CN105769750A - 基于bdnf(脑源性神经营养因子)的眼制剂及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基于BDNF(脑源性神经营养因子)的眼制剂及其用途。具体而言，本发明涉及基于BDNF(脑源性神经营养因子)的滴眼剂形式的眼制剂。所述制剂可局部施用于完整眼表面，可用于预防和治疗视网膜、视神经、外侧膝状体和视皮质的神经变性疾病中，以预防视力下降，使视觉功能恢复正常。

Description

基于BDNF(脑源性神经营养因子)的眼制剂及其用途

本申请为2010年11月12日提交的发明名称为“基于BDNF(脑源性神经营养因子)的眼制剂及其用途”的PCT申请PCT/IB2010/003220的分案申请，所述PCT申请进入中国国家阶段日期为2012年5月15日，申请号为201080051655.1。

技术领域

本发明涉及滴眼剂形式的眼制剂，其含有脑源性神经营养因子(BDNF)和粘度控制剂，优选从罗望子(tamarind)种子中提取的半乳糖木糖葡聚糖，也称为TS多糖或TSP。

所述制剂可用于预防和治疗神经变性的视网膜病症，尤其是色素性视网膜炎、青光眼(包括先天性青光眼、婴儿青光眼、幼年性青光眼、成年青光眼、原发性开角型青光眼、原发性闭角型青光眼、继发性青光眼、医源性青光眼和急性青光眼)、年龄相关的视网膜病例如年龄相关性黄斑变性、血管和增殖性视网膜病症、视网膜脱落、早产儿视网膜病(ROP)和糖尿病性视网膜病，所有这些疾病能导致失明。

背景技术

神经营养因子(neurotrophins)是由神经细胞合成的蛋白质，其控制神经系统中多种细胞的生存和正常的营养作用。

了解最多的是神经生长因子(NGF)，由R.Levi-Montalcini和S.Cohen在20世纪中期发现。

其他蛋白结构与NGF类似的因子随后被发现，因而我们现在考虑一类NGF因子(神经营养因子)，其包括BDNF、NT-3、NT-4/5和NT-6以及NGF(前三个主要表达于哺乳动物的神经系统中，而NT-6是在硬骨鱼中发现的神经营养因子新成员，而在哺乳动物脑中不存在)。

包括神经营养因子在内的神经性营养因子由合成其的神经细胞释放并结合膜上的特异性受体。

尽管它们结构类似，但各种神经营养因子通过不同的受体起作用，因此具有不同的作用机制。

神经性营养因子与其特异性受体的结合(TrkA结合NGF；TrkB结合BDNF和部分NT-4；TrkC结合NT-3)产生了一系列的事件，从而诱导神经细胞的特异性反应。

不同的神经营养因子受体在不同的区域、同一区域内不同的细胞中表达，激活特异性的细胞内信号转导途径。因此逻辑上并非所有的区域或神经细胞都能对上述4种神经营养因子中的每一种响应；限制因素是给定的神经营养因子的特异性受体的细胞分布。

能合成和释放NGF的视网膜细胞的分布，神经营养因子的原始型和表达NGF受体(TrkA)的视网膜细胞的分布是非常有限的，实际上限于神经节细胞和星形神经胶质细胞的亚类(Garcia等人,2003)。

EP1161256B1描述了含有200-500μg/mlNGF的眼制剂，其施用至完整眼表面以治疗和/或预防影响巩膜、睫状体、晶状体、视网膜、视神经、玻璃体液和/或脉络膜的病症。

Lambiase等报道这些制剂增加了NGF的视网膜水平；然而，可证实NGF不能在视网膜上产生神经保护作用。

这与最近Shi等人报道的结果一致(2007)。NGF可结合两类视网膜中的受体，TrkA和P75，其发挥对神经细胞的营养和生存相反的作用。当外源性NGF到达视网膜时，其可能诱导对视网膜细胞的两种相反作用，从而相互抵消。

此外，BDNF与其受体TrkB在哺乳动物视网膜中大量表达。视网膜由分层排列的多种类型细胞组成。具体而言，BDNF由视网膜内层的某些神经节细胞和无长突细胞合成，例如多巴胺能细胞(Herzog等.,1994；Perez和Caminos,1995；Hallbook等,1996；Herzog和vonBartheld,1998；Karlsson和Hallbook,1998；Bennett等,1999；Pollock和Frost,2003；Seki等,2003；Chytrova和Johnson,2004)。

BDNF受体称为TrkB，在多种类型的视网膜细胞中表达，包括神经节细胞、无长突细胞和穆勒神经胶质细胞(Jelsma等,1993；Cellerino和Kohler,1997；DiPolo等,2000)。

WO97/45135涉及水溶液或冻干物形式的稳定的BDNF药物组合物，在该文献尤其是在涉及现有技术部分中，认为BDNF可用于治疗多种病症，包括色素性视网膜炎。唯一明确提到的施用形式是注射制剂。

JP2003048851涉及基于BDNF的眼制剂，以滴眼剂的形式在结膜上施用。其公开的制剂含有多种粘度控制剂，描述为能同等有效地将BDNF递送至视网膜。

所述文献中报道的活性的证据是不令人信服的，因为BDNF的浓度范围非常宽：0.001-1重量/体积％，对应于1x10^-2-10μg/μl的浓度范围[权利要求3，专利范围；根据本发明的[0006]，第3段的详细描述，但是在报道的实施例中，使用的浓度＝0.004％(重量/体积％)，对应于4x10^-2μg/μl，即，远低于能增加BDNF视网膜水平并预防长时间光照引起的视网膜变化的有效浓度(其大于等于15μg/μl，范围为15-200μg/μl，根据本发明)。应当注意，JP2003048851中该应用一天重复3次(10μl/次,0.004％重量/体积)，进行5天，等于1.2μg/天的剂量，总剂量为6μg。即使考虑日剂量和总剂量，其对于神经保护作用也太低了；事实上，按照本发明，为了在光损伤的视网膜中获得神经保护作用，至少需要局部施用150μg的最低总剂量。另一项试验模型(发生青光眼的小鼠)中获得的新数据证实了在所用的3个BDNF浓度中(1、5和15μg/μl)，仅最高的浓度(15μg/μl)是有效的。

此外，JP2003048851涉及通过组织学技术(视网膜切片的苏木精曙红染色)测定视网膜厚度来验证视网膜保护效应，但却没有附上证明如本发明所述的通过闪光视网膜电图记录测定的视网膜功能的恢复。本领域公知，为证明任何视网膜水平的治疗的神经保护效力，仅有组织学/形态学技术获得的结果是不充分的；还需要视网膜功能的恢复的证据。因此认为在JP2003048851中以实施例报道的浓度(更普遍在优选的范围中)外用的BDNF眼制剂不能以足够的量通过眼表面到达内部组织，进而产生能恢复视网膜功能的神经保护作用。

WO2006/046584涉及用交联的明胶水凝胶浸渍的含有HGF、BDNF或PEDF的持续释放组合物，其可用于治疗涉及视细胞病变的病症，例如色素性视网膜炎变性。在具体的实施例中，所述组合物是含有0.001-1000μgBDNF剂量的微球形式，可通过眼内注射或视网膜下植入施用。

EP0958831描述了含有选自包括BDNF在内的神经性营养因子的眼用组合物。所述组合物可从外部施用，例如以眼用软膏或溶液的形式，或者可制成隐形眼镜。

EP0958831中公开的神经性营养因子的浓度范围为0.0001-0.5％(重量/体积)，即从1x10^-3至5μg/l。因此所报道的浓度范围非常宽泛。EP0958831很宽泛，因为其涉及多种神经性营养因子，包括BDNF，它们在浓度范围内是同等有效的。已知神经性营养因子由于决定其在不同脑区域和各神经细胞中的生物学效果的受体的密度和分布不同，其在相同的浓度范围内不是同等有效的。

此外，EP958831对于局部使用的有效BDNF浓度范围是非常含糊和不清楚的。在第3页第44行(参见第0022和0033段，权利要求19和20)给出了两种浓度范围，其并不匹配(范围A最大，介于0.0001-0.5％(W/V)，等于10^-3到5μg/μl的浓度范围，范围B介于10^-3到2x10⁵μg/l；这两个浓度范围显然不能对应。然而根据本发明，BDNF的有效浓度等于/大于15μg/μl(范围15-200μg/μl，即高于EP958831中报道的范围A，即其最大浓度范围)。EP958831中的实施例涉及BDNF浓度为0.02、0.04和10μg/l的眼用组合物，即远低于(低1x10⁶倍)根据本发明所证明的能有效提高视网膜中BDNF水平、预防光损伤和青光眼损伤的最低浓度，即15μg/μl。

因此可以得出结论，以EP958831报道的浓度外用的BDNF的眼用组合物不能以足够的量通过眼表面到达内部组织而增加BDNF的视网膜水平，和由此产生治疗作用。

另一种结合TrkB的神经营养因子NT-4在视网膜中低水平表达，仅作用于无长突细胞亚类，即合成多巴胺的那些细胞(Calamusa等,2007)。

BDNF或其受体的缺乏能引起视网膜功能的严重改变；例如，缺乏TrkB受体的小鼠(敲除的小鼠)的特征为视网膜对光响应的完全丧失(闪光视网膜电图中b波的完全缺失；Rohrer等,1999)。

LaVail的研究组已经证实，眼内注射BDNF而非NGF能有效预防光损伤导致的光感受器的形态学变性。

眼内注射BDNF和其他神经性营养因子能减少由视神经损伤导致的视网膜神经节细胞的损伤，但还不清楚BDNF是否能单独行使神经保护效应，即不依赖于其他神经性营养因子(Watanabe等,2003；Yata等,2007)。

已证明其他神经性营养因子例如FGF2在预防光损伤引起的形态学变化中同样有效，但与BDNF不同，其施用具有与炎症反应有关的活化因子的不希望的作用(LaVail等,1987)。

另一种神经性营养因子CNTF也能预防光损伤导致的形态学变性(LaVail等,1978)；不幸的是，最近的试验表明基于CNTF的治疗改变了视网膜对光的应答，因此导致其潜在的治疗应用受到一系列的限制(McGill等,2007)。

这些结果表明，在视网膜病症模型中为达到神经保护的目的，仅评价剌激神经的分子的形态学作用是不够的；重要的是，必须评价这些分子是否对视网膜功能起保护作用，并保证其不损伤视网膜细胞对视觉刺激的响应。因此目前仍然需要鉴定可通过非侵入性技术将BDNF递送至视网膜的新的BDNF制剂，其避免了不适合长期慢性治疗的高度侵入的施用技术，例如眼内、视网膜下或眼球后注射，因为这些技术有引起例如眼球穿孔、感染或出血的风险。

本发明提供了多种含BDNF的制剂的局部结膜应用，其中BDNF的浓度范围为15-200μg/μl，根据要治疗的眼球的大小，每次施用的BDNF总剂量为50-4000μg，其取决于治疗的动物物种，包括人。

所述制剂优选含有粘度控制剂。所述粘度控制剂优选是从罗望子种子中提取的半乳糖木糖葡聚糖(TS多糖或TSP)，分子量为500000至800000Da，具有下列结构式：

我们证实所述制剂在给定的浓度和剂量下能显著增加视网膜的BDNF水平，并预防i)长期暴露于光导致的视网膜变化，以及ii)青光眼的视网膜变化。

以前已经证实(Uccello-BarrettaG等,2008；GhelardiE等,2004；BurgalassiS等,2000；GhelardiE等2000)，TSP能携带药物活性分子用于眼表面的局部治疗。通过增加制剂在眼表面的保留时间，观察到活性分子的吸收增加。TSP的这种性质已描述在其与抗生素(芦氟沙星、庆大霉素、氧氟沙星)、抗组胺药(酮替芬)和抗高血压药(噻吗洛尔)的组合中，所有这些均是小分子。

在含有重组蛋白例如BDNF的药物制剂中，活性成分是蛋白质，一种具有高分子量的分子，其进行翻译后修饰和空间弯曲调整以达到活性三维构型。由于和识别它们的特定的受体和酶之间的相互作用，蛋白质的生物活性密切依赖于其三维构型，因此其干预靶细胞的生化过程的能力依赖于此。蛋白质构型可被发现重组蛋白的环境所显著改变。含有重组蛋白的制剂因此必需保证蛋白质以活性构型保留在溶液中，并保证其稳定性。

本发明证实TSP能保证BDNF在制剂中的稳定性，并由于制剂长时间在眼表面停留而增加其眼吸收，而且重要的是维持BDNF的生物活性构型。

发明内容

现已发现含有至少15μg/μl浓度的BDNF的眼制剂能预防长时间暴露在光照下的视网膜改变，以及青光眼模型中与眼内压增加有关的病症。

本发明因此涉及滴眼剂形式的眼制剂，其含有脑源性神经营养因子(BDNF)。根据其优选的方面，本发明涉及的组合物含有从罗望子种子中提取的称为TSP的半乳糖木糖葡聚糖。

本发明还涉及BDNF在制备用于预防和/或治疗视网膜、视神经和外侧膝状体神经变性病症的滴眼剂形式的药物中的用途。

本发明还涉及含有BDNF的滴眼剂形式的眼制剂，其用于预防和/或治疗视网膜、视神经和外侧膝状体神经变性病症。

附图说明

图1-局部施用BDNF的盐溶液后测定视网膜(A)、视神经(B)和玻璃体液(C)中的BDNF水平。Y轴为BDNF水平，在用BDNF治疗的眼和用盐溶液处理的对照眼中测定；*表示差异显著。

图2-局部施用BDNF的含羧甲基纤维素钠的溶液后测定视网膜(A)、视神经(B)和玻璃体液(C)中的BDNF水平。图例和标志见图1。

图3-局部施用BDNF的含TSP的溶液后测定视网膜(A)、视神经(B)和玻璃体液(C)中的BDNF水平。图例和标志见图1。

图4-比较TSP、盐溶液(NaCl)和羧甲基纤维素钠(CMC)在携带BDNF和增加其视网膜浓度(pg/mg蛋白，见X轴)中的效果。使用BDNF的含TSP的溶液局部治疗后，BDNF的视网膜水平与BDNF的盐溶液和羧甲基纤维素钠溶液局部治疗后的BDNF水平相比显著增加(*)。数据来自图1、2、3中的A栏。

图5-局部施用BDNF的含TSP的溶液后，视网膜、视神经和玻璃体液中BDNF水平的动力学。BDNF水平在治疗后最初6小时依然显著地很高(*)。

图6-局部施用BDNF的含TSP的溶液减少了光损伤诱导的视网膜闪光响应的改变(闪光ERG)。测定了并记录了用BDNF(黑色标志)处理的眼或仅用TSP处理的对照眼(光损伤对照，白色标志)被不同亮度(cd/m²,见x-轴)激发的视网膜电图b波的振幅(μV,见y-轴)；*表示差异显著。

图7-使用BDNF的含TSP的溶液局部治疗增加了光损伤后存活的光感受器的数量。光感受器用碘化丙啶在视网膜横切片中标记。不论所用的方法如何(感光细胞体行数(图7B))或外核层(ONL)厚度的测定(图7C))，用BDNF治疗的眼中的中央和周边视网膜上的光感受器显著多于用载体处理的眼(对照)。

图8-BDNF的盐溶液(NaCl)的局部应用减少了光损伤诱导的视网膜对光的响应的损伤。图例和标志见图6。

图9-用BDNF的盐溶液局部治疗增加了光损伤后光感受器的存活。图例和标志见图7。

图10-用BDNF的含羧甲基纤维素钠的溶液局部治疗光损伤导致的对光响应的损伤。图例和标志见图6。

图11-用BDNF的含羧甲基纤维素钠的溶液局部治疗对在用BDNF治疗的眼和用载体(对照)处理的眼中光损伤后光感受器存活的影响，图例和标志见图7。

图12-实验青光眼小鼠模型中DBA/2J小鼠相比正常小鼠(C57bl/6J)的眼内压(IOP,mmHg)的增加。6¹/₂月龄的DBA/2J中IOP的增加显著(*)。

图13-记录正常小鼠(C57bl/6J,黑柱)与青光眼小鼠(DBA/2J)的视网膜对视觉图像的响应(图像ERG,P-ERG；刺激为空间频率＝0.2C/deg,对比度90％)；通过刺激使用不同浓度的BDNF(1、5和15μg/μl)处理的眼和使用载体处理的眼(对照眼，CTRL)测定P-ERG响应的振幅(μV,见y-轴)；*表示差异显著。在DBA/2J小鼠7个月龄时(即眼内压(IOP)增加后)记录P-ERG。

图14-青光眼DBA/2J小鼠(7月龄)的视网膜神经节细胞(整装制片)用结合了转录因子(Brn3b)的荧光抗体标记。A.左栏显示两周的BDNF的含TSP的溶液的局部治疗对中央视网膜(上面一行)和周边视网膜(下面一行)的效果。使用BDNF治疗后(左栏)，标记的细胞比仅用载体处理的对照眼(CTRL)中的细胞(右栏)更多。B.使用BDNF局部治疗对青光眼小鼠(DBA/2J；用BDNF治疗的眼；用载体处理的眼，CTRL)和正常小鼠(C57bl/6J)中用Brn3b标记的神经节细胞(密度以细胞/mm²测定，如y轴所示)效果的定量。

发明详述

令人惊讶的发现，通过在完整眼表面、尤其是结膜囊中局部施用外源性的脑源性神经营养因子(BDNF),BDNF对视网膜细胞在功能和形态学水平上均具有神经保护作用，从而预防和/或治疗神经变性视网膜病症。

已证明，BDNF不仅对光感受器具有神经保护作用，对神经节细胞也具有保护作用，所述细胞即(i)视网膜最内层的细胞，其将纤维传递至视觉中枢，(ii)视神经纤维，以及(iii)视网膜外视觉中枢，例如外侧膝状体。

本发明涉及含有BDNF(脑源性神经营养因子)的眼制剂。

所述眼制剂含有浓度范围能够为15μg/μl-200μg/μl的BDNF，优选20-100μg/μl，甚至更优选30-50μg/μl。根据施用的眼制剂体积和要治疗的眼所属物种(包括人)，每次施用的总的可生物利用的剂量介于50-4000μg。

BDNF可单独施用或与其他活性成分联合施用，例如β-阻断剂、前列腺素类和碳酸酐酶抑制剂。

所述制剂以滴眼剂形式制备，可以是含有活性成分BDNF或多种活性成分的溶液、混悬液、凝胶或眼用软膏，活性成分位于与其相容并能被眼所耐受的可接受载体中。

可药用的载体可以是盐溶液，优选含0.9％的氯化钠的盐溶液。

已发现，若在制剂中使用至少一种可药用的载体，可增加改善的BDNF的吸收水平，优选从罗望子种子中提取的半乳糖木糖葡聚糖(TSP)，由于其粘性可使得BDNF在眼表面比在盐溶液中施用保留更长时间，并可从结膜上更快的洗去。

TSP浓度是可变的，优选0.05至2％(重量/体积-w/v)，甚至更优选0.25至0.5％(w/v)。

TPS是透明的、粘弹性和无菌的，用于角膜保护。TSP还在眼表面形成长效的薄膜，其润滑和湿润角膜和结膜。

根据一个优选的方面，该粘性溶液含有透明质酸，甚至更优选透明质酸和TSP的组合。

透明质酸的浓度是可变的，优选0.05％-0.8％(w/v)，甚至更优选0.2-0.4％(w/v)。

根据优选的实施方案，所述制剂可在含0.9％NaCl的盐溶液中包括浓度为15μg/μl的BDNF。

根据进一步优选的实施方案，所述制剂可在含TSP(优选为0.25％)的盐溶液中含有浓度为15μg/μl的BDNF。

所述滴眼剂制剂可局部直接施用到完整的眼表面，即以非侵入的方式，避免使用侵入性方法，例如眼内、视网膜下和眼球后注射。具体而言，所述制剂可施用至结膜囊。所述制剂也可配制成眼罩或在隐形眼镜中的形式。

视网膜是中枢神经系统的部分独立的部分；不同类型的屏障，包括血-视网膜屏障的存在防止了诸如大分子的化合物对视网膜的非特异性扩散。通过系统性吸收和角膜和结膜中酶的代谢性分解，局部应用的药用活性化合物的眼内穿透受到这些组织中屏障的调节。滴注后，药用活性化合物必须穿过血液屏障的复杂系统，包括血-视网膜屏障，以穿透到远至视网膜的潜层组织。

此外，视网膜通过神经节细胞(其为视神经纤维发生的地方)经视神经与视觉中枢例如背外侧膝状体(dLGN)连接。

如试验部分所证实，当根据本发明局部施用时，BDNF可被递送至视网膜，导致其视网膜浓度增加至能起到功能和形态学水平的神经保护作用的水平。

同样惊奇的发现，如试验证据所证实，神经节细胞允许BDNF的顺向转运，允许BDNF预防和治疗不仅神经节细胞、还有视神经纤维的变性，以及所述病症向视网膜外视觉中枢的延伸，例如外侧膝状体。

本发明还涉及BDNF在制备预防和/或治疗视网膜、视神经和外侧膝状体神经变性病症、尤其是变性视网膜病(例如色素性视网膜炎和青光眼)、年龄相关的视网膜病例如年龄相关性黄斑变性、血管和增殖性视网膜病症、视网膜脱落、早产儿视网膜病(ROP)和糖尿病性视网膜病等能导致失明的疾病的滴眼剂形式的用于局部施用至完整眼表面的眼用药物中的用途。根据本发明的制剂可用于预防和/或治疗视网膜、视神经和外侧膝状体的神经变性疾病，尤其是例如色素性视网膜炎和青光眼(包括先天性青光眼、婴儿青光眼、幼年性青光眼、成年青光眼、原发性开角型青光眼、原发性闭角型青光眼、急性青光眼、医源性青光眼和继发性青光眼)。

青光眼是影响眼睛的一系列进行性病症的一种，如果未经适当的治疗，能由于神经节细胞的损失和视神经纤维的进行性萎缩导致失明。

青光眼的特征为眼内压(IOP)增加，其能够直接(机械性地)或通过诱导供应内侧视网膜的视网膜血管局部缺血而间接损伤神经节细胞和视神经纤维。在进行性阶段，除视网膜外，青光眼能影响视觉中枢，例如外侧膝状体，直到最终影响视皮质。

已发现，有效浓度的BDNF治疗不仅预防和减少了由长时间光暴露(光损伤)导致的光感受器的变性，保持了视网膜对光的响应；而且，青光眼试验模型的使用证实局部应用BDNF预防了动物青光眼模型中由眼内压(IOP)升高导致的视网膜神经节细胞的变性；在两种动物模型中，BDNF未改变对视觉刺激的视网膜响应。

以下实施例进一步举例说明本发明。

具体实施方式

制剂的实例

■制剂1-BDNF的盐溶液：将150μgBDNF溶于10μl含有0.9％NaCl的盐溶液中；

■制剂2-BDNF的含羧甲基纤维素钠的盐溶液：将150μgBDNF溶于由5μl含有0.9％NaCl的盐溶液和5μl0.4％羧甲基纤维素钠溶液构成的溶液中。

■制剂3-BDNF的含TSP的盐溶液：将150μgBDNF溶于5μl含有0.9％NaCl的盐溶液和5μl0.5％的TSP中。

■制剂4-BDNF的含透明质酸(0.2％)的盐溶液：将150μgBDNF溶于5μl含有0.9％NaCl的盐溶液和5μl0.4％的透明质酸中。

■制剂5-BDNF的含透明质酸(0.4％)的盐溶液：将150μgBDNF溶于5μl含有0.9％NaCl的盐溶液和5μl0.8％的透明质酸中。

■制剂6-BDNF的含透明质酸和TSP的盐溶液(I)：将150μgBDNF溶于5μl含有0.9％NaCl的盐溶液和5μl0.4％的透明质酸和0.4％的TSP中。

■制剂7-BDNF的含透明质酸和TSP的盐溶液(II)：将150μgBDNF溶于5μl含有0.9％NaCl的盐溶液和5μl0.8％的透明质酸和0.4％的TSP中。

■制剂8-BDNF的含透明质酸和TSP的盐溶液(II)：将150μgBDNF溶于5μl含有0.9％NaCl的盐溶液和5μl0.4％的透明质酸和0.6％的TSP中。

生物分析

2.1实施例-眼睛用基于BDNF的制剂局部治疗6小时后玻璃体液、视网膜和视神经中的BDNF水平测定。

■使用上述的制剂1、2和3：

试验在大白鼠上进行(Wistar大鼠,Harlan,意大利)；局部应用BDNF的含羧甲基纤维素钠的盐溶液或含TSP的盐溶液，滴注到一只眼睛的结膜囊中，而另一只眼作为对照施用用来携带BDNF的溶液(安慰剂)。

■视网膜、玻璃体液和视神经中的BDNF水平测定

施用后6小时腹膜内注射乌拉坦(20％)深度麻醉后处死动物。随后去除眼球，测定用BDNF治疗的眼和仅用载体溶液处理的眼(对照眼)中玻璃体液、视网膜匀浆和视神经匀浆中BDNF的水平。测定通过免疫测定法进行(ELISA；BDNFEmax免疫测定系统,Promega,Madison,WI,USA)。同样测定了视神经中BDNF的量，以确定外部施用的BDNF是否被视网膜细胞吸收和转运，尤其是通过其纤维形成视神经的视网膜神经节细胞。

图1中所示是局部应用BDNF盐溶液(0.9％NaCl)的结果，表示为视网膜(A)、视神经(B)和玻璃体液(C)中的平均BDNF浓度值，表示为pg/mg蛋白质。

统计分析使用学生t检验进行，比较了用BDNF治疗的眼和对照眼；在所有情况下，治疗眼和对照眼中的差异是统计学显著的(*,p<0.05)。

图2中所示是局部应用BDNF的含羧甲基纤维素钠的溶液(0.2％)的结果，图3中所示是局部应用BDNF的含TSP的溶液(0.25％)的结果；两者均使用学生t检验统计分析，比较用BDNF治疗的眼和对照眼。在所有情况下，治疗眼和对照眼中的差异是统计学显著的(*,p<0.05)。

图4显示了每一类所用溶液/载体的视网膜BDNF的比较水平；该分析易于比较同一BDNF浓度(10μl溶液，含有150μgBDNF)下不同溶液/载体的效果。使用BDNF的含TSP的溶液局部治疗后产生了比另两种使用的制剂(即BDNF的盐溶液和BDNF的含羧甲基纤维素钠的溶液)显著更高的视网膜BDNF水平(学生t检验*,p<0.05)。使用BDNF的含羧甲基纤维素钠的溶液局部治疗证明是在增加视网膜BDNF水平中效果最差的。

2.2实施例-用BDNF的含TSP的溶液局部治疗眼睛后不同时间的视网膜、玻璃体液和视神经中的BDNF水平测定

研究了在单次局部应用BDNF后视网膜、玻璃体液和视神经中哪个含量维持较高。该研究使用含有TSP的载体进行，其已证明在促进BDNF的经巩膜进入视网膜、视神经和玻璃体液中最为有效。随后使用TSP研究了局部治疗眼后视网膜、视神经和玻璃体液中的BDNF水平的动力学。各实验组治疗了N＝5只眼睛。在施用含BDNF的0.25％TSP溶液(10μl含有150μgBDNF的溶液)后的不同时间间隔测定视网膜、视神经和玻璃体液中的BDNF浓度。对照眼仅用含0.25％TSP的载体溶液处理。该试验用于建立单次局部施用后BDNF水平的时间趋势。图中显示应用后6、12和24小时视网膜、视神经和玻璃体液中的平均BDNF值(y轴；pg/ml)。图5显示视网膜中的BDNF水平保持统计学较高，在12-24小时内回到基线水平。统计学分析使用学生t检验进行：在A*中，与对照眼相比p<0.01。该实验的结果表明使用人工泪液(尤其是基于TSP的)携带的BDNF长期治疗时，每隔12小时一次局部应用足以使BDNF在视网膜中维持较高水平。

2.3实施例-局部应用基于BDNF的制剂的神经保护作用

为确认在结膜囊中局部应用后BDNF的神经保护作用，在动物模型中使用了通过光损伤诱导的视网膜变性的实验模型；该模型广泛用于研究长期暴露于强光源下导致的视网膜光感受器的变性(LaVail等,1987；Rex等,2003)。光感受器通过凋亡死亡，其由视色素视紫质过量吸收光子引起，导致色素再生循环的改变，其最终牵涉到色素上皮细胞。使用的实验动物模型是光感受器对光具有显著灵敏度的大白鼠(Surace等,2005)。对由LaVail等人的研究组(LaVail等,1987)提出的原始试验方案进行了改良和扩展(Rex等,2003)。

使用了以下基于BDNF的制剂：

a)BDNF的0.25％TSP溶液(10μl含有150μgBDNF的溶液)。

b)BDNF的盐溶液(0.9％NaCl-10μl含有150μgBDNF的溶液)。

c)BDNF的0.2％羧甲基纤维素钠溶液(10μl含有150μgBDNF的溶液)。

大鼠的眼用上述所列的制剂处理，随后进行光损伤处理。对照眼仅用载体溶液处理。每个实验组处理N＝4只眼。具体而言，经过6小时的治疗后(用BDNF治疗眼，对照眼仅用载体溶液处理)，将这些大鼠长期暴露于光下48小时(动物光损伤模型，光源强度1000勒克司)。长时间暴露于光下导致大白鼠视网膜上许多光感受器变性。通过设计为评价光感受器存活的形态学方法和记录视网膜对光的响应(闪光视网膜电图[ERG]，其广泛用于评价视网膜病症患者外部视网膜的功能状态)的功能性方法来验证BDNF发挥的神经保护作用。考虑到大鼠中构成光适应条件下ERG响应的基础的视锥细胞数目较少并且光适应条件下ERG振幅较小，仅记录了暗适应条件下的闪光ERG，其代表了作为大鼠视网膜中主要成分的视杆细胞的响应。光损伤周期结束7天后记录闪光ERG(暗适应)。

-制剂a)

图6显示了在暗适应条件下根据亮度的闪光ERG的b波振幅。如图6中所示，局部应用BDNF的含TSP的溶液显著减小了光损伤对视网膜闪光响应的影响(闪光ERG)。事实上，用BDNF治疗的眼的振幅(以μV表示的平均振幅值)显著高于对照眼,*,p<0.05(单向ANOVA)。

-制剂b)

图8显示了在暗适应条件下根据亮度的b波振幅。结果表明BDNF的盐溶液同样能减小光损伤诱导的视网膜光响应的改变(闪光ERG)。用BDNF治疗的大鼠的光损伤眼中b波的振幅高于对照眼；用BDNF的盐溶液治疗的眼的振幅(以μV表示的平均振幅值)显著高于对照眼,*,p<0.05(单向ANOVA)。

-制剂c)

图10显示了在暗适应条件下根据亮度的b波振幅。该图显示在最高亮度下用BDNF的含羧甲基纤维素钠的溶液治疗的眼的振幅(以μV表示的平均振幅值)显著高于对照眼,*,p<0.05(单向ANOVA)。结论是，在视网膜对光的响应的功能恢复方面，已证明羧甲基纤维素钠在预防视网膜光响应的损伤方面效果不如TSP和盐溶液。

随后在记录了闪光ERG的眼的视网膜中评价了上述基于BDNF的制剂的局部治疗对于视网膜光感受器变性的效果。

BDNF局部治疗对光感受器变性的效果通过计数光损伤后存活的光感受器的行数以及测定含有感光细胞体的视网膜外核层(ONL)的厚度进行定量。为进行所述测定，光感受器细胞核用碘丙啶标记。

-制剂a)

获得的结果如图7所示。图7A显示了用BDNF(在0.25％TSP中)处理的眼和对照眼的视网膜横切片。为进行所述测定，光感受器细胞核用碘丙啶标记。不论使用的方法如何(光感受器细胞行数计数(图7B)或外核层(ONL)的厚度(图7C)，使用BDNF治疗的眼中的中央和周边视网膜中的光感受器数都显著多于仅用载体处理的眼(对照)(学生t检验*,p<0.001)。

随后证实，当局部施用于结膜囊中时，BDNF的含TSP的溶液保护视网膜不受光损伤的影响。

-制剂b)

图9(A)显示了使用BDNF治疗的右眼(盐溶液，0.9％NaCl)和仅用盐水处理的左眼(对照)的视网膜横切片。BDNF局部治疗对光感受器变性的效果通过计数光损伤后存活的光感受器的行数(图9B)或测定含有光感受器细胞体的视网膜外核层(ONL)的厚度(图9C)进行定量。在治疗眼和对照眼之间的中央和周边视网膜的差异(光感受器行数或ONL厚度)均证明是显著的(学生t检验*,p<0.001)。

与对照眼相比，BDNF盐溶液的局部治疗增加了光损伤后存活的光感受器的数目。

-制剂c)

最后，BDNF局部治疗(羧甲基纤维素钠溶液)对光感受器变性的效果通过计数光损伤后存活的光感受器的行数(图11B)或测定含有光感受器细胞体的视网膜外核层(ONL)的厚度(图11C)进行定量。

考虑所获得的结果，在光损伤后功能恢复和光感受器变性预防方面，认为局部施用BDNF的TSP和盐溶液对光损伤具有神经保护作用，而在同样的BDNF浓度下，用BDNF的含羧甲基纤维素钠的溶液处理效果较差。

还证明了用BDNF治疗不会导致视网膜的功能改变，不损伤其对于视觉刺激的响应。

2.4实施例：实验性青光眼模型中重复局部应用BDNF的神经保护作用

青光眼是多种原因引起的视网膜变性病症，具有多种形式(根据年龄分为先天性青光眼、婴儿青光眼、幼年性青光眼或成年青光眼；根据发病机理分为原发性青光眼：原发性开角型青光眼或原发性闭角型青光眼，以及由其他病症诱导的继发性青光眼，包括医源性青光眼)。最常见的青光眼形式即原发性开角型青光眼(POAG)特征在于眼内压增加，其引起功能障碍和随后的与视神经萎缩有关的神经节细胞的变性；症状为视觉的逐步丧失，最终失明。引起伴有视神经萎缩的神经节细胞的功能障碍和变性的机理目前尚未完全清楚，但普遍观点认为增加的眼内压(IOP)诱导了筛板中视神经纤维的机械性损伤，及视神经头部和内层视网膜的缺血性改变。最近几年，药物治疗的目的是降低IOP，但大量的患者对于现有的药物治疗具有耐药性并患有进行性的不可逆的视觉功能丧失。当前没有药物设计用于视网膜神经节细胞和视神经纤维的神经保护，以预防视力下降和使视力回复正常。在本专利中，我们提出了使用BDNF在结膜囊中局部治疗以便通过稳定的途径增加视网膜的BDNF水平，从而抵消神经节细胞渐进的功能障碍和随后的变性和死亡。该方案部分基于BDNF受体(称为TrkB)在神经节细胞中表达的事实(Jelsma等,1993)。为证实该假设，我们使用了自发性青光眼的最常见实验模型，称为DBA/2J的双突变小鼠(John等,1998；Chang等,1999)。DBA/2J小鼠具有两个独立基因的纯合突变；第一个是编码黑素蛋白的酪氨酸相关蛋白(Tyrp1-/-)，第二个是膜糖蛋白(Gpnmb-/-)。该小鼠特征在于眼内压进行性的递增，视网膜对于结构性视觉刺激的响应也逐步丧失，该响应依赖于内视网膜/神经节细胞；在人类和动物模型中，该视网膜响应被称为图像视网膜电图(P-ERG；Domenici等,1991；Ventura和Porciatti,2006；Falsini等,2008)。神经节细胞功能障碍之后，所述细胞变性，视神经纤维进行性萎缩(Ventura等,2006)。如图12所示，在该小鼠青光眼模型中(DBA/2J)，出生后5个月IOP开始增加；在6¹/₂月时DBA/2J小鼠(N＝10)的IOP已经显著高于(t-检验；*p<0.05)正常小鼠的值(C57bl/6J；N＝5)和5个月龄的DBA/2J小鼠的值(N＝9)。图13显示了内视网膜/神经节细胞对结构性视觉刺激的响应振幅(P-ERG；视觉图像刺激的亮度特征为空间频率＝0.2C/deg,对比度90％)，用连接放大器的角膜电极记录，连接计算机进行在线分析。如图13所示，7个月大的DBA/2J小鼠(CTRL,N＝4)的P-ERG已改变(P-ERG振幅显著减小；学生t检验,*p<0.05)。从6.5个月(即IOP稳定增加的时间)开始(图12)，在一只眼睛中局部应用BDNF的含TSP的溶液进行两周的重复治疗(每48小时一次治疗)，另一只眼施用载体(对照眼)。使用了三种不同的BDNF浓度(每组N＝4DBA/2J小鼠)：1、5和15μg/μl。如直方图中所示，使用BDNF以15μg/μl而非1和5μg/μl的浓度局部施用(150μg在10μl含有0.25％TSP的溶液中，眼制剂a)预防了DBA/2J小鼠的P-ERG改变(比较治疗眼和对照眼的数据；学生t检验,*p<0.05)。为确认P-ERG改变是否对应于用免疫组化方法标记的神经节细胞的改变，我们使用了神经节细胞中表达的转录因子Brn3b；该因子突变的小鼠(Brn3b-/-)与神经节细胞的改变有关(Badea等,2009)。图14A显示了视网膜制备物的放大图，其中神经节细胞用荧光抗体标记为绿色，进行共聚焦显微镜分析。DBA/2J小鼠眼中的中央和周边视网膜中标记的神经节细胞数显著下降。图14B显示了密度形式表示的标记细胞的定量(细胞数/mm²)。与仅用载体处理的对照眼相比，使用15μg/μl浓度的BDNF的含TSP的溶液治疗2周预防了Brn3b标记的细胞的减少(学生t-检验,*p<0.05)。

从报道的数据可以得出结论，在青光眼实验模型中，使用BDNF重复局部治疗预防了神经节细胞的功能性变化，并且使视网膜视觉功能恢复。能对神经节细胞功能发挥保护作用的BDNF的最低有效浓度是15μg/μl。

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Claims (10)

1.滴眼剂形式的眼制剂，其包含脑源性神经营养因子(BDNF)和作为可药用的载体的粘性溶液，其中所述粘性溶液是包含从罗望子种子中提取的多糖(TSP)的溶液，并且其中所述脑源性神经营养因子的浓度为30-200μg/μl，但不包括30μg/μl。

2.根据权利要求1的眼制剂，其中BDNF范围为50-200μg/μl。

3.根据权利要求1或2的眼制剂，其还包括盐溶液作为可药用的载体。

4.根据权利要求3所述的眼制剂，其中盐溶液含有0.9％的氯化钠。

5.根据前述任一项权利要求所述的眼制剂，其中TSP的浓度范围为0.05至2％w/v。

6.根据前述任一项权利要求所述的眼制剂，其还包含透明质酸。

7.根据前述任一项权利要求所述的眼制剂，其中粘性溶液包含TSP和透明质酸。

8.根据权利要求1所述的滴眼剂形式的眼制剂在制备用于预防和/或治疗视网膜、视神经和外侧膝状体的神经变性疾病的药物中的用途。

9.根据权利要求8的用途，其用于预防和/或治疗色素性视网膜炎。

10.根据权利要求8的用途，其用于预防和/或治疗原发性开角型青光眼。