饱和烃基。示例性烷基包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基及其类似基团。

如本文所用，“烯基”是指具有一个或多个碳-碳双键的烷基。在一些实施方案中，所述烷基具有2至6个碳原子、2至4个碳原子或2至3个碳原子。示例性烯基包括乙烯基(ethenyl/vinyl)、丙烯基及其类似基团。

如本文所用，“烯基烷基”是指式-烷基-烯基的基团。在一些实施方案中，烯基烷基为烯丙基。

如本文所用，术语“卤代烷基”在单独或与额外部分一起使用时是指被一个或多个独立地选自F、Cl、Br和I的卤素原子取代的烷基。示例性卤代烷基包括CF₃、CHF₂、CH₂CF₃及其类似基团。

如本文所用，术语“烷氧基”是指-O-烷基。在一些实施方案中，所述烷基具有1至6个碳原子、1至4个碳原子或1至3个碳原子。示例性烷氧基包括甲氧基、乙氧基、丙氧基(例如正丙氧基和异丙氧基)、叔丁氧基及其类似基团。

如本文所用，“三烷基胺”是指被三个独立地选择的烷基取代的氮原子。在一些实施方案中，各烷基具有2至6个碳原子、2至4个碳原子或2至3个碳原子。示例性三烷基氨基团包括三甲胺、三乙胺及其类似基团。

如本文所用，术语“烷氧羰基”是指式-C(O)-O-烷基的基团。在一些实施方案中，所述烷基具有2至6个碳原子、2至4个碳原子或2至3个碳原子。示例性烷氧羰基包括乙氧羰基、叔丁氧羰基(Boc)及其类似基团。

卤化烃溶剂是指卤化烷烃，诸如二氯甲烷、氯仿、二氯乙烷或四氯乙烷，其中所述烷烃可为具有1至12个碳原子、1至6个碳原子或1至4个碳原子并且具有一个或多个卤原子的支链或直链。在一些实施方案中，卤化烃溶剂为1至12个碳原子、1至6个碳原子或1至4个碳原子的氯化烷烃。

在本说明书各处，本发明的化合物的取代基可以组形式或以范围形式公开。明确意图本发明包括所述组和范围的成员的各个和每个单独的子组合。

意图本发明化合物为稳定的。如本文所用，“稳定”是指足够稳固以经受得住从反应混合物分离至适用纯度并且优选地能够配制成有效治疗剂中的化合物。

还应了解，为清晰起见描述于各别实施方案的上下文中的某些本发明特征也可组合提供于单一实施方案中。相反地，为简洁起见描述于单一实施方案的上下文中的各种本发明特征也可分别地或以任何合适子组合提供。

本发明的化合物还意图包括所有可能的几何异构体。所述化合物的顺式和反式几何异构体得到描述并且可以异构体混合物形式或以分离的异构体形式分离。

本发明的化合物还包括互变异构体形式。互变异构体形式由单键与相邻双键交换并伴随质子迁移而产生。

本发明的化合物还可包括中间体或最终化合物中出现的原子的所有同位素。同位素包括原子序数相同但质量数不同的那些原子。举例而言，氢的同位素包括氚和氘。

在一些实施方案中，本发明的化合物及其盐基本上被分离。“基本上被分离”意指化合物从其形成或检测时所处的环境中至少部分或基本上分离。部分分离可包括例如富含本发明的化合物的组合物。基本上分离可包括含有至少约50重量％、至少约60重量％、至少约70重量％、至少约80重量％、至少约90重量％、至少约95重量％、至少约97重量％或至少约99重量％的本发明的化合物或其盐的组合物。用于分离化合物及其盐的方法在本领域为常规的。

本申请还包括本文所述的化合物的盐。如本文所用，“盐”是指所公开化合物的衍生物，其中母体化合物通过使现有酸或碱部分转化成其盐形式来修饰。盐的实例包括但不限于碱性残基(诸如胺)的无机酸(诸如HCl、HBr、H₂SO₄)或有机酸(诸如乙酸、苯甲酸、三氟乙酸)盐；酸性残基(诸如羧酸)的碱金属(诸如Li、Na、K、Mg、Ca)或有机(诸如三烷基铵)盐；及其类似物。本申请的盐可通过常规化学方法由含有碱性或酸性部分的母体化合物合成。一般而言，此类盐可通过使游离酸或碱形式的这些化合物与化学计量的量的适当碱或酸于水中或于有机溶剂中，或于所述两者的混合物中反应来制备；一般而言，如乙醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈(ACN)的非水性介质为优选的。

本申请还包括本文所述的化合物的药学上可接受的盐。“药学上可接受的盐”包括上述“盐”的子集，其为例如由无毒无机酸或有机酸形成的母体化合物的常规无毒盐。合适的盐的列表见于Remington′s Pharmaceutical Sciences，第17版，Mack PublishingCompany，Easton，Pa.，1985，第1418页和Journal of Pharmaceutical Science，66，2(1977)中，所述文献各自以引用的方式整体并入本文中。短语“药学上可接受”在本文中用于指在合理医学判断范围内适合与人类和动物的组织接触使用而无过度毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症，符合合理的效益/风险比的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。

本文所述的方法可根据本领域已知的任何合适方法来监测。举例而言，产物形成可通过以下监测：光谱手段，诸如核磁共振光谱法(例如¹H或¹³C)、红外光谱法、分光光度测定法(例如UV-可见光)或质谱；或色谱，诸如高效液相色谱(HPLC)或薄层色谱。通过所述反应获得的化合物可通过本领域已知的任何合适方法来纯化。例如，在合适吸附剂(例如，硅胶、氧化铝及其类似物)上的色谱(中等压力)、HPLC或制备型薄层色谱；蒸馏；升华、研磨或再结晶。一般而言，所述化合物的纯度通过物理方法，诸如测量熔点(在固体的情况下)、获得NMR谱或执行HPLC分离来测定。如果熔点降低，如果NMR谱中不需要的信号减少或如果HPLC迹线中的外来峰被移除，则可认为所述化合物已经纯化。在一些实施方案中，所述化合物为基本上纯化的。

化合物的制备可涉及各种化学基团的保护和脱保护。对于保护和脱保护的需求和适当保护基的选择可容易地由本领域技术人员确定。保护基的化学可见于例如Wuts和Greene，Greene′s Protective Groups in Organic Synthesis，第4版，John Wiley&Sons：New York，2006中，所述文献以引用的方式整体并入本文中。

本文所述的方法的反应可在可容易由有机合成领域技术人员选择的适合溶剂中进行。在进行反应的温度(即，范围可为溶剂的冷冻温度至溶剂的沸腾温度的温度)下，合适的溶剂可基本上不与起始材料(反应物)、中间体或产物反应。给定反应可在一种溶剂或一种以上溶剂的混合物中进行。视反应步骤而定，可选择用于所述特定反应步骤的合适溶剂。适当溶剂包括水、烷烃(诸如戊烷、己烷、庚烷、环己烷等或其混合物)、芳族溶剂(诸如苯、甲苯、二甲苯等)、醇(诸如甲醇、乙醇、异丙醇等)、醚(诸如二烷基醚、甲基叔丁基醚(MTBE)、四氢呋喃(THF)、二噁烷等)、酯(诸如乙酸乙酯、乙酸丁酯等)、卤化烃溶剂(诸如二氯甲烷(DCM)、氯仿、二氯乙烷、四氯乙烷)、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亚砜(DMSO)、丙酮、乙腈(ACN)、六甲基磷酰胺(HMPA)和N-甲基吡咯烷酮(NMP)。所述溶剂可以其湿性形式或无水形式使用。

化合物的外消旋混合物的拆分可通过本领域已知的多种方法中的任一种来进行。示例性方法包括使用“手性拆分酸”进行分级再结晶，所述手性拆分酸为光学活性的成盐有机酸。用于分级再结晶方法的合适拆分剂为例如光学活性酸，诸如酒石酸、二乙酰基酒石酸、二苯甲酰基酒石酸、杏仁酸、苹果酸、乳酸的D和L形式，或各种光学活性樟脑磺酸。外消旋混合物的拆分也可通过在填充有光学活性拆分剂(例如二硝基苯甲酰基苯基甘氨酸)的柱上洗脱来进行。合适的洗脱溶剂组合物可由本领域技术人员确定。

使用方法

式I化合物可抑制酶吲哚胺-2，3-双加氧酶(IDO)的活性。举例而言，式I化合物可用于通过施用抑制量的式I化合物来抑制细胞中或需要调节所述酶的个体中的IDO活性。

式I化合物可用于抑制含有表达IDO的细胞的系统(诸如组织、活生物体或细胞培养物)中的色氨酸降解的方法中。在一些实施方案中，本申请提供通过施用有效量的式I化合物来改变(例如，增加)细胞外色氨酸水平的方法。测量色氨酸水平和色氨酸降解的方法在本领域为常规的。

式I化合物可用于通过向患者施用有效量的式I化合物来抑制患者中的免疫抑制(诸如IDO介导的免疫抑制)的方法中。IDO介导的免疫抑制已与例如癌症、肿瘤生长、转移、病毒感染、病毒复制等相关。

式I化合物也可用于通过向个体(例如患者)施用治疗有效量或剂量的式I化合物或其药物组合物来治疗需要所述治疗的个体中与IDO的活性或表达(包括异常活性和/或过度表达)有关的疾病的方法中。示例性疾病可包括直接或间接与IDO酶的表达或活性(诸如过度表达或异常活性)有关的任何疾病、病症或病状。IDO相关疾病也可包括可通过调节酶活性而预防、改善或治愈的任何疾病、病症或病状。IDO相关疾病的实例包括癌症、病毒感染(诸如HIV感染、HCV感染)、抑郁、神经退化性病症(诸如阿兹海默氏病和亨廷顿氏病)、创伤、年龄相关白内障、器官移植(例如器官移植物排斥)以及自身免疫疾病(包括哮喘、类风湿性关节炎、多发性硬化症、过敏性炎症、炎性肠病、牛皮癣以及全身性红斑狼疮)。可由本文方法治疗的示例性癌症包括结肠癌、胰脏癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、脑癌、卵巢癌、子宫颈癌、睾丸癌、肾癌、头颈癌、淋巴瘤、白血病、黑色素瘤以及其类似癌症。式I化合物也可适用于治疗肥胖和缺血。

如本文所用，术语“细胞”意指活体外、离体或活体内的细胞。在一些实施方案中，离体细胞可为从生物体(诸如哺乳动物)切离的组织样品部分。在一些实施方案中，活体外细胞可为细胞培养物中的细胞。在一些实施方案中，活体内细胞为活在生物体(诸如哺乳动物)中的细胞。

如本文所用，术语“接触”是指使在活体外系统或活体内系统中的指定部分集合在一起。举例而言，使IDO酶与式I化合物“接触”包括向具有IDO的个体或患者(诸如人类)施用式I化合物，以及例如将式I化合物引入含有包含IDO酶的细胞制剂或纯化制剂的样品中。

如本文所用，可互换使用的术语“个体”或“患者”是指任何动物，包括哺乳动物，优选为小鼠、大鼠、其他啮齿动物、兔、狗、猫、猪、牛、绵羊、马或灵长类动物，并且最优选为人类。

如本文所用，短语“治疗有效量”是指活性化合物或药剂在组织、系统、动物、个体或人类中引出研究人员、兽医、医生或其他临床医师所寻求的生物反应或医学反应的量。

如本文所用，术语“治疗(treating/treatment)”是指1)预防疾病；例如在可能易患疾病、病状或病症但尚未经历或显示所述疾病的病理或症状的个体中预防疾病、病状或病症；2)抑制疾病；例如在正在经历或显示疾病、病状或病症的病理或症状的个体中抑制疾病、病状或病症(即阻止病理和/或症状的进一步发展)，或3)改善疾病；例如在正在经历或显示疾病、病状或病症的病理或症状的个体中改善疾病、病状或病症(即逆转病理和/或症状)。

组合疗法

一种或多种额外药剂或治疗方法，诸如像抗病毒剂、化学治疗剂或其他抗癌剂、免疫增强剂、免疫抑制剂、辐射、抗肿瘤和抗病毒疫苗、细胞因子疗法(例如，IL2、GM-CSF等)和/或酪氨酸激酶抑制剂可与式I化合物组合用于治疗IDO相关疾病、病症或病状。所述药剂可与式I化合物组合于单一剂型中，或所述药剂可作为分开的剂型同时或依次施用。

预期与式I化合物组合使用的合适抗病毒剂可包括核苷和核苷酸逆转录酶抑制剂(NRTI)、非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTI)、蛋白酶抑制剂以及其他抗病毒药物。

示例性的合适NRTI包括齐多夫定(AZT)；地丹诺辛(ddl)；扎西他滨(ddC)；司他夫定(d4T)；拉米夫定(3TC)；阿巴卡韦(1592U89)；阿德福韦酯(adefovir dipivoxil)[双(POM)-PMEA]；洛布卡韦(BMS-180194)；BCH-10652；恩奇他滨[(-)-FTC]；β-L-FD4(也称为β-L-D4C并且命名为β-L-2′，3′-双脱氧-5-氟-胞嘧啶核苷)；DAPD，((-)-β-D-2，6，-二氨基-嘌呤二氧戊环)；以及洛德腺苷(FddA)。典型的合适NNRTI包括奈韦拉平(BI-RG-587)；地拉韦啶(BHAP，U-90152)；依法韦仑(DMP-266)；PNU-142721；AG-1549；MKC-442(1-(乙氧基-甲基)-5-(1-甲基乙基)-6-(苯基甲基)-(2，4(1H，3H)-嘧啶二酮)；以及(+)-胡桐素A(NSC-675451)和胡桐素B。典型的合适蛋白酶抑制剂包括沙奎那韦(Ro 31-8959)；利托那韦(ABT-538)；印地那韦(MK-639)；奈弗那韦(AG-1343)；安泼那韦(141W94)；拉西那韦(BMS-234475)；DMP-450；BMS-2322623；ABT-378；以及AG-1 549。其他抗病毒剂包括羟基脲、病毒唑、IL-2、IL-12、喷他夫西以及Yissum Project第11607号。

合适的化学治疗剂或其他抗癌剂包括例如烷基化剂(包括但不限于氮芥(nitrogen mustard)、乙烯亚胺衍生物、烷基磺酸酯、亚硝基脲和三氮烯)，诸如尿嘧啶氮芥(uracil mustard)、氮芥(chlormethine)、环磷酰胺(Cytoxan^TM)、异环磷酰胺、美法仑(melphalan)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、哌泊溴烷(pipobroman)、三乙烯基-蜜胺、三乙烯基硫代磷酰胺、白消安(busulfan)、卡莫司汀(carmustine)、洛莫司汀(lomustine)、链佐星(streptozocin)、达卡巴嗪(dacarbazine)以及替莫唑胺(temozolomide)。

在黑色素瘤的治疗中，与式I化合物组合使用的合适药剂包括：达卡巴嗪(DTIC)，任选地连同其他化学治疗药物，诸如卡莫司汀(BCNU)和顺铂；“达特茅斯方案(Dartmouthregimen)”，其由DTIC、BCNU、顺铂和他莫西芬组成；顺铂、长春碱和DTIC的组合；或替莫唑胺。根据本发明的化合物也可在黑色素瘤的治疗中与免疫治疗药物，包括诸如干扰素α、白介素-2和肿瘤坏死因子(TNF)的细胞因子组合。

式I化合物也可与疫苗疗法组合用于治疗黑色素瘤中。抗黑色素瘤疫苗以一些方式类似于用于预防由病毒引起的疾病(诸如脊髓灰质炎、麻疹和流行性腮腺炎)的抗病毒疫苗。弱化的黑色素瘤细胞或黑色素瘤细胞部分(称为抗原)可注射至患者中以刺激身体的免疫系统破坏黑色素瘤细胞。

限于臂或腿的黑色素瘤也可使用高温隔离肢体灌注技术用包括式I化合物的药剂组合治疗。此治疗方案暂时地分开累及肢体的循环与身体其余部分并且将高剂量的化学治疗剂注射至供给所述肢体的动脉中，从而向肿瘤区域提供高剂量而未使内部器官暴露于这些剂量，这些剂量在其他情况下可能引起严重副作用。通常将流体升温至102°F至104°F。美法仑为最常用于此化学疗法程序中的药物。此药物可与称为肿瘤坏死因子(TNF)的另一药剂一起给予(参见关于细胞因子的章节)。

合适的化学治疗剂或其他抗癌剂包括例如抗代谢物(包括但不限于叶酸拮抗剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物和腺苷脱氨酶抑制剂)，诸如甲胺喋呤、5-氟尿嘧啶、氟尿苷、阿糖胞苷、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、磷酸氟达拉滨、喷司他汀(pentostatine)以及吉西他宾。

合适的化学治疗剂或其他抗癌剂还包括例如某些天然产物及其衍生物(例如长春花生物碱、抗肿瘤抗生素、酶、淋巴因子和表鬼臼毒素)，诸如长春碱、长春新碱、长春地辛、博菜霉素、更生霉素、道诺霉素、阿霉素、表柔比星、伊达比星、阿糖胞苷(ara-C)、紫杉醇(TAXOL^TM)、光辉霉素(mithramycin)、脱氧助间型霉素、丝裂霉素-C、L-天冬酰胺酶、干扰素(尤其为IFN-a)、依托泊苷以及替尼泊苷。

其他细胞毒性剂包括诺维本、CPT-11、阿那曲唑、来曲唑、卡培他滨、里罗克菲、环磷酰胺、异环磷酰胺以及多罗克菲。

也合适的是细胞毒性剂诸如为表鬼臼毒素；抗肿瘤酶；拓扑异构酶抑制剂；丙卡巴肼；米托蒽醌；铂配位复合物，诸如顺铂和卡铂；生物反应调节剂；生长抑制剂；抗激素治疗剂；甲酰四氢叶酸；替加氟；以及造血生长因子。

其他抗癌剂包括抗体治疗剂，诸如曲妥珠单抗(Herceptin)、共刺激诸如CTLA-4、4-1BB和PD-1的分子的抗体、或细胞因子(IL-10、TGF-β等)的抗体。

其他抗癌剂还包括阻断免疫细胞迁移的抗癌剂，诸如趋化因子受体(包括CCR2和CCR4)的拮抗剂。

其他抗癌剂还包括加强免疫系统的抗癌剂，诸如佐剂或继承性T细胞转移。

抗癌疫苗包括树突细胞、合成肽、DNA疫苗和重组病毒。

用于安全并有效地施用大多数这些化学治疗剂的方法为本领域技术人员已知。此外，其施用描述于标准文献中。例如，多种化学治疗剂的施用描述于“Physicians′DeskReference“(PDR，例如1996年版本，Medical Economics Company，Montvale，NJ)中，所述文献的公开内容以引用的方式并入本文中，如同其整体阐述一般。

药物制剂和剂型

当用作药剂时，式I化合物可以药物组合物形式施用，所述药物组合物为式I化合物与药学上可接受的载体的组合。这些组合物可以医药领域中熟知的方式制备，并且根据需要局部治疗抑或全身性治疗并根据欲治疗的区域，可通过多种途径施用。施用可为局部(包括眼部和黏膜，包括鼻内递送、经阴道递送和经直肠递送)、经肺(例如通过吸入或吹入粉末或气雾剂，包括通过喷雾器；气管内、鼻内、经表皮和经皮)、眼部、经口或经胃肠外。用于眼部递送的方法可包括局部施用(滴眼剂)、结膜下、眼周或玻璃体内注射，或通过以手术方式置于结膜囊中的气囊导管或眼部插入物来引入。胃肠外施用包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌肉内注射或输注；或颅内，例如鞘内或心室内施用。胃肠外施用可呈单一推注剂量形式，或可例如通过连续灌注泵达成。用于局部施用的药物组合物和制剂可包括经皮贴片、软膏剂、洗剂、乳膏剂、凝胶剂、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体以及粉末。常规药物载体、水性、粉末状或油性基质、增稠剂及其类似物可为必需或合乎需要的。

含有式I化合物的药物组合物可与一种或多种药学上可接受的载体组合制备。在制备本发明的组合物时，活性成分通常与赋形剂混合、由赋形剂稀释或封闭在呈例如胶囊、药囊、纸或其他容器形式的这种载体内。当赋形剂充当稀释剂时，其可为充当活性成分的媒剂、载体或介质的固体、半固体或液体材料。因此，所述组合物可呈以下形式：片剂、丸剂、粉末、锭剂、药囊、扁囊剂、酏剂、悬浮液、乳液、溶液、糖浆、气雾剂(呈固体形式或于液体介质中)、含有例如高达10重量％活性化合物的软膏剂、软明胶和硬明胶胶囊、栓剂、无菌可注射溶液以及无菌封装粉末。

在制备制剂时，活性化合物可在与其他成分组合之前进行研磨以提供适当粒径。如果活性化合物基本上不可溶，则它可研磨至小于200目的粒径。如果活性化合物基本上可溶于水，则粒径可通过研磨来调整以提供制剂中基本上均一的分布，例如约40目。

合适赋形剂的一些实例包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、海藻酸盐、黄蓍胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆以及甲基纤维素。制剂可另外包含：润滑剂，诸如滑石、硬脂酸镁和矿物油；润湿剂；乳化剂和助悬剂；防腐剂，诸如羟基苯甲酸甲酯和羟基苯甲酸丙酯；甜味剂；以及调味剂。本发明的组合物可被配制为使得活性成分在通过使用本领域已知的程序施用给患者之后快速、持续或延迟释放。

所述组合物可配制成单位剂型，各剂型含有约5mg至约100mg，更通常约10mg至约30mg的活性成分。术语“单位剂型”是指适合作为用于人类受试者和其他哺乳动物的单位剂量的物理分散单元，各单元含有经过计算产生所需治疗效果的预定量的活性材料以及合适的药物赋形剂。

活性化合物可在广泛剂量范围内有效并且通常以药物有效量施用。然而，应了解实际施用的化合物的量将通常由医师根据相关情况来确定，所述情况包括待治疗的病状、所选施用途径、施用的实际化合物、个别患者的年龄、体重和反应、患者症状的严重性及其类似情况。

为制备固体组合物如片剂，使主要活性成分与药物赋形剂混合以形成含有式I化合物的均质混合物的固体预配制组合物。当提及这些预配制组合物称为均质时，活性成分通常均匀分散在整个组合物中，以便组合物可易于细分成同等有效的单位剂型，诸如片剂、丸剂和胶囊。接着将此固体预配制物细分成上述类型的单位剂型，所述单位剂型含有例如0.1mg至约500mg本申请的活性成分。

含有式I化合物的片剂或丸剂可包覆包衣或以其他方式混配以提供具有延长作用的优势的剂型。举例而言，片剂或丸剂可包含内部剂量组分和外部剂量组分，后者为位于前者之上的包膜形式。两种组分可由用于抵抗胃中的崩解并且允许内部组分完整进入十二指肠或延迟释放的肠溶层分离。多种材料可用于所述肠溶层或包衣，所述材料包括多种聚合酸和聚合酸与诸如虫胶、十六醇和乙酸纤维素的材料的混合物。

可掺入本申请的化合物和组合物以便经口或通过注射施用的液体形式包括水溶液、合适调味的糖浆、水性或油性悬浮液，以及用可食用油(诸如棉籽油、芝麻油、椰子油或花生油)调味的乳液，以及酏剂及类似药物媒剂。

用于吸入或吹入的组合物包括药学上可接受的水性或有机溶剂或其混合物中的溶液和悬浮液、以及粉末。液体或固体组合物可含有如上所述的合适药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，组合物通过经口或经鼻呼吸途径施用以达成局部或全身性作用。组合物可通过使用惰性气体进行雾化。雾化溶液可直接从雾化装置呼吸，或雾化装置可连接于面罩帐或间歇式正压呼吸机。溶液、悬浮液或粉末组合物可经口或经鼻从以适当方式递送制剂的装置施用。

施用于患者的化合物或组合物的量将根据所施用物、施用目的(诸如预防或疗法)、患者状态、施用方式及其类似因素而变化。在治疗应用中，组合物可以足以治愈或至少部分阻止疾病及其并发症的症状的量施用于已罹患所述疾病的患者。有效剂量将取决于所治疗的疾病状况，以及主治临床医师根据诸如疾病严重性、患者年龄、体重和一般状况及其类似因素的因素所作的判断。

施用于患者的组合物可呈上述药物组合物形式。这些组合物可通过常规灭菌技术灭菌，或可经过无菌过滤。水溶液可包装用于按原样使用，或可冻干，冻干制剂在施用之前与无菌水性载体组合。化合物制剂的pH通常将在3与11之间、更优选为5至9并且最优选为7至8。应了解使用某些上述赋形剂、载体或稳定剂将导致形成药物盐。

式I化合物的治疗剂量可根据例如治疗所欲达成的特定用途、化合物的施用方式、患者的健康和状况以及处方医师的判断而变化。药物组合物中式I化合物的比例或浓度可根据许多因素而变化，所述因素包括剂量、化学特征(例如，疏水性)和施用途径。举例而言，式I化合物可以含有约0.1％至约10％w/v所述化合物的生理缓冲水溶液形式提供以用于胃肠外施用。一些典型剂量范围为每日约1μg/kg至约1g/kg体重。在一些实施方案中，剂量范围为每日约0.01mg/kg至约100mg/kg体重。剂量可能取决于此类变量，诸如疾病或病症的类型和进展程度、特定患者的总体健康状态、所选化合物的相对生物功效、赋形剂的配方以及其施用途径的。有效剂量可从由活体外或动物模型测试系统获得的剂量-反应曲线外推而来。

式I化合物还可与一种或多种额外活性成分组合配制，所述一种或多种额外活性成分可包括任何药剂，诸如抗病毒剂、疫苗、抗体、免疫增强剂、免疫抑制剂、消炎剂及其类似物。

本申请还包括适用于例如治疗或预防IDO相关疾病或病症、肥胖症、糖尿病和本文提及的其他疾病的药物试剂盒，其包括一个或多个容器，所述一个或多个容器含有包含治疗有效量的式I化合物的药物组合物。所述试剂盒还可在必要时包括一种或多种不同的常规药物试剂盒组分，诸如像具有一种或多种药学上可接受的载体的容器、额外容器等，如本领域技术人员应容易了解。试剂盒中还可包括呈插页或标签形式的说明书，其指示待施用的组分的量、施用的指导和/或混合组分的指导。

实施例

本发明将借助于特定实施例更详细地加以描述。提供以下实施例以达成说明目的，并且不意图以任何方式限制本发明。本领域技术人员应容易了解可改变或修改以生成基本上相同结果的多种非关键性参数。

实施例1. 4-({2-[(氨基磺酰基)氨基]乙基}氨基)-N-(3-溴-4-氟苯基)-N′-羟基-1，2，5-噁二唑-3-甲脒的合成

步骤A：4-氨基-N′-羟基-1，2，5-噁二唑-3-甲脒(2)

将丙二腈[Aldrich，产品#M1407](320.5g，5mol)添加至水(7L)中，预热至45℃并且在45℃下搅拌5分钟。将所得溶液在冰浴中冷却，并且添加亚硝酸钠(380g，5.5mol，1.1当量)。当温度达到10℃时，添加6N盐酸(55mL)。随着温度达到16℃，发生轻微放热反应。15分钟后，移除冷浴并且将反应混合物在16℃-18℃下搅拌1.5h。将反应混合物冷却至13℃，并且一次性添加50％盐酸羟胺水溶液(990g，15mol，3.0当量)。使温度升至26℃。当放热反应平息时，移除冷浴并且在26℃-27℃下继续搅拌1h，接着使其缓慢回流。使回流维持2h并且接着使反应混合物逐渐冷却过夜。将反应混合物在冰浴中搅拌并且经40分钟逐份添加6N盐酸800mL)以调节至pH 7.0。在冰浴中于5℃下继续搅拌。通过过滤收集沉淀物，用水充分洗涤并且在真空烘箱中(50℃)干燥，得到呈灰白色固体状的所需产物(644g，90％)。¹³C NMR(75MHz，CD₃OD)：6156.0，145.9，141.3；C₃H₅N₅O₂(MW 143.10)，LCMS(EI)m/e 144.0(M⁺+H)。

步骤B：4-氨基-N-羟基-1，2，5-噁二唑-3-甲亚胺酰氯(3)

将4-氨基-N′-羟基-1，2，5-噁二唑-3-甲脒(422g，2.95mol)添加至水(5.9L)、乙酸(3L)和6N盐酸(1.475L，3.0当量)的混合物中并且将悬浮液在42℃-45℃下搅拌直至获得澄清溶液。添加氯化钠(518g，3.0当量)并且将此溶液在冰/水/甲醇浴中搅拌。经3.5h添加亚硝酸钠(199.5g，0.98当量)于水(700mL)中的溶液，同时维持温度低于0℃。完全添加后，在冰浴中继续搅拌1.5h并且接着使反应混合物升温至15℃。通过过滤收集沉淀物，将其用水充分洗涤，溶解于乙酸乙酯(3.4L)中，用无水硫酸钠(500g)处理并且在室温下搅拌1h。使此悬浮液通过硫酸钠(200g)过滤并且将滤液在旋转蒸发器上浓缩。将残余物溶解于甲基叔丁基醚(5.5L)中，用活性炭(40g)处理，在室温下搅拌40分钟并且通过硅藻土过滤。在旋转蒸发器中移除溶剂并且在真空烘箱中(45℃)干燥所得产物，得到呈灰白色固体状的所需产物(256g，53.4％)。¹³C NMR(100MHz，CD₃OD)δ155.8，143.4，129.7；C₃H₃ClN₄O₂(MW 162.53)，LCMS(EI)m/e 163/165(M⁺+H)。

步骤C：4-氨基-N-(3-溴-4-氟苯基)-N′-羟基-1，2，5-噁二唑-3-甲脒(4)

将4-氨基-N-羟基-1，2，5-噁二唑-3-甲亚胺酰氯(33.8g，208mmol)与水(300mL)混合。在60℃下，将3-溴-4-氟苯胺(Sigma-Aldrich)(43.6g，229mmol，1.1当量)添加至悬浮液中同时搅拌10分钟。在60℃下，在搅拌下经15分钟添加碳酸氢钠(26.3g，313mmol，1.5当量)于水(300mL)中的溶液。搅拌20分钟后，LCMS指示反应完成。接着将反应混合物冷却至室温并且用乙酸乙酯(2×300mL)萃取。将合并的乙酸乙酯溶液经无水硫酸钠干燥并且浓缩，得到呈灰白色固体状的所需产物(65g，99％)，其无需进一步纯化即用于后续反应中。C₉H₇BrFN₅O₂(MW 316.09)，LCMS(EI)m/e 316/318(M⁺+H)。

步骤D：3-(4-氨基-1，2，5-噁二唑-3-基)-4-(3-溴-4-氟苯基)-1，2，4-噁二唑-5(4H)-酮(5)

将4-氨基-N-(3-溴-4-氟苯基)-N′-羟基-1，2，5-噁二唑-3-甲脒(65.7g，208mmol)、N，N-羰基二咪唑(Sigma-Aldrich)(50.6g，312mmol，1.5当量)和乙酸乙酯(750mL)的混合物加热至60℃并且搅拌20分钟。LCMS指示反应完成。将反应物冷却至室温，用1N盐酸(2×750mL)洗涤，经硫酸钠干燥，并且浓缩。将粗产物用二氯甲烷、乙酸乙酯和乙醚的混合物研磨，得到呈灰白色固体状的所需产物(60.2g，85％)。¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)δ8.05(m，1H)，7.69(m，1H)，7.57(t，1H，J＝8.7Hz)，6.58(s，2H)；C₁₀H₅BrFN₅O₃(MW 342.08)，LCMS(EI)m/e 342/344(M⁺+H)。

步骤E：[2-({4-[2-(3-溴-4-氟苯基)-5-氧代-2，5-二氢-1，2，4-噁二唑-3-基]-1，2，5-噁二唑-3-基}氨基)乙基]氨基甲酸叔丁酯(7)

在氮气下，在搅拌下向三氟乙酸(20.0mL)和四氢呋喃(10.0mL)的溶液中逐份添加三乙酰氧基硼氢化钠(10.59g，49.97mmol，10.0当量)。将此混合物在室温下搅拌10分钟并且接着冷却至-5℃。在搅拌下经30分钟逐滴添加3-(4-氨基-1，2，5-噁二唑-3-基)-4-(3-溴-4-氟苯基)-1，2，4-噁二唑-5(4H)-酮(1.71g，5.0mmol)和(2-氧代乙基)氨基甲酸叔丁酯(Sigma-Aldrich)(1.99g，12.5mmol，2.5当量)于THF(15.0mL)中的溶液，同时维持温度低于0℃。将反应物在-5℃至0℃下搅拌并且以4h时间间隔在20分钟、40分钟时逐滴添加额外部分的含(2-氧代乙基)氨基甲酸叔丁酯(0.20g，1.2mmol，0.24当量)的THF(1.0mL)。HPLC指示5.25h后反应完成。将反应混合物倒入冰冷碳酸氢钠(500mL)中并且将此溶液在室温下搅拌过夜。通过过滤收集沉淀物并且用盐水洗涤。将所得残余物与庚烷(40mL)和乙醚(40mL)混合并且在室温下搅拌5h。通过过滤收集沉淀物，将其用乙醚洗涤并且在真空烘箱中干燥，得到呈灰白色固体状的所需产物(1953mg，80.5％)。¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)δ8.08(m，1H)，7.71(m，1H)，7.59(t，1H，J＝8.7Hz)，6.94(m，1H)，6.52(m，1H)，3.32(m，2H)，3.15(m，2H)，1.36(s，9H)；C₁₇H₁₈BrFN₆O₅(MW485.26)；LCMS(EI)m/e 507/509(M⁺+Na)。

步骤F：盐酸3-{4-[(2-氨基乙基)氨基]-1，2，5-噁二唑-3-基}-4-(3-溴-4-氟苯基)-1，2，4-噁二唑-5(4H)-酮(8)

方法A(由[2-({4-[2-(3-溴-4-氟苯基)-5-氧代-2，5-二氢-1，2，4-噁二唑-3-基]-1，2，5-噁二唑-3-基}氨基)乙基]氨基甲酸叔丁酯制备；步骤E)：

向500-mL烧瓶中装入[2-({4-[2-(3-溴-4-氟苯基)-5-氧代-2，5-二氢-1，2，4-噁二唑-3-基]-1，2，5-噁二唑-3-基}氨基)乙基]氨基甲酸叔丁酯(20g，41.2mmol)和异丙醇(255mL)。在室温下搅拌浆料。将氯化氢气体(7.55g，207mmol，5.0当量)用表面下玻璃管经16分钟添加至浆料中。接着将乙酸乙酯(111mL)添加至批料中并且将反应物加热至43℃并搅拌7.5h。将批料冷却至19℃并且添加乙酸乙酯(44mL)。过滤浆料，并且用乙酸乙酯(2×55mL)洗涤所得残余物。将分离的固体在减压下于45℃下干燥15h，得到呈灰白色至白色固体状的所需产物(16.61g，95.5％产率)。¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)δ8.11(bs，3H)，7.78(m，1H)，7.73(m，1H)，7.59(t，1H，J＝8.7Hz)，6.74(t，1H，J＝6.1Hz)，3.50(m，2H)，3.02(m，2H)；C₁₂H₁₁BrClFN₆O₃，(MW 421.61；C₁₂H₁₀BrFN₆O₃(关于游离碱)，MW 385.15)，LCMS(EI)m/e 385/387(M⁺+H)。

方法B(由3-(4-氨基-1，2，5-噁二唑-3-基)-4-(3-溴-4-氟苯基)-1，2，4-噁二唑-5(4H)-酮直接制备；步骤D)：

将三乙酰氧基硼氢化钠(2.33g，11.0mmol，11.0当量)与三氟乙酸(12.0mL，155.8mmol，155.8当量)混合。将所得溶液在室温下混合30分钟。在N₂下搅拌3-(4-氨基-1，2，5-噁二唑-3-基)-4-(3-溴-4-氟苯基)-1，2，4-噁二唑-5(4H)-酮(5，0.342g，1.0mmol)和(2-氧代乙基)氨基甲酸叔丁酯(Sigma-Aldrich)(1.04g，6.51mmol，6.5当量)于二氯甲烷(10.0mL)和乙腈(6.0mL)中的溶液。将此溶液冷却至-5℃并且经5分钟逐滴添加三乙酰氧基硼氢化钠和三氟乙酸的溶液。将反应物在室温下搅拌4h。HPLC和LC-MS(M⁺-Boc+H：385/387，溴化物图案)指示所需产物与起始材料的比率为4∶1。浓缩混合物并且用二氯甲烷(10mL)稀释。将溶液冷却至0℃并且缓慢添加4N氢氧化钠，同时维持温度为0℃-5℃，以调节pH至8-9。用二氯甲烷(3×10mL)萃取水层。将合并的二氯甲烷溶液用碳酸氢钠和盐水洗涤，经硫酸钠干燥并且浓缩。接着将粗残余物溶解于二氯甲烷(6.0mL)中并且将所得溶液冷却至0℃。在0℃-5℃下逐滴添加含4N盐酸的二噁烷(3.0mL)。将混合物在室温下搅拌20分钟。通过过滤收集沉淀物，用乙醚洗涤并且在真空中干燥，得到呈灰白色固体状的所需产物(289mg，54％)。¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)δ8.11(bs，3H)，7.78(m，1H)，7.73(m，1H)，7.59(t，1H，J＝8.7Hz)，6.74(t，1H，J＝6.1Hz)，3.50(m，2H)，3.02(m，2H)；C₁₂H₁₁BrClFN₆O₃，(MW421.61；C₁₂H₁₀BrFN₆O₃(关于游离碱)，MW 385.15)，LCMS(EI)m/e 385/387(M⁺+H)。

步骤G：({[2-({4-[4-(3-溴-4-氟苯基)-5-氧代-4，5-二氢-1，2，4-噁二唑-3-基]-1，2，5-噁二唑-3-基}氨基)乙基]氨基}磺酰基)氨基甲酸叔丁酯(9)

在室温下，在20-L玻璃反应器中装入盐酸3-{4-[(2-氨基乙基)氨基]-1，2，5-噁二唑-3-基}-4-(3-溴-4-氟苯基)-1，2，4-噁二唑-5(4H)-酮(1200g，2.846mol)和二氯甲烷(6.5L)。经7分钟将三乙胺(950g，9.39mol，3.3当量)添加至批料中。接着将批料冷却至-14.6℃。

在5-L圆底烧瓶中装入叔丁醇(253g，3.41mol，1.2当量)和二氯甲烷(2.6L)。将溶液冷却至0.9℃。经43分钟向此溶液中添加氯磺酰基异氰酸酯(463g，3.27mol，1.15当量)，同时维持批料温度低于10℃。将所得(氯磺酰基)氨基甲酸叔丁酯溶液在3℃-5℃下保持1h。

将(氯磺酰基)氨基甲酸叔丁酯溶液经73分钟添加至反应器中，同时维持批料温度低于0℃。接着将批料经1h升温至10℃并且接着在10℃-14℃下搅拌1h。将水(4.8L)添加至批料中并且将淬灭的反应混合物在室温下搅拌14.5h。使批料沉降并且各相分离。分离二氯甲烷溶液，保持于反应器中并且经25分钟装入乙酸(513g)以使产物沉淀。将所得浆料在20℃下搅拌2.5h。通过过滤分离产物并且用二氯甲烷(1.8L)洗涤。将产物在减压(-30inHg)下于45℃下干燥16h，得到呈白色固体状的所需产物(1342g，83.5％产率)。¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)：δ10.90(s，1H)，8.08(dd，J＝6.2，2.5Hz，1H)，7.72(m，1H)，7.59(t，J＝8.6Hz，1H)，6.58(t，J＝5.7Hz，1H)，3.38(dd，J＝12.7，6.2Hz，2H)，3.10(dd，J＝12.1，5.9Hz，2H)，1.41(s，9H)。C₁₇H₁₉BrFN₇O₇S(MW 564.34)，LCMS(EI)m/e 585.9/587.9(M⁺+Na)。

步骤H：N-[2-({4-[4-(3-溴-4-氟苯基)-5-氧代-4，5-二氢-1，2，4-噁二唑-3-基]-1，2，5-噁二唑-3-基}氨基)乙基]磺酰胺(10)

在20℃下向含有({[2-({4-[4-(3-溴-4-氟苯基)-5-氧代-4，5-二氢-1，2，4-噁二唑-3-基]-1，2，5-噁二唑-3-基}氨基)乙基]氨基}磺酰基)氨基甲酸叔丁酯(1200g，2.126mol)的20-L烧瓶中添加乙醇(12L)。将所得混合物在室温下搅拌并且装入氯化氢气体(472g，12.9mol，6.07当量)。将批料加热至50℃并且将所述温度维持3h直至反应完成。通过在33℃-39℃下真空蒸馏来移除溶剂并且收集6Kg馏出物。将乙酸乙酯(6.8L，6.1Kg)添加至批料中并且蒸馏，收集5.1Kg馏出物。将乙酸乙酯(7.2L，6.48Kg)添加至批料中并且蒸馏，收集5.1Kg馏出物。将乙酸乙酯(2.4L，2.14Kg)添加至批料中，以调节溶剂比率。¹H NMR指示乙酸乙酯与乙醇的摩尔比为1.0∶0.1。将溶液加热至65℃。在60℃-65℃下，经43分钟将正庚烷(4.1kg)添加至溶液中。将所得浆料在65℃下搅拌1h。经2.5h将浆料冷却至20℃并且在此温度下搅拌15h。通过过滤收集产物并且用正庚烷(2.42L)洗涤。将产物在减压下于45℃下干燥65h，得到呈灰白色固体状的所需产物(906g，91.8％产率)。¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ8.08(dd，J＝6.2)7.72(m，1H)，7.59(t，J＝8.7Hz，1H)，6.67(t，J＝5.9Hz，1H)，6.55(s，2H)6.52(t，J＝6.0Hz，1H)，3.38(dd，J＝12.7，6.3Hz，2H)，3.11(dd，J＝12.3，6.3Hz，2H)；C₁₂H₁₁BrFN₇O₅S(MW 464.23)，LCMS(EI)m/e 485.8/487.8(M⁺-C₅H₈O₂+Na)。

步骤I：4-({2-[(氨基磺酰基)氨基]乙基}氨基)-N-(3-溴-4-氟苯基)-N′-羟基-1，2，5-噁二唑-3-甲脒(11)

向20-L玻璃反应器中添加N-[2-({4-[4-(3-溴-4-氟苯基)-5-氧代-4，5-二氢-1，2，4-噁二唑-3-基]-1，2，5-噁二唑-3-基}氨基)乙基]磺酰胺(799.4g，1.72mol)和THF(3.2L)。将所得溶液在20℃下搅拌7分钟，并且接着装入水(1.6L)。将批料冷却至2℃并且经8分钟装入30重量％氢氧化钠溶液(475mL，666.4g，4.99mol，2.9当量)。将批料升温至20℃并且将所述温度维持16h。接着经23分钟在批料中装入甲基叔丁基醚(8.0L)。添加水(2.7L)并且将批料冷却至约0℃。接着经9分钟在批料中装入85重量％磷酸(370.7g，3.22mol，1.9当量)。将批料升温至20℃并且搅拌1h。使批料沉降并且各相分离。将有机层保持于反应器中并且装入水(2.9L)和85重量％磷酸(370.7g，3.22mol)并且在20℃下搅拌1h。使批料沉降并且各相分离。将有机层保持于反应器中并且装入水(3.2L)并在20℃下搅拌1h。使批料沉降并且各相分离。将有机溶液保持于反应器中并且在减压下在20℃下蒸馏以移出3.4Kg馏出物。将乙醇(4.8L)装入批料中并且使批料蒸馏至3.2L体积。此蒸馏过程再重复一次。将乙醇(0.6L)添加至批料中以调节批料体积至4L。将批料在20℃下搅拌16h，并且接着装入水(6.39L)。将所得浆料在20℃下搅拌5h。通过过滤收集产物并且用乙醇(529mL)和水(1059mL)的混合物洗涤两次。将产物在减压下于45℃下干燥65h，得到呈白色固体状的所需产物(719.6g，95.4％)。¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)：δ11.51(s，1H)，8.90(s，1H)，7.17(t，J＝8.8Hz，1H)，7.11(dd，J＝6.1，2.7Hz，1H)，6.76(m，1H)，6.71(t，J＝6.0Hz，1H)，6.59(s，2H)，6.23(t，J＝6.1Hz，1H)，3.35(dd，J＝10.9，7.0Hz，2H)，3.10(dd，J＝12.1，6.2Hz，2H)；C₁₁H₁₃BrFN₇O₄S(MW 438.23)，LCMS(EI)m/e 437.9/439.9(M⁺+H)。

实施例2.N-[2-({4-[4-(3-溴-4-氟苯基)-5-氧代-4，5-二氢-1，2，4-噁二唑-3-基]-1，2，5-噁二唑-3-基}氨基)乙基]磺酰胺的替代制备

步骤1：{[(叔丁氧羰基)-氨基]磺酰基}氨基乙酸乙酯(13)

将氯磺酰基异氰酸酯(Sigma-Aldrich)(5.0mL，57.4mmol)于二氯甲烷(100mL)中的溶液冷却至0℃。将叔丁醇(4.26g，57.4mmol，1.0当量)经由加料漏斗添加至二氯甲烷(100mL)中。将此溶液在0℃下搅拌30分钟。在0℃下添加甘氨酸乙酯盐酸盐(8.82g，63.2mmol，1.1当量)，继而逐滴添加三乙胺(20.0mL，144mmol，2.5当量)。将此反应混合物在室温下搅拌4h。将反应物用二氯甲烷(100mL)稀释并且用0.1N盐酸和盐水洗涤。将有机层经硫酸钠干燥并且浓缩，得到呈粗灰白色固体状的所需产物(13.2g，81.4％)，其无需进一步纯化即用于后续反应中。¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)δ10.88(s，1H)，8.07(t，1H，J＝6.1Hz)，4.08(q，2H，J＝7.1Hz)，3.78(d，2H，J＝6.1Hz)，1.40(s，9H)，1.18(t，3H，J＝7.1Hz)。

步骤2a.(烯丙基{[烯丙基(叔丁氧羰基)氨基]磺酰基}氨基)乙酸乙酯(14a)

在N₂下，在室温下将({[(叔丁氧羰基)氨基]磺酰基}氨基乙酸乙酯(1.0g，3.54mmol)与碳酸钾(2.45g，17.7mmol，5.0当量)和乙腈(23.0mL)混合。逐滴添加烯丙基溴(1.84mL，21.2mmol，6.0当量)。将此反应混合物加热至70℃并且在此温度下搅拌14h。HPLC和LCMS指示反应完成。过滤反应物并且浓缩滤液。将残余物溶解于二氯甲烷中并且用碳酸氢钠和盐水洗涤。将有机层经硫酸钠干燥并且浓缩，得到呈粗灰白色固体状的所需产物(1.11g，87％)，其无需进一步纯化即用于后续反应中。¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)δ5.75(m，2H)，5.20(m，4H)，4.12(m，6H)，3.89(m，2H)，1.43(s，9H)，1.18(t，3H，J＝8.7Hz)。

步骤2b.[{[(叔丁氧羰基)(4-甲氧基苯甲基)氨基]磺酰基}(4-甲氧基苯甲基)氨基]乙酸乙酯(14b)

在室温下，将({[(叔丁氧羰基)氨基]磺酰基}氨基)乙酸乙酯(1.00g，4.0mmol)与N，N-二甲基甲酰胺(DMF，6.0mL)混合并且搅拌。碘化钠(0.01g，0.1mmol，0.025当量)、碳酸钾(2.40g，20mmol，5.0当量)和对甲氧基苯甲基氯(2.64mL，19.5mmol，4.875当量)添加至混合物中。将此反应物升温至80℃并且在80℃下搅拌2h。LCMS指示反应完成。将反应物冷却至室温并且通过硅藻土过滤。将硅藻土床用二氯甲烷洗涤并且浓缩合并的有机滤液。将浓缩的残余物溶解于二氯甲烷(20mL)中并且用碳酸氢钠(5×12mL)和盐水洗涤。将有机层经硫酸钠干燥并且浓缩。将残余物在硅胶(0-40％乙酸乙酯/己烷梯度洗脱)上纯化，得到呈灰白色固体状的所需产物(1.39g，80％)。¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)δ7.22(m，2H)，7.14(m，2H)，6.88(m，4H)，4.64(s，2H)，4.33(s，2H)，4.03(q，2H，J＝7.1Hz)，3.92(s，2H)，3.72(s，3H)，3.71(s，3H)，1.39(s，9H)，1.14(t，3H，J＝7.1Hz)。

步骤3a.烯丙基{[烯丙基(2-氧代乙基)氨基]磺酰基}氨基甲酸叔丁酯(15a)

将(烯丙基{[烯丙基(叔丁氧羰基)氨基]磺酰基}氨基)乙酸乙酯(1.11g，3.05mmol)于二氯甲烷(15mL)中的溶液在-78℃下在N₂下用含1.0M二异丁基氢化铝的二氯甲烷(3.66mL，3.66mmol，1.2当量)处理。将反应混合物在-78℃下搅拌1h并且接着用甲醇(1.5mL)淬灭，并且用饱和酒石酸钾钠溶液(65mL)处理。将此溶液在室温下搅拌过夜。接着将水层用二氯甲烷(3×20mL)萃取。将合并的二氯甲烷溶液用盐水洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并且浓缩，得到呈粗黏稠无色油状的所需产物(0.62g，64％)，其无需进一步纯化即用于后续反应中。¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)δ9.45(s，1H)，5.76(m，2H)，5.18(m，4H)，4.15(m，4H)，3.72(m，2H)，1.43(s，9H)。

步骤3b.(4-甲氧基苯甲基){[(4-甲氧基苯甲基)(2-氧代乙基)氨基]磺酰基}氨基甲酸叔丁酯(15b)

将[{[(叔丁氧羰基)(4-甲氧基苯甲基)氨基]磺酰基}(4-甲氧基苯甲基)氨基]乙酸乙酯(5.30g，10mmol)于二氯甲烷(20.0mL)中的溶液在-78℃下在N₂下用含1.0M二异丁基氢化铝的二氯甲烷(12.2mL，12.2mmol，1.22当量)处理。将反应混合物在-78℃下搅拌3h。接着将反应物用甲醇(3mL)淬灭并且用二氯甲烷(100mL)和饱和酒石酸钾钠溶液(150mL)处理。将此溶液在室温下搅拌过夜。接着将水层用二氯甲烷(3×20mL)萃取。将合并的二氯甲烷溶液用盐水洗涤，经硫酸钠干燥并且浓缩。将残余物接着在硅胶(0-30％乙酸乙酯/己烷梯度洗脱)上纯化，得到呈灰白色固体状的所需产物(3.45g，71％)。¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)δ9.24(s，1H)，7.23(m，4H)，6.88(m，4H)，4.68(s，2H)，4.31(s，2H)，4.07(s，2H)，3.72(s，3H)，3.71(s，3H)，1.40(s，9H)。

步骤4a.烯丙基(N-烯丙基-N-(2-(4-(4-(3-溴-4-氟苯基)-5-氧代-4，5-二氢-1，2，4-噁二唑-3-基)-1，2，5-噁二唑-3-基氨基)乙基)氨磺酰基)氨基甲酸叔丁酯(16a)

在环境温度下向50-mL烧瓶中添加三乙酰氧基硼氢化钠(1.06g，5.0mmol，1.0当量)、三氟乙酸(TFA，2.0mL，26mmol)和四氢呋喃(THF，1.0mL)。将此混合物在N₂下冷却至-5℃并且在0℃-5℃下搅拌10分钟。在0℃-5℃下经5分钟向此溶液中逐滴添加含3-(4-氨基-1，2，5-噁二唑-3-基)-4-(3-溴-4-氟苯基)-1，2，4-噁二唑-5(4H)-酮(0.171g，5.0mmol；步骤D)和烯丙基{[烯丙基(2-氧代乙基)氨基]磺酰基}氨基甲酸叔丁酯(0.398g，2.5mmol，0.5当量)的THF(1.5mL)。将所得反应混合物在N₂下在0℃-5℃下搅拌。在20分钟、40分钟和2.5h时间点，在0℃-5℃下逐滴添加烯丙基{[烯丙基(2-氧代乙基)氨基]磺酰基}氨基甲酸叔丁酯(0.040g，0.125mmol，0.25当量)于THF(0.20mL)中的溶液。在2.5h，在0℃-5℃下添加三乙酰氧基硼氢化钠(0.211g，1.0mmol，0.2当量)于三氟乙酸(TFA，1.5mL，9.5mmol)中的溶液。将反应物升温至室温并且搅拌过夜。接着讲反应混合物倒入冰冷饱和碳酸钠溶液(50mL)中并且用二氯甲烷(3×20mL)萃取。将合并的二氯甲烷萃取物用盐水洗涤，经硫酸钠干燥并且浓缩。接着将残余物在硅胶(0-75％乙酸乙酯/己烷梯度洗脱)上纯化，得到呈灰白色固体状的所需产物(0.239g，74.2％)。¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)δ8.07(m，1H)，7.71(m，1H)，7.58(t，1H，J＝8.7Hz)，6.62(m，1H)，5.77(m，2H)，5.19(m，4H)，4.17(m，2H)，3.89(m，2H)，3.44(m，2H)，3.38(m，2H)，1.42(s，9H)；C₂₃H₂₇BrFN₇O₇S(MW 644.47)，LCMS(EI)m/e 544/546(M⁺-Boc+H)。

步骤4b.N-(2-(4-(4-(3-溴-4-氟苯基)-5-氧代-4，5-二氢-1，2，4-噁二唑-3-基)-1，2，5-噁二唑-3-基氨基)乙基)-N-(4-甲氧基苯甲基)氨磺酰基(4-甲氧基苯甲基)氨基甲酸叔丁酯(16b)

在环境温度下向50-mL烧瓶中添加三乙酰氧基硼氢化钠(0.50g，2.37mmol，4.74当量)、三氟乙酸(TFA，1.0mL，13mmol)和四氢呋喃。将此混合物在N₂下冷却至0℃-5℃并且在0℃-5℃下搅拌10分钟。在0℃-5℃下向此溶液中添加含(4-甲氧基苯甲基){[(4-甲氧基苯甲基)(2-氧代乙基)氨基]磺酰基}氨基甲酸叔丁酯(0.40g，0.84mmol，1.68当量)和3-(4-氨基-1，2，5-噁二唑-3-基)-4-(3-溴-4-氟苯基)-1，2，4-噁二唑-5(4H)-酮(0.17g，0.50mmol；步骤D)的四氢呋喃(THF，1.50mL)。将反应物在0℃-5℃下搅拌45分钟并且接着在0℃-5℃下添加(4-甲氧基苯甲基){[(4-甲氧基苯甲基)(2-氧代乙基)氨基]磺酰基}氨基甲酸叔丁酯(0.12g，0.20mmol，0.4当量)于THF(0.50mL)中的溶液。在0℃-5℃下搅拌1h后，将反应物在搅拌下逐渐升温至室温。在2.5h和4.5h时间点，添加三氟乙酸(0.25mL)。在5h，添加(4-甲氧基苯甲基){[(4-甲氧基苯甲基)(2-氧代乙基)氨基]磺酰基}氨基甲酸叔丁酯(0.060g，0.1mmol，0.2当量)于THF(0.20mL)中的溶液。在6.5h，添加三乙酰氧基硼氢化钠(0.060g，0.24mmol，0.48当量)于三氟乙酸(0.25mL)中的溶液。HPLC指示约4％的3-(4-氨基-1，2，5-噁二唑-3-基)-4-(3-溴-4-氟苯基)-1，2，4-噁二唑-5(4H)-酮起始材料(来自步骤D)仍剩余。将反应混合物在室温下搅拌过夜。HPLC指示反应完成。将反应混合物倒入冰冷饱和碳酸钠溶液(50mL)中并且将混合物用二氯甲烷(3×20mL)萃取。将合并的二氯甲烷萃取物用盐水洗涤，经硫酸钠干燥并且浓缩。接着将残余物在硅胶(0-30％乙酸乙酯/己烷梯度洗脱)上纯化，得到呈灰白色固体状的所需产物(0.33g，82.5％)。¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)δ8.06(m，1H)，7.69(m，1H)，7.57(t，1H，J＝8.7Hz)，7.22(m，4H)，6.87(m，4H)，6.48(m，1H)，4.72(s，2H)，4.36(s，2H)，3.70(S，6H)，3.39(m，2H)，3.31(m，2H)，1.37(s，9H)；C₃₃H₃₅BrFN₇O₉S(MW804.64)，LCMS(EI)m/e 826/828(M⁺-Boc+Na)。

步骤5：N-[2-({4-[4-(3-溴-4-氟苯基)-5-氧代-4，5-二氢-1，2，4-噁二唑-3-基]-1，2，5-噁二唑-3-基}氨基)乙基]磺酰胺(10)

在环境温度下向25-mL烧瓶中添加含{[[2-({4-[4-(3-溴-4-氟苯基)-5-氧代-4，5-二氢-1，2，4-噁二唑-3-基]-1，2，5-噁二唑-3-基}氨基)乙基](4-甲氧基苯甲基)氨基]磺酰基}(4-甲氧基苯甲基)氨基甲酸叔丁酯(40.2mg，0.050mmol)的三氟乙酸(TFA，0.50mL，6.5mmol)。将此反应混合物在N₂下加热至70℃并且搅拌1h。HPLC指示反应完成。将反应混合物冷却至室温并且蒸发掉TFA。将残余TFA通过用二氯甲烷(3×10mL)处理，接着在真空下蒸发来移除。接着将残余物用二氯甲烷和甲醇研磨，得到呈粗灰白色固体状的所需产物(20mg，87％)。¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ8.08(dd，J＝6.2，2.5Hz，1H)，7.72(m，1H)，7.59(t，J＝8.7Hz，1H)，6.67(t，J＝5.9Hz，1H)，6.55(s，2H)6.52(t，J＝6.0Hz，1H)，3.38(dd，J＝12.7，6.3Hz，2H)，3.11(dd，J＝12.3，6.3Hz，2H)；C₁₂H₁₁BrFN₇O₅S(MW 464.23)，LCMS(EI)m/e487.8/489.8(M⁺+Na)。

实施例3.N-[2-({4-[4-(3-溴-4-氟苯基)-5-氧代-4，5-二氢-1，2，4-噁二唑-3-基]-1，2，5-噁二唑-3-基)氨基)乙基]磺酰胺的替代制备

步骤1a.N-(2，2-二甲氧基乙基)氨磺酰基氨基甲酸叔丁酯(17a)

将氯磺酰基异氰酸酯(11.32g，80mmol)于二氯甲烷(120mL)中的溶液冷却至0℃。经由加料漏斗添加叔丁醇(7.65mL，80.0mmol，1.0当量)。将混合物在0℃下搅拌1.5h。经由加料漏斗向此混合物中逐滴添加氨基乙醛二甲缩醛(8.76mL，80.0mmol，1.0当量)和三乙胺(TEA，33.4mL，240mmol，3.0当量)于二氯甲烷(DCM，120.0mL)中的溶液。将反应物升温至室温并且搅拌过夜。将反应物用0.1N盐酸处理，并且将有机层用盐水洗涤，经硫酸钠干燥并且浓缩，得到呈粗灰白色固体状的所需产物(15.6g，68.5％)，其无需进一步纯化即用于后续反应中：¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)δ10.84(s，1H)，7.62(t，1H，J＝6.0Hz)，4.38(t，1H，J＝5.5Hz)，3.24(s，6H)，2.96(dd，2H，J＝5.8Hz)，1.41(s，9H)。

步骤1b.N-(2，2-二甲氧基乙基)氨磺酰基氨基甲酸苯甲酯(17b)

将氯磺酰基异氰酸酯(16.26g，114.9mmol)于二氯甲烷(100mL)中的溶液冷却至0℃。经由加料漏斗添加苯甲醇(12.44g，115.0mmol，1.0当量)。将混合物在0℃下搅拌0.5h。在低于15℃下经由加料漏斗向此混合物中逐滴添加氨基乙醛二甲缩醛(13.25g，126.0mmol，1.1当量)和三乙胺(TEA，17.4g，172mmol，1.5当量)的混合物。将反应物升温至室温并且搅拌过夜。将反应混合物用0.5N盐酸(100mL)处理并且将收集的有机相用盐水洗涤，经硫酸钠干燥并且在真空中浓缩，得到呈粗灰白色固体状的所需产物(23.5g，64.3％)。¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)δ11.29(s，1H)，7.90(t，1H，J＝6.0Hz)，7.37(m，5H)，5.12(s，2H)，4.35(t，1H，J＝5.5Hz)，3.21(s，6H)，2.97(dd，2H，J＝5.8Hz)。

步骤1c.N-(2，2-二甲氧基乙基)氨磺酰基氨基甲酸乙酯(17c)

将氯磺酰基异氰酸酯(11.32g，80mmol)于二氯甲烷(120mL)中的溶液冷却至0℃。经由加料漏斗添加乙醇(4.67mL，80.0mmol，1.0当量)。将混合物在0℃下搅拌1.5h。在0℃下经由加料漏斗向此混合物中逐滴添加氨基乙醛二甲缩醛(8.76mL，80.0mmol，1.0当量)、三乙胺(TEA，33.4mL，240mmol，3.0当量)于二氯甲烷(DCM，120.0mL)中的溶液。将反应物升温至室温并且搅拌过夜。将反应物用0.1N盐酸处理并且将收集的有机相用盐水洗涤，经硫酸钠干燥并且在真空中浓缩，得到呈粗灰白色固体状的所需产物(11.2g，55％)。¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)δ11.13(s，1H)，7.81(t，1H，J＝6.0Hz)，4.37(t，1H，J＝5.5Hz)，4.09(q，2H，J＝7.1Hz)，3.23(s，6H)，2.97(dd，2H，J＝5.8Hz)，1.19(t，3H，J＝7.1Hz)。

步骤1d.N-(2，2-二甲氧基乙基)氨磺酰基氨基甲酸2，2，2-三氯乙酯(17d)

将氯磺酰基异氰酸酯(6.96mL，80mmol)于二氯甲烷(120mL)中的溶液冷却至0℃。在0℃下，经由加料漏斗添加2，2，2-三氯乙醇(7.67mL，80.0mmol，1.0当量)。将此混合物在0℃下搅拌1.5h。接着在0℃下经由加料漏斗向此混合物中逐滴添加氨基乙醛二甲缩醛(8.76mL，80.0mmol，1.0当量)和三乙胺(TEA，33.4mL，240mmol，3.0当量)于二氯甲烷(DCM，120.0mL)中的溶液。将反应物升温至室温并且在室温下搅拌过夜。将反应物用0.1N盐酸处理，并且将收集的有机相用盐水洗涤，经Na₂SO₄干燥并且浓缩，得到呈粗灰白色固体状的所需产物(28.01g，97％)，其无需进一步纯化即用于后续反应中。¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)δ11.79(s，1H)，8.08(t，1H，J＝5.9Hz)，4.90(s，2H)，4.37(t，1H，J＝5.5Hz)，3.23(s，6H)，3.00(dd，2H，J＝5.7Hz)。

步骤2a.({[2-({[4-(3-溴-4-氟苯基)-5-氧代-4，5-二氢-1，2，4-噁二唑-3-基]-1，2，5-噁二唑-3-基}氨基)乙基]氨基}磺酰基)氨基甲酸叔丁酯(18a)

在N₂下在室温下搅拌3-(4-氨基-1，2，5-噁二唑-3-基)-4-(3-溴-4-氟苯基)-1，2，4-噁二唑-5(4H)-酮(103mg，0.302mmol，1.5当量；步骤D)和N-(2，2-二甲氧基乙基)氨磺酰基氨基甲酸叔丁酯(57.2mg，0.201mmol)于二氯甲烷(1.0mL)中的混合物。向此混合物中逐滴添加三氟乙酸(0.50mL，6.5mmol)和三乙基硅烷(80.2μL，0.502mmol，2.5当量)。将此反应混合物在室温下搅拌2h。HPLC指示约30％转化。将反应混合物冷却至0℃并且用饱和碳酸氢钠淬灭至pH约8。将混合物以乙酸乙酯(3×10mL)萃取。将合并的有机萃取物用盐水洗涤，经硫酸钠干燥并且浓缩。将残余物通过制备型TLC(50％乙酸乙酯/己烷)纯化，得到呈灰白色固体状的所需产物(27.5mg，29.5％)。¹H NMR(DMSO-d₆，400MHz)：δ10.90(s，1H)，8.08(dd，J＝6.2，2.5Hz，1H)，7.72(m，1H)，7.59(t，J＝8.6Hz，1H)，6.58(t，J＝5.7Hz，1H)，3.38(dd，J＝12.7，6.2Hz，2H)，3.10(dd，J＝12.1，5.9Hz，2H)，1.41(s，9H)。C₁₇H₁₉BrFN₇O₇S(MW564.34)，LCMS(EI)m/e 485.8/487.8(M⁺-C₅H₈O₂+Na)。

步骤2b.({[2-({[4-(3-溴-4-氟苯基)-5-氧代-4，5-二氢-1，2，4-噁二唑-3-基]-1，2，5-噁二唑-3-基}氨基)乙基]氨基}磺酰基)氨基甲酸苯甲酯(18b)

将3-(4-氨基-1，2，5-噁二唑-3-基)-4-(3-溴-4-氟苯基)-1，2，4-噁二唑-5(4H)-酮(68mg，0.20mmol；来自步骤D)和{[(2，2-二甲氧基乙基)氨基]磺酰基}氨基甲酸苯甲酯(191mg，0.60mmol，3.0当量)于1，2-二氯乙烷(3.0mL)中的混合物冷却至0℃。向此混合物中逐滴添加三氟乙酸(1.0mL，13.0mmol)和三乙基硅烷(105μL，0.66mmol，3.3当量)。将此反应混合物在0℃下搅拌2h。HPLC指示反应完成。将反应混合物冷却至0℃并且用饱和碳酸氢钠淬灭至pH约8。并且将淬灭的反应混合物用EtOAc(3×10mL)萃取。将合并的有机萃取物用盐水洗涤，经硫酸钠干燥并且浓缩。接着将残余物在庚烷和乙醚的混合物中搅拌过夜。通过过滤收集固体，将其用庚烷洗涤并且在真空中干燥，得到呈粗灰白色固体状的所需产物(125mg，99％)。¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)δ11.31(s，1H)，8.05(m，1H)，7.87(m，1H)，7.68(m，1H)，7.56(m，1H)，7.32(m，5H)，6.54(m，1H)，5.07(s，2H)，3.29(m，2H)，3.09(m，2H)；C₂₀H₁₇BrFN₇O₇S(MW 598.36)，LCMS m/e 598/600(M⁺+H)。

步骤2c({[2-({4-[4-(3-溴-4-氟苯基)-5-氧代-4，5-二氢-1，2，4-噁二唑-3-基]-1，2，5-噁二唑-3-基}氨基)乙基氨基}磺酰基)氨基甲酸乙酯(18c)

在0℃下搅拌3-(4-氨基-1，2，5-噁二唑-3-基)-4-(3-溴-4-氟苯基)-1，2，4-噁二唑-5(4H)-酮(68mg，0.20mmol；来自步骤D)和{[(2，2-二甲氧基乙基)氨基]磺酰基}氨基甲酸乙酯(154mg，0.600mmol，3.0当量)于1，2-二氯乙烷(2.50mL，31.7mmol)中的混合物。向此混合物中逐滴添加三氟乙酸(1.00mL，13.0mmol)和三乙基硅烷(105μL，0.66mmol，3.3当量)。将反应混合物在0℃下搅拌3h。HPLC指示97.5％转化为所需产物。将反应混合物冷却至0℃并且用饱和碳酸氢钠淬灭至pH约8。将混合物用乙酸乙酯(3×10mL)萃取。将合并的有机萃取物用盐水洗涤，经硫酸钠干燥并且浓缩。将残余物在庚烷和乙醚的混合物中搅拌过夜。通过过滤收集固体，用庚烷洗涤，得到呈粗灰白色固体状的所需产物(95mg，88％)。¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)δ11.18(s，1H)，8.08(m，1H)，7.70(m，2H)，7.59(t，1H，J＝8.7Hz)，6.56(s，1H)，4.04(d，2H，J＝7.2Hz)，3.35(m，2H)，3.11(m，2H)，1.15(t，3H，J＝7.2Hz)；C₁₅H₁₅BrFN₇O₇S(MW 536.29)，LCMS(EI)m/e 536/538(M⁺+H)。

步骤2d.({[2-({4-[4-(3-溴-4-氟苯基)-5-氧代-4，5-二氢-1，2，4-噁二唑-3-基]-1，2，5-噁二唑-3-基}氨基)乙基]氨基}磺酰基)氨基甲酸2，2，2-三氯乙酯(18d)

在室温下搅拌3-(4-氨基-1，2，5-噁二唑-3-基)-4-(3-溴-4-氟苯基)-1，2，4-噁二唑-5(4H)-酮(5，0.680g，1.99mmol)和{[(2，2-二甲氧基乙基)氨基]磺酰基}氨基甲酸2，2，2-三氯乙酯(17d，2.22g，6.17mmol，3.1当量)于二氯甲烷(DCM，6.0mL)中的悬浮液。向此混合物中添加三乙基硅烷(1.27mL，7.95mmol，4.0当量)和三氟乙酸(TFA，3.0mL，39.0mmol)于二氯甲烷(DCM，2.0mL)中的溶液，同时维持反应温度低于30℃。在室温下搅拌5分钟后，反应混合物变得均匀，并且在室温下搅拌1h。HPLC指示反应完成。过滤反应物并且使沉淀物悬浮于二氯甲烷和庚烷的混合物(二氯甲烷与庚烷的比率以体积计为1∶9)中。将悬浮液在室温下搅拌过夜。通过过滤收集沉淀物并且用含10％二氯甲烷的庚烷洗涤并在真空中干燥，得到呈粗灰白色固体状的所需产物(1.15g，90.4％)，其无需进一步纯化即用于后续反应中。¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)δ11.85(s，1H)，8.07(m，2H)，7.70(m，1H)，7.57(t，1H，J＝8.7Hz)，6.56(m，1H)，4.88(m，2H)，3.37(m，2H)，3.16(m，2H)；C₁₅H₁₂BrCl₃FN₇O₇S(MW 639.62)，LCMS(EI)m/e 638/640/642(M⁺+H)。

步骤3.N-[2-({4-[4-(3-溴-4-氟苯基)-5-氧代-4，5-二氢-1，2，4-噁二唑-3-基]-1，2，5-噁二唑-3-基}氨基)乙基]磺酰胺(10)

在室温下搅拌({[2-({4-[4-(3-溴-4-氟苯基)-5-氧代-4，5-二氢-1，2，4-噁二唑-3-基]-1，2，5-噁二唑-3-基}氨基)乙基]氨基}磺酰基)氨基甲酸2，2，2-三氯乙酯(320mg，0.50mmol；来自步骤Q，方法D)于四氢呋喃(THF，4.0mL)中的溶液。依次添加乙酸(0.30mL，5.3mmol)和薄锌片(160mg，2.5mmol，5.0当量)。将此反应混合物在室温下搅拌3h。HPLC指示反应完成。将反应混合物通过硅藻土过滤，并且将所述硅藻土用THF洗涤。将合并的滤液在真空中浓缩并且将所得残余物溶解于乙酸乙酯(20mL)中。将乙酸乙酯溶液用饱和碳酸钠和盐水洗涤，经硫酸钠干燥并且浓缩。从乙酸乙酯和乙醚中结晶析出粗材料，得到呈灰白色固体状的所需产物(147mg，63％)。

实施例4. 4-({2-[(氨基磺酰基)氨基]乙基}氨基)-N-(3-溴-4-氟苯基)-N′-羟基-1，2，5-噁二唑-3-甲脒的替代制备

步骤1.N-(2，2-二甲氧基乙基)氨磺酰基氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯

在室温下向烘箱干燥的2L 4-颈圆底烧瓶中装入9-芴基甲醇(50.0g，255mmol)和无水DCM(382mL)。将所得浆料在冰浴中冷却至约0℃-5℃。将氯磺酰基异氰酸酯(CSI，23.0mL，264mmol)于无水DCM(127mL)中的溶液经22分钟经由加料漏斗逐滴添加至浆料中，维持反应混合物温度＜5℃。将所得混合物在0℃-5℃下搅拌1.75h，产生黏稠白色浆料。将氨基乙醛二甲缩醛(27.9mL，255mmol)于无水DCM(382mL)和4-甲基吗啉(84.0mL，764mmol)中的溶液在约0℃-5℃下经71分钟添加至混合物中。接着将所得反应混合物在冰浴中搅拌1.5小时。当HPLC显示反应完成时，通过经22分钟逐滴添加1.0M磷酸(H₃PO₄水溶液，640mL)至pH 1-2来酸化反应混合物。接着添加水(300mL)、EtOAc(2150mL)和庚烷(250mL)并且将所得混合物搅拌10分钟。分离两相并且将有机相依次用水(500mL)、庚烷(300mL)和水(2×500mL)洗涤并且经MgSO₄干燥。将滤液在真空下浓缩至干。将所得固体在65℃下再溶解于EtOAc(600mL)中并且将温溶液过滤至洁净3L圆底烧瓶中。将滤液冷却至室温并且搅拌2.5h，接着经80分钟经由加料漏斗添加庚烷(1200mL)。在室温下搅拌过夜之后，接着将混合物在冰浴中冷却1h。将所得固体通过过滤收集，用25％EtOAc/庚烷(250mL)洗涤，并且在约40℃-45℃下在真空下干燥过夜，得到呈白色粉末状的{[(2，2-二甲氧基乙基)氨基]磺酰基}氨基甲酸9H-芴-9-基甲酯(91.3g，88％产率)。¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)δ11.43(s，1H)，7.98-7.85(m，3H)，7.76(d，J＝7.5Hz，2H)，7.43(t，J＝7.2Hz，2H)，7.33(td，J＝7.4，1.1Hz，2H)，4.44-4.33(m，3H)，4.33-4.22(m，1H)，3.23(s，6H)，2.99(t，J＝5.8Hz，2H)ppm。

步骤2.({[2-({4-[4-(3-溴-4-氟苯基)-5-氧代-4，5-二氢-1，2，4-噁二唑-3-基]-1，2，5-噁二唑-3-基}氨基)乙基]氨基}磺酰基)氨基甲酸9H-芴-9-基甲酯

在环境温度下经10分钟向3-(4-氨基-1，2，5-噁二唑-3-基)-4-(3-溴-4-氟苯基)-1，2，4-噁二唑-5(4H)-酮(10.00g，29.23mmol)于DCM(160mL)中的搅拌悬浮液中添加甲磺酸(MeSO₃H，8.46g，88.04mmol)和三乙基硅烷(Et₃SiH，8.37g，71.96mmol)，以得到浆料。逐份添加(1g/3-4分钟；经1h)固体{[(2，2-二甲氧基乙基)氨基]磺酰基}氨基甲酸9H-芴-9-基甲酯(12.25g，30.14mmol)，同时使用水浴维持内部温度低于约20℃。添加之后，将所得混合物在约13℃至22℃下搅拌3天。添加额外的三乙基硅烷(Et₃SiH，0.1755g，1.51mmol)和{[(2，2-二甲氧基乙基)氨基]磺酰基}氨基甲酸9H-芴-9-基甲酯(0.3082g，0.76mmol)并且将所得混合物在环境温度下再搅拌23h。添加异丙醇(IPA，15mL)并且将所得混合物在环境温度下搅拌1h。添加庚烷(100mL)并且将混合物在环境温度下再搅拌2h。通过过滤收集固体，将其用IPA/庚烷(1/5；2×30mL)和庚烷(2×30mL)洗涤并且在真空下干燥，得到呈白色固体状的({[2-({4-[4-(3-溴-4-氟苯基)-5-氧代-4，5-二氢-1，2，4-噁二唑-3-基]-1，2，5-噁二唑-3-基}氨基)乙基]氨基}磺酰基)氨基甲酸9H-芴-9-基甲酯(18.30g，91.1％产率)。¹H NMR(500MHz，DMSO-d₆)δ11.44(s，1H)，8.07(dd，J＝6.2，2.5Hz，1H)，7.90(t，J＝5.6Hz，1H)，7.88(d，J＝7.6Hz，2H)，7.72(d，J＝7.0Hz，2H)，7.71(ddd，J＝8.9，4.3，2.6Hz，1H)，7.57(dd，J＝8.7，8.7Hz，1H)，7.40(t，J＝7.4Hz，2H)，7.31(td，J＝7.4，1.0Hz，2H)，6.55(t，J＝6.0Hz，1H)，4.35(d，J＝7.3Hz，2H)，4.25(t，J＝7.2Hz，1H)，3.39(q，J＝6.4Hz，2H)，3.15(q，J＝6.3Hz，2H)；¹³C NMR(126MHz，DMSO-d₆)δ159.03(d，J＝248.7Hz)，156.61(s)，155.22(s)，151.55(s)，148.67(s)，143.29(s)，140.68(s)，133.82(s)，133.39(s)，130.05(d，J＝8.5Hz)，128.54(d，J＝3.2Hz)，127.73(s)，127.07(s)，125.24(s)，120.11(s)，117.42(d，J＝24.0Hz)，108.19(d，J＝22.5Hz)，66.70(s)，46.17(s)，43.34(s)，40.79(s)ppm；¹⁹F NMR(376MHz，DMSO-d₆)δ-103.99--107.39(m)ppm。

步骤3.4-({2-[(氨基磺酰基)氨基]乙基}氨基)-N-(3-溴-4-氟苯基)-N′-羟基-1，2，5-噁二唑-3-甲脒

在环境温度下向1L4-颈圆底烧瓶中装入({[2-({4-[4-(3-溴-4-氟苯基)-5-氧代-4，5-二氢-1，2，4-噁二唑-3-基]-1，2，5-噁二唑-3-基}氨基)乙基]氨基}磺酰基)氨基甲酸9H-芴-9-基甲酯(25.0g，36.4mmol)和无水THF(250mL)，产生均匀溶液。接着将溶液在冰浴中冷却至0℃-5℃，接着经35分钟经由加料漏斗逐滴添加N，N-双(2-氨基乙基)乙烷-1，2-二胺(114mL，728mmol)。将加料漏斗用无水THF(50mL)冲洗并且将冲洗液添加至反应混合物中。移除冷浴并且将反应物逐渐升温至环境温度并且在环境温度下搅拌2.5h。添加EtOAc(400mL)并且将所得混合物转移至2L 4-颈圆底烧瓶并且在冰浴中冷却至约0℃-5℃。经由加料漏斗逐滴添加2.0M HCl水溶液(400mL，800.0mmol)，同时维持内部温度低于10℃。分离两相，并且将水相用EtOAc(200mL)萃取。合并有机级分并且将冷却至约6℃-7℃。将2.0MHCl水溶液(200.0mL，400.0mmol)逐滴添加至冷有机级分中，维持内部温度低于10℃。分离两相并且将有机相用水(2×400mL)洗涤，经MgSO₄干燥并且在减压下浓缩成浅黄色浆液。将所述浆液溶解于EtOAc(60.0mL)中，得到均匀溶液。向溶液中逐滴添加DCM(250.0mL)和叔丁基甲基醚(TBME，100.0mL)的溶液。将所得浆料在室温下搅拌过夜，接着在冰浴中冷却1h。通过过滤收集固体，用冰冷250mL DCM(150mL)和TBME(100mL)溶液洗涤并且在真空下干燥，得到14.4g呈白色固体状的粗所需产物。

将粗产物在60℃下溶解于EtOAc(140.0mL)中并且过滤温溶液。将滤液冷却至室温，接着经55分钟逐滴添加庚烷(100.0mL)。接着将所得混合物在室温下搅拌过夜。通过过滤收集固体，用庚烷和EtOAc的2∶1混合物(75mL)洗涤并且在真空下在40℃-50℃下干燥至恒重，得到呈白色固体状的4-({2-[(氨基磺酰基)氨基]乙基}氨基)-N-(3-溴-4-氟苯基)-N′-羟基-1，2，5-噁二唑-3-甲脒(12.9g，81％产率)。

实施例A：人类吲哚胺2，3-双加氧酶(IDO)酶分析

在大肠杆菌中表达具有N端His标签的人类吲哚胺2，3-双加氧酶(IDO)并且将其纯化至均质。IDO催化色氨酸的吲哚核的吡咯环的氧化裂解，生成N′-甲酰基犬尿氨酸。在室温下如文献中所述地使用95nM IDO和2mM D-Trp在20mM抗坏血酸盐、5μM亚甲基蓝和0.2mg/mL过氧化氢酶存在下在50mM磷酸钾缓冲液(pH 6.5)中执行所述分析。通过连续追踪在321nm下由于形成N′-甲酰基犬尿氨酸而引起的吸光度增加来记录初始反应速率(参见：Sono，M.等人，1980，J.Biol.Chem.255，1339-1345)。在实施例A的分析中测试式I化合物并且发现其具有＜200nM的IC₅₀。

实施例B：在基于海拉细胞的吲哚胺2，3-双加氧酶(IDO)/犬尿氨酸分析中测定抑制剂活性

海拉细胞(#CCL-2)获自美国典型组织培养物保藏中心(ATCC，Manassas，VA)并且常规地维持在具有2mM L-谷氨酰胺和Earle氏BSS的极限必需培养基(eagle)中，所述Earle氏BSS被调节为含有1.5g/L碳酸氢钠、0.1mM非必需氨基酸、1mM丙酮酸钠和10％胎牛血清(全部都来自Invitrogen)。将细胞保持在37℃供应有5％CO₂的含湿润培育箱中。将所述分析执行如下：将海拉细胞以5×10³个/孔的密度接种于96孔培养板中并且生长过夜。次日，将IFN-γ(50ng/mL最终浓度)和化合物的连续稀释液(200μL培养基的总体积)添加至细胞中。在48小时孵育之后，将每孔140μL上清液转移至新的96孔板中。将10μL 6.1N三氯乙酸(#T0699，Sigma)混入各孔中并且在50℃下孵育30分钟以将由吲哚胺2，3-双加氧酶产生的N-甲酰基犬尿氨酸水解为犬尿氨酸。接着将反应混合物在2500rpm下离心10分钟以移除沉积物。将每孔100μL上清液转移至另一96孔板中并且将其与100μl含2％(w/v)对二甲基氨基苯甲醛(#15647-7，Sigma-Aldrich)的乙酸混合。在480nm下使用SPECTRAmax 250微型板读取器(Molecular Devices)测量源于犬尿氨酸的黄色。将L-犬尿氨酸(#K8625，Sigma)用作标准物。在100μL培养基中制备标准物(240、120、60、30、15、7.5、3.75、1.87μM)并且将其与等体积的2％(w/v)对二甲基氨基苯甲醛混合。测定在个别浓度下的抑制百分比并且获得两次重复值的平均值。通过使用非线性回归来分析数据，生成IC₅₀值(Prism Graphpad)。参见：Takikawa O等人，1988，J.Biol.Chem.，263(4)：2041-8。

实施例C：测定IDO抑制剂对由表达IDO的树突细胞抑制的T细胞增殖的效应

通过白细胞电泳法从人类外周单核细胞收集单核细胞。接着使用补充有10％胎牛血清和2mM L-谷氨酰胺(全部都来自Invitrogen)的RPMI 1640培养基将单核细胞以1×10⁶个细胞/孔的密度接种于96孔板中。在37℃下过夜培养之后粘附细胞保留于所述板上。接着将粘附单核细胞用100ng/ml GM-CSF(#300-03，PeproTech)和250ng/ml IL-4(#200-04，PeproTech)刺激5-7天，继而用5μg/mL来自鼠伤寒沙门杆菌的LPS(#437650，Sigma)和50ng/mL IFN-γ(#285-IF，R&D Systems)再活化2天，以诱导树突细胞成熟。

在树突细胞活化之后，将培养基用补充有100-200U/mL IL-2(#CYT-209，ProSpec-Tany TechnoGene)和100ng/mL抗CD3抗体(#555336，PharMingen)、T细胞(2-3×10⁵个细胞/孔)和IDO化合物的连续稀释液的完全RPMI 1640更换。再孵育2天之后，通过BrdU掺入分析法，使用比色细胞增殖ELISA试剂盒根据制造商的说明书(#1647229，Roche MolecularBiochemicals)测量T细胞增殖。将细胞在10μM BrdU标记溶液存在下连续培养16-18h。接着，移除标记培养基，并且将每孔200μL FixDenat添加至细胞中并且在室温下孵育30分钟。移除FixDenat溶液并且添加100μL/孔抗BrdU-POD抗体缀合物工作溶液。使反应在室温下进行90分钟。接着移除抗体缀合物，并且用200μL/孔洗涤溶液冲洗细胞3次。最后，添加100μL/孔底物溶液并且在显色期间使用微型板读取器(Spectra Max PLUS，Molecular Devices)获得结果。获得不同时间点的多个读数以确保数据在线性范围内。常规地从两次重复实验中获得数据，并且适当对照包括在内。参见：Terness P等人2002，J.Exp.Med.，196(4)：447-57；和Hwu，P等人2000，J.Immunol.，164(7)：3596-9。

实施例D：IDO抑制剂抗肿瘤活性的活体内测试

活体内抗肿瘤功效可使用修改的肿瘤同种异体移植物/异种移植物方案来测试。例如，文献中已描述在免疫活性小鼠中IDO抑制作用可与细胞毒性化学疗法协同作用(Muller，A.J.等人2005，Nat.Med.11：312-319)。通过比较研究性IDO抑制剂在免疫活性同系小鼠中生长的鼠类肿瘤异种移植物模型(例如，B16和相关变体CT-26、LLC)中的协同作用与用中和的抗CD4抗体治疗的同系小鼠中或在免疫缺陷小鼠(例如nu/nu)中生长的相同肿瘤中观察到的协同作用，显示此协同作用依赖于T细胞。

在免疫活性相对免疫缺陷小鼠中的差异性抗肿瘤效应的概念也可允许测试呈单一药剂形式的研究性IDO抑制剂。例如，LLC肿瘤在其同系宿主鼠C57Bl/6中生长良好。然而，如果这些小鼠用IDO抑制剂1-MT治疗(相对于安慰剂)，则肿瘤形成显著延迟，这意味着IDO抑制作用为生长抑制(Friberg，M.等人2002，Int.J.Cancer 101：151-155)。根据此逻辑，可检查C57Bl/6免疫活性小鼠中生长的LLC异种移植物肿瘤模型中IDO抑制作用的功效，并且将其与IDO抑制剂对裸小鼠或SCID小鼠(或用中和T细胞活性的抗体治疗的C57Bl/6小鼠)中生长的LLC肿瘤的效应进行比较。由于减少IDO的肿瘤介导免疫抑制活性的效应将可能根据不同肿瘤模型的免疫原潜力而不同，可对肿瘤细胞进行遗传修饰以增强其免疫原潜力。例如，GM-CSF在B16.F10细胞中的表达会增强其免疫原潜力(Dranoff，G.等人1993，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，90：3539-3543)。因而，在一些肿瘤模型(例如B16.F10)中，可产生表达免疫刺激蛋白(诸如GM-CSF)的[多]克隆并且在免疫活性小鼠和免疫缺陷小鼠中测试IDO抑制剂针对由这些肿瘤细胞建立的肿瘤的生长抑制效应。

用于分析IDO抑制剂活体内功效的第三种方法采用‘预存免疫’的鼠类肿瘤同种异体移植物/异种移植物模型。在这些模型中，使免疫活性小鼠对一种或多种特异性肿瘤抗原敏感以模拟治疗性抗肿瘤疫苗接种。在异种移植物实验中，此举针对小鼠随后用鼠类肿瘤细胞系(具有类似于用于免疫的抗原的肿瘤抗原)攻击时由免疫系统介导的抗肿瘤反应激活小鼠。IDO的表达已显示钝化抗肿瘤反应并且允许异种移植物更快速地生长。重要的是，此模型中肿瘤的生长通过IDO抑制剂1-MT抑制(Uyttenhove，C.等人2003，Nat.Med.9：1269-1274)。当IDO活性为P815肿瘤生长所许可并且IDO的特异性抑制应因此为生长抑制时，此模型为尤其有吸引力的。

最后，可使用治疗性免疫来评价IDO抑制剂的活体内影响。例如，已使用B16-BL6细胞证实，可通过静脉内注射肿瘤细胞，继而用由所述肿瘤细胞表达的充分表征的免疫原肽(例如TRP-2)处理来攻击Blk/6小鼠(Ji等人，2005，J.Immunol，175：1456-63)。重要的是，诸如抗CTL-4抗体的免疫系统调节剂可改善对所述治疗性免疫的反应。IDO抑制剂的影响可以类似方式(在使用或不使用IDO抑制剂的情况下进行肿瘤肽免疫)来评估。功效通过动物存活(距发病的时间)或通过测量在规定时间点处肺和/或其他器官的肿瘤转移来评估。

在任何/所有上文所提及的模型中，也可能直接和/或间接测量肿瘤反应性免疫细胞的数目和/或活性。用于测量肿瘤反应性免疫细胞的数目和/或活性的方法已充分建立并且可使用本领域技术人员所熟悉的技术来执行(Current Protocols in Immunology，第4卷，Coligan，J.E.等人；Immunotherapy of Cancer，Human Press，2006，Disis，M.L.，及其中的参考文献)。概念上，IDO的免疫抑制性效应的减少可导致肿瘤特异性免疫细胞的数目或反应性增加。此外，IDO抑制作用当与其他治疗剂，例如化学治疗剂和/或免疫调节剂(例如，抗CTLA4抗体)组合时可进一步增加肿瘤反应性免疫细胞的数目或反应性。

所有同种异体移植物/异种移植物实验均可使用标准肿瘤技术来执行(由Corbett等人，在Cancer Drug Discovery and Development：Anticancer Drug DevelopmentGuide：Preclinical Screening，Clinical Trials，and Approval，第2版。Teicher，B.A.和Andrews，P.A.，Gumana Press Inc.：Totowa，NJ，2004中回顾)。基因(例如IDO、GM-CSF)克隆并引入至肿瘤细胞系中可使用本领域技术人员所熟悉的技术来执行(在Sambrook，J.和Russel，D.，Molecular Cloning：A laboratory Manual(第3版)，Cold Spring HarborLaboratory Press：Cold Spring Harbor，NY，2001中回顾)。

实施例E：人类免疫缺乏病毒-1(HIV-1)脑炎模型中IDO抑制剂的活体内测试

1.细胞分离和病毒感染

单核细胞和PBL可通过从HIV-1、HIV-2和B型肝炎血清阴性供体逆流离心淘析白细胞电泳包而获得。在悬浮培养物中使用铁氟龙烧瓶在补充有10％热灭活混合人类血清、1％谷氨酰胺、50μg/mL庆大霉素、10μg/mL环丙沙星(Sigma)和1000U/mL高度纯化的重组人类巨噬细胞菌落刺激因子的杜贝克氏改质伊格尔氏培养基(DMEM，Sigma-Aldrich)中培养单核细胞。培养7天后，用HIV-1_ADA以0.01的感染复数感染MDM。

2.Hu-PBL-NOD/SCID HIVE小鼠

可购得四周龄雄性NOD/C.B-17 SCID小鼠(Jackson Laboratory)。在无病原体条件下将动物维持于无菌微型隔离器笼中。所有动物均在PBL移植的前3天腹膜内注射大鼠抗CD122(0.25mg/小鼠)，并且两只动物在PBL注射(20×10⁶个细胞/小鼠)的前1天和后3天注射兔无唾液酸-GM1抗体(0.2mg/小鼠)(Wako)。在PBL重构之后8天，颅内(i.c.)注射HIV-1_ADA感染的MDM(于10μL中的3×10⁵个细胞)，产生hu-PBL-NOD/SCID HIVE小鼠。紧接着在i.c.注射HIV-1感染的MDM之后，将hu-PBL-NOD/SCID HIVE小鼠皮下(s.c)植入对照(媒剂)或化合物球粒(14或28天缓慢释放，Innovative Research)。设计初始实验以确认在用IDO化合物处理的hu PBL-NOD/SCID HIVE动物中诱导病毒特异性CTL。这通过四聚体染色和从脑组织消除MDM的神经病理学分析来确认。接着，设计实验以分析人类淋巴细胞重构、体液免疫反应和神经病理学改变。在这些实验中，动物在i.c.注射人类MDM之后第7天放血并且在14和21天处死。将在含EDTA的管中收集的血液用于流式细胞术并且将血浆用于使用ELISA(Beckman Coulter^TM)检测HIV-1 p24。HIV-1特异性抗体通过蛋白质印迹测试根据制造商说明书(Cambridge Biotech HIV-1蛋白质印迹试剂盒，Calypte Biomedical)来检测。在对照和化合物处理的动物中检测到类似量的病毒特异性抗体。可使用三个不同人类白细胞供体来执行总计三个独立实验。

3.hu PBL-NOD/SCID HIVE小鼠中的外周血液和脾脏的FACScan

可在i.c.注射人类MDM之后第1-3周对外周血液执行两色FACS分析并且在第2周和第3周对脾细胞执行两色FACS分析。在4℃下，细胞与人类CD4、CD8、CD56、CD3、IFN-γ的萤光染料缀合的单克隆Ab(mAb)至(eBioscience)一起孵育30分钟。为了评价细胞免疫反应，与抗人类CD8和FITC缀合的抗小鼠CD45组合执行IFN-γ细胞内染色以排除鼠类细胞。为了测定Ag特异性CTL，对植物血凝素/白介素-2(PHA/IL-2)刺激的脾细胞执行针对HIV-1^gag(p17(aa77-85)SLYNTVATL，SL-9)和HIV-1^pol[(aa476-485)ILKEPVHGV，IL-9]的别藻蓝蛋白缀合四聚体染色。根据NIH/国家过敏和传染病研究所(NIH/National Institute of Allergyand Infections Disease)的国家四聚体核心部门的建议对细胞染色。用FACS Calibur^TM使用CellQuest软件(Becton Dickinson Immunocytometry System)分析数据。

4.组织病理学和图像分析

在i.c.注射MDM之后第14天和第21天收集脑组织，将其固定于4％磷酸盐缓冲多聚甲醛中并且包埋于石蜡中或在-80℃下冷冻以供稍后使用。切割包埋块的冠状切片以便鉴别注射位点。对于每只小鼠，从人类MDM注射位点切割30-100个(5-μm厚)连续切片并且分析3-7个载片(分开的10个切片)。用二甲苯使脑切片脱蜡并且在梯度醇中水合。免疫组织化学染色遵循使用抗原修复的基础间接方案，通过在0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液中加热至95℃持续30分钟以进行抗原修复。为了鉴别小鼠脑中的人类细胞，使用波形蛋白的mAb(1∶50，克隆3B4，Dako Corporation)，其鉴别所有人类白细胞。分别用CD68(1∶50稀释，克隆KP 1)和CD8(1∶50稀释，克隆144B)检测人类MDM和CD8⁺淋巴细胞。用HIV-1 p24(1∶10，克隆Kal-1，均来自Dako)的mAb标记病毒感染的细胞。用Iba-1抗体(1∶500，Wako)检测反应性鼠类微神经胶质细胞。用从日本札幌北海道大学医学研究所的中央研究院细胞药理学系(Departmentof Cell Pharmacology，Central Research Institute，Graduate School of Medicine，Hokkaido University，Sapporo，Japan)获得的Ab观测人类IDO(huIDO)的表达。用适当的生物素化二抗检测一抗并且用抗生物素蛋白-生物素复合物(Vectastain Elite ABC试剂盒，Vector Laboratories)和辣根过氧化酶(HRP)偶联的葡聚糖聚合物(EnVision，DakoCorporation)观测。用梅尔氏苏木精(Mayer′s hematoxylin)对免疫染色的切片进行复染色。缺失一抗或并入无关IgG同种型的切片用作对照。两个采用盲方式的独立观察者计数来自各小鼠的各切片中的CD8⁺淋巴细胞、CD68⁺MDM和HIV-1 p24⁺细胞的数目。用NikonEclipse 800显微镜(Nikon Instruments Inc)执行光学显微镜检查。如先前所述通过计算机辅助图像分析(Media Cybernetics)进行Iba1的半定量分析(免疫染色占据的面积百分比)。

5.统计学分析

可使用Prism(Graph Pad)和Student t测试分析数据以用于比较和ANOVA。P-值＜0.05被视为显著的。

6.参考文献

Poluektova LY、Munn DH、Persidsky Y和Gendelman HE(2002).Generation ofcytotoxic T cells against virus-infected human brain macrophages in a murinemodel of HIV-1 encephalitis.J.Immunol.168(8)：3941-9。

除本文所述的修改之外，本发明的各种修改也将为本领域技术人员根据以上描述所显而易知。所述修改也意图属于所附权利要求书的范围内。本申请中引用的各参照文献，包括所有专利、专利申请案和公开案皆以引用的方式整体并入本文中。

Claims (48)

1.一种制备式F7化合物的方法，其包括使式F5化合物：

与式F6的醛反应：

其中Pg¹为氨基保护基，以提供式F7化合物：

2.如权利要求1所述的方法，其中Pg¹为叔丁氧羰基。

3.如权利要求1至2中任一项所述的方法，其中所述反应在还原剂存在下执行。

4.如权利要求3所述的方法，其中所述还原剂为三乙酰氧基硼氢化钠。

5.一种制备式F8化合物的方法：

其包括使通过如权利要求1所述的方法制备的式F7化合物脱保护以提供式F8化合物。

6.如权利要求5所述的方法，其中所述脱保护包括使所述式F7化合物与盐酸反应。

7.一种制备式F9化合物的方法：

其包括使通过如权利要求5所述的方法制备的式F8化合物与Pg²-NH-SO₂-X在有机碱存在下反应以提供式F9化合物，

其中：

Pg²为氨基保护基；并且

X为卤基。

8.如权利要求7所述的方法，其中Pg²为乙氧羰基、叔丁氧羰基、苯甲氧羰基或9-芴基甲氧羰基。

9.如权利要求7所述的方法，其中Pg²为叔丁氧羰基。

10.如权利要求7-9中任一项所述的方法，其中X为氯。

11.一种制备式F10化合物的方法：

其包括使通过如权利要求7所述的方法制备的式F9化合物脱保护以提供式F10化合物。

12.如权利要求11所述的方法，其中所述脱保护包括使式F9化合物与盐酸反应。

13.如权利要求11所述的方法，其中所述脱保护包括使式F9化合物与盐酸在包含乙酸乙酯的溶剂组分中反应。

14.一种制备式I化合物的方法：

其包括使通过如权利要求11所述的方法制备的式F10化合物与碱反应以提供式I化合物。

15.如权利要求14所述的方法，其中所述碱为氢氧化钠。

16.一种制备式F16化合物的方法，其包括使式F15化合物：

与式F5化合物反应：

以提供式F16化合物：

其中：

各R¹独立地为氨基保护基；并且

R³为C_1-6烷基或苯甲基。

17.如权利要求16所述的方法，其中各R¹为C_2-4烯基-C_1-3烷基或苯基-C_1-3烷基，其中所述苯基-C_1-3烷基任选地被1、2或3个独立地选择的C_1-4烷氧基取代。

18.如权利要求16所述的方法，其中各R¹为烯丙基或4-甲氧基苯甲基，且R³为叔丁基。

19.如权利要求16-18中任一项所述的方法，其中所述反应在还原剂存在下执行。

20.如权利要求19所述的方法，其中所述还原剂为三乙酰氧基硼氢化钠。

21.一种制备式F10化合物的方法：

其包括使通过如权利要求16所述的方法制备的式F16化合物脱保护以提供式F10化合物。

22.如权利要求21所述的方法，其中所述脱保护包括使式F16化合物与三氟乙酸反应。

23.如权利要求21所述的方法，其中所述脱保护包括使式F16化合物与盐酸反应。

24.如权利要求16所述的方法，其中所述式F15化合物通过如下方法获得，所述方法包括用还原剂处理式F14化合物：

以提供所述式F15化合物；其中R²为C_1-4烷基。

25.如权利要求24所述的方法，其中所述还原剂为二异丁基氢化铝。

26.如权利要求24或25所述的方法，其中所述式F14化合物通过如下方法获得，所述方法包括用一种或多种选自烯丙基溴和4-甲氧基苯甲基氯的氨基保护剂保护式F13化合物：

以提供式F14化合物。

27.如权利要求26所述的方法，其中所述保护在碱存在下执行。

28.一种式F15化合物：

其中：

R³为C_1-6烷基或苯甲基；并且

各R¹独立地为氨基保护基。

29.如权利要求28所述的化合物，其为烯丙基{[烯丙基(2-氧代乙基)氨基]磺酰基}氨基甲酸叔丁酯。

30.如权利要求28所述的化合物，其为(4-甲氧基苯甲基){[(4-甲氧基苯甲基)(2-氧代乙基)氨基]磺酰基}氨基甲酸叔丁酯。

31.一种制备式F18化合物的方法，其包括使式F17化合物：

其中R⁴为C_1-6烷基、C_1-6卤代烷基、苯甲基或9H-芴-9-基甲基，与式F5化合物反应：

以提供式F18化合物：

32.如权利要求31所述的方法，其中R⁴为叔丁基、苯甲基、乙基或2,2,2-三氯乙基。

33.如权利要求32所述的方法，其中所述反应在还原剂存在下进行。

34.如权利要求33所述的方法，其中所述还原剂为三乙基硅烷。

35.一种制备式F10化合物的方法：

其包括使通过如权利要求32-34中任一项所述的方法制备的式F18化合物脱保护以提供式F10化合物。

36.如权利要求35所述的方法，其中所述脱保护包括使所述式F18化合物与锌在乙酸存在下反应。

37.一种制备式I化合物的方法：

其包括使通过如权利要求35所述的方法制备的式F10化合物与碱反应以提供式I化合物。

38.如权利要求37所述的方法，其中所述碱为氢氧化钠。

39.如权利要求31所述的方法，其中R⁴为9H-芴-9-基甲基。

40.如权利要求39所述的方法，其中所述反应在三乙基硅烷存在下进行。

41.如权利要求40所述的方法，其中所述反应在甲磺酸存在下进行。

42.一种制备式I化合物的方法：

其包括使通过如权利要求39-41中任一项所述的方法制备的式F18化合物转化为式I化合物，

其中所述转化包括使所述式F18化合物与碱组合以形成第一混合物；和

将酸添加到所述第一混合物中。

43.如权利要求42所述的方法，其中所述碱为N,N-双(2-氨基乙基)乙烷-1,2-二胺。

44.如权利要求42所述的方法，其中所述酸为盐酸水溶液。

45.一种式F17化合物：

其中R⁴为C_1-6卤代烷基、苯甲基或9H-芴-9-基甲基。

46.如权利要求45所述的化合物，其为N-(2,2-二甲氧基乙基)氨磺酰基氨基甲酸苯甲酯、N-(2,2-二甲氧基乙基)氨磺酰基氨基甲酸2,2,2-三氯乙酯或N-(2,2-二甲氧基乙基)氨磺酰基氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯。

47.一种化合物，其为N-(2,2-二甲氧基乙基)氨磺酰基氨基甲酸叔丁酯或N-(2,2-二甲氧基乙基)氨磺酰基氨基甲酸乙酯。

48.一种制备式I化合物的方法，其包括：

i)使式F19化合物：

与式F5化合物在三乙基硅烷和甲磺酸存在下反应：

以提供式F20化合物：

以及

ii)使所述式F20化合物转化为式I化合物：

其中所述转化包括使所述式F20化合物与N,N-双(2-氨基乙基)乙烷-1,2-二胺组合。