CN105861485A - 一种提高基因置换效率的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医学领域，涉及一种利用Cas9核酸酶的aptamer提高基因置换效率的方法，包括以下步骤：(1)双功能DNA单链的合成：合成具有Cas9特异结合能力的aptamer和DNA供体的序列；所述aptamer序列为：5′‑AGTCCATGGTAAACCCACCTTGGGGT‑GACT‑3′；(2)质粒的制备：构建Cas9‑gRNA质粒，使其能表达Cas9蛋白和转录靶位点附近的gRNA；(3)把所得双功能DNA单链与质粒共转染到要进行基因置换的细胞或组织。本发明采用高亲和度的特异DNA aptamer，不干扰Cas9‑gRNA复合物的形成与稳定，使同源性重组和基因修复的比例达到最高。
Description
技术领域
本发明属于生物医学领域，涉及一种基因置换方法，尤其涉及一种利用Cas9核酸酶的aptamer(适配体)提高基因置换效率的方法，可用于基因治疗。
背景技术
生物医学中的基因置换技术对基因功能研究、药物筛选和基因治疗有着不可估量的重要性。细胞内基因置换是通过同源性重组实现的，而同源性重组在绝大多数细胞中的效率极低，因此提高同源性重组效率是生物学家面临的巨大挑战。若能提高同源性重组的效率，基因置换和基因治疗的成功率就会极大地提高。
目前，现有基因置换技术主要存在以下问题：(1)同源性重组在绝大多数细胞中的效率极低。(2)Cas9-gRNA复合物只能定位到靶位点进行基因切断，不能完成基因置换。(3)基因治疗过程中的靶定向特异性低，置换、修复效率低。
发明内容
针对上述问题，发明人进行了大量试验，积累的研究表明，先切断某个基因片段会大大提高这个基因置换的频率(几个数量级)，进而得到一种aptamer介导的提高基因置换效率的方法，采用高亲和度的特异DNA aptamer，不干扰Cas9-gRNA复合物的形成与稳定，使同源性重组和基因修复的比例达到最高。
为解决上述问题，本发明通过以下技术方案实现：
设计一种提高基因置换效率的方法，包括以下步骤：
(1)双功能DNA单链的合成：采用DNA合成仪经常规方法合成包含Cas9特异结合能力的aptamer和DNA供体的单链序列；所述aptamer序列为：5′-AGTCCATGGTAAACCCACCTTGGGGTGACT-3′；
(2)质粒的制备：常规方法构建Cas9-gRNA质粒，使其能表达Cas9蛋白和转录靶位点附近的gRNA；
(3)把所得双功能DNA单链与质粒共转染到要进行基因置换的细胞或组织。
优选的，将所述双功能DNA单链与质粒以摩尔比1：(15～25)共转染到要进行基因置换的细胞或组织。更优选的，将双功能DNA单链、Cas9-gRNA质粒以摩尔比1：20于Lipofectamine试剂盒中室温混合15～25min，再加入具有细胞培养液的6孔板中，培养两天后，筛选细胞株验证置换效果。所述细胞培养液浓度为60wt％。
本发明的优势表现在：
在本发明的技术方案中，将具有Cas9特异结合能力的单链DNAaptamer和单链DNA供体(donor)连在一块，被一个结合在靶位点的Cas9核酸酶富集到靶位点，来对被Cas9核酸酶切断后的靶位点进行基因置换；即利用Cas9-aptamer把aptamer-donor富集到靶位点。
(1)本发明采用高亲和度的特异DNA aptamer，不干扰Cas9-gRNA复合载体的形成与稳定。
(2)Cas9-gRNA质粒，以及aptamer-donor单链之间的摩尔比例得到优化，同源性重组和基因修复的比例可达到最高(＞15％)。
附图说明
图1为Cas9-gRNA质粒的构建流程示意图；
图2为Cas9-gRNA质粒的剪切活性试验结果；
图3为aptamer与Cas9-gRNA结合能力关系图；
图4为aptamer与Cas9-gRNA剪切活性关系图；
图5为靶基因修复率验证效果图。
具体实施方式
以下结合具体实施例进一步阐述本发明。下述实施例中所涉及的试验方法或分析方法，如无特别说明，均为常规方法，所用试剂如无特别说明，均为市售。
本实施例以用野生型抗癌基因p53置换突变致病性p53(SEQ IDNo：3)为例，提供一种基因置换方法，具体分为以下几个步骤实施：
(1)合成双功能DNA单链：采用DNA合成仪用常规方法将Cas9aptamer(SEQ ID No：1)和野生型p53序列(SEQ ID No：2)连成一起的DNA单链(SEQ ID No：4)。
(2)合成Cas9-gRNA双功能-双表达质粒：常规方法构建Cas9-gRNA质粒，使其能表达Cas9蛋白和转录p53附近位点gRNA；具体构建方法见图1，首先合成寡核苷酸片段，用作PCR模板，其中含有定向到p53的gRNA2和gRNA1序列，被两个BbsI内切酶位点隔开，便于PCR后通过Gibson连接，加上gRNA1的转录启动子U6，再通过BbsI加入到表达Cas9的质粒上构成Cas9-gRNA双功能-双表达质粒。
完成构建后对Cas9-gRNA双功能-双表达质粒进行验证，结果见图2，其中，图2a是Cas9-gRNA双功能-双表达质粒中的gRNA2、gRNA1和Cas9编码序列的位置图；图2b表明Cas9在有gRNA1或gRNA2、gRNA1帮助下有剪切活性，而在只有gRNA2时不能定向到靶位点进行剪切；图2c和2d进一步证实了这一点。
从图3可以看出，在有无10nM(M＝mol/L)aptamer存在的情况下，持续增加gRNA1的浓度，Cas9与gRNA1的结合都会增加，并不受这个Cas9特异性aptamer的影响，说明这个aptamer与gRNA1可同时与Cas9结合发挥各自的功能，aptamer并不干扰gRNA与Cas9结合。
从图4可以看出，在有无aptamer存在的情况下，并不影响Cas9的剪切活性。
(3)共转染：将双功能DNA单链、Cas9-gRNA质粒以摩尔比1：20于Lipofectamine试剂盒中，室温混合20min，再加到有细胞培养液的6孔板中，培养两天；
(4)筛选基因被置换的细胞株，基因组DNA提取后，对靶基因进行PCR扩增，扩增产物测序验证基因置换。将有p53突变的细胞株培养在48孔板上，Cas9-gRNA双功能-双表达质粒与p53-WT-Cy5(p53野生型片段、单链、Cy5荧光标记)或aptamer-p53-WT-Cy5共转染，数字荧光显微镜计数；几天后，收集细胞群落，分别提取DNA测序，得到统计数字，结果见图5，数据表明，有aptamer的供体DNA提高基因修复率十几倍。
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tgaagctccc agaatgccag aggctgctcc ccccgtggcc cctgcaccag cagctcctac 120
accggcggcc cctgcaccag ccccctcctg gcccctgtca tcttctgtcc cttcccaga 179
Claims (5)
1.一种提高基因置换效率的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)双功能DNA单链的合成：合成包含Cas9特异结合能力的aptamer和DNA供体的单链序列；
(2)质粒的制备：构建Cas9-gRNA质粒，使其能表达Cas9蛋白和转录靶位点附近的gRNA；
(3)把所得双功能DNA单链与质粒共转染到要进行基因置换的细胞或组织。
2.根据权利要求1所述提高基因置换效率的方法，其特征在于：所述aptamer序列为：5′-AGTCCATGGTAAACCCACCTTGGGGT-GACT-3′。
3.根据权利要求1所述提高基因置换效率的方法，其特征在于：步骤(3)中所述双功能DNA单链与质粒以摩尔比1：(15～25)共转染。
4.根据权利要求3所述提高基因置换效率的方法，其特征在于：步骤(3)中将双功能DNA单链、质粒以摩尔比1：20于Lipofectamine试剂盒中室温混合15～25min，再加入具有细胞培养液的6孔板中，培养两天后，筛选细胞株验证置换效果。
5.根据权利要求4所述提高基因置换效率的方法，其特征在于：所述细胞培养液浓度为60wt％。
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