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CN105765057A - 从长寿村成人分离的有助于排便活动的新型乳酸菌发酵乳杆菌 - Google Patents

从长寿村成人分离的有助于排便活动的新型乳酸菌发酵乳杆菌 Download PDF

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CN105765057A
CN105765057A CN201480041819.0A CN201480041819A CN105765057A CN 105765057 A CN105765057 A CN 105765057A CN 201480041819 A CN201480041819 A CN 201480041819A CN 105765057 A CN105765057 A CN 105765057A
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lactobacillus
fermentation lactobacillus
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novel
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朴钟洙
白璟洙
安基铉
申恩舟
洪贤珍
李学美
李旻英
申铉靖
赵永勳
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PL BIO CO Ltd
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Abstract

本发明涉及作为新型菌株的发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)菌株及其的用途，具体地，从长寿村成人分离的新型发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)PL9988、新型发酵乳杆菌PL9037、新型发酵乳杆菌PL9038、新型发酵乳杆菌PL9039、新型发酵乳杆菌PL9040菌株及它们的培养液无抗生素耐性转移，肠细胞粘着性、耐酸性及耐胆汁性优秀，抑制肠内有害的病原菌，具有免疫增强效果、内毒素休克抑制效果及抗氧化效果，尤其，发酵乳杆菌PL9988菌株全部显著地满足作为益生菌应具备的上述条件，因而上述发酵乳杆菌PL9988菌株可有用地用作提高及增进肠健康和排便活动的益生菌或保健食品。

Description

从长寿村成人分离的有助于排便活动的新型乳酸菌发酵乳杆菌
技术领域
本发明涉及有助于排便活动的提高及增进的从长寿村成人分离的新型发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)菌株及上述菌株的益生菌用途。
背景技术
自古以来，众所周知，人摄取的饮食与健康之间的关的系重要性，尤其，众所周知，根据摄取的饮食，肠内微生物的分布也不同。肠内微生物与人的健康和疾病具有密切的关系，从而确定肠部的免疫力(RoundJL,MazmanianSK.2009.Teggutmicrobiotashapesintestinalimmuneresponsesduringhealthanddisease,NatureReviewsImmunology9,313-323)。发表确定是否肥胖的研究结果(TurnbaughPJ,etal.,GordonJI.2006.Theobesity-associatedgutmicrobiomewithincreasedcapacityforenergyharvest.Natyre444,1027-1031)等一个人的肠内微生物与一个人的体质具有密切的关系。
一个人具有哪种乳酸菌是由出生之后，最初几个月进入体内的乳酸菌确定的，其之后，进入体内的乳酸菌在肠内不持续维持，因而由在食品中摄取的乳酸菌确定。例如，在牛奶的摄取量多的西方人中多发现的嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)在东方人中几乎未被发现，与其对照性地，在东方人中普遍发现的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)在西方人中不容易发现。这些乳酸菌分别在西方的乳制品和东方人的发酵食品中多发现。
至今，在韩国已商品化并销售的多个代表性乳酸菌大部分作为从西方人或这些的食品中分离而开发的乳酸菌，是在韩国人的内肠中通常不容易发现的乳酸菌。对此，从居住于韩国的代表性的长寿带且进行健康的肠活动(顺畅排便)的成人分离乳酸菌来开发韩国式乳酸菌，并查明作为上述乳酸菌的益生菌(probiotic)的多种功能，尤其，开发无当前在全世界上成为问题的抗生素耐性转移可能性，并有利于排便活动的新型功能性乳酸菌来用作具有功效的益生菌。
益生菌(probiotics)定义为当摄取适量时，改善微生物的性质来对宿主产生有益的影响的存活的微生物的单独或复合菌株，但最近，定义为为了通过Salminen等增进人体或动物的健康而发明的食品及饲料或食物添加剂中所含的存活的微生物制剂。
益生菌乳酸菌大致分为乳酸菌(Lactobacillus)、乳球菌(Lactococcus)、链球菌(Streptococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、片球菌属(Pediococcus)及双歧杆菌属(Bifidobacterium)，并起到防止肠管及泌尿生殖器的微生物的污染、维持肠健康、缓解便秘、抑制有害菌的增殖、抗癌、增强免疫、减少胆固醇、生产共轭亚油酸(CLA，Conjugatedlinoleicacid)、抑制幽门螺杆菌的功能等，从而对人体健康的增进起到重要的作用。
作为益生菌必备的优选条件如下：首先需要安全，需要具有对酸和胆汁的耐性(tolerance)，需要具有可粘着于肠管上皮(intestinalepithelium)的能力，需要对病原菌(pathogenicbacteria)具有抑制活性，需要具有免疫增强效果，抗生素耐性需要只具有内在耐性，从而防止抗生素耐性转移。
细菌以两种方法具有抗生素耐性。第一，作为内在耐性不从外部转移而先天就具有的耐性。例如，在乳酸菌的情况下，是指细胞壁的结构和细胞壁的厚度变厚，从而对万古霉素(vancomycin)呈现耐性的情况，这种内在耐性不由转移实现，并且不向其他细菌转移耐性基因。第二，作为外在耐性，外在耐性是指耐性基因与质粒或转座子相结合，来从外部其他细菌中进入而生成的耐性，这种情况下，这种耐性细菌的基因还向其他细菌容易传递耐性。
众所周知，以前，认为耐性强的乳酸菌好，从而认为处理多种抗生素来存活的抗生素耐性乳酸菌为好的乳酸菌，但当前，有报告指出，对多种抗生素具有耐性的乳酸菌的耐性基因向肠内细菌转移，从而引起耐性问题。由此，当前，在西方国家中，从很久以前开始在抗生素耐性乳酸菌可转移基因的情况下，均不允许商业化。并且，最近，韩国也在食品药品安全部的微生物的食品原料判断基准中插入与抗生素耐性转移相关的条款，来用作微生物的食品原料判断基准。
另一方面，2011年，食品药品安全部将韩国农村健康长寿村居住人员和城市地区40岁以上的居住人员作为对象分析肠内微生物分布，最终确认如下：在对有助于健康的乳酸菌、乳球菌等有益菌的分布的城市居住人员与长寿村居住人员之间的差异中，乳酸菌与整个肠内细菌之比为0.56％：1.355％、乳球菌与整个肠内细菌之比为0.02％：0.1％，其表明与城市居住人员相比，长寿村居住人员的有益菌的分布高3至5倍以上，但没有如下乳酸菌：无抗生素耐性转移可能性，全部满足作为益生菌应具有的对酸和胆汁的耐性、可粘着于肠管上皮的能力、对病原菌的抑制活性、抗氧化活性及免疫增强效果等。
对此，多个本发明人为了寻找无抗生素耐性转移可能性的安全的乳酸菌而努力，最终确认如下：从生活于众所周知的韩国的长寿村的健康的成人分离了新型发酵乳杆菌菌株，就上述菌株及其的培养液而言，肠细胞粘着能力、耐酸性及耐胆汁性优秀，无对抗生素的外在耐性，并呈现肠内有害的病原菌抑制效果、免疫增强效果及内毒素休克抑制效果及抗氧化效果，尤其，新型发酵乳杆菌PL9988菌株全部显著地满足作为益生菌应具备的上述条件，因而将上述新型发酵乳杆菌PL9988或其的培养液可用作提高及增进排便活动的益生菌或保健食品，从而完成了本发明。
发明内容
技术问题
本发明的目的在于，提供从居住于长寿带地区，并进行有规则的肠运动(顺畅排便)的成人分离的新型发酵乳杆菌菌株。
本发明的另一目的在于，提供将新型发酵乳杆菌菌株或其的培养液作为有效成分的益生菌组合物、排便活动提高及增强用保健食品。
技术方案
为了解决上述技术问题，本发明提供新型发酵乳杆菌菌株。
并且，本发明提供益生菌组合物，上述益生菌组合物包含新型发酵乳杆菌PL9988、新型发酵乳杆菌PL9037、新型发酵乳杆菌PL9038、新型发酵乳杆菌PL9039、新型发酵乳杆菌PL9040或它们的培养液作为有效成分。
并且，本发明提供用于增进排便活动及肠健康状态的保健食品，上述保健食品包含新型发酵乳杆菌PL9988、新型发酵乳杆菌PL9037、新型发酵乳杆菌PL9038、新型发酵乳杆菌PL9039、新型发酵乳杆菌PL9040或它们的培养液作为有效成分。
并且，本发明提供以保藏编号KCTC12624BP保藏的新型发酵乳杆菌PL9988、新型发酵乳杆菌PL9037、新型发酵乳杆菌PL9038、新型发酵乳杆菌PL9039、新型发酵乳杆菌PL9040或它们的培养液的用途，上述以保藏编号KCTC12624BP保藏的新型发酵乳杆菌PL9988、新型发酵乳杆菌PL9037、新型发酵乳杆菌PL9038、新型发酵乳杆菌PL9039、新型发酵乳杆菌PL9040或它们的培养液用作益生菌组合物。
并且，本发明提供以保藏编号KCTC12624BP保藏的新型发酵乳杆菌PL9988、新型发酵乳杆菌PL9037、新型发酵乳杆菌PL9038、新型发酵乳杆菌PL9039、新型发酵乳杆菌PL9040或它们的培养液的用途，上述以保藏编号KCTC12624BP保藏的新型发酵乳杆菌PL9988、新型发酵乳杆菌PL9037、新型发酵乳杆菌PL9038、新型发酵乳杆菌PL9039、新型发酵乳杆菌PL9040或它们的培养液用作保健食品。
有益效果
就本发明的新型发酵乳杆菌PL9988、新型发酵乳杆菌PL9037、新型发酵乳杆菌PL9038、新型发酵乳杆菌PL9039、新型发酵乳杆菌PL9040或它们的培养液而言，肠细胞粘着性、耐酸性及耐胆汁性优秀，无抗生素耐性转移的危险，抑制肠内有害的多个病原菌，具有免疫增强效果、内毒素休克抑制效果及抗氧化效果，尤其，发酵乳杆菌PL9988菌株全部显著地满足作为益生菌应具备的上述条件，因而上述发酵乳杆菌PL9988菌株可有用地用作增进排便活动及肠健康状态的益生菌或保健食品。
附图说明
图1为表示发酵乳杆菌PL9988菌株及发酵乳杆菌的标准菌株CECT562(发酵乳杆菌菌株CECT562)的16S核糖体核糖核酸(rRNA)碱基序列的亲缘关系的图。
图2为表示发酵乳杆菌PL9037菌株及发酵乳杆菌的标准菌株CECT562的16S核糖体核糖核酸碱基序列的亲缘关系的图。
图3为表示发酵乳杆菌PL9038菌株及发酵乳杆菌的标准菌株CECT562的16S核糖体核糖核酸碱基序列的亲缘关系的图。
图4为表示发酵乳杆菌PL9039菌株及发酵乳杆菌的标准菌株CECT562的16S核糖体核糖核酸碱基序列的亲缘关系的图。
图5为表示发酵乳杆菌PL9040菌株及发酵乳杆菌的标准菌株CECT562的16S核糖体核糖核酸碱基序列的亲缘关系的图。
图6为观察发酵乳酸菌PL9988菌株的形状的图。
图7为确认发酵乳酸菌PL9988菌株对有害细菌的抑菌圈大小的图。
图8为观察粘着于肠细胞的发酵乳酸菌PL9988菌株的图。
图9为发酵乳杆菌PL9988菌株对处理了脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)的免疫细胞呈现免疫增强效果的确认图。
图10为确认发酵乳杆菌PL9988菌株的抗氧化能力的图。
具体实施方式
以下，对本发明进行详细说明。
本发明提供新型发酵乳杆菌菌株。
上述菌株优选为具有以序列1记载的16S核糖体核糖核酸碱基序列并以保藏编号KCTC12624BP保藏的新型发酵乳杆菌PL9988、具有以序列2记载的16S核糖体核糖核酸碱基序列的新型发酵乳杆菌PL9037、具有以序列3记载的16S核糖体核糖核酸碱基序列的新型发酵乳杆菌PL9038、具有以序列4记载的16S核糖体核糖核酸碱基序列的新型发酵乳杆菌PL9039或具有以序列5记载的16S核糖体核糖核酸碱基序列的新型发酵乳杆菌PL9040。
在本发明的具体实施例中，多个本发明人从居住于长寿带，并进行有规则的顺畅排便的健康成人的粪便样品中分离菌株来鉴定之后，通过16S核糖体核糖核酸碱基序列分析，确认与发酵乳杆菌的标准菌株CECT562(发酵乳杆菌菌株CECT562)呈现99.42％的同源性的新型菌株，通过革兰氏染色，确认了上述菌株具有作为典型的发酵乳杆菌形状的革兰氏阳性杆菌的状态(参照图1及图6)。并且，将上述新型发酵乳杆菌属菌株命名为发酵乳杆菌PL9988，并于2014年7月16日保藏于韩国生命工学研究院微生物资源中心(保藏编号KCTC12624BP)。
并且，多个发明人还从上述粪便样品分离多个菌株来鉴定之后，通过16S核糖体核糖核酸碱基序列分析，确认与发酵乳杆菌的标准菌株CECT562呈现99％以上的同源性的发酵乳杆菌菌株四种，并分别命名为发酵乳杆菌PL9037、发酵乳杆菌PL9038、发酵乳杆菌PL9039及发酵乳杆菌PL9040(图2至图5)。
并且，本发明提供益生菌组合物，上述益生菌组合物包含以保藏编号KCTC12624BP保藏的新型发酵乳杆菌PL9988、新型发酵乳杆菌PL9037、新型发酵乳杆菌PL9038、新型发酵乳杆菌PL9039、新型发酵乳杆菌PL9040或它们的培养液作为有效成分。
上述发酵乳杆菌PL9988菌株具有以序列1记载的16S核糖体核糖核酸碱基序列，上述新型发酵乳杆菌PL9037菌株具有以序列2记载的16S核糖体核糖核酸碱基序列，上述新型发酵乳杆菌PL9038菌株具有以序列3记载的16S核糖体核糖核酸碱基序列，上述新型发酵乳杆菌PL9039菌株具有以序列4记载的16S核糖体核糖核酸碱基序列，上述新型发酵乳杆菌PL9040菌株具有以序列5记载的16S核糖体核糖核酸碱基序列。
上述微生物的培养液包含微生物生产的多种抗菌性有机酸及非蛋白质性抗菌物质。
并且，本发明的上述组合物还可包含其他种类的公知的微生物，上述微生物具有适合与本发明的乳酸菌一同摄取，当摄取时，抑制有害微生物的生育，并改善肠内菌种的均衡的活性。
上述菌株无对庆大霉素(gentamicin)、卡那霉素(kanamycin)、链霉素(streptomycin)、新霉素(neomycin)、四环素(tetracycline)、红霉素(erythromycin)、克林霉素(clindamycin)、氯霉素(chloramphenicol)、氨苄青霉素(ampicillin)、辛内吉(synercid，quinupristinanddalfopristincombination)、利奈唑胺(linezolid)、甲氧苄啶(trimethoprim)、环丙沙星(ciprofloxacin)及利福平(rifampicin)等的抗生素的内在耐性及外在耐性(转移可能性)，而对无耐性转移可能性的万古霉素具有内在耐性。
上述菌株的肠细胞粘着力、耐酸性及耐胆汁性优秀，上述菌株具有抗菌能力、抗氧化效果、免疫增强活性及内毒素休克抑制效果。
在本发明的具体实施例中，多个本发明人为了确认发酵乳杆菌菌株的抗生素感受性，按照国际标准化组织(ISO)指导方针，对发酵乳杆菌PL9988菌株、发酵乳杆菌PL9037、发酵乳杆菌PL9038、发酵乳杆菌PL9039及发酵乳杆菌PL9040菌株处理作为抗生素的庆大霉素、四环素、红霉素、克林霉素、氯霉素、氨苄青霉素、辛内吉、利奈唑胺及利福平，并执行液体稀释法，最终确认如下：发酵乳杆菌PL9988菌株与其他多个发酵乳杆菌菌株不同，全部对抗生素具有感受性，从而无抗生素耐性转移的危险(参照表1)。
并且，多个本发明人为了确认发酵乳杆菌菌株的病原菌抑制能力，培养作为六种有害细菌的大肠菌株(Escherichaiacoli)0157：H7ATCC43894、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)CCARM8001、肠炎沙门氏菌(Salmonellaenteritidis)CCARM8010、粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)CCARM0011、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)CCARM0045、单核细胞增生利斯特菌(Listeriamonocytogenes)CCARM0019和发酵乳酸菌菌株，来确认是否存在抑菌圈和抑菌圈的大小，最终确认如下：发酵乳杆菌PL9988菌株、发酵乳杆菌PL9037、发酵乳杆菌PL9038、发酵乳杆菌PL9039及发酵乳杆菌PL9040菌株呈现显著的病原菌抑制力，尤其，发酵乳杆菌PL9988菌株可杀死除了大肠菌株0157：H7之外的其余五种有害细菌，因而病原菌抑制能力优秀(参照图7及表2)。
并且，多个本发明人为了确认发酵乳杆菌菌株的安全性，执行了溶血现象检查、氨(尿素(urea))、吲哚(indole)及苯丙酮酸(phenylpyruvicacid)等的有害物质及β-葡萄糖醛酸酶(β-glucuronidase)、β-葡萄糖苷酶(β-gluscosidase)等的有害酶生成检查及明胶液化反应检查，最终确认如下：上述发酵乳杆菌PL9988菌株与发酵乳杆菌PL9037、发酵乳杆菌PL9038、发酵乳杆菌PL9039及发酵乳杆菌PL9040菌株相比，不呈现溶血现象，不生成有害物质及有害酶，在明胶液化反应中呈现阴性，因而稳定性最优秀(参照表3)。
并且，多个本发明人为了确认发酵乳杆菌菌株的耐酸性及耐胆汁性，在菌株中，添加人工胃液及胆汁来培养之后，测定生菌数，最终确认如下：上述发酵乳杆菌PL9988菌株的大部分菌株生存，因而耐酸性及耐胆汁性优秀(参照表4)。
并且，多个本发明人为了确认发酵乳杆菌PL9988菌株对肠管细胞的粘着能力，对人类肠细胞株处理乳酸菌，并利用革兰氏染色及连续稀释法测定粘着的乳酸菌数，最终确认到上述发酵乳杆菌PL9988菌株的粘着能力优秀(参照图8)。
并且，多个本发明人为了确认发酵乳杆菌PL9988菌株的免疫增强效果，对巨噬细胞株处理脂多糖及发酵乳杆菌PL9988菌株，并测定作为促炎性细胞因子(proinflammatorycytokine)的肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6及白细胞介素-1β的浓度，最终可知在处理了发酵乳杆菌PL9988菌株的情况下，三种浓度增加，从而呈现免疫增强效果。并且，在单独处理脂多糖的情况下，虽然肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6及白细胞介素-1β的浓度增加，但在同时处理脂多糖和发酵乳杆菌PL9988菌株的情况下，确认到肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6及白细胞介素1β的浓度减少，从而确认了上述发酵乳杆菌PL9988菌株具有将内毒素休克最小化的效果(参照图9)。
并且，多个本发明人为了确认发酵乳杆菌PL9988菌株的抗氧化效果，执行了抗氧化功能测定实验，最终，当添加10mM及100mM的生产超氧阴离子(superoxideanion)的百草枯的情况下，全部未观察到生长抑菌圈，从而确认到上述发酵乳杆菌PL9988菌株具有对百草枯的耐性，从而确认了上述发酵乳杆菌PL9988菌株的抗氧化能力优秀(参照图10及表5)。
因此，就本发明的新型发酵乳杆菌菌株或其的培养液而言，肠细胞粘着性、耐酸性及耐胆汁性优秀，无抗生素耐性转移的危险，抑制肠内有害的病原性细菌，并呈现免疫增强效果、内毒素休克抑制效果及抗氧化效果，尤其，发酵乳杆菌PL9988菌株全部显著地满足作为益生菌应具备的上述条件，因而上述新型发酵乳杆菌PL9988或其的培养液可有用地用作用于增进排便活动及肠健康状态的益生菌组合物。
可按照通常的益生菌组合物的制备方法制备本发明的组合物，通常，本发明的组合物可以为培养悬浮液或干燥粉末的形态。并且，在作为主成分的上述发酵乳杆菌PL9988菌株或其的培养液的有效剂量中选择一种或两种以上的药剂学上可接受的通常的载体或一种或两种以上的添加剂来可制备成通常的剂型的组合物。
载体在稀释剂、润滑剂、结合剂、崩解剂、甜味剂、稳定剂及防腐剂中可选择一种或两种以上来使用，作为添加剂，在香料、维生素类、抗氧化剂中可选择一种或两种以上来使用。
在本发明中，载体或添加剂可使用在药剂学上可接受的所有载体及添加剂，具体地，作为稀释剂，优选为乳糖(乳糖一水合物(lactosemonohydrate))、海藻糖(Trehalose)、玉米淀粉(cornstarch)、豆油(soybeanoil)、微晶纤维素(microcrystallinecellulose)或甘露醇(D-甘露醇(D-mannitorl))，作为润滑剂，优选为硬脂酸镁(magnesiumstearate)或滑石(talc)，优选地，结合剂选自聚乙烯吡咯烷酮(PVP：polyvinyipvrolidone)或羟丙基纤维素(HPC：hydroxypropylcellulose)中。并且，优选地，崩解剂选自羧甲基纤维素钙(Ca-CMC：carboxymethylcellulosecalcium)、羟基乙酸淀粉钠(sodiumstarchglycolate)、波拉克林钾(polacrylinpotassium)或交联聚乙烯吡咯烷酮(cross-linkedpolyvinylpyrrolidone)中，甜味剂选自白糖、果糖、山梨糖醇(sorbitol)或阿斯巴甜(aspartame)中，稳定剂选自羧甲基纤维素钠(Na-CMC：carboxymethylcellulosesodium)、β-环糊精(β-cyclodextrin)、白蜂蜡(whitebee'swax)或黄原胶(xanthangum)中，优选地，防腐剂选自对羟基苯甲酸甲酯(methylp-hydroxybenzoate.methlparaben)、对羟基苯甲酸丙酯(propylp-hydroxybenzoate.propylparaben)或山梨酸钾(potassiumsorbate)中。
并且，本发明提供保健食品，上述保健食品包含以保藏编号KCTC12624BP保藏的新型发酵乳杆菌PL9988、新型发酵乳杆菌PL9037、新型发酵乳杆菌PL9038、新型发酵乳杆菌PL9039、新型发酵乳杆菌PL9040或它们的培养液作为有效成分。
上述发酵乳杆菌PL9988菌株具有以序列1记载的16S核糖体核糖核酸碱基序列，上述新型发酵乳杆菌PL9037菌株具有以序列2记载的16S核糖体核糖核酸碱基序列，上述新型发酵乳杆菌PL9038菌株具有以序列3记载的16S核糖体核糖核酸碱基序列，上述新型发酵乳杆菌PL9039菌株具有以序列4记载的16S核糖体核糖核酸碱基序列，上述新型发酵乳杆菌PL9040菌株具有以序列5记载的16S核糖体核糖核酸碱基序列。
上述微生物的培养液包含微生物生产的多种抗菌性有机酸及非蛋白质性抗菌物质。
本发明的上述组合物还可包含其他种类的公知的微生物，上述微生物具有适合与本发明的乳酸菌一同摄取，当摄取时，抑制有害微生物的生育，并改善肠内菌种的均衡的活性。
上述菌株的肠细胞粘着力、耐酸性及耐胆汁性优秀，上述菌株通过抗菌能力、抗氧化效果、免疫增强活性、内毒素休克抑制及肠内病原性微生物生长抑制来增进肠健康活性。
上述食品优选为选自由包含冰淇淋类、牛奶、豆奶、酸奶及奶酪的乳制品、肉类、香肠、面包、巧克力、糖类、快餐类、饼干类、比萨、方便面、其他面类、口香糖类、各种汤、饮料、茶、功能饮料及酒精饮料组成的组中的一种。
因此，就本发明的发酵乳酸菌菌株而言，肠细胞粘着性、耐酸性及耐胆汁性优秀，无抗生素耐性转移的危险，抑制肠内有害的病原性细菌，具有免疫增强效果、内毒素休克抑制及抗氧化效果，因而可有用地用作用于增进排便活动及肠健康状态的保健食品。
作为本发明的保健食品，可例举将上述乳酸菌属菌株或其的培养液作为有效成分的茶、果冻、汁、提取物、饮料等的将改善肠功能作为目的的民间疗法剂。像这样，以多种形态加工的本发明的疾病预防用保健食品既对人体无副作用，又容易服用，且可长时间保管。
在使用本发明的上述乳酸菌属菌株或其的培养液用作食品添加剂的情况下，直接添加上述菌株或上述菌株的培养液，或可与其他食品或食品成分一同使用，可根据通常的方法适当地使用。有效成分的混合量可根据使用目的(预防、健康或治疗性处置)适合地确定。通常，当制备食品或饮料时，相对于100重量份的本发明的上述乳酸菌属菌株或其的培养液原料，以15重量份以下添加，优选地，以10重量部以下的量添加。但是，在将健康及卫生作为目的或将健康调节作为目的的长时间的摄取的情况下，上述量可以为上述范围以下，在安全性方面不存在任何问题，因而有效成分还可使用上述范围以上的量。
上述食品的种类无特别限制。可添加本发明的上述乳酸菌属菌株或其的培养液的食品的例有包含肉类、香肠、面包、巧克力、糖类、快餐类、饼干类、比萨、方便面、其他面类、口香糖类、冰棍、冰淇淋类、牛奶、牛奶代用品、奶油、黄油、酪乳、酸奶、酸乳、奶酪的乳制品、各种汤、饮料、茶、功能饮料、酒精饮料及维生素复合剂等，包含通常意义上的所有保健食品。
本发明的保健饮料组合物与通常的饮料相同，可包含多种香味剂或天然碳水化合物等作为追加成分。上述的天然碳水化合物为葡萄糖、果糖等的单糖，麦芽糖、蔗糖等的二糖、糊精、环糊精等的多糖，木糖醇、山梨糖醇、赤藓糖醇等的糖醇。作为甜味剂，可使用奇异果甜蛋白、甜叶菊提取物等的天然甜味剂或糖精、阿斯巴甜等的合成香味剂等。相对于每100ml的本发明的上述乳杆菌属菌株或其的培养液，上述天然碳水化合物的比率通常为0.01至0.04g，优选为约0.02至0.03g。
上述之外的本发明的上述乳酸菌属菌株或其的培养液可包含多种营养剂、维生素、电解质、调味剂、着色剂、果胶酸及其盐、海藻酸及其盐、有机酸、保护性胶体增稠剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、酒精、碳酸饮料中使用的碳酸化剂等。除此之外，本发明的益生菌可包含用于制备天然果汁、果汁饮料及蔬菜饮料的果肉。这种成分可单独使用或组合使用。这种添加剂的比率并不重要，但本发明的菌株或其的培养液通常在每100重量份中在0.01至0.1重量份的范围内选择。
并且，本发明提供以保藏编号KCTC12624BP保藏的新型发酵乳杆菌PL9988、新型发酵乳杆菌PL9037、新型发酵乳杆菌PL9038、新型发酵乳杆菌PL9039、新型发酵乳杆菌PL9040或它们的培养液的用途，用作益生菌组合物。
上述发酵乳杆菌PL9988菌株具有以序列1记载的16S核糖体核糖核酸碱基序列，上述新型发酵乳杆菌PL9037菌株具有以序列2记载的16S核糖体核糖核酸碱基序列，上述新型发酵乳杆菌PL9038菌株具有以序列3记载的16S核糖体核糖核酸碱基序列，上述新型发酵乳杆菌PL9039菌株具有以序列4记载的16S核糖体核糖核酸碱基序列，上述新型发酵乳杆菌PL9040菌株具有以序列5记载的16S核糖体核糖核酸碱基序列。
上述微生物的培养液包含微生物生产的多种抗菌性有机酸及非蛋白质性抗菌物质。
本发明的上述组合物还可包含其他种类的公知的微生物，上述微生物具有适合与本发明的乳酸菌一同摄取，当摄取时，抑制有害微生物的生育，并改善肠内菌种的均衡的活性。
上述菌株无对庆大霉素、卡那霉素、链霉素、新霉素、四环素、红霉素、克林霉素、氯霉素、氨苄青霉素、辛内吉、利奈唑胺、甲氧苄啶、环丙沙星及利福平等的抗生素的内在耐性及外在耐性(转移可能性)，而对无耐性转移可能性的万古霉素具有内在耐性。
上述菌株的肠细胞粘着力、耐酸性及耐胆汁性优秀，上述菌株具有抗菌能力、抗氧化效果、免疫增强活性及内毒素休克抑制效果。
因此，就本发明的新型发酵乳杆菌菌株或其的培养液而言，肠细胞粘着性、耐酸性及耐胆汁性优秀，无抗生素耐性转移的危险，抑制肠内有害的病原性细菌，具有免疫增强效果、内毒素休克抑制效果及抗氧化效果，尤其，发酵乳杆菌PL9988菌株全部显著地满足作为益生菌应具备的上述条件，因而上述新型发酵乳杆菌PL9988或其的培养液可有用地用作增进排便活动及肠健康状态的益生菌组合物。
并且，本发明提供以保藏编号KCTC12624BP保藏的新型发酵乳杆菌PL9988、新型发酵乳杆菌PL9037、新型发酵乳杆菌PL9038、新型发酵乳杆菌PL9039、新型发酵乳杆菌PL9040或它们的培养液的用途，用作保健食品。
上述发酵乳杆菌PL9988菌株具有以序列1记载的16S核糖体核糖核酸碱基序列，上述新型发酵乳杆菌PL9037菌株具有以序列2记载的16S核糖体核糖核酸碱基序列，上述新型发酵乳杆菌PL9038菌株具有以序列3记载的16S核糖体核糖核酸碱基序列，上述新型发酵乳杆菌PL9039菌株具有以序列4记载的16S核糖体核糖核酸碱基序列，上述新型发酵乳杆菌PL9040菌株具有以序列5记载的16S核糖体核糖核酸碱基序列。
上述微生物的培养液包含微生物生产的多种抗菌性有机酸及非蛋白质性抗菌物质。
本发明的上述组合物还可包含其他种类的公知的微生物，上述微生物具有适合与本发明的乳酸菌一同摄取，当摄取时，抑制有害微生物的生育，并改善肠内菌种的均衡的活性。
上述菌株的肠细胞粘着力、耐酸性及耐胆汁性优秀，上述菌株通过抗菌能力、抗氧化效果、免疫增强活性、内毒素休克抑制及肠内病原性微生物生长抑制来增进肠健康活性。
上述食品优选为选自由包含冰淇淋类、牛奶、豆奶、酸奶及奶酪的乳制品、肉类、香肠、面包、巧克力、糖类、快餐类、饼干类、比萨、方便面、其他面类、口香糖类、各种汤、饮料、茶、功能饮料及酒精饮料组成的组中的一种。
因此，就本发明的发酵乳酸菌菌株而言，肠细胞粘着性、耐酸性及耐胆汁性优秀，无抗生素耐性转移的危险，抑制肠内有害的病原性细菌，具有免疫增强效果、内毒素休克抑制及抗氧化效果，因而可有用地用作用于增进排便活动及肠健康状态的保健食品。
以下，利用实施例及制备例对本发明进行详细说明。
只是，以下实施例及制备例用于具体例示本发明，本发明的内容并不限定于实施例及制备例。
实施例1.菌株的分离
从所谓的韩国的长寿带的全罗北道的村子的8个地方中接收101名进行有规则的顺畅排便的健康成人的粪便样品，并以冷藏状态6小时内到达实验室。利用灭菌生理食盐水稀释提供的上述粪便样品之后，在DeManRogosa(MRS,Difco,BectonDickinson,Sparks,MD,USA)培养基中稀释并进行涂抹，来在37℃培养器中培养48小时。采集呈现乳酸菌形态的菌落来分离了单独菌落(Lee,HM,LeeY,2008,LettersinAppliedMicrobiology46,676-681)，在同一个人中观察到相同形态的菌落的情况下，分析最多两个来分离了菌株。分离的上述菌株通过过氧化氢酶(catalase)反应实验筛选了呈现阴性反应的菌株，之后，进行革兰氏染色来分离了既是革兰氏阳性菌株又是杆形(rodform)的菌株。
实施例2.菌株的鉴定
为了鉴定在上述实施例1中分离的菌株，执行了16S核糖体核糖核酸基因碱基序列分析。
具体地，碱基序列使用EzTaxon-eserver(http://eztaxon-e.ezbiocloud.net/；Kimetal.,2012)和在线的BLASTalgorithmattheNationalCenterforBiotechnologyInformationWebserver(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)来鉴定了菌株，并基于16S核糖体核糖核酸碱基序列进行了分子系统分类学分析。
最终，如图1所示，确认如下：本发明的发酵乳杆菌PL9988菌株为具有以序列1记载的16S核糖体核糖核酸碱基序列，并与发酵乳杆菌的标准菌株CECT562(发酵乳杆菌菌株CECT562)呈现99.42％的16S核糖体核糖核酸的同源性的新型菌株(图1)。并且，将上述菌株命名为发酵乳杆菌PL9988，并于2014年7月16日以保藏编号KCTC12624BP保藏于韩国生命工学研究院微生物资源中心。
并且，利用与上述相同的方法进一步分离及鉴定了多个菌株。
最终，如图2至图5所示，分离及鉴定了四种发酵乳杆菌菌株，上述四种发酵乳杆菌菌株与本发明的发酵乳杆菌PL9988菌株不同，具有以序列2至序列5记载的16S核糖体核糖核酸碱基序列，与发酵乳杆菌的标准菌株CECT562呈现99％以上的16S核糖体核糖核酸同源性(图2至图5)，并分别命名为发酵乳杆菌PL9037、发酵乳杆菌PL9038、发酵乳杆菌PL9039或发酵乳杆菌PL9040。
实施例3.发酵乳杆菌PL9988菌株的染色
为了确认从上述实施例1分离的发酵乳杆菌PL9988菌株的形状，执行了革兰氏染色法。
具体地，为了分析在上述实施例1及实施例2中分离、鉴定的发酵乳杆菌PL9988菌株的形态，在30℃温度下，在营养琼脂平板培养基中，将上述菌株培养24小时之后，将上述菌涂抹于载玻片，利用显微镜观察菌的形态及菌落的形态，并使用由西格玛公司制备的革兰氏染色试剂盒(SigmaDiagnostics，kitHT90-A)来执行了革兰氏染色实验。
最终，如图6所示，确认到本发明的发酵乳杆菌PL9988菌株的形状为作为典型的发酵乳杆菌的形状的革兰氏阳性杆菌的状态(图6)。
实施例4.发酵乳酸菌菌株的抗生素感受性的确认
为了测定从上述实施例2鉴定的发酵乳杆菌PL9988菌株的抗生素感受性，执行了液体稀释法。乳酸菌的抗生素感受性检查的方法公开有国际标准化组织(ISO，internationalorganizationforstandardization)方法、临床实验室标准化协会(CSLI，Clinicalandlaboratorystandardsinstitute)方法、欧洲药敏试验委员会(EUCAST，Europeancommitteeonantimicrobialsusceptibilitytesting)方法，但几乎未确立对多种乳酸菌种和抗生素的耐性基准。对此，同时执行对多个分离的发酵乳杆菌的感受性检查来判断了是否相对地具有耐性。
具体地，乳酸菌的抗生素感受性检查根据国际标准化组织指导方针(ISO10932:2010(E),Milkandmilkproducts-Determinationoftheminimalinhibitoryconcentration(MIC)ofantibioticsapplicabletobifidobacteriaandnon-enterococcallacticacidbacteria(LAB))，使用LSM培养基(IST肉汤(Iso-Sensitest，90％；Oxoid)和MRS肉汤(10％)的混合培养基(pH6.7))来通过液体稀释法执行。抗生素使用在国际标准化组织指导方针中公开的庆大霉素、四环素、红霉素、克林霉素、氯霉素、氨苄青霉素、万古霉素、辛内吉、利奈唑胺及利福平以0.5至256μg/ml的浓度范围进行了实验。以2×的方式制备所要实验的抗生素，并在微板中以每孔(well)50μl的方式分株而放置。在含有抗生素的孔中接种培养了一宿的乳酸菌之后，在37℃温度且厌氧性条件下，将接种了菌株的微板培养48小时来观察了结果。
最终，如表1所示，确认本发明的多个新型发酵乳杆菌对万古霉素呈现最小抑制浓度(minimalinhibitoryconcentration(MIC)＝128μg/ml以上)的高度耐性，从而确认到上述多个发酵乳杆菌菌株具有作为乳酸菌的普通特征的基于厚的内壁的现象。并且，确认到本发明的发酵乳杆菌PL9988与对庆大霉素、红霉素及克林霉素具有一个以上的耐性的其他发酵乳杆菌PL9037、发酵乳杆菌PL9038、发酵乳杆菌PL9039及发酵乳杆菌PL9040不同，对所有抗生素具有感受性，从而确认到上述发酵乳杆菌PL9988菌株无抗生素耐性转移的危险(表1)。
表1
多个发酵乳杆菌菌株的最小抑制浓度(MIC)测定结果
(GEN：庆大霉素、TET：四环素、ERY：红霉素、CLI：克林霉素、CHL：氯霉素、AMP：氨苄青霉素、VAN：万古霉素、SYN：辛内吉、LIN：利奈唑胺、RIF：利福平)
实施例5.发酵乳杆菌菌株的病原菌抑制能力的确认
为了测定从上述实施例1分离的新型发酵乳杆菌菌株的病源菌抑制能力，执行了以下实验。
具体地，在MRS液体培养基中将乳酸菌培养25小时后，进行离心分离，来准备了上清液。包含大肠菌株0157:H7ATCC43894、鼠伤寒沙门氏菌CCARM8001、肠炎沙门氏菌CCARM8010、粪肠球菌CCARM0011、金黄色葡萄球菌CCARM0045、单核细胞增生利斯特菌CCARM0019的六种有害细菌以McFalandstandard0.5调节浊度来接种于MH固体培养基，利用灭菌试验管在培养基中穿孔，来混合1ml的上述乳酸菌培养上清液与200μl的3％的琼脂，并放入孔中。在30℃温度下，培养单核细胞增生利斯特菌，在37℃温度下，培养其余有害细菌来确认了是否存在抑菌圈和抑菌圈的大小。
最终，如图7及表2所示，确认发酵乳杆菌PL9988菌株对除了大肠菌株0157:H7之外的其余五种有害菌呈现抑制力，从而确认到上述发酵乳杆菌PL9988菌株对多种病原菌具有抑制能力。并且，确认如下：发酵乳杆菌PL9037及发酵乳杆菌PL9038菌株对五种有害菌呈现抑制力，发酵乳杆菌PL9039及发酵乳杆菌PL9040菌株也呈现与本发明的发酵乳杆菌PL9988菌株类似的病原菌抑制活性(图7及表2)。
表2
多个发酵乳杆菌菌株的抑菌圈大小
实施例6.发酵乳杆菌菌株的安全性的确认
为了确认从上述实施例1分离的新型发酵乳杆菌菌株的人体安全性，执行了溶血现象检查、有害物质及有害酶生成检查。并且，细胞的病原性由细胞侵入能力确定的情况多，细胞的侵入需要蛋白质分解能力，因而为了确认蛋白质分解能力，执行了明胶液化反应检查。
具体地，在血液琼脂培养基中接种实验菌，在37℃温度下，培养24小时来确认了溶血现象。并且，在包含0.3g的牛肉提取物(beefextract)、0.5g的蛋白胨(peptone)、12g的明胶(gelatin)及100ml的MRS培养基的MRS明胶培养基中接种实验菌之后，在35℃温度下，培养6周，培养之后与未接种的对照组一同，在4℃温度下，冷却4小时左右之后，确认了明胶液化反应。若冷藏之后培养基未凝固，则视为阳性反应。并且，确认了是否生成氨(尿素酶)、吲哚及苯丙酮酸等的有害物质、β-葡萄糖醛酸酶及β-葡萄糖苷酶等的一部分肠内微生物生成的有害酶。
最终，如表3所示，确认到本发明的新型发酵乳杆菌PL9988菌株在明胶液化反应中都呈现阴性，并不生成作为有害代谢产物的氨、吲哚、苯丙酮酸、作为有害酶的β-葡萄糖醛酸酶及β-葡萄糖苷酶。
相反，确认如下：发酵乳杆菌PL9039菌株与发酵乳杆菌PL9988菌株不同，产生α-型溶血现象，发酵乳杆菌PL9037、发酵乳杆菌PL9038及发酵乳杆菌PL9040菌株生成有害代谢产物或有害酶，从而确认了上述发酵乳杆菌PL9988菌株最安全(表3)。
表3
实施例7.发酵乳杆菌菌株的耐酸性及耐胆汁性的确认
为了测定从上述实施例1分离的发酵乳杆菌菌株的耐酸性及耐胆汁性，执行了耐酸性及耐胆汁性实验。
具体地，为了在与消化管条件类似的环境下进行测定，在pH3.0的培养基中，添加1000U/ml的胃蛋白酶的人工胃液中实施了耐酸性实验。分别在液体培养基中将分离乳酸菌菌株培养24小时之后，进行离心分离来回收细胞，并用灭菌生理食盐水清洗了三次。以与上清液相同的量添加人工胃液，并在与乳酸菌的培养条件相同的条件下，反应90分钟之后，以与对照组进行比较的方式稀释，来涂抹于MRS板，并计算生菌数，从而测定了耐酸性程度。
并且，在耐胆汁性实验中，使用了在人工胃液条件下处理90分钟的各乳酸菌培养液，并在pH7.0的培养基中，添加0.3％的胆汁(猪胆汁提取液，西格玛公司)及1000U/ml的胰蛋白酶的人工胆汁液中进行了实施。对经人工胃液处理的培养液进行离心分离之后，添加与上清液相同的量的人工胆汁液，来进一步反应90分钟之后，以与对照组进行比较的方式稀释，来涂抹于MRS板，并计算生菌数，从而测定了耐胆汁性程度。
最终，如表4所示，确认如下：处理了人工胃液及人工胆汁液之后，发酵乳杆菌PL9988、发酵乳杆菌PL9037、发酵乳杆菌PL9038及发酵乳杆菌PL9037菌株也具有显著的生存能力，尤其，处理了人工胃液及人工胆汁液之后，发酵乳杆菌PL9988菌株还大部分生存，从而确认到上述发酵乳杆菌PL9988菌株的耐酸性及耐胆汁性显著优秀(表4)。
表4
实施例8.对发酵乳杆菌PL9988菌株的肠管细胞的粘着能力的确认
为了测定从上述实施例1分离的发酵乳杆菌菌株对人类肠细胞的粘着能力，执行了以下实验。
具体地，针对作为人类肠细胞株的Caco-2细胞(韩国细胞株银行，韩国)，使用包含非激活的胎牛血清(feralbovineserum，FBS；吉毕科(Gibco)公司)、l％(v/v)的抗生素-抗真菌剂(antibiotic-antimycotics，吉毕科公司)的极限必需培养基(Eagles，吉毕科公司)，来在37℃温度下，在7％的CO2培养器中进行了培养。用10mM的磷酸盐缓冲液(pH7.0)将在70％以上的上述的Caco-2细胞及MRS肉汤中培养的乳酸菌(1×108CFU/ml)清洗三次，并在1ml的MEM培养基中悬浮，从而放入各个准备的板中。在37℃温度下，在CO2培养器中反应1小时之后，利用10mM的磷酸盐缓冲液将上述板清洗三次，来去除未粘着的乳酸菌，并用在1L的蒸馏水中包含100ml的35％的甲醛(formaldehyde)、16g的Na2HPO4及4g的NaH2PO4·H2O的4％的固定液进行固定之后，如上述实施例3，利用显微镜观察了通过革兰氏染色粘着的乳酸菌。并且，利用10mM的磷酸盐缓冲液将进行反应的上述板清洗三次之后，放入1ml的0.1％的聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)，并利用刮光机(scrapper)获取细胞和乳酸菌悬浮液之后，利用连续稀释法计算在MRS肉汤板中生长的乳酸菌数，从而确认了粘着于上述人类肠细胞的乳酸菌数。粘着实验共进行三次，来进行平均处理。
最终，如图8所示，确认在肠细胞中，在每区粘着有约2.8×106CFU的发酵乳杆菌PL9988，从而确认到上述发酵乳杆菌PL9988在人体肠管中可栖息，并在肠内条件下可进行生育(图8)。
实施例9.发酵乳杆菌PL9988菌株的免疫增强效果的确认
若非病原性菌(乳酸菌)刺激巨噬细胞(macrophagecell)，则分泌作为促炎性细胞因子的肿瘤坏死因子-α，由此，细胞因子信使核糖核酸(mRNA)的水平变高，并分泌白细胞介素-10来呈现免疫增强效果。因此，为了确认通过从上述实施例1分离的发酵乳杆菌PL9988菌株在巨噬细胞中分泌的肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6及白细胞介素-1β的浓度，执行了以下实验。
具体地，在添加有10％的胎牛血清(吉毕科公司)及1％的抗生素-抗真菌剂(吉毕科公司)的RPMI1640(RoswellParkMemorialInstitute-1640，GibcoBRL，Grandisland，USA)培养基中培养巨噬细胞株RAW264.7(韩国细胞株银行，韩国)，在96孔板中以1.0×105/孔的方式进行接种，并利用1μg/ml的脂多糖(lipopolysaccaride，LPS)刺激了细胞。之后，利用磷酸盐缓冲液将在MRS肉汤中继代培养的各乳酸菌清洗三次，以最终菌数成为1.0×108CFU/孔的方式在RPMI1640中进行悬浮之后，分株于板，并在37℃温度下，在CO2培养器中培养了24小时。获取仅使脂多糖反应的培养上清液、仅使乳酸菌反应的培养上清液及与脂多糖及乳酸菌一同反应的上清液，并根据制备公司的程序，利用肿瘤坏死因子-α细胞因子试剂盒(TNF-aCytokinekit)(Biosource，CA，USA)对作为在获取的细胞培养上清液中存在的免疫增强相关细胞因子的肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6或白细胞介素-1β的浓度进行分析。上述实验共进行三次，来进行平均处理。
最终，如图9所示，确认如下：在利用脂多糖刺激巨噬细胞株，并处理发酵乳杆菌PL9988的情况下，与脂多糖单独处理组相比，肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6及白细胞介素-1β的分泌显著减少，从而上述发酵乳杆菌PL9988菌株具有免疫增强效果，尤其，降低基于脂多糖的过渡的肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6及白细胞介素-1β的分泌，因而具有当感染细菌时，可将由脂多糖诱导的内毒素休克最小化的功能(图9)。
实施例10.发酵乳杆菌PL9988菌株的抗氧化效果的确认
为了确认从上述实施例1分离的发酵乳杆菌PL9988菌株的抗氧化效果，执行了抗氧化功能测定实验。
具体地，针对培养一宿的菌株，在食盐水中制备107CFU/ml的悬浮液，并将0.1ml的上述悬浮液接种于MRS固体培养基之后，放置含有10μl的溶解于生理食盐水的百草枯(paraquat)的纸碟，并在37℃温度下，培养一宿来利用尺测定生长抑菌圈，并且，在上述悬浮液中，添加10及100mM的百草枯来培养一宿之后，按时间以600nm的吸光度测定细菌生长，来测定了活性氧类(ROS)抵抗能力。并且，作为对照组，利用了以保藏编号KCCM-10250记载的发酵乳杆菌PL9005。
最终，如图10及表5所示，在以保藏编号KCCM-10250记载的发酵乳杆菌PL9005菌株的情况下，当添加100mM的百草枯时，观察到生长抑菌圈，但当添加10mM及100mM的百草枯时，在本发明的发酵乳杆菌PL9988菌株中均未观察到生长抑菌圈，从而确认了对百草枯有耐性，进而确认到上述发酵乳杆菌PL9988菌株的抗氧化能力优秀(图10及表5)。
表5
基于百草枯(paraquat)生产的超氧阴离子(superoxideanion)的生长抑菌圈大小
制剂例1.食品的制备
包含本发明的发酵乳杆菌PL9988菌株及其的培养液的食品制备如下。
1-1.烹饪用调料的制备
在100重量份的烹饪用调料中，混合1至12重量份的本发明的发酵乳杆菌PL9988菌株及其的培养液，来制备了用于改善肠功能的烹饪用调料。
1-2.汤及肉汁(gravies)的制备
在100重量份的汤及肉汁中，添加1至12重量份的本发明的发酵乳杆菌PL9988菌株及其的培养液，来制备了肠功能改善有肉加工产品、面类的汤及肉汁。
1-3.乳制品(dairyproducts)的制备
在100重量份的牛奶中，添加1至12重量份的本发明的发酵乳杆菌PL9988菌株及其的培养液，并利用上述牛奶制备了黄油及冰淇淋等的多种乳制品。
l-4.膳食的制备
利用真空浓缩机对本发明的发酵乳杆菌PL9988菌株及其的培养液进行减压、浓缩，并利用粉碎机将通过喷雾、热风干燥机干燥而得的干燥物粉碎成60目的粒度，从而取得了干燥粉末。
配合在上述中制备的谷物类、种子和坚果类及本发明的发酵乳杆菌PL9988菌株及其的培养液来制备了膳食。
制剂例2.饮料的制备
2-1.碳酸饮料的制备
将5至10重量份的白糖、0.05至0.3重量份的柠檬酸、0.005至0.02重量份的焦糖、0.1至1重量份的维生素C及10重量份的本发明的发酵乳杆菌PL9988菌株及其的添加物进行混合，在其中混合PL9039及94重量份的纯化水来制备糖浆，并在95至98℃温度下，将糖浆杀菌20至180秒钟，来与冷却水以1：4的比例混合之后，注入0.5至0.82重量份的二氧化碳，来制备了碳酸饮料。
2-2.功能性饮料的制备
在0.1重量份的维生素C、5.8重量份的果糖、3.8重量份的白砂糖、0.12重量份的柠檬酸、0.03重量份的苹果酸、0.04重量份的柠檬酸钠及0.02重量份的栀子蓝色素中，配合10重量份的本发明的发酵乳杆菌PL9988菌株及其的培养液，来完全溶解于已计量的水中。利用已计量的纯化水进行调节，使得溶解的上述饮料的总量成为100重量份。
2-3.保健饮料的制备
将0.5重量份的液状果糖、2重量份的低聚糖、2重量份的白糖、0.5重量份的食盐、75重量份的水等辅料和10重量份的本发明的发酵乳杆菌PL9988菌株及其的培养液均质配合，来进行瞬间杀菌之后，包装于玻璃瓶、PET瓶等小包装容器，从而制备了保健饮料。
2-4.蔬菜汁的制备
在西红柿汁或胡萝卜汁中，添加10g的本发明的发酵乳杆菌PL9988菌株及其的培养液的真空干燥物，来制备了健康增进用蔬菜汁。
2-5.果汁的制备
在1l的苹果汁或葡萄汁中，添加10g的本发明的发酵乳杆菌PL9988菌株及其的培养液的真空干燥物，来制备了健康增进用果汁。
制剂例3.发酵乳的制备
在72至75℃温度下，对利用脱脂奶粉将无脂油固体成分含量调节为8至20重量份的原料油杀菌15秒钟。将已杀菌的原料油冷却至规定温度之后，以106CFU/ml的浓度接种发酵乳杆菌PL9988菌株，并培养至pH成为4至5。培养结束之后，冷却培养液。使0.1至50重量份的果汁浓缩液、0.1至20重量份的食物纤维、0.5至30重量份的葡萄糖、0.1至15重量份的低聚糖、0.001至10重量份的钙、0.0001至5重量份的维生素等溶解来制备了糖浆。对如此制备的糖浆进行杀菌之后，进行冷却，来以规定的比率与上述培养液混合、搅拌，从而包装于已均质化的容器来制备发酵乳。
制剂例4.乳酸菌菌末的制备
在MRS培养基中，以106CFU/ml的浓度接种发酵乳杆菌PL9988菌株，来在37℃温度下，实施18至24小时的pH-调节发酵(pH-controlfermentation)。培养结束之后，在4℃温度下，以10.000×g进行离心分离来回收了菌体。在5％的脱脂牛奶(skimmilk)中，以相同的量混合已回收的菌体与含有2.5％的乳清(whey)、5％的蔗糖(sucrose)的保护剂之后，利用冷冻干燥机进行粉末化。利用海藻糖稀释像这样制备的发酵乳杆菌PL9988的干燥粉末，来制备成具有1×1011CFU/g以上的生菌数。
制剂例5.乳酸菌制剂的制备
利用在制剂例4中制备的乳酸菌菌末来制备了乳酸菌食品、整肠剂等的乳酸菌制剂。在20重量份的发酵乳杆菌PL9988的干燥粉末(生菌数1×1010CFU/g以上)中，混合10重量份的低聚糖、20重量份的无水葡萄糖、5重量份的结晶果糖、2重量份的维生素C、5重量份的水果粉末香料、5重量份的芦荟、15重量份的食物纤维、18重量份的车前子壳，来在杆或瓶中接种规定量来进行包装。像这样制备的乳酸菌制剂维持了5×108CFU/g以上的生菌数。

Claims (15)

1.一种菌株，其特征在于，其为新型发酵乳杆菌菌株。
2.根据权利要求1所述的菌株，其特征在于，上述菌株为具有以序列1记载的16S核糖体核糖核酸碱基序列并以保藏编号KCTC12624BP保藏的新型发酵乳杆菌PL9988、具有以序列2记载的16S核糖体核糖核酸碱基序列的新型发酵乳杆菌PL9037、具有以序列3记载的16S核糖体核糖核酸碱基序列的新型发酵乳杆菌PL9038、具有以序列4记载的16S核糖体核糖核酸碱基序列的新型发酵乳杆菌PL9039或具有以序列5记载的16S核糖体核糖核酸碱基序列的新型发酵乳杆菌PL9040。
3.一种益生菌组合物，其特征在于，包含以保藏编号KCTC12624BP保藏的新型发酵乳杆菌PL9988、新型发酵乳杆菌PL9037、新型发酵乳杆菌PL9038、新型发酵乳杆菌PL9039、新型发酵乳杆菌PL9040或它们的培养液作为有效成分。
4.根据权利要求3所述的益生菌组合物，其特征在于，上述菌株或上述菌株的培养液无抗生素外在耐性，从而不存在耐性转移的危险。
5.根据权利要求3所述的益生菌组合物，其特征在于，上述菌株或上述菌株的培养液具有抗菌活性。
6.根据权利要求3所述的益生菌组合物，其特征在于，上述菌株或上述菌株的培养液的耐酸性及耐胆汁性优秀。
7.根据权利要求3所述的益生菌组合物，其特征在于，上述菌株或上述菌株的培养液的肠细胞粘着能力优秀。
8.根据权利要求3所述的益生菌组合物，其特征在于，上述菌株或上述菌株的培养液具有抗氧化活性。
9.根据权利要求3所述的益生菌组合物，其特征在于，上述菌株或上述菌株的培养液具有免疫增强活性。
10.根据权利要求3所述的益生菌组合物，其特征在于，上述菌株或上述菌株的培养液抑制肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6或白细胞介素-1β的分泌来具有免疫增强活性。
11.一种保健食品，其特征在于，包含以保藏编号KCTC12624BP保藏的新型发酵乳杆菌PL9988、新型发酵乳杆菌PL9037、新型发酵乳杆菌PL9038、新型发酵乳杆菌PL9039、新型发酵乳杆菌PL9040或它们的培养液作为有效成分。
12.根据权利要求11所述的保健食品，其特征在于，上述菌株或上述菌株的培养液通过抑制肠内病原性微生物生长来增进肠健康活性。
13.根据权利要求11所述的保健食品，其特征在于，上述保健食品为选自由包含冰淇淋类、牛奶、豆奶、酸奶及奶酪的乳制品、豆奶制品、肉类、香肠、面包、巧克力糖类、快餐类、饼干类、比萨、方便面、其他面类、口香糖类、各种汤、饮料、茶、功能饮料及酒精饮料组成的组中的一种。
14.一种以保藏编号KCTC12624BP保藏的新型发酵乳杆菌PL9988、新型发酵乳杆菌PL9037、新型发酵乳杆菌PL9038、新型发酵乳杆菌PL9039、新型发酵乳杆菌PL9040或它们的培养液的用途，其特征在于，上述以保藏编号KCTC12624BP保藏的新型发酵乳杆菌PL9988、新型发酵乳杆菌PL9037、新型发酵乳杆菌PL9038、新型发酵乳杆菌PL9039、新型发酵乳杆菌PL9040或它们的培养液用作益生菌组合物。
15.一种以保藏编号KCTC12624BP保藏的新型发酵乳杆菌PL9988、新型发酵乳杆菌PL9037、新型发酵乳杆菌PL9038、新型发酵乳杆菌PL9039、新型发酵乳杆菌PL9040或它们的培养液的用途，其特征在于，上述以保藏编号KCTC12624BP保藏的新型发酵乳杆菌PL9988、新型发酵乳杆菌PL9037、新型发酵乳杆菌PL9038、新型发酵乳杆菌PL9039、新型发酵乳杆菌PL9040或它们的培养液用作保健食品。
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