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CN105802979A - 一种小牛肠碱性磷酸酶的表达载体及表达方法 - Google Patents

一种小牛肠碱性磷酸酶的表达载体及表达方法 Download PDF

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CN105802979A CN201610200709.5A CN201610200709A CN105802979A CN 105802979 A CN105802979 A CN 105802979A CN 201610200709 A CN201610200709 A CN 201610200709A CN 105802979 A CN105802979 A CN 105802979A
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Abstract

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种小牛肠碱性磷酸酶的表达载体及表达方法。本发明提供的表达方法能够高效、准确表达CIAP蛋白，且其生物活性不受影响。实验表明，经过24小时的培养，每OD600的细胞能够产生30mg的CIAP融合蛋白。以本发明提供的小牛肠碱性磷酸酶融合蛋白制备的SAT报告探针具有良好的灵敏性，与现有技术中提取的CIAP蛋白相比，性质并无显著差异。

Description

一种小牛肠碱性磷酸酶的表达载体及表达方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种小牛肠碱性磷酸酶的表达载体及表达方法。
背景技术
小牛肠碱性磷酸酶(CalfIntestinalAlkalinePhosphatase，简称CIAP)，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，通过化学偶联剂S-HyNic(酰琥珀酰亚胺酯丙酮腙)、4FB(琥珀酰亚胺4-甲酰基苯甲酸)的交联作用，小牛肠碱性磷酸酶氨基酸侧链上的ε氨基和寡核苷酸3’端的氨基分别被腈基和醛基取代，从而使小牛肠碱性磷酸酶与寡核酸结合在一起反应成为复合的二级蛋白-核酸结构体，经FPLC(高效液相色谱)纯化或者超滤浓缩纯化后作为SAT(核酸信号放大技术)核酸检测平台的报告探针使用。因此，小牛肠碱性磷酸酶在生物技术领域有着非常广泛的应用。
现有技术中，CIAP主要通过都是从动物组织上提取到的产物，这种提取制备CIAP的方式产率低，费时费力，导致原料价格居高不下。并且，提取获得的CIAP中总是存在着部分难以纯化去除的杂质，给后期实验带来了不稳定的隐患。
利用基因工程的方法，对蛋白进行原核表达是目前解决蛋白质体外合成的热门方法之一，其产量高，生产周期短。但是，原核表达过程中，密码子的选择、载体的类型、表达条件等都会表达结果产生重要的影响，而目前尚无针对CIAP的原核表达方法的报道。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种小牛肠碱性磷酸酶的表达载体及表达方法，本发明提供的表达载体和表达方法能够高效的表达CIAP。
本发明提供了一种小牛肠碱性磷酸酶的表达载体，包括SEQIDNO:2所示的核苷酸序列。
作为优选，表达载体的骨架为PMAL-c5x载体。
由于在体外表达哺乳动物的基因，特别是采用原核表达体系表达哺乳动物的基因具有不可预测性，且难度很大。密码子的选择、表达载体骨架的种类，密码子与表达载体之间的配合，都会对表达结果产生影响。本发明中，SEQIDNO:2所示核苷酸序列是根据CIAP的氨基酸序列优选后的密码子序列，与SEQIDNO:3～4的核苷酸序列相比，使用SEQIDNO:2所示核苷酸序列对CIAP进行表达，能够获得更高的表达量，且所得蛋白不会形成包涵体。
PMAL-c5x载体为商品化载体，购自NEB北京。
作为优选，SEQIDNO:2所示氨基酸序列在PMAL-c5x载体中插入位点位于NcolI-HindIII之间。
本发明提供的表达载体的制备方法包括：
步骤1：将SEQIDNO:2所示核苷酸序列以NcolI-HindIII酶切，获得目的片段；
步骤2：将PMAL-c5x载体以NcolI-HindIII酶切后，与目的片段连接，获得表达载体。
在本发明中，SEQIDNO：2所示核苷酸序列采用人工合成的方式制备。SEQIDNO:3为野生型CIAP的表达密码子，SEQIDNO:4为经优化的另一密码子，实验表明，SEQIDNO:3～4连接入载体后，表达效果皆不及SEQIDNO:2。
酶切SEQIDNO:2所示核苷酸序列的温度为37℃，酶切时间为5h。
酶切PMAL-c5x载体的温度为37℃，酶切时间为5h。
PMAL-c5x载体酶切后与目的片段连接采用T4DNA连接酶，连接条件为16℃，过夜。
经过连接的质粒转化入大肠杆菌DH5α中，以氨苄霉素筛选阳性克隆，以菌落PCR法进行验证。
本发明实验结果表明，采用PMAL-c5x载体对CIAP进行表达，能够获得较大的表达量。
本发明还提供了一种宿主细胞，其被本发明提供的表达载体转染。
作为优选，宿主细胞为大肠杆菌BL21细胞。
作为优选，转染采用热激法。
本发明还提供了一种小牛肠碱性磷酸酶融合蛋白的表达方法，以本发明提供的表达载体转染宿主细胞后诱导培养。
作为优选，宿主细胞为大肠杆菌BL21细胞。
BL21是常用的表达菌株,一般配合以强表达载体来进行目的基因的强表达，适合表达非毒性蛋白。本发明采用BL21细胞对CIAP进行了高效的表达。
通常认为，以原核细胞表达动物细胞的蛋白质虽然表达量非常高，但往往会导致错误的二级结构形成，使得表达产物在分子结构、理化特性和生物学功能方面与天然蛋白质存在差异。本发明通过对密码子、宿主细胞、表达载体、表达条件的优化，使得融合蛋白的表达量在没有降低的前提下，保证了融合蛋白二级结构的形成，且没有影响融合蛋白的生物活性。
作为优选，诱导培养的诱导剂为IPTG；所述诱导剂的浓度为0.5mmol/L。
作为优选，诱导培养的培养液为LB培养基。
作为优选，诱导培养后还包括纯化的步骤，所述纯化为：收集经诱导培养的宿主细胞超声裂解后，弃除细胞碎片，以镍柱吸附后以咪唑洗脱，经透析，获得小牛肠碱性磷酸酶融合蛋白。
超声裂解的条件为，0℃～4℃，6mm变幅杆，35％功率，3.5s工作，7s休息，超声50min。
超声前加入蛋白酶抑制剂PMSF。
透析的分子量为66kDa。
本发明提供的表达方法制备的小牛肠碱性磷酸酶融合蛋白。
本发明制备的小牛肠碱性磷酸酶融合蛋白在SEQIDNO:1所示氨基酸序列的N端连接有6×his的标签。实验表明，该标签的存在没有影响融合的蛋白的生物活性。
本发明提供的表达方法制备的小牛肠碱性磷酸酶融合蛋白在制备SAT报告探针中的应用。
本发明提供的小牛肠碱性磷酸酶融合蛋白能够用于SAT报告探针的制备。
本发明提供的小牛肠碱性磷酸酶融合蛋白对偶联的核酸无特殊要求。
本发明提供了用于CIAP的表达载体、宿主、表达方法和应用。本发明提供的表达方法能够高效、准确表达CIAP蛋白，且其生物活性不受影响。实验表明，经过24小时的培养，每OD600的细胞能够产生30mg的CIAP融合蛋白。以本发明提供的小牛肠碱性磷酸酶融合蛋白制备的SAT报告探针具有良好的灵敏性，与现有技术中提取的CIAP蛋白相比，性质并无显著差异。
附图说明
图1示检测结果信噪比。
具体实施方式
本发明提供了一种小牛肠碱性磷酸酶的表达载体及表达方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的材料、试剂或仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1表达载体的构建
1)、人工合成SEQIDNO:2所示核苷酸序列，以NdelI-HindIII酶进行酶切，酶切条件为37度。将酶切后产物进行琼脂糖凝胶电泳，胶回收大小为1545bp的核苷酸片段。
2)、将PMAL-c5x载体以NdelI-HindIII酶进行酶切，酶切条件为37度。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳，胶回收大小为1500bp左右的片段。
3)、将酶切后的线性载体与目的片段以T4DNA连接酶连接，连接温度为16℃，连接过夜。
4)、连接产物转化大肠杆菌DH5α，以含有氨苄抗生素的LB培养基培养，挑取阳性菌落进行菌落PCR鉴定。对鉴定结果为阳性的菌落进行扩繁。
5)、扩繁后的菌落提取质粒后，将质粒转化入大肠杆菌BL21感受态细胞，以含有氨苄抗生素的LB培养基培养，挑取阳性菌落进行菌种保藏以备后续试验。
对比例1表达载体的构建
1)、人工合成SEQIDNO:3所示核苷酸序列，以EcoRV-HindIII酶进行酶切，酶切条件为37度。将酶切后产物进行琼脂糖凝胶电泳，胶回收大小为1545bp的核苷酸片段。
2)、将PMAL-c5x载体以EcoRV-HindIII酶进行酶切，酶切条件为37度。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳，胶回收大小为1500bp左右的片段。
3)、将酶切后的线性载体与目的片段以T4DNA连接酶连接，连接温度为16℃，连接过夜。
4)、连接产物转化大肠杆菌DH5α，以含有氨苄抗生素的LB培养基培养，挑取阳性菌落进行菌落PCR鉴定。对鉴定结果为阳性的菌落进行扩繁。
5)、扩繁后的菌落提取质粒后，将质粒转化入大肠杆菌BL21感受态细胞，以含有氨苄抗生素的LB培养基培养，挑取阳性菌落进行菌种保藏以备后续试验。
对比例2表达载体的构建
1)、人工合成SEQIDNO:4所示核苷酸序列，以NcolI-HindIII酶进行酶切，酶切条件为37度。将酶切后产物进行琼脂糖凝胶电泳，胶回收大小为1545bp的核苷酸片段。
2)、将PMAL-c5x载体以NcolI-HindIII酶进行酶切，酶切条件为37度。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳，胶回收大小为1500bp左右的片段。
3)、将酶切后的线性载体与目的片段以T4DNA连接酶连接，连接温度为16℃，连接过夜。
4)、连接产物转化大肠杆菌DH5α，以含有氨苄抗生素的LB培养基培养，挑取阳性菌落进行菌落PCR鉴定。对鉴定结果为阳性的菌落进行扩繁。
5)、扩繁后的菌落提取质粒后，将质粒转化入大肠杆菌BL21感受态细胞，以含有氨苄抗生素的LB培养基培养，挑取阳性菌落进行菌种保藏以备后续试验。
对比例3表达载体的构建
1)、人工合成SEQIDNO:2所示核苷酸序列，以NcolI-HindIII酶进行酶切，酶切条件为37度。将酶切后产物进行琼脂糖凝胶电泳，胶回收大小为1545bp的核苷酸片段。
2)、将pet28b载体以NcolI-HindIII酶进行酶切，酶切条件为37度。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳，胶回收大小为1500bp的片段。
3)、将酶切后的线性载体与目的片段以T4DNA连接酶连接，连接温度为16℃，连接过夜。
4)、连接产物转化大肠杆菌DH5α，以含有氨苄抗生素的LB培养基培养，挑取阳性菌落进行菌落PCR鉴定。对鉴定结果为阳性的菌落进行扩繁。
5)、扩繁后的菌落提取质粒后，将质粒转化入大肠杆菌BL21感受态细胞，以含有氨苄抗生素的LB培养基培养，挑取阳性菌落进行菌种保藏以备后续试验。
对比例4表达载体的构建
1)、人工合成SEQIDNO:2所示核苷酸序列，以EcoRV-HindIII酶进行酶切，酶切条件为37度。将酶切后产物进行琼脂糖凝胶电泳，胶回收大小为1545bp的核苷酸片段。
2)、将pet32a载体以EcoRV-HindIII酶进行酶切，酶切条件为37度。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳，胶回收大小为1500bp左右的片段。
3)、将酶切后的线性载体与目的片段以T4DNA连接酶连接，连接温度为16℃，连接过夜。
4)、连接产物转化大肠杆菌DH5α，以含有氨苄抗生素的LB培养基培养，挑取阳性菌落进行菌落PCR鉴定。对鉴定结果为阳性的菌落进行扩繁。
5)、扩繁后的菌落提取质粒后，将质粒转化入大肠杆菌BL21感受态细胞，以含有氨苄抗生素的LB培养基培养，挑取阳性菌落进行菌种保藏以备后续试验。
实施例2融合蛋白表达
1、将实施例1和对比例1～4构建的菌种诱导表达目的蛋白，并进行检测，方法为：
1)、将菌株在3mlLB培养基中摇至OD600为0.6，加入IPTG，IPTG浓度为0.3mmol/L，37℃，140rpm诱导过夜；
2)、SDS-PAGE电泳检测各菌种目的蛋白的表达情况，并进行包涵体的检测。
结果显示：实施例1、对比例1～2的菌种的后，破碎菌体后形成的上清液中显示成功表达了融合蛋白；而对比例3和对比例4虽然也表达了融合蛋白，但其蛋白形成了包涵体，没有出现在上清液中。
2、对实施例1、对比例1～2的菌种进行扩大培养，并进行检测，方法为：
菌种接种入300ml含有氨苄抗生素的LB液体培养基中37℃，250rpm摇至OD600值为1.0左右(记录OD600值)，加入IPTG至IPTG浓度为0.5mmol/L，37℃，140rpm诱导过夜；将菌液6000rpm，4min，4度离心收集菌体后，检测获得蛋白的量。其中，融合蛋白的提取采用镍柱亲和层析法(试剂盒购自英诺生物)，实验参照说明书进行。具体的：
1)、菌体在冰浴条件下，用6mm变幅杆，35％功率，3.5s工作，7s休息，超声破碎50min。
2)、将破碎好的溶液收集到50ml离心管中。10000rpm，15min，4°离心，取上清液，加到已经平衡好的镍柱上。
3)、洗脱蛋白后，洗脱下来的液体经过透析袋透析(透析液为20mMPBS+50mMNaCl)，透析袋的分子量为62kDa。
4)、测定透析后蛋白的浓度，换算所得蛋白的质量，结果如表1：
表1诱导培养结果
实施例1 对比例1 对比例2
诱导前OD600值 0.55 0.60 0.65
诱导后OD600值 1.2 0.9 0.85
所得蛋白质量(mg) 30 15 6
单位OD值获得蛋白质量 25mg 16.7mg 7mg
注：*示与实施例1相比存在显著性差异
结果表明，实施例1所制得的菌种能够更高效的表达CIAP融合蛋白。
实施例3探针的制备及应用
以现有技术中提取获得的CIAP蛋白为对照，以实施例1制得菌种表达的CIAP融合蛋白为实验对象，将二者分别与序列为AGGTCTCTGCTTAGAGGTACTT的探针偶联，该探针用于SAT技术的报告检测探针。偶联方法参见专利6686461,6800728,7102024,7173125,7462689附上产品说明书。
实施流程：
探针标记物在SAT技术中的应用；
步骤1设计一种包被引物核酸序列(5’-NH2-GAGCGGATATATGCTTAGGAAT-3’)，合成该序列并溶解在PH为8.0的TE缓冲溶液中，将引物稀释至3～5ug/ml；
步骤2配制包被缓冲液，按照配方表中各组分，磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、多聚赖氨酸溶液、硫酸钠、氯化钠、去离子水，注意，先加磷酸钠缓冲液，后加入多聚赖氨酸，待溶液澄清后加入易溶解的硫酸钠和氯化钠试剂，避光常温磁力搅拌2～3小时左右；
步骤3将溶解在TE缓冲液中的引物和配制好的包被缓冲液等比例混合，确保引物终浓度在1.5～2.5ug/ml之间；
骤4使用1XPBSPH8.2溶液清洗空白的96孔聚苯乙烯塑料板三遍，离心1200rpm2min左右，确保板内无残留液体，放置干燥箱箱中待用；
步骤5将步骤3中准备的试剂用包被机或者校准过的多通道移液器等分至每孔中，每孔加入包被试剂100～150ul左右，用锡箔纸或者保鲜膜密封板，并放置在4度冰箱中过夜包被。
步骤6使用1XPBSPH8.2溶液清洗空白的96孔聚苯乙烯塑料板三遍，离心1200rpm2min左右，确保板内无残留液体，放置干燥箱中干燥5～6小时。
步骤7装袋密封，加入2g干燥剂。转至成品库储存。
步骤8包被板的验证，设计一种核酸序列(5’-AGGTCTCTGCTTAGAGGTACTT-NH2-3’)，该序列与包被的引物互补，合成该引物，将浓度稀释至100pmol/ul。
步骤9将引物稀释成3个梯度，分别是100pmol/ul,10pmol/ul,1pmol/ul。分别加入100ul到包被板孔内。实验设计方案如表2：
表2实验设计方案
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按照表2检测各板孔的信号值，实验获得数据如表3：
表3实验数据
800 536580 62500 5735
855 554850 61450 6555
765 578565 65135 5355
755 568745 64780 5675
920 567850 59865 6125
880 578695 68710 6345
910 605245 58740 5845
775 575850 61520 6005
实验信噪比数据如图1，结果显示，以本申请实施例1制得菌种表达CIAP融合蛋白制得的探针能够准确检测到靶标信号值，该结果与以现有技术提取制得的CIAP蛋白制得探针的结果一致。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种小牛肠碱性磷酸酶的表达载体，其特征在于，包括SEQIDNO:2所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体的骨架为PMAL-c5x载体。
3.一种宿主细胞，其特征在于，其被权利要求1或2的表达载体转染。
4.根据权利要求3所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21细胞。
5.一种小牛肠碱性磷酸酶融合蛋白的表达方法，其特征在于，以权利要求1或2的的表达载体转染宿主细胞后诱导培养。
6.根据权利要求5所述的表达方法，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21细胞。
7.根据权利要求5所述的表达方法，其特征在于，所述诱导培养的诱导剂为IPTG；所述诱导剂的浓度为0.5mmol/L。
8.根据权利要求5所述的表达方法，其特征在于，所述诱导培养后还包括纯化的步骤，所述纯化为：收集经诱导培养的宿主细胞超声裂解后，弃除细胞碎片，以镍柱吸附后以咪唑洗脱，经透析，获得小牛肠碱性磷酸酶融合蛋白。
9.权利要求5～8任一项所述的表达方法制备的小牛肠碱性磷酸酶融合蛋白。
10.权利要求5～8任一项所述的表达方法制备的小牛肠碱性磷酸酶融合蛋白在制备SAT报告探针中的应用。
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