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CN105829340A - 用于治疗重度低血糖症的新型化合物 - Google Patents

用于治疗重度低血糖症的新型化合物 Download PDF

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CN105829340A
CN105829340A CN201480069406.3A CN201480069406A CN105829340A CN 105829340 A CN105829340 A CN 105829340A CN 201480069406 A CN201480069406 A CN 201480069406A CN 105829340 A CN105829340 A CN 105829340A
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ser
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CN201480069406.3A
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J.阿尔西纳-费尔南德斯
R.C.卡明斯
郭莉莉
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Eli Lilly and Co
Original Assignee
Eli Lilly and Co
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Abstract

本发明提供了可用于治疗低血糖症的新型化合物。

Description

用于治疗重度低血糖症的新型化合物
本发明涉及用于治疗糖尿病和/或肥胖的，具有超过人胰高血糖素的改善的溶解性以及物理和化学稳定性的化合物。
人胰高血糖素具有下述氨基酸序列：His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr（SEQ ID NO: 1），是在胰腺中产生的29氨基酸肽激素。当血糖开始下降时，胰高血糖素向肝传递信号以将贮存的糖原分解成葡萄糖用于释放到血流中，引起血糖水平上升。
在患有糖尿病的受试者中，低血糖症可以作为糖尿病治疗的副作用而出现。此外，糖尿病患者中天然胰高血糖素应答对低血糖症可以是受损的，其使得葡萄糖水平更难以回到正常范围。如果未经治疗，则重度或急性低血糖症可以引起严重问题诸如癫痫发作、意识不清、脑损伤或甚至死亡。
胰高血糖素的施用是用于治疗急性低血糖症的确定疗法。紧急胰高血糖素施用可在施用的数分钟内恢复正常葡萄糖水平。然而，制备用于施用的胰高血糖素具有严重问题。在生理学pH或接近生理学pH下的水性缓冲液中，胰高血糖素具有弱溶解性。当在低或高pH下配制时，胰高血糖素还被证实具有弱化学稳定性和弱物理稳定性，诸如胶凝和溶解性聚集体形成。为了使这些问题降到最低，目前的商业胰高血糖素产品作为冻干粉末提供，伴随在施用时重构的说明书。在紧急情况下，重构冻干粉末是累赘和不便的。因此，期望提供用于治疗用途的化合物，其在生理条件下维持人胰高血糖素的生物学性能，同时还在非生理条件下显示出足够的水溶解性、化学稳定性和物理稳定性。
具有氨基酸置换以改善在酸性和生理学pH缓冲液中的溶解性和稳定性的胰高血糖素类似物公开于WO2008086086中。仍存在化合物的需要，所述化合物在生理条件下维持人胰高血糖素的生物学性能，同时还在非生理条件下显示出足够的溶解性、以及化学和物理稳定性。
相应地，本发明提供了维持野生型胰高血糖素活性，但还显示出足够的溶解性以及化学和物理稳定性的化合物。本发明还提供了适合于泵和/或紧急施用的化合物。此外，本发明提供了可以在双腔泵中与速效胰岛素类似物组合施用的化合物，以提供闭环血糖控制。
本发明提供了包含下述氨基酸序列的化合物：
Tyr-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-（Aib）-Lys-Lys-Ala-Gln-Glu-Phe-Val-Glu-Trp-Leu-Leu-Lys-Thr-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Lys-Ser-Lys-NH2（SEQ ID NO: 2）。本发明还提供了由下述氨基酸序列组成的化合物：
Tyr-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-（Aib）-Lys-Lys-Ala-Gln-Glu-Phe-Val-Glu-Trp-Leu-Leu-Lys-Thr-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Lys-Ser-Lys-NH2（SEQ ID NO: 2）。出乎意料的是，已发现与在水溶液中的人胰高血糖素相比较，本发明的化合物显示出增加的水溶解性、增加的化学稳定性和减少的原纤维形成。此外，本发明的化合物证实在5-7范围内的pH下增强的溶解性。本发明的化合物还提供了与人胰高血糖素相似的活性，例如与人胰高血糖素相比较的效力、作用时间和对胰高血糖素受体的选择性。因此，本发明的化合物适合于治疗低血糖症，包括重度或急性低血糖症。本发明的化合物的改善性能还允许制备在水溶液中的胰高血糖素，用于泵施用和/或重度低血糖症治疗。
本发明进一步提供了治疗受试者中的低血糖症的方法，其包括施用包含SEQ IDNO: 2的氨基酸序列的化合物。本发明还提供了治疗受试者中的低血糖症的方法，其包括施用由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成的化合物。本发明进一步提供了用于在疗法中使用的包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的化合物。本发明还提供了用于在疗法中使用的由SEQ IDNO:2的氨基酸序列组成的化合物。本发明还提供了用于在低血糖症治疗中使用的包含SEQID NO: 2的氨基酸序列的化合物。本发明还提供了用于在低血糖症治疗中使用的由SEQ IDNO:2的氨基酸序列组成的化合物。本发明提供了用于在低血糖症治疗的药剂制造中使用的包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的化合物。本发明还提供了用于在低血糖症治疗的药剂制造中使用的由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成的化合物。
本发明提供了药物组合物，其包括包含了SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的化合物和药学可接受的缓冲液。本发明还提供了药物组合物，其包括由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成的化合物和药学可接受的缓冲液。本发明还提供了药物组合物，其包括了包含SEQ IDNO: 2的氨基酸序列的化合物和组氨酸缓冲液。本发明还提供了药物组合物，其包括由SEQID NO:2的氨基酸序列组成的化合物和组氨酸缓冲液。本发明还提供了药物组合物，其包括了包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的化合物和组氨酸。本发明还提供了药物组合物，其包括由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成的化合物和组氨酸。本发明还提供了药物组合物，其包括了包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的化合物和组氨酸缓冲盐水。本发明还提供了药物组合物，其包括由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成的化合物和组氨酸缓冲盐水。所述药物组合物优选是水溶液。如本文使用的，术语“药学可接受的缓冲液”应理解为包含本领域技术人员已知的标准药物缓冲液中的任一种。用于肠胃外施用的药学可接受的缓冲液包括诸如生理盐水、磷酸盐缓冲盐水、柠檬酸盐缓冲盐水和组氨酸缓冲盐水。可以采用标准药物配制技术，例如Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company，Easton，PA中所述的那些。
本发明的化合物可以使用任何标准施用途径进行施用，诸如肠胃外、静脉内、皮下、肌内或经皮。在一个实施方案中，本发明的化合物是皮下或肌内施用。
药物组合物可以具有生理学可接受的pH。在一个实施方案中，药物组合物可以具有范围为约4至约8的pH。更优选地，药物组合物可以具有约5至约6的pH。
本发明的化合物的剂量范围可以为约0.01 mg至约100 mg。剂量范围可以为约0.01 mg至约10 mg。剂量范围还可以为约0.1 mg至约3 mg。此外，剂量范围可以为约0.01mg至约0.03mg。
本发明的化合物可以作为试剂盒的部分提供。在一个实施方案中，试剂盒与用于将化合物施用于人受试者的装置一起提供。更优选地，试剂盒包括用于施用化合物的注射器和针。最优选地，化合物在注射器内的水溶液中预配制。
本发明的化合物还可以用于泵系统中，例如胰岛素泵或双激素（例如胰岛素-胰高血糖素）泵系统。
如本文使用的，术语“有效量”或“治疗有效量”应理解为意指当施用于受试者时，产生期望的疗效而不引起不可接受的副作用的量。例如，本发明的化合物的“有效量”是将导致比不存在治疗的情况下血糖浓度的更大控制的数量。施用于受试者的本发明的化合物的“有效量”可以取决于疾病的类型和严重性，以及受试者的特征，包括但不限于一般健康状况、年龄、性别、体重、对药物的耐受、以及无法调节血糖的严重程度。
如本文使用的，术语“治疗”应理解为意指与特异性病症或状况诸如低血糖症相关的症状的改善。
本发明的氨基酸序列含有关于二十种天然存在的氨基酸的标准单字母或三字母代码。此外，“Aib”是α氨基异丁酸。
如本文使用的，“原纤维形成”指当胰高血糖素在低或高pH下配制时，观察到的胶凝形成和溶解性聚集体形成。
实施例1：肽合成
SEQ ID NO: 2的化合物通过固相肽合成在Protein Technologies Inc. Symphony上生成。合成（0.125 mmols规模）在Fmoc-Rink酰胺聚苯乙烯树脂（Rapp Polymere Tubingen，德国）上执行，具有大约0.68 mmol/g的置换。合成使用Fmoc主链保护基团策略执行。使用的氨基酸侧链衍生物是：Asp（O-叔丁基，OtBu）、Gln（三苯甲基，Trt）、Glu（OtBu）、His（Trt）、Lys（叔丁氧羰基，Boc）、Ser（OtBu）、Thr（OtBu）、Trp（Boc）和Tyr（OtBu）。偶联用在二甲基甲酰胺（DMF）中由二异丙基碳化二亚胺（DIC）和羟基苯并三唑（HOBt）活化的大约10当量的氨基酸（1:1:1摩尔比）进行。偶联在室温下进行90分钟至4小时。
伴随的从树脂中切割和侧链保护基团去除在含有三氟乙酸（TFA）: 三异丙基硅烷: 1,2-乙二硫醇：水：茴香硫醚90:4:2:2:2（v/v）的溶液中在室温下进行2小时。将溶液过滤，并且肽用冷二乙醚沉淀且以4000 rpm离心3分钟（冷乙醚洗涤重复三次）。将粗制肽再溶解于40 mL含有10%乙酸的水中，并且在C18反相高效液相色谱（HPLC）柱（WatersSymmetryPrep 7 µm，19 x 300 mm）上以18 mL/分钟的流速进行纯化。样品用15 - 55% B的线性AB梯度经过100分钟进行洗脱，其中A = 0.05% TFA/ H2O和B = 0.04% TFA/乙腈。产物一般用约26-28%乙腈洗脱。肽纯度和分子量在具有单四极杆MS检测器的Agilent 1100Series液相色谱-质谱法（LC-MS）系统上加以证实。分析型HPLC分离在WatersSymmetryShield RP18，3.5 µm，4.6 mm x 100 mm柱上使用10 - 100% B的线性AB梯度经过15分钟完成，其中A = 0.05% TFA/H2O和B = 0.04% TFA/ 40% H2O/ 60%乙腈，并且流速为0.7 mL/分钟（220 nm波长）。化合物纯化至> 95%纯度，并且证实为具有在1原子质量单位（amu）内对应于计算值的分子量。
使用AG 1-X8 Resin（Bio-RAD，乙酸盐形式，100-200 mesh，3.2 meq/干g，含湿量按重量计39-48%）（阴离子交换树脂），将TFA盐转换为乙酸盐。例如，将470 mg肽溶解于120mL 30%乙腈/H2O中。加入35 g树脂（与肽的正电荷约100倍摩尔比）。混合物溶液通过在室温下旋转搅拌1小时进行混合。将混合物溶液过滤，并且将树脂用30% ACN/H2O洗涤5次。将原始溶液和洗涤溶液合并且冻干。
溶解性和化学稳定性
将SEQ ID NO: 2的化合物在H2O 中溶解至10 mg/mL浓度（肽含量），通过0.22 µm滤器（Millex，SLGV004SL）过滤，并且随后在缓冲液P5 （在H2O 中的10 mM组氨酸，150 mM NaCl，pH 5.0）或缓冲液P6（在H2O 中的10 mM组氨酸，150 mM NaCl，pH 6.0）中稀释至1 mg/mL。将每种溶液转移至三个小瓶且高压灭菌。样品随后维持在4℃、30℃和40℃下。样品在不同时间点就浊度和相分离进行视觉评价。化合物的稳定性通过分析型反相HPLC（RP-HPLC）在加热至60℃的Phenomenex Aeris Widepore， 3.6 µm，XB-C18 4.6 x 100 mm柱上进行评价，使用5% B等度经过5分钟、5 - 25% B经过20分钟、25 - 30% B经过30分钟和30 - 45% B经过10分钟的AB（A=0.05% TFA/H2O； B= 0.04% TFA/乙腈）梯度，伴随1.2 mL/分钟的流速（220 nm的波长）。
通过视觉评价和RP-HPLC两者，SEQ ID NO: 2的化合物在4℃、30℃和40℃下在pH5（缓冲液P5）和pH 6（缓冲液P6）下经过4周维持良好溶解性。物理外观是澄清至无色，无乳白光和无颗粒。通过RP-HPLC的回收是定量的，如表1中证实的。
表1
缓冲液 总峰面积第0天 4℃总峰面积4周 30℃总峰面积4周 40℃总峰面积4周 30℃相对于4℃回收4周 40℃相对于4℃回收4周
P5 5107 5071 5156 5041 102% 99%
P6 5156 5152 5186 5282 101% 103%
当在4℃、30℃和40℃下维持4周时，SEQ ID NO: 2的化合物还在pH 5（缓冲液P5）和pH 6（缓冲液P6）下维持化学稳定性。如表2中证实的，通过RP-HPLC的样品评价指示对于在缓冲液P5中的SEQ ID NO:2的化合物小于4%的主峰变化（pH 5在4周时30℃相对于4℃）；在缓冲液P6中< 1%（pH 6在4周时30℃相对于4℃）；在缓冲液P5和P6两者中<6%（pH5和pH6在4周时40℃相对于4℃）。
表2
使用硫黄素T结合测定法的物理稳定性测试
原纤维形成是当胰高血糖素在水溶液中配制时的常见问题。为了评价本发明的化合物的原纤维形成水平，执行硫黄素T结合测定法。
将SEQ ID NO: 2的化合物以1 mg/mL溶解于具有平底的2.5 mL Fisher小瓶（Fisher FS60965D）中的各种测试缓冲液中，所述小瓶含有跳蚤大小的搅拌棒（Fishers目录# 1451364）。测试缓冲液在H2O中进行制备，并且全部调整至pH 6.0：
缓冲液1= 20 mM组氨酸
缓冲液2= 10 mM组氨酸，150 nM NaCl
缓冲液3= 10 mM组氨酸，300 mM山梨糖醇
缓冲液4= 10 mM组氨酸，0.02% Tween 80
缓冲液5= 10 mM组氨酸，300 mM蔗糖
此外，将人胰高血糖素（SEQ ID NO: 1）在以pH 2.8的12 mg/mL甘油溶液中溶解至1mg/mL的最终胰高血糖素浓度。所有样品均在25℃下在设为300 rpm的磁力搅拌板中进行机械应激。不同样品的等分试样（每个等分试样100 µL且一式三份完成）在时间点0、40和120小时获取，并且加入板中，随后为10 µL 1 mM硫黄素T（在H2O，pH 2.8中的原液）（ T35516-25G，Sigma Aldrich）。将样品温育30分钟。使用Spectramax M5（Moleculer Devices）测量荧光，使用440 nm作为激发波长，并且发射波长设为480 nm，具有475 nm截断和自动灵敏度调整。原始数据用Softmax Pro 5.4.1（Molecular Devices）收集并且输入至Excel。3个孔/每个时间点的平均值变成下表3中所示的报告荧光单位。
表3
样品 t = 0小时 t = 48小时 t = 96小时
在缓冲液1中的SEQ ID NO: 2 84.5 89.5 98.1
在缓冲液2中的SEQ ID NO: 2 188.4 211.6 231.4
在缓冲液3中的SEQ ID NO: 2 83.6 90.9 101.7
在缓冲液4中的SEQ ID NO: 2 70.1 76.9 83.9
在缓冲液5中的SEQ ID NO: 2 86.3 87.5 98.9
在12 mg/mL甘油，pH 2.8中的人胰高血糖素（SEQ ID NO: 1） 37.7 426.6 632.7
缓冲液1 34.4 36.8 36.5
缓冲液2 40.6 39.7 39.9
缓冲液3 39.6 39.8 45.0
缓冲液4 36.4 34.2 36.0
缓冲液5 48.7 50.1 51.3
12 mg/mL甘油，pH 2.8 33.8 35.4 37.1
如表3中所示，SEQ ID NO: 2的化合物在机械应力的存在下在25℃和pH 6下维持物理稳定性96小时，如通过视觉评价和硫黄素T结合测定法评价的。SEQ ID NO: 2的化合物未证实原纤维形成，如通过硫黄素T结合测定法测量的。
化合物对C57/Bl6雄性小鼠中的血糖水平的作用
为了确定SEQ ID NO: 2的化合物对血糖水平的作用，将化合物施用于C57/B16小鼠。使用三月龄雄性C57/B16小鼠（Harlan Laboratories）。动物单独饲养在具有12小时光/暗循环的温度控制（24℃）设施中，并且自由接近食物和水、在对设施的1周适应后，将小鼠随机化至治疗组（n = 4/组）。测试化合物在缓冲液2中进行配制（参见使用硫黄素T结合测定法的物理稳定性测试）。在测试早上，食物在08:00 AM时移除。在食物移除后两小时，将测试化合物以0、0.3、1、3或10 µg/kg剂量皮下给予。在测试化合物施用后的时间0、15、30、60和120分钟时，用ACCU-CHECK®（Roche Diagnostics）血糖仪测量血糖。表4显示了在不同时间点的葡萄糖值。结果表示为每组4只小鼠的平均值±标准误平均值（SEM）。
ED50在30分钟葡萄糖测量时进行计算。在10 µg/kg SEQ ID NO: 2的化合物时的血糖水平视为最大值。对于SEQ ID NO: 2的化合物，ED50是1.36 µg/kg（95%置信区间）。结果证实SEQ ID NO: 2的化合物能够增加血糖。
表4
人胰高血糖素受体结合测定法
通过使用过表达人胰高血糖素受体（hGR）的293HEK细胞系（Lok S等人Gene 140（2），203-209（1994）；GenBank: L20316），确定SEQ ID NO: 2的化合物的结合。
使用来自悬浮或贴壁培养的细胞制备粗制质膜。细胞团块在冰上在具有以20 µg/ml的DNA酶（Invitrogen，18047-019）的低渗匀浆化缓冲液（25 mM Tris HCl，pH 7.5，1 mMMgCl2和不含EDTARoche Complete™ Inhibitors（Roche，11873580001））中进行裂解。用玻璃杜恩思匀浆器（glass dounce homogenizer）（使用Teflon研杵共25次冲击）将细胞悬浮液匀浆化。匀浆物在4℃下以1800 X g离心15分钟。收集上清液，并且将团块重悬浮于低渗匀浆化缓冲液（不含DNA酶）中且再匀浆化。混合物以1800 X g离心15分钟。将第二上清液与第一上清液合并，并且以1800 X g离心15分钟至澄清。该澄清上清液进一步在4℃下以25000 X g离心30分钟。将膜团块重悬浮于低渗匀浆化缓冲液（不含DNA酶）中，且作为冷冻等分试样贮存于-80℃下直至使用。
人胰高血糖素通过125I-乳过氧化物酶程序进行放射性碘化，并且通过反相HPLC在Perkin-Elmer/NEN（NEX207）处进行纯化。比活性为约2200 Ci/mmol。由于125I标记的胰高血糖素材料中的高丙醇含量，KD测定通过同源竞争代替饱和结合来执行。KD估计为1.24 nM，并且用于计算所有测试化合物的Ki值。
受体结合测定法使用闪烁迫近测定法（SPA）（Sun，S.，Almaden，J.，Carlson，T.J.，Barker，J.和Gehring，M.R. Assay development and data analysis of receptor-ligand binding based on scintillation proximity assay. Metab Eng. 7:38-44（2005））进行，使用先前用1%无脂肪酸牛血清白蛋白（BSA）（Gibco，7.5% BSA） 封闭的麦胚凝集素（WGA）珠（Perkin-Elmer）。将人胰高血糖素（SEQ ID NO: 1） 和化合物（SEQ ID NO:2）以2 mM的浓度溶解于二甲亚砜（DMSO）中，并且冷冻贮存于-20℃下。
将人胰高血糖素和SEQ ID NO: 2的化合物系列稀释到DMSO中。将10 µL稀释样品转移到Corning 3632透明底部测定板，其含有40 µL测定结合缓冲液（25 mM 4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸（HEPES），pH 7.4，2.5 mM CaCl2，1 mM MgCl2，0.1%无脂肪酸BSA，0.003%Tween20和不含EDTA的Roche Complete Inhibitors）或冷胰高血糖素（以1 µM最终浓度的非特异性结合（NSB））。加入90 µL膜（3 µg/孔）、50 µL 125I-标记的胰高血糖素（在反应中的（0.15 nM最终浓度）和50 µL WGA珠（150 µg/孔）。DMSO浓度不超过4.2%。将板密封，倾覆混合（mixed end over end），并且在室温下在12小时的沉降时间后，用MicroBeta®闪烁计数器读数。
结果计算为在化合物的存在下特异性125I-标记的胰高血糖素结合的百分比。通过125I-标记的胰高血糖素的特异性结合百分比相对于加入样品的浓度（8.5x10-12至0.5x10-7 mol/L）的非线性回归而衍生化合物的绝对IC50浓度。使用Cheng-Prusoff方程（Cheng Y.，Prusoff W. H.，Biochem. Pharmacol. 22: 3099-3108（1973）），将IC50剂量转换为Ki。SEQ ID NO: 2的化合物的Ki对于hGR结合为0.286 ± 0.050 nM（n=4）（关于人胰高血糖素的Ki对于hGR结合为1.66 ± 0.09 nM，n=47）。该数据证实与人胰高血糖素比较，SEQID NO: 2的化合物以增加的亲和力与hGR结合，并且可以活化该受体，依次又触发胰高血糖素依赖性生理学应答。
小鼠胰高血糖素受体结合测定法
为了测定SEQ ID NO: 2的化合物是否结合小鼠胰高血糖素受体（mGR），执行基本上如人胰高血糖素受体结合测定法中所述的结合测定法。粗制质膜由在悬浮培养中表达克隆mGR的293HEK细胞进行制备。（（Burcelin R，Li J，Charron MJ. Gene 164（2），305-10（1995）GenBank: L38613）。膜团块如人胰高血糖素受体结合测定法中所述进行制备，重悬浮于匀浆化缓冲液中，且作为作为冷冻等分试样贮存于-80℃下直至使用时。
人胰高血糖素通过125I-乳过氧化物酶程序进行放射性碘化，并且通过反相HPLC在Perkin-Elmer/NEN（NEX207）处进行纯化。比活性为约2200 Ci/mmol。由于125I标记的胰高血糖素材料中的高丙醇含量，KD测定通过同源竞争代替饱和结合来执行。KD估计为2.05 nM，并且用于计算所有测试化合物的Ki值。
SPA受体结合测定法和结果的计算如人胰高血糖素受体结合测定法中所述进行。SEQ ID NO: 2的化合物的Ki对于mGR结合为1.82 ± 0.34 nM（n=4）（关于人胰高血糖素的Ki对于mGR结合为1.37 ± 0.07 nM（n=33））。该数据证实与人胰高血糖素比较，SEQ ID NO:2的化合物以相似的亲和力与mGR结合，并且可以活化该受体，依次又触发胰高血糖素依赖性生理学应答。
胰高血糖素样肽1受体结合测定法
为了确定SEQ ID NO: 2的化合物是否结合人胰高血糖素样肽1受体（hGLP-1R），执行基本上如人胰高血糖素受体结合测定法中所述的结合测定法。粗制质膜由与293HEK膜分离的表达克隆的人胰高血糖素样肽1受体（hGLP-1R）的293HEK悬浮细胞进行制备（Graziano MP，Hey PJ，Borkowski D，Chicchi GG，Strader CD，Biochem Biophys Res Commun. 196（1）:141-6（1993）GenBank: NM_002062）。膜团块如人胰高血糖素受体结合测定法中所述进行制备，重悬浮于匀浆化缓冲液中，且作为作为冷冻等分试样贮存于-80℃下直至使用时。
胰高血糖素样肽1 7-36酰胺（GLP-1酰胺）（SEQ ID NO: 3）通过125I-乳过氧化物酶程序进行放射性碘化，并且通过反相HPLC在Perkin-Elmer/NEN（NEX308）处进行纯化。比活性为约2200 Ci/mmol。由于125I标记的GLP-1酰胺材料中的高丙醇含量，KD测定通过同源竞争代替饱和结合来执行。KD估计为0.329 nM，并且用于计算所有测试化合物的Ki值。
SPA受体结合测定法和结果的计算如人胰高血糖素受体结合测定法中所述进行，除了使用放射性碘化的GLP-1酰胺代替人胰高血糖素受体结合测定法的放射性碘化的胰高血糖素之外。
SEQ ID NO: 2的化合物的Ki对于hGLP-1R结合为2543 ± 160 nM（n=3），而关于胰高血糖素（SEQ ID NO: 1）的Ki为2098 ± 91（n=17）（关于人GLP-1 7-36酰胺的Ki对于hGLP-1R结合为0.427 ± 0.169 nM（n=64））。该数据证实SEQ ID NO: 2的化合物以低亲和力与hGLP-1R结合，并且因此不起始GLP-1R介导的生理学应答。
葡萄糖依赖性促胰岛素肽受体结合测定法
为了测定SEQ ID NO: 2的化合物是否结合葡萄糖依赖性促胰岛素肽受体（GIP-R），执行基本上如人胰高血糖素受体结合测定法中所述的结合测定法。粗制质膜由表达人GIP-R的悬浮中国仓鼠卵巢细胞（CHO-S）（Usdin,T.B.，Gruber,C.，Modi,W.和Bonner,T.I.，GenBank: AAA84418.1）进行制备，使用来自悬浮培养的细胞。膜团块如人胰高血糖素受体结合测定法中所述进行制备，重悬浮于匀浆化缓冲液中，且作为作为冷冻等分试样贮存于-80℃下直至使用时。
GIP（SEQ ID NO: 4）通过I-125-乳过氧化物酶程序（Markalonis，J.J.，Biochem.J. 113:299（1969））进行放射性碘化，并且通过反相HPLC在Perkin-Elmer/NEN（NEX-402）处进行纯化。比活性为2200 Ci/mmol。KD测定通过使用冷人GIP的同源竞争代替饱和结合来执行。KD估计为0.174 nM，并且用于计算所有测试化合物的Ki值。
SPA受体结合测定法和结果的计算如人胰高血糖素受体结合测定法中所述进行，除了使用放射性碘化的GIP代替人胰高血糖素受体结合测定法的放射性碘化的胰高血糖素之外。
SEQ ID NO: 2的化合物的Ki对于人GIP-R结合为532 ± 76 nM（n=4），而胰高血糖素（SEQ ID NO: 1）的Ki为>3010（n=1）（关于人GIP的Ki为0.279 ± 0.0205 nM,（ n=2））。该数据证实SEQ ID NO: 2的化合物以低亲和力与hGIP-R结合，并且因此不起始hGIP-R介导的生理学应答。
人胰高血糖素受体刺激的cAMP功能测定法
hGR刺激的cAMP功能测定法使用与上文人胰高血糖素受体结合测定法中所述的用于hGR结合测定法相同的克隆hGR表达细胞系。细胞用胰高血糖素、缓冲液对照或测试样品进行刺激，并且使用CisBio cAMP Dynamic 2 HTRF Assay Kit（62AM4PEC）定量细胞内生成的cAMP。简言之，在细胞裂解缓冲液的存在下，通过与cAMP-d2捕获抗体结合来检测细胞内的cAMP水平。加入试剂盒中提供的第二检测抗体，抗cAMP穴状化合物，以制备竞争夹心测定法。当其中形成检测抗体法时，存在Perkin-Elmer Envision®仪器上测量的信号中的增加。
用无酶细胞解离溶液（Specialty Media 5-004-B）从亚汇合组织培养皿中收获hGR-HEK293细胞。细胞在室温下以100 X g形成团块5分钟，随后用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤两次。将洗涤的细胞团块以1x 107细胞/ml重悬浮于RecoveryTM Freeze Media（Gibco2044）中，并且在液氮中冷冻。在处理当天时，将细胞的冷冻等分试样转移到预温的Resuspension Cell Media（DMEM，Gibco（31053P），含有0.5%确定FBS（Hyclone SH30070）；20 mM HEPES，pH 7.4；和2 mM谷氨酰胺）内。细胞随后在室温下以100 X g形成团块5分钟。去除上清液，并且将细胞团块以1.25x105细胞/ml重悬浮于细胞培养基（DMEM，Gibco（31053P），具有0.1%无脂肪酸牛血清白蛋白，BSA，7.5%,（Gibco 15620）；20 mM HEPES，pH7.4和2 mM谷氨酰胺）中。测试样品在DMSO中制备为2 mM原液，并且在-20℃下冷冻直至需要时。胰高血糖素、缓冲液对照和SEQ ID NO: 2的化合物系列稀释到DMSO内，随后向下稀释（step-down dilution）到化合物稀释培养基（含有500 µmol/L IBMX的测定法培养基（DMEM，Gibco 31053P，具有0.1%无脂肪酸牛血清白蛋白，BSA，7.5%,（Gibco 15620）；20 mMHEPES，pH 7.4和2 mM谷氨酰胺））内。通过将20 µL细胞（2500细胞/孔）或cAMP标准曲线样品加入96孔板Half Area Black 平板（Costar 3694）中，随后加入20 µL在化合物稀释培养基中的2X浓缩胰高血糖素、缓冲液对照或SEQ ID NO: 2的化合物，在40 µL中执行反应。最终DMSO浓度不超过1.1%，并且最终IBMX浓度为250 µM。通过加入20 µL稀释到CisBio裂解缓冲液内的cAMP-d2-捕获抗体（CisBio）来停止反应，随后在TITERTEK振荡器中轻轻混合。在裂解5分钟后，加入20 µL检测抗体，抗cAMP穴状化合物（CisBio），并且以600 rpm混合1分钟。在室温下1小时后，使用Perkin-Elmer Envision®将裂解细胞和抗体混合物读数。使用cAMP标准曲线，将Envision®单位转换为pmol/L cAMP/孔。在每个孔中生成的cAMP的皮摩尔转换为用胰高血糖素对照观察到的最大应答的百分比。通过使用最大应答百分比相对于加入肽的浓度（0.17x10-12至1x10-8 M）的非线性回归而衍生相对EC50值。
SEQ ID NO: 2的化合物以0.0203 ±0.0039 nM（n=8）的EC50结合hGR（关于人胰高血糖素的EC50为0.0142±0.0018 nM,（n=6））。该数据证实SEQ ID NO: 2的化合物结合且活化hGR，并且由此可以起始胰高血糖素受体介导的生理学应答。
序列表
人胰高血糖素：
His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr（SEQ ID NO: 1）
实施例1:
Tyr-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-（Aib）-Lys-Lys-Ala-Gln-Glu-Phe-Val-Glu-Trp-Leu-Leu-Lys-Thr-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Lys-Ser-Lys-NH2（SEQ ID NO: 2）
人GLP-1:
His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2（SEQ ID NO: 3）
人GIP:
Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Ile-Ser-Asp-Tyr-Ser-Ile-Ala-Met-Asp-Lys-Ile-His-Gln-Gln-Asp-Phe-Val-Asn-Trp-Leu-Leu-Ala-Gln-Lys-Gly-Lys-Lys-Asn-Asp-Trp-Lys-His-Asn-Ile-Thr-Gln（SEQ ID NO:4）

Claims (8)

1.一种化合物，其包含Tyr-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-（Aib）-Lys-Lys-Ala-Gln-Glu-Phe-Val-Glu-Trp-Leu-Leu-Lys-Thr-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Lys-Ser-Lys-NH2（SEQ ID NO: 2）的氨基酸序列。
2.权利要求1的化合物，其中所述化合物由Tyr-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-（Aib）-Lys-Lys-Ala-Gln-Glu-Phe-Val-Glu-Trp-Leu-Leu-Lys-Thr-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Lys-Ser-Lys-NH2（SEQ ID NO: 2）的氨基酸序列组成。
3.一种药物组合物，其包含权利要求1或权利要求2的化合物和药学可接受的缓冲液。
4.权利要求3的药物组合物，其中所述药学可接受的缓冲液是组氨酸缓冲盐水。
5.一种治疗受试者中的低血糖症的方法，其包括施用有效量的权利要求1或权利要求2的化合物。
6.用于疗法中的权利要求1或权利要求2的化合物。
7.用于低血糖症治疗中的权利要求1或权利要求2的化合物。
8.在用于低血糖症治疗的药剂的制备中使用的权利要求1或权利要求2的化合物。
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