KR101768678B1

KR101768678B1 - 한국 장수마을에서 개발된 건강기능성이 우수한 비피도박테리움 롱검 아종 인판티스 bi9988

Info

Publication number: KR101768678B1
Application number: KR1020150023190A
Authority: KR
Inventors: 이연희; 백경수; 신은주; 홍현진; 이학미; 이민영
Original assignee: (주) 피엘바이오
Priority date: 2015-02-16
Filing date: 2015-02-16
Publication date: 2017-08-18
Anticipated expiration: 2035-02-16
Also published as: KR20160101268A

Abstract

본 발명의 신규한 비피도박테리움 롱검 아종 인판티스(Bifidobacterium longum ssp. infantis)BI9988 균주, 또는 이의 배양액은 내산성 및 내담즙성이 우수하고 항생제 내성 전이의 위험이 없으며, 장 세포 부착능, 면역 증가능(마크로파아지 활성능), 식중독균 억제능 및 콜레스테롤 소화능 등이 뛰어나므로 상기 균주 및 이의 배양액은 배변활동 및 장 건강 상태를 증진시키는 생균제 또는 유산균제제, 발효유제품, 건강보조식품, 사료첨가제, 의약품, 화장품 등의 다양한 제품의 건강기능성 첨가제로 사용할 수 있다.

Description

한국 장수마을에서 개발된 건강기능성이 우수한 비피도박테리움 롱검 아종 인판티스 BI9988{Bifidobacterium longum ssp. infantis BI9988 isolated from Korean longevity village and having high nutraceutical activities}

본 발명은 장기능 활성, 면역증강, 콜레스테롤 억제 등 건강기능 증진에 도움을 주는 한국 장수마을 장수노인으로부터 분리한 신규한 비피도박테리움 롱검 아종 인판티스(Bifidobacterium longum ssp. infantis) 균주의 생균제 용도에 관한 것이다.

현재까지 우리나라에서 상품화되어 팔리고 있는 대표적인 유산균들은 대부분은 서구인 또는 그들의 식품에서 분리되어 개발된 유산균으로 일상의 우리나라 사람의 내장에서는 잘 발견되지 않는 유산균들이다. 이에 우리나라의 대표적인 장수벨트에 거주하고 있으며 건강한 장 활동(쾌변)을 하고 있는 성인으로부터 유산균을 분리하여 한국형 유산균을 개발하고, 이 유산균의 생균제(probiotic)로서의 여러 가지 기능들을 규명하고, 특히 현재 전 세계적으로 문제가 되고 있는 항생제 내성 전이 가능성이 없고 배변활동에 도움을 주는 신규 기능성 유산균을 개발하여 효능 있는 생균제로 사용하려고 한다.

생균제(probiotics)는 적당량 섭취시 장내 미생물의 성질을 개선시켜 숙주에 유익한 영향을 주는 살아있는 미생물의 단독 또는 복합균주로 정의되었으나, 최근 들어 Salminen 등(Salminen et al. 1999. Probiotics:how should they be defined, Trends in food Science & Technology, 10, 107-110)에 의해 인체나 동물의 건강을 증진시키기 위하여 고안된 식품 및 사료 또는 식이 첨가제에 들어있는 살아있는 미생물 제제라고 정의되고 있다.

프로바이오틱스 유산균은 크게 락토바실러스(Lactobacillus), 락토코커스(Lactococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 루코노스톡(Leuconostoc), 페디오코커스(Pediococcus), 비피도박테리움(Bifidobacterium)으로 구분하며, 장관 및 비뇨생식기의 미생물 오염방지 및 장 건강 유지, 변비완화, 유해균 증식억제, 항암, 면역증강, 콜레스테롤 감소, 공액 리놀레산(CLA, Conjugated linoleic acid) 생산, 헬리코박터 피롤리 억제 기능 등의 역할을 함으로써 인체 건강 증진에 중요한 역할을 하고 있다.

생균제로서 갖추어야 할 바람직한 조건은, 우선 안전해야 하고, 산과 담즙에 대한 내성(tolerance)이 있어야 하며, 장관 상피(intestinal epithelium)에 부착능이 있어야 하고, 병원성균(pathogenic bacteria)에 대하여 억제 활성이 있어야 하며, 면역 증강 효과가 있어야 하고, 항생제 내성전이를 일으키지 말아야 한다.

세균은 항생제 내성을 두 가지 방법으로 가지게 된다. 첫째는 내재 내성으로 외부에서 전이되지 않고 태생적으로 가지고 있는 내성이다. 예를 들어, 락토바실러스 애시도필러스를 제외한 대부분의 유산균의 경우 세포벽의 구조와 세포벽의 두께가 두꺼워 밴코마이신(vancomycin)에 내성을 보이는 경우를 말하며, 이런 내재 내성은 전이로 이루어지지 않고 또한 다른 세균으로 내성 유전자를 전이하지 않는다. 둘째는 외재 내성으로,　외재 내성은 내성 유전자가 플라스미드　또는 트랜스포존에 결합하여, 외부 다른 세균에서 들어가 생기는 내성을 말하며, 이 경우 이런 내성 세균의 유전자가 다른 세균에게도 내성을 쉽게 전달하게 된다.

이전에는 내성이 강한 유산균이 무조건 좋은 것으로 알려져서, 다양한 항생제를 처리해서 살아남은 항생제 내성 유산균을 좋은 유산균으로 생각했으나, 현재는 여러 가지 항생제에 내성을 가진 유산균의 내성 유전자가 장내 세균으로 전이되어 내성 문제를 일으킨다는 보고가 되고 있다. 이에 따라 서구에서는 이미 오래 전부터 항생제 내성 유산균이 내성 유전자를 전이할 수 있는 경우는 모두 상업화 하지 못하게 하고 있는 실정이다 (Clinical Laboratory Standard Institute, CLSI, USA).

1899년 Tisser에 의해 비피도박테리아가 분리된 이래, 비피도박테리아는 정장 작용 및 장내 균총(colony)의 정상화 등 인체에 유익한 균주로 여겨지고 있다(Benno, Y., K. Sawada and T. Mitsuoka. 1984. The intestinal microflora of infants; composition of fecal flora in breast-fed and bottle-fed infants. Microbiol. Immunol. 28:975-986). 분리된 초기에는 생리적 특성이 락토바실러스와 유사하여 락토바실러스 비피더스라 불려지다가(Weiss, J.E. and Rettger L. F. 1938. Lactobacillus bifidus. J. Bacteriology. 28:501-527) 현재는 비피도박테리움(Bifidobacterium)으로 별도 분류되어 있다.

보통 성인의 장내에 분포하는 혐기성 장내 미생물인 비피도박테리아는 락토바실러스와 연쇄상구균(Streptococcus)보다 약 1,000배 이상 존재하는 유산균으로 과당-6-인산 포스포케톨라아제(fructose-6-phosphate phosphoketolase; FPPK)의 특이 대사계(Scardovi, V. and L.D. Trovatelli. 1965. The fructose-6-phosphate shunt as a peculiar pattern of hexose degradation in genus Bifidobacterium. Ann. Microbiol. Enzymol. 15:19-29)를 통하여 아세트산 및 젖산 등의 유기산을 생성하여 장내 pH를 약 산성으로 낮추어 산에 예민한 유해균의 증식을 억제(Collins, E.B and B.J. Hall. 1984. Growth of bifidobacteria in milk and preparation of Bifidobacterium infantis for a dietary adjunct. J. Dairy Sci. 7:1376-1380)하고 과산화수소(H₂0₂)와 유용 항생물질을 생산하여 장질환을 예방한다. 또한 비타민을 합성하여 영양학적으로 도움이 되며(Shahani, K.M. and R.C. Chandan. 1979. Nutritional and healthful aspects of cultured and culture-cintaining dairy foods. J. Dairy. Sci. 62: 1685-1694), 단백질을 분해하여도 암모니아, 아민, 황화 수소 등 독성물질의 생산이 거의 없기 때문에 우리의 건강에 유익한 균주로 여겨지고 있다. 최근에는 항암작용이나 숙주 면역체제의 강화 등 면역 기능의 활성화 측면에서도 많은 연구가 진행되고 있다(Sasaki, T., S. Fukami, and S. Namioka. 1994. Enhanced resistance of mice to Esherichia coli infection induced by administration of peptidoglycan derived from Bifidobacterium thermophilum. J. Vet. Med. Sci. 53:433-437). 이와 같이 최근 주요 생리학적 기능을 갖는 비피더스균은 기능성 식품의 소재로 부각되면서 이전부터 사용되고 있는 유산균 락토바실러스 및 장내구균과 더불어 유제품 및 정장제품에 널리 이용되고 있다.

이에, 본 발명자들은 안전하고 내산성 및 내담즙성, 면역증강 및 콜레스테롤 억제능이 우수한 비피도박테리아(Bifidobacteria)를 찾고자 노력한 결과, 우리나라의 장수마을에 거주하는 80세 이상의 장수노인의 분변으로부터 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum)의 아종(sub sp.) 균주들을 다수 분리하였고, 상기 균주 중 장내 유해효소로 알려진 베타글루코시다아제(β-glucosidase) 비보유 비피도박테리아 중에서 대장상피세포 부착능, 면역 증가능(마크로파아지 활성능), 식중독균 억제능 및 콜레스테롤 소화능 등이 뛰어나면서 항생제 내성 전이의 위험성이 없는 비피도박테리움 균주- 즉, Bifidobacterium longum ssp. infantis BI9988을 선발하였으며 이를 유산균제제, 발효유제품, 건강보조식품, 사료첨가제, 의약품, 화장품 및 생균제 등의 다양한 제품의 첨가제로 사용할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 건강한 장수노인으로부터 분리한 신규한 비피도박테리움 롱검 아종 인판티스(Bifidobacterium longum ssp. infantis) 균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 신규한 비피도박테리움 롱검 아종 인판티스 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 하는 생균제 조성물, 및 배변활동 향상 및 증강용 건강식품을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 신규한 비피도박테리움 롱검 아종 인판티스(Bifidobacterium longum ssp. infantis) 균주를 제공한다.

또한, 본 발명은 신규한 비피도박테리움 롱검 아종 인판티스 BI9988, 또는 이들의 배양액을 유효성분으로 함유하는 생균제 조성물을 제공한다.

아울러, 본 발명은 신규한 비피도박테리움 롱검 아종 인판티스 BI9988, 또는 이들의 배양액을 유효성분으로 함유하는 배변활동 촉진과 장내유해균 억제 등 장 건강 증진, 면역증강, 콜레스테롤 억제 등을 위한 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 신규한 비피도박테리움 롱검 아종 인판티스(Bifidobacterium longum ssp. infantis)BI9988 균주, 또는 이의 배양액은 내산성 및 내담즙성이 우수하고 항생제 내성 전이의 위험이 없으며, 장 세포 부착능, 면역 증가능(마크로파아지 활성능), 돌연변이 억제능, 식중독균 억제능 및 콜레스테롤 소화능 등이 뛰어나므로 상기 균주 및 이의 배양액은 배변활동 및 장 건강 상태를 증진시키는 생균제 또는 유산균제제, 각종 유제품, 건강보조식품, 사료첨가제, 의약품, 화장품 등의 다양한 제품의 첨가제로 사용할 수 있다.

도 1은, Bifidobacterium longum ssp. infantis BI9988의 그람 염색 사진이다.
도 2는, Bifidobacterium longum ssp. infantis BI9988의 전자현미경 사진이다.
도 3은, Bifidobacterium longum ssp. infantis BI9988가 장 세포주인 HT29-MTX 세포에 결합된 것을 그람 염색 후 광학 현미경으로 관찰한 사진이다.
도 4는, Bifidobacterium longum ssp. infantis BI9988의 16S rRNA 서열을 나타낸 도이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 신규한 비피도박테리움 롱검 아종 인판티스(Bifidobacterium longum ssp. infantis) 균주를 제공한다.

상기 균주는 서열번호 1로 기재되는 16S rRNA 서열을 가지며 수탁번호 KCTC 12747BP로 기탁된 비피도박테리움 롱검 아종 인판티스(Bifidobacterium longum ssp. infantis) BI9988인 것이 바람직하다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 내산 및 내담즙성이 우수한 비피도박테리아를 분리 및 동정하기 위해, 실험 대상자인 장수마을에 거주하는 건강하고 규칙적인 장 활동을 하는 80세 이상의 장수 노인의 분변을 수집하여 멸균 식염수에 십 배수로 순차적 희석을 하여 혐기 배양을 통해 비피도박테리움의 균주를 분리하였다. 비피도박테리움은 과당-6-인산 포스포케톨라아제(fructose-6-phosphate phosphoketolase; F-6-PPK)의 특이적 대사계를 통해 포도당으로부터 초산과 젖산을 1.5:1의 비율로 생성하므로 F-6-PPK 반응이 양성인 균주를 비피도박테리움 속으로 동정하였으며 이들 균주를 다시 API 50 CHL 동정 kit(bioMerieux Vitex, Inc, France)을 사용하여 선발 균주의 탄수화물 발효 패턴을 결정하였고 Bergy's manual of systematic bacteriology 및 Roy와 Ward(Roy, D. and P. Ward. 1990. Evaluation of rapid methods for differentiation of Bifidobacterium species. J. Appl. Bacteriol. 69:739-749)에 의한 방법에 준하여 균주를 분석하였다. 최종적으로 16S rRNA 유전자의 염기서열을 Microseq 16S rRNA gene kit(Perkin Elmer Applied Biosystem)을 분석하여 동정한 후, 상기 균주를 그람 염색 후 광학 현미경과 전자현미경으로 형태를 확인하였으며, 비피도박테리움의 전형적인 형태인 그람 양성의 간균의 형태를 나타내었다(도 1 내지 도 2 참조).

또한, 16S rRNA의 BLAST 검색결과(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast), 서열번호 1로 기재되는 16S rRNA 서열을 가지는 상기 선발된 균주는 각각 비피도박테리움 롱검 아종 인판티스(Bifidobacterium longum subsp. infantis) ATCC 15697(T)와 99.67%의 상동성을 나타내었으며, 이에 본 발명에서 분리한 상기 균주를 비피도박테리움 롱검 아종 인판티스(Bifidobacterium longum ssp. infantis) BI9988로 명명하였으며(이하, BI9988), 상기 균주를 KCTC 12747BP(Bifidobacterium longum ssp. infantis BI9988)으로 한국생명공학연구원 미생물자원센터(Korean Collection of Type Culture, KCTC)에 국제기탁하였다.

또한, 본 발명은 수탁번호 KCTC 12747BP로 기탁된 신규한 비피도박테리움 롱검 아종 인판티스(Bifidobacterium longum ssp. infantis) BI9988, 또는 이들의 배양액을 유효성분으로 함유하는 생균제 조성물을 제공한다.

상기 신규한 비피도박테리움 롱검 아종 인판티스 BI9988 균주는 서열번호 1로 기재되는 16S rRNA 염기서열을 가진다.

상기 미생물의 배양액에는 미생물이 생산하는 여러 항균성 유기산 및 비단백질성 항균물질이 포함되어 있으며, 콜레스테롤 억제 물질이 포함되어 있다.

또한, 상기 본 발명의 따른 조성물은 본 발명의 유산균과 함께 섭취하기에 적합하고, 섭취시 유해 미생물의 생육을 억제하며, 장내 균총의 균형을 개선시키는 활성을 가지는 다른 종류의 공지된 미생물을 추가로 포함할 수 있다.

상기 균주는 젠타마이신(gentamicin), 스트렙토마이신(streptomycin), 테트라사이클린(tetracycline), 에리스로마이신(erythromycin), 클린다마이신(clindamycin), 클로람페니콜(chloramphenicol), 암피실린(ampicillin) 및 밴코마이신(vancomycin) 등의 항생제에 대한 외재 내성(전이 가능성)이 없으며, 발암성 효소 베타글루코시데이즈의 활성을 가지지 않는다.

상기 균주는 장 세포 부착력, 내산성, 내담즙성 및 항균 능력이 우수하고 면역세포의 TNF-α, IL-6, 또는 IL-1β의 분비를 증가시켜 면역증강 활성을 가진다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 상기 분리한 비피도박테리움 균주의 내산성을 측정하기 위하여 분리한 균주 BI9988을 TP 액체 배지(broth)에 24시간 배양한 후 균체 농도가 10⁸-10¹⁰ CFU/mL이 되도록 10 배수로 연속 희석한 후 중성 TP 배지(pH 7.0)와 산이 첨가된 TP 배지(pH 5.0)에 도말하여 혐기적 배양기(anaerobic jar system)에서 37℃, 48시간 배양하여 최확수법(most probable number method; MPN)으로 균수를 측정하였으며 그 결과, 본 발명에서 분리한 균주인 BI9988의 내산성은 참조균(ATCC15697)와 비교하여 (Conway, P.L., S.L. Gorback, and B.R. Goldin. 1987. Survival of lactic acid bacteria in the human stomach and adhesion to intestinal cells. J. Dairy Sci. 70:1-12) 높은 생존률을 나타내는 것을 확인하였다(표 2 참조).

또한, 본 발명자들은 상기 분리한 비피도박테리움 균주의 내담즙성을 측정하기 위하여 TP 평판배지에서 자란 균 수에 대해 OX-BILE를 0.25% 함유한 TP 평판배지에서 자란 균 수의 백분율을 생존율로 정의하여 측정하였으며 그 결과, 본 발명의 균주인 BI9988의 내담즙성은 참조 균주와 비교하여 높은 내담즙성을 나타내는 것을 확인하였다(표 3 참조).

또한, 본 발명자들은 상기 분리한 비피도박테리움 균주의 항생제 내성을 측정하기 위하여 ISO 가이드라인에 따라 젠타마이신(gentamicin), 스트렙토마이신(streptomycin), 테트라사이클린(tetracycline), 에리스로마이신(erythromycin), 클린다마이신(clindamycin), 클로람페니콜(chloramphenicol), 암피실린(ampicillin) 및 밴코마이신(vancomycin)을 사용하여 0.5 내지 256 ㎍/㎖ 농도 범위대로 실험하였다. 2일 후 본 발명의 비피도박테리움 균주 BI9988의 성장을 확인하여 최소저해농도(minimal inhibitory concentration; MIC)를 확정하였으며 그 결과, 본 발명의 균주인 BI9988는 ISO 가이드라인에서 제시된 모든 항생제에 대하여 민감도를 나타냄으로써 항생제 내성을 가지고 있지 않아 항생제 내성 전이의 위험이 없는 것으로 확인하였다(표 5 참조).

또한, 본 발명자들은 상기 비피도박테리움 균주의 안정성을 확인하기 위하여 비피도박테리움이 가질 수 있는 발암성 효소 베타글루코시데이즈의 활성을 측정하였으며 그 결과, 본 발명의 균주인 BI9988는 베타글루코시데이즈(β-Glucosidase)의 활성이 검출되지 않은 것을 확인하였다.

또한, 본 발명자들은 상기 분리한 비피도박테리움 균주의 식중독균 억제능을 측정하기 위하여 식중독균인 대장균(Escherichia coli O157:H7, CCARM 0012), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium, CCARM 8001), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis , CCARM 8010), 리스테리아 모노시토제네스(Listeria monocytogenes, CCARM 0019), 황색포도상구균 (Staphylococcus aureus B, CCARM 0045), 비브리오 파라헤모리티쿠스 (Vibrio parahaemolyticus, CCARM 7001) 을 액체배지에 접종하여 본 발명의 균주인 BI9988의 배양 여액에 대한 상기 식중독 균주 성장 생균 수를 측정하여 로그(log) 값으로 나타내었다. 그 결과, 본 발명의 균주와 함께 배양된 식중독균의 생존률이 낮아진 것으로 보아, 본 발명의 균주인 BI9988은 식중독균을 억제하는 물질들을 생산하여 식중독균의 성장을 억제하는 것을 확인하였다(표 6 참조). 이와 같이, 본 발명의 균주는 식중독을 유발하는 균주의 성장을 억제하는 물질들을 생산함을 확인할 수 있었다.

본 발명자들은 상기 분리한 균주 BI9988의 혐기성 세균인 클로스트리디움 디피실 억제능력을 측정하였으며, 본 발명의 균주와 함께 배양된 경우 클로스트리디움 디피실의 생존률이 낮아진 것으로 보아 본 발명의 균주인 BI9988은 클로스트리디움 디피실의 성장을 억제하는 것을 확인하였다(표 7 참조).

본 발명자들은 상기 분리한 본 발명의 비피도박테리움 균주인 BI9988의 면역 활성능을 측정하기 위해 상기 균주에 의한 대식세포주(Macrophage cell line) RAW 264.7 세포의 IL-1, IL-6, TNF-α 생산능력을 확인하였으며, 그 결과, 본 발명의 균주의 배양 여액을 첨가한 경우 참조 균주의 배양 여액을 첨가한 경우에 비해 대식세포로부터 사이토카인(TNF-α, IL-1 및 IL-6)의 분비가 활성화된 것으로 보아 본 발명의 균주인 BI9988은 대식세포의 TNF-α, IL-1 및 IL-6 생산을 크게 증가시켜 대식세포의 면역활성을 증대시키는 것을 확인하였다(표 8 참조).

본 발명자들은 상기 분리한 균주의 대장 상피세포(Caco-2 cell)에 대한 부착능을 측정하였으며 그 결과, 발명의 균주인 BI9988은 참조 균주에 비해 대장세포에 부착된 균 수가 훨씬 많은 것을 확인하였으며, 본 발명의 BI9988 균주가 대장 세포주 Caco-2 세포에 잘 결합된 것을 확인하였다(도 3 및 표 9 참조).

또한 본 발명자들은 상기 분리한 비피도박테리움 균주에 의한 콜레스테롤 억제능(분해능)을 확인하기 위하여 가용성 콜레스테롤(7.2 mg)이 함유된 MRS 배지에 상기 본 발명의 비피도박테리움 균주를 배양하고 상등액을 분리하여 잔존하는 콜레스테롤의 함량을 나타내었다. 그 결과, 본 발명의 균주가 첨가된 경우 참조 균주가 첨가된 경우보다 배지 내 잔존하는 콜레스테롤의 함량이 줄어든 것으로 보아 본 발명의 균주인 BI9988 균주는 콜레스테롤의 억제능(분해능)이 뛰어난 것을 확인하였다(표 10 참조).

따라서, 본 발명의 신규한 비피도박테리움 롱검 아종 인판티스(Bifidobacterium longum ssp. infantis) BI9988 균주, 또는 이의 배양액은 내산성 및 내담즙성이 우수하고 항생제 내성 전이의 위험이 없으며, 장 세포 부착능, 면역 증가능(마크로파아지 활성능), 식중독균 억제능 및 콜레스테롤 소화능 등이 뛰어나므로 상기 균주 및 이의 배양액은 배변활동 및 장 건강 상태를 증진시키는 생균제 또는 유산균제제, 발효유제품, 건강보조식품, 사료첨가제, 의약품, 화장품 등의 다양한 제품의 첨가제로 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물은 통상적인 생균제 조성물 제조방법에 따라 제조될 수 있으며, 일반적으로, 배양현탁액이나 건조분말 형태일 수 있다. 또한, 주성분인 상기 비피도박테리움 롱검 아종 인판티스 BI9988 균주, 또는 이의 배양액의 유효량에 1종 또는 2종 이상의 약제학적으로 허용 가능한 통상적인 담체 또는 1종 또는 2종 이상의 첨가제를 선택하여 통상적인 제형의 조성물로 제조할 수 있다.

담체는 희석제, 활택제, 결합제, 붕해제, 감미제, 안정제, 방부제 중에서 1종 또는 2종 이상을 선택하여 사용할 수 있으며, 첨가제로는 향료, 비타민류, 항산화제 중에서 1종 또는 2종 이상을 선택하여 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 담체 및 첨가제는 약제학적으로 허용 가능한 것은 모두 사용이 가능하며, 구체적으로는 희석제로는 유당(lactose monohydrate), 트레할로스(Trehalose), 옥수수 전분(cornstarch), 콩기름(soybean oil), 미결정 셀룰로오스(microcrystalline cellulose) 또는 만니톨(D-mannitorl)이 좋고, 활택제로는 스테아린산 마그네슘(magnesiumstearate) 또는 탈크(talc)가 바람직하며, 결합제로는 폴리비닐피롤리돈(PVP: polyvinyipyrolidone) 또는 하이드록시프로필셀룰로오스(HPC: hydroxypropylcellulose) 중에서 선택함이 바람직하다. 또한, 붕해제로는 카르복시메칠셀룰로오스칼슘(Ca-CMC: carboxymethylcellulose calcium), 전분글리콜산나트륨(sodium starchglycolate), 폴라크릴린칼륨(polacrylin potassium) 또는 크로스포비돈(cross-linked polyvinylpyrrolidone)중에서 선택함이 바람직하고, 감미제로는 백당, 과당, 소르비톨(sorbitol) 또는 아스파탐(aspartame) 중에서 선택되고, 안정제로는 카르복시메칠셀룰로오스나트륨(Na-CMC: carboxymethylcellulose sodium), 베타-싸이크로덱스트린(β-cyclodextrin), 백납(white bee's wax) 또는 잔탄검(xanthan gum) 중에서 선택되며, 방부제로는 파라옥시안식향산메칠(methyl p-hydroxy benzoate, methlparaben), 파라옥시안식향산프로필(propyl p-hydroxybenzoate, propylparaben), 또는 소르빈산칼륨(potassium sorbate) 중에서 선택하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 수탁번호 KCTC 12747BP로 기탁된 비피도박테리움 롱검 아종 인판티스 BI9988, 또는 이들의 배양액을 유효성분으로 함유하는 건강식품을 제공한다.

상기 균주 또는 이의 배양액은 장내 병원성 미생물 성장 억제를 통한 장 건강 활성을 증진시키는 것이 바람직하다.

상기 식품은 아이스크림류, 우유, 두유, 요구르트, 치즈를 포함하는 유제품, 및 두유제품, 육류, 소세지, 빵, 초콜릿 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 각종 수프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료, 캡슐 또는 스틱 포장의 유산균 제제로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하다.

이에, 본 발명의 신규한 비피도박테리움 롱검 아종 인판티스 BI9988 균주, 또는 이의 배양액은 내산성 및 내담즙성이 우수하고 항생제 내성 전이의 위험이 없으며, 장 세포 부착능, 면역 증가능(마크로파아지 활성능), 식중독균 억제능 및 콜레스테롤 소화능 등이 뛰어나므로 상기 균주 및 이의 배양액은 배변활동 및 장 건강 상태를 증진시키는 생균제 또는 유산균제제, 발효유제품, 건강보조식품, 사료첨가제, 의약품, 화장품 등의 다양한 제품의 첨가제로 사용할 수 있다.

본 발명의 건강식품으로는 상기 비피도박테리움 속 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 하는 차, 젤리, 즙, 엑기스, 음료 등의 장 기능 개선을 목적으로 하는 민간요법제를 들 수 있다. 이와 같이 다양한 형태로 가공된 본 발명의 질환 예방용 건강식품은 인체에 부작용이 없으면서 복용이 용이하고 장기간 보관이 가능하다.

본 발명의 상기 비피도박테리움 속 균주 또는 이의 배양액을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 균주 또는 이의 배양액을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시에는 본 발명의 상기 비피도박테리움 속 균주 또는 이의 배양액 원료 100 중량부에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없으므로 유효성분은 상기범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 본 발명의 상기 비피도박테리움 속 균주 또는 이의 배양액을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 얼음과자, 아이스크림류, 우유, 우유 대용품, 크림, 버터, 버터 밀크, 요구르트, 요거트, 치즈를 포함하는 낙농제품, 각종 수프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료, 유산균 제제 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

본 발명의 건강 음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스, 슈크로오스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 상기 비피도박테리움 속 균주 또는 이의 배양액 100 ㎖당 일반적으로 0.01 내지 0.04 g, 바람직하게는 약 0.02 내지 0.03 g이다.

상기 외의 본 발명의 상기 비피도박테리움 속 균주 또는 이의 배양액은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 프로바이오틱스는 천연 과일 주스, 과일 주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하지 않지만 본 발명의 균주 또는 이의 배양액은 100 중량부 당 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 본 발명을 실시예 및 제조예에 의하여 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 제조예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 실시예 및 제조예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 비피도박테리움 ( Bifidobacterium )의 분리 및 동정

본 발명자들은 내산 및 내담즙성이 우수한 비피도박테리아를 분리 및 동정하기 위해, 실험 대상자인 장수마을에 거주하는 건강하고 규칙적인 장 활동을 하는 80세 이상의 장수 노인의 분변을 수집하여 멸균 식염수에 십 배수로 순차적 희석을 하여 비피도박테리움의 선택 배지인 TP 배지(표 1)를 사용하여 균주를 분리하였다.

구체적으로, 혐기 배양을 위하여 Gas-pak을 사용한 Cold catalyst system(Palladium coated alumina pellets: BBL)을 이용하여 37℃에서 3일간 혐기 배양하였다. TP 배지에서 생성된 콜로니 중 일차적으로 Y 혹은 V자형 또는 곤봉형의 그람양성 간균을 선택하였고 편성 혐기성균을 재확인하였다.

비피도박테리움은 과당-6-인산 포스포케톨라아제(fructose-6-phosphate phosphoketolase; F-6-PPK)의 특이적 대사계를 통해 포도당으로부터 초산과 젖산을 1.5:1의 비율로 생성하므로 F-6-PPK 반응이 양성인 균주를 비피도박테리움 속으로 동정하였으며 이들 균주를 다시 API 50 CHL 동정 kit(bioMerieux Vitex, Inc, France)을 사용하여 선발균주의 탄수화물 발효 패턴을 결정하였고 Bergy's manual of systematic bacteriology 및 Roy와 Ward(Roy, D. and P. Ward. 1990. Evaluation of rapid methods for differentiation of Bifidobacterium species. J. Appl. Bacteriol. 69:739-749)에 의한 방법에 준하여 균주를 분석하였다.

최종적으로 16S rRNA 유전자의 염기서열을 Microseq 16S rRNA gene kit(Perkin Elmer Applied Biosystem)을 분석하여 동정한 후, 상기 균주를 그람 염색 후 광학 현미경과 전자현미경으로 형태를 확인하였다.

그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이 상기 선발된 두 균주는 그람양성을 나타내었으며, 도 2에 나타낸 바와 같이 전자현미경으로 관찰한 균의 형태는 비피도박테리움의 모양인 간균의 형태를 나타내었다.

또한, 16S rRNA의 BLAST 검색결과(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast), 서열번호 1로 기재되는 16S rRNA 서열(도 4)을 가지는 상기 선발된 균주는 비피도박테리움 롱검 아종 인판티스(Bifidobacterium longum subsp. infantis) ATCC 15697(T)와 99.67%의 상동성을 나타내었으며, 이에 본 발명에서 분리한 상기 균주를 비피도박테리움 롱검 아종 인판티스(Bifidobacterium longum ssp. infantis)BI9988로 명명하였으며(이하, BI9988), 상기 균주를 KCTC 12747BP(Bifidobacterium longum ssp. infantis BI9988)으로 한국생명공학연구원 미생물자원센터(Korean Collection of Type Culture, KCTC)에 국제기탁하였다.

TP 배지 성분

성분	양
Trypticase peptone (BBL)	10 g
Protease peptone No.3	5 g
Ammonium sulfate	3 g
KH₂PO₄	2 g
K₂HPO₄	1 g
L-cysteine.HCl.H₂O	0.5 g
MgSO₄	0.2 g
Agar	15 g
Sterilized 20% TOS¹ ⁾	50 mL
Sterilized 30% sodium propionate	50 mL
Distilled water	1ℓ

¹⁾Trans galacto oligo saccharide(pH 7.0)

< 실시예 2> 내산성(Acid resistance)의 확인

상기 <실시예 1>에서 분리한 비피도박테리움 균주의 내산성을 측정하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, 내산성 실험은 소화관 조건과 유사한 환경에서 측정하기 위하여 pH 3.0 배지에 1000 U/㎖의 펩신을 첨가한 인공 위액에서 실시하였다. 상기 분리한 균주 BI9988을 액체 배지에서 24 시간 배양한 후 원심 분리하여 세포를 회수하고 멸균 생리식염수로 3 회 세척하였다. 상등액과 동일한 양으로 인공위액을 첨가하여 비피도박테리움 배양 조건과 같은 조건에서 90 분 동안 반응시킨 후 대조군과 비교하여 희석하여 Bifidobacterium agar(Modified) 플레이트에 도말하여 생균수를 계수하였다.

그 결과, 표 2에 나타낸 바와 같이 본 발명에서 분리한 균주인 BI9988 및 BL9988의 내산성 및 내답즙성은 참조균주 ATCC15697 및 ATCC15707(Conway, P.L., S.L. Gorback, and B.R. Goldin. 1987. Survival of lactic acid bacteria in the human stomach and adhesion to intestinal cells. J. Dairy Sci. 70:1-12, Ibrahim, S.A. and Bezkorovainy, A. 1993. Survival of bifidobacteria in the presence of bile salt. J. Sci. Food Agric. 62 : 351-354)와 비교하여 높은 생존률을 나타내는 것을 확인하였다(표 2).

산성 조건에서 비피도박테리움 균주의 생존률

	pH 7.0	pH 5.0	생존률(%)
Bifidobacterium longum ssp. infantis BI9988	9.3×10⁸	9.0×10⁸	96.80%
Bifidobacterium longum ssp. infantis ATCC15697	2.1×10⁹	8.4×10⁸	40.00%

< 실시예 3> 내담즙성 (Bile acid resistance) 확인

상기 <실시예 1>에서 분리한 비피도박테리움 균주의 내담즙성을 측정하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, 내담즙성 실험은 인공 위액 조건에서 90 분 동안 처리된 각 비피도박테리움 배양액을 사용하였으며, pH 7.0 배지에 0.3% 담즙(돼지 담즙 추출액, Sigma) 및 1000 U/㎖ 트립신이 첨가된 인공 담즙액에서 실시하였다. 인공 위액 처리된 배양액을 원심분리 후 상등액과 동일한 양의 인공 담즙액을 첨가하여 90 분간 더 반응시킨 후 대조군과 비교하여 희석하여 Bifidobacterium agar(Modified) 플레이트에 도말하여 생균 수를 계수하여 내담즙성 정도를 측정하였다.

그 결과, 표 3에 나타낸 바와 같이 본 발명의 균주인 BI9988의 내담즙성은 참조 균주(ATCC15697(Ibrahim, S.A. and Bezkorovainy, A. 1993. Survival of bifidobacteria in the presence of bile salt. J. Sci. Food Agric. 62 : 351-354))와 비교하여 높은 내담즙성을 나타내는 것을 확인하였다(표 3).

0.25%의 담즙염(bile salt) 조건에서 비피도박테리움 균주의 생존률

	Bile 0.00%	Bile 0.25%	생존률(%)
Bifidobacterium longum ssp. infantis BI9988	9.3×10⁸	3.43×10⁸	36.90%
Bifidobacterium longum ssp. infantis ATCC15697	2.1×10⁹	1.00×10⁸	4.70%

< 실시예 4> 항생제 내성 확인

상기 <실시예 1>에서 분리한 비피도박테리움 균주의 항생제 내성을 측정하기 위하여 하기와 같이 ISO 가이드라인에 따라 측정하였다.

구체적으로, 항생제는 ISO 가이드라인(ISO10932:2010(E), Milk and milk products-Determination of the minimal inhibitory concentration(MIC) of antibiotics applicable to bifidobacteria and non-enterococcal lactic acid bacteria(LAB))에서 제시한 젠타마이신(gentamicin), 스트렙토마이신(streptomycin), 테트라사이클린(tetracycline), 에리스로마이신(erythromycin), 클린다마이신(clindamycin), 클로람페니콜(chloramphenicol), 암피실린(ampicillin) 및 밴코마이신(vancomycin)을 사용하여 표 4에 나타낸 범위대로 실험하였다. 실험하고자 하는 항생제를 2×로 제조하여 플레이트 배지에 50 ㎕ 씩 분주하여 두었다. 37℃에서 혐기적으로 48시간 배양한 본 발명의 비피도박테리움 균주 BI9988을 0.85% 생리식염수에 맥팔란트 탁도 1이 되도록 맞춘 후 2X 0.03% 시스테인(cystein) 함유 LSM 배지(Cappel, Aurora, OH, USA)(LSM-cys)에 500배 희석하였다. 이를 상기 항생제가 첨가된 LSM-cys 배지에 접종하여 37℃에서 48시간 동안 혐기적으로 배양하였다. 2일 후 본 발명의 비피도박테리움 균주 BI9988의 성장을 확인하여 최소저해농도(minimal inhibitory concentration; MIC)를 확정하였다. 항생제 내성 여부는 EFSA (European Food Safety Authority, 2012;10(6):2740)에서 정한 임계값에 따라 결정하였다.

그 결과, 표 5에 나타낸 바와 같이 본 발명의 균주인 BI9988는 다른 비피도박테리움 균주와 비교하여 모든 항생제에 대하여 민감도를 나타냄으로써 항생제 내성을 가지고 있지 않아 항생제 내성 전이의 위험이 없는 것으로 확인하였다.

본 발명의 비피도박테리움 균주의 MIC에 이용한 항생제 농도 범위

항생제	농도 범위 (㎍/mL)
엠피실린(Ampicillin)	0.032 ~ 16
벤코마이신(Vancomycin)	0.25 ~ 128
젠타마이신(Gentamicin)	0.5 ~ 256
스트렙토마이신(Streptomycin)	0.5 ~ 256
에르스로마이신(Erythromycin)	0.016 ~ 8
클린다마이신(Clindamycin)	0.032 ~ 16
테트라사이클린(Tetracycline)	0.125 ~ 64
클로람페니콜(Chloramphenicol)	0.125 ~ 64

본 발명의 비피도박테리움 균주 BI9988의 최소저해농도(MIC)

분리된 비피도박테리움 균주 샘플 번호	16SID결과	최소저해농도(MICs)
분리된 비피도박테리움 균주 샘플 번호	16SID결과	GEN	STR	TET	ERY	CLI	CHL	AMP	VAN
1	본 발명의 비피도박테리움 BI9988(KCTC12747BP)	2	2	1	0.063	0.032	0.5	1	0.5
2	B. longum subsp. infantis	16	8	2	1	0.063	2	4	0.25
3	B. longum subsp. infantis	32	8	2	0.5	0.063	2	0.5	0.5
4	B. longum subsp. infantis	8	8	1	0.25	0.032	2	1	0.5
5	B. longum subsp. infantis	32	4	0.5	0.25	0.032	1	0.5	0.5
6	B. longum subsp . infantis	16	32	0.5	0.5	0.032	2	0.25	0.5
7	B. longum subsp . infantis	32	16	>64	0.25	0.032	2	0.25	0.5
8	B. longum subsp . Infantis	32	1	1	0.125	0.032	2	0.25	0.25
9	B. longum subsp . infantis	32	32	1	0.25	0.063	2	0.5	0.25
10	B. longum subsp . infantis	16	16	1	0.5	0.032	4	0.125	0.25
11	B. longum subsp . infantis	4	8	1	0.125	0.032	1	0.25	0.25
12	B. longum subsp . infantis	32	32	1	0.5	>16	2	0.5	0.5
13	B. longum subsp . longum	8	4	4	0.125	0.032	1	0.5	0.25
14	B. longum subsp . longum	8	4	1	1	0.032	4	0.25	0.25
15	B. longum subsp . longum	1	8	1	0.25	0.032	4	0.125	0.25
16	B. longum subsp . longum	2	8	1	0.016	0.032	4	0.032	0.25
17	B. longum subsp . longum	32	16	64	0.125	0.032	4	0.125	0.25
18	B. longum subsp . longum	2	2	0.5	0.125	0.032	1	0.032	0.25
19	B. longum subsp . longum	16	32	0.5	0.5	0.032	2	2	0.25
20	B. longum subsp . longum	2	4	1	0.25	0.032	0.25	0.063	1
21	B. longum subsp . longum	4	16	1	0.5	0.063	2	0.5	0.25
22	B. faecale	16	64	0.5	0.25	0.032	1	0.063	0.25
23	B. pseudocatenulatum	2	2	0.5	0.125	0.032	0.25	0.063	0.5
24	B. pseudocatenulatum	4	8	0.5	4	1	1	0.25	0.5
25	B. adolescentis	4	16	0.25	0.25	0.063	1	0.063	0.25
26	B. adolescentis	4	32	0.5	0.125	0.032	1	0.125	0.25
	B.longum(ATCC 참조균주)	16	16	0.5	0.25	0.063	1	0.25	0.5
비피도박테리움(Bifidobacterium)의 최소저해농도 임계값(cut-off values)		64	128	8	1	1	4	2	2

(GEN: 젠타마이신, STR: 스트렙토마이신, TET: 테트라사이클린, ERY: 에르스로마이신, CLI: 클린다마이신, CHL: 클로람페니콜, AMP: 암피실린, VAN: 밴코마이신)

< 실시예 5> 베타글루코시데이즈 (β- Glucosidase ) 활성 확인

베타글루코시데이즈(β-Glucosidase)는 배당체를 분해하는 효소로 배당체가 분해되면 당과 비배당체 부분으로 나뉘어진다. 섭취된 식품 중 배당체는 분해되면 반응성이 증가하고 분해된 배당체는 반응성이 증가하면서 체내 흡수가 증가되는 것으로 알려져 있다. 특히 아미그달린(amygdalin)과 같은 청산 배당체와 쿠마린 배당체는 분해 후 독성기가 유리되어 너무 많은 양이 생성되면 바람직하지 않다.

본 발명자들은 상기 <실시예 1>에서 분리한 비피도박테리움 균주의 안전성을 확인하기 위하여 비피도박테리움이 가질 수 있는 발암성 효소 베타글루코시데이즈의 활성을 조사하였다.

구체적으로, 베타글루코시데이즈의 활성 확인은 Ferhak 및 Pey(Ferhak J. D. and Pey E.K., 1983. Effect of glucose and other sugars on the β-1,4-glucosidase of Thermonospora fusca. Biotech. Bioeng. 25:2855-2864)의 방법을 이용하여 측정하였다. TP 배지에 약 12시간 본 발명의 균주를 배양한 뒤 원심분리하여 균체를 수집하고 0.1 M의 인산완충용액(pH 6.0)으로 두 번 세척한 뒤 아세톤-톨루엔(acetone-toluene)(9:1)이 1/50(v/v) 포함된 동일한 인산완충용액 0.4 ㎖에 현탁시켰다. 여기에 기질 PNPG(p-nitro-phenyl-β-D-glucopyranoside)를 최종농도가 1 mM 되도록 넣어준 뒤 45℃에서 일정시간 반응을 시켰다. 반응을 정지시키기 위해 0.5 M Na₂CO₃를 0.6 ㎖ 첨가하였고 이때 유리되는 PNP(p-nitrophenol)의 양을 400 nm에서 흡광도로 측정하였다. 여기서 1 unit는 45℃에서 1분간 유리되는 PNP의 μmole 수로 정의하였다.

그 결과, 본 발명의 균주인 BI9988는 베타글루코시데이즈(β-Glucosidase)의 활성이 검출되지 않은 것을 확인하였다.

< 실시예 6> 식중독균 억제능 확인

상기 <실시예 1>에서 분리한 비피도박테리움 균주의 식중독균 억제능을 측정하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, 상기 균주 BI9988의 TP 배양 여액과 2배 농도의 BHI (Brain Heart Infusion) 배지에 대장균(Escherichia coli O157:H7, CCARM 0012), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium, CCARM 8001), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis, CCARM 8010), 리스테리아 모노시토제네스(Listeria monocytogenes, CCARM 0019), 황색포도상구균 (Staphylococcus aureus B, CCARM 0045), 비브리오 파라헤모리티쿠스 (Vibrio parahaemolyticus, CCARM 7001)을 최종농도가 1% 되도록 접종하여 37℃에서 배양하였다. 24시간 후 배양액 내의 각각의 식중독균의 수를 최확수법(most probable number method; MPN)으로 측정하였다. 이때 리스테리아 모노시토제네스는 혈액 한천배지에, 살모넬라 티피무리움, 살모넬라 엔테리티디스, 에로모나스 히드로필라 및 대장균 O157:H7는 MacConkey 배지에 접종하여 생균 수를 측정하였다. 본 발명의 균주인 BI9988의 배양 여액에 대한 상기 식중독 균주 성장 생균 수(Colony forming unit; CFU)를 측정하여 로그(log) 값으로 나타내었다.

그 결과, 표 6에 나타낸 바와 같이 본 발명의 균주와 함께 배양된 식중독 균의 생존률이 낮아진 것으로 보아, 본 발명의 균주인 BI9988은 식중독균을 억제하는 물질들을 생산하여 식중독균의 성장을 억제하는 것을 확인하였다(표 6). 이와 같이, 본 발명의 균주는 식중독을 유발하는 균주의 성장을 억제하는 물질들을 생산함을 확인할 수 있었다.

본 발명의 비피도박테리움 균주 BI9988 배양액의 각종 식중독균의 억제능

균주	식중독균 (log CFU/ml)
균주	0 hr	24 hr
대장균(E. coli O157:H7, CCARM 0012)	7.2	7.69
대장균(E. coli O157:H7, CCARM 0012)+ BI9988 배양액	6.51	6.31
살모넬라 티피무리움(Sal . typhimurium , CCARM 8001)	7.3	9.34
살모넬라 티피무리움(Sal . typhimurium , CCARM 8001)+ BI9988 배양액	7.62	7.81
살모넬라 엔테리티디스(Sal . enteritidis , CCARM 8010)	7.39	9.25
살모넬라 엔테리티디스(Sal . enteritidis , CCARM 8010)+ BI9988 배양액	7.04	7.14
리스테리아 모노시토제네스(Lis . monocytogenes , CCARM 0019)	6.9	9.04
리스테리아 모노시토제네스(Lis . monocytogenes , CCARM 0019)+ BI9988 배양액	6.95	8.69
황색포도상구균 (Staph. aureus B, CCARM 0045)	7	9.11
황색포도상구균 (Staph. aureus B, CCARM 0045)+ BI9988 배양액	7.2	8.03
비브리오 파라헤모리티쿠스 (Vibrio parahaemolyticus, CCARM 7001)	6.78	8.56
비브리오 파라헤모리티쿠스 (Vibrio parahaemolyticus, CCARM 7001)+ BI9988 배양액	6.79	7.15

< 실시예 7> 혐기성 세균 성장 억제능 확인

감염증 치료를 위해 다량의 항생제 섭취나 장기간의 항생제 치료시 장내 유산균의 수가 감소하면 장내에 소수로 존재하던 혐기성 세균인 클로스트리디움 디피실(Clostridium difficile) 균주가 압도적으로 증가하게 된다. 클로스트리디움 디피실은 설사 등의 장염을 유발하여 항암환자의 치료를 더욱 어렵게 만든다. 따라서 상기 <실시예 1>에서 분리한 균주 BI9988의 클로스트리디움 디피실 억제능력을 측정하였다.

구체적으로, 클로스트리디움 디피실을 헤민(Hemin, 0.01 g/ℓ) 및 L-시스테인(0.5 g/ℓ)이 함유된 Thio-glycolate 액체배지에 접종하고 37℃에서 48시간 혐기적으로 배양하였다. 상기 배양한 클로스트리디움 디피실(CCARM 0007)의 최종농도가 1% 되도록 BHI-Cys 배지에 접종한 후, BI9988의 배양 여액과 2배 농도의 상기 클로스트리디움 디피실이 접종된 BHI-Cys 배양액을 동량 혼합하여 배양액 위에 파라핀 오일을 덮어 혐기적으로 37℃에서 배양하였다. 24 시간 후 배양액을 희석하여 혈액 한천배지에 접종하여 혐기적 배양기에서 37℃, 48시간 배양한 후 클로스트리디움 디피실의 생균 수를 측정하였다.

그 결과, 표 7에 나타낸 바와 같이 본 발명의 균주와 함께 배양된 경우 클로스트리디움 디피실의 생존률이 낮아진 것으로 보아 본 발명의 균주인 BI9988은 클로스트리디움 디피실의 성장을 억제하는 것을 확인하였다(표 7).

본 발명의 비피도박테리움 균주 BI9988의 배양액의 클로스트리디움 디피실(Clostridium difficile)의 억제능.

	클로스트리디움 디피실(CFU/ml )
클로스트리디움 디피실(Clostridium difficile CCARM 0007)(pH 7.0 BHI)	1.7×10⁵
클로스트리디움 디피실(Clostridium difficile CCARM 0007)(pH 7.0 BHI)+ Bifidobacterium longum ssp. infantis BI9988	0.7×10⁶
클로스트리디움 디피실(Clostridium difficile CCARM 0007)(pH 5.8 BHI)	4.3×10⁵
클로스트리디움 디피실 (Clostridium difficile CCARM 0007)+ Bifidobacterium longum ssp. infantis BI9988	2.2×10⁵

< 실시예 8> 대식세포(Macrophage) 면역 활성에 미치는 영향 확인

인체에 침투한 외부의 해로운 물질을 인식하고 대응하는 것이 면역계로, 특이적 면역에 대응하는 인체의 세포는 B세포, T세포, 대식세포(macrophage) 등을 들 수 있다. 비피도박테리움(Bifidobacterium)은 면역세포인 대식세포를 직접 활성화하고 이로 인해 사이토카인(cytokine) 등의 생산을 증가시키는 것으로 보고되어 있다(Yasui, H. and M. Ohwaki. 1991. Enhancement of immune responses in Peyer's patch cells cultured with Bifidobacterium breve. J. Dairy Sci. 74:1187-1195; Hatcher, G.E. and R.S. Lambrecht. 1993. Augmentation of macrophage phagocytic activity by cell-free extracts of selected lactic acid-producing bacteria. J. Dairy Sci. 76: 2485-2492). 비피도박테리아의 면역 자극물질로는 세포벽의 구성성분인 펩티도글리칸(peptidoglycan)과 세포 내외에 있는 다당류(polysaccharide) 등이라는 주장이 있다. 이러한 면역자극은 외부에서 침입한 병원성 세균의 사멸 및 병원성 세균 감염에 대한 저항을 강화시키며, 활성화된 대식세포에서 생산된 TNF-α(tumor necrosis factor) 또는 IL(interleukin)-6와 같은 여러 종류의 매개물질을 통해 면역조절에 관여한다(Laskin, D.L. and J. Pendino. 1995. Macrophages and inflammatory mediators in tissue injury. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 35:655-677). TNF-α는 암세포 파괴능을 지니며 호중구 활성으로 염증반응을 유도하며 혈관 내피세포에 작용하여 백혈구 부착 항진과 다른 사이토카인(cytokine)을 생성하고 IL-6는 활성화 B세포의 분화과정에 관여한다.

이에, 본 발명자들은 상기 <실시예 1>에서 분리한 본 발명의 비피도박테리움 균주인 BI9988의 면역 활성능을 측정하기 위해 상기 균주에 의한 대식세포주(Macrophage cell line) RAW 264.7 세포(American Type Tissue Collection)의 IL-1, IL-6, TNF-α 생산능력을 확인하였다.

구체적으로, RAW 264.7 세포를 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM, Gibco Lab., Chagrin falls, IL)에서 37℃, 5-8% CO₂ 상태에서 2-3일 배양하고, 세포의 최종 농도가 5×10⁵ cells/mL이 되도록 조절하여 96 well flat-bottomed tissue culture plate(Corning, New York)에서 3회 반복 배양하였다. TNF-α와 IL-6의 정량은 Dong의 방법(Dong, W., J.I. Azona-Olivera, K.H. Brooks, J.E. Linz, and J.J. Pestka. 1994. Elevated gene expression and production of interleukins-2, 4, 5, and during exposure to vomitoxin(deoxyhivalene) and cycloheximide in the EL-4 thymoma. Toxicol. Appl. Pharmacol. 127:282-290)을 변형하여 이용하였다. 순수분리된 rat anti-TNF-α나 IL-6 항체(PharMingen., SanDiego, CA)를 함유한 IL-coating buffer를 50 ㎕씩 microtiter strep well(Immunolon Removawell: Dynatech Laboratories Inc., Chantilly, VG)에 분주한 후 4℃에서 하룻밤 동안 방치하였다. PBST(phosphate buffered saline containing Tween 80) 용액을 이용하여 세척하고 30% BSA-PBST를 이용하여 block을 시켰다. 37℃에서 30분간 방치한 후 다시 세척하고 미리 배양해 두었던 대식세포와 BI9988 배양여액을 50 uL 씩 첨가하였다. 37℃에서 한 시간 반응 후 biotinylated rat anti TNF-α나 IL-6 항체를 50 uL 씩 첨가하여 상온에서 한 시간동안 반응시킨 후 streptavidin peroxidase를 첨가하여 다시 한 시간 반응시켰다. 여기에 기질로써 TMB(3,3',5,5-tetramethylbenzidine)을 첨가하고 상온에서 방치한 후 색이 변화하면 6 N H₂SO₄를 첨가하여 반응을 정지시키고 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 표 8에 나타낸 바와 같이 본 발명의 균주의 배양 여액을 첨가한 경우 참조 균주의 배양 여액을 첨가한 경우에 비해 대식세포로부터 사이토카인(TNF-α, IL-1 및 IL-6)의 분비가 활성화된 것으로 보아 본 발명의 균주인 BI9988은 대식세포의 면역활성을 증대시키는 것을 확인하였다(표 8).

대식세포 Raw 264.7에 의한 TNF-α, IL-1 및 IL-6 생산에 있어서 본 발명의 비피도박테리움 균주 BI9988의 영향(ng/mL).

	IL-1	IL-6	TNF-α
대식세포	1.89E-06	0.473	16.564
B. longum ssp . longum ATCC 15707	8.163	-	45.46
B. longum ssp . infantis ATCC 15697	0.39	-	38.266
B. longum ssp . infantis BI9988	503.16	2.629	47.239

< 실시예 9> 대장 상피세포( HT29 -MTX cell)에 대한 부착능 확인

상기 <실시예 1>에서 분리한 균주의 대장 상피세포(HT29-MTX cell)에 대한 부착능을 측정하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, HT29-MTX 세포를 10%(v/v) heat-inactivated fetal bovine serum과 항생제 혼합물이 첨가된 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM) 배지에서 배양하였다. 이때 항생제는 최종적으로 50 mg/mL penicillin, 50 mg/mL streptomycin, 50 mg/mL gentamicin 및 1.25 mg/mL amphotericin B 되도록 하였다. HT29-MTX 세포는 30 mm 배양접시에 1 x 10⁵cells/mL 가 되도록 심고 37℃에서 14일 동안 5% CO₂ 배양기에서 포화상태(약 1 x 10⁷ cells/mL)로 배양하였다. 모든 실험은 세 번 반복하였다. 비피도 균주 배양액은 원심분리로 수거하고 Dulbecco’s PBS buffer(Sigma) 로 두 번 세척한 후 항생제가 들어있지 않은 DMEM 에 세균:장 세포가 10:1이 되도록 현탁시켰다. 항생제를 제거하기 위해 HT29-MTX 단일층을 Dulbecco’s PBS로 두 번 세척한 후 비피도 균주를 첨가하였다. 이 후 37℃, CO₂ 배양기에서 1시간 동안 방치한 후 상등액을 버리고 각 well을 Dulbecco’s PBS buffer로 부드럽게 세 번 세척하여 부착되지 않은 세균을 제거하였다. 세포를 4% 고정액(35% formaldehyde 100 mL, Na₂HPO₄ 16 g, NaH₂PO₄·H₂O 4g with distilled water to 1 L)으로 고정하고, 비피도 세균은 그람염색하여 광학 현미경으로 관찰하였다.

세포에 부착된 비피도 세균 수를 세기 위해서는 먼저 세포와 비피도 균주를 0.1% TritonX-100로 배양접시로부터 떼어내고, 이것을 연속 희석하여 100 uL 씩 MRSC 고체 배지에 스프레딩 방법으로 접종하였다. 이후 혐기 조건에서 2일간 배양하여 CFU를 계수하였다. 모든 실험은 세 번 반복하였고, 얻은 데이터는 SPSS 11.0 software for Windows (SPSS Inc., Chicago, IL, USA)로 분석하였다(Gonzalez de los Reyes-Gavilan, Clara et al., 2011. Adhesion of bile-adapted Bifidobacterium strains to the HT29-MTX cell line is modified after sequential gastrointestinal challenge simulated in vitro using human gastric and duodenal juices. Res. Microbiol. 162:514-519; Kainulainena V., J. Reunanena, K. Hiippalaa, S. Guglielmettib, S. Vesterlundc, A. Palvaa and R. Satokaria. 2013. BopA does not have a major role in the adhesion of Bifidobacterium bifidum to intestinal epithelial cells, extracellular matrix proteins, and mucus. Appl. Environ. Microbiol. 79:6989-6997).

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이 그람 염색 후 광학현미경으로 관찰했을 때 본 발명의 균주인 BI9988 은 장 세포주인 HT29-MTX 세포에 결합이 잘 되는 것이 관찰되었다(도 3). 또한, 표 9에 나타낸 바와 같이 하나의 well의 HT29-MTX 세포들에 부착된 Bifidobacterium longum ssp. infantis BI9988의 수를 나타내었으며, 세포에 균들이 잘 부착된 것을 확인하였다(표 9).

한 개의 well 안에서 자란 HT29-MTX 세포에 결합된 Bifidobacterium longum ssp. infantis BI9988 의 수

	한 개의 well안의 세포에 부착된 세균 수
Bifidobacterium longum ssp. longumATCC 15707	1x10⁴ CFU/well
Bifidobacterium longum ssp. infantis ATCC 15697	1x10⁴ CFU/well
Bifidobacterium longum ssp. infantis BI9988	1x10⁶CFU/welll

< 실시예 10> 콜레스테롤 억제능 확인

유산균이 혈중 콜레스테롤을 저하시킬 수 있다는 다수의 보고가 있다. 시험관 내에서, 유산균이 콜레스테롤이 첨가된 배지에서 자라면서 콜레스테롤을 소화분해 또는 흡착한다는 보고(Gilliland, S.E., C.R. Nelson and C. Maxwell. 1985. Assimilation of Cholesterol by Lactobacillus acidophillus. Appl. Environ. Microbio. 49:377-381)가 있으며, 유산균이 담즙염 가수분해효소(bile salt hydrolase)를 분비함으로써 소장으로 분비되는 담즙산을 탈접합(deconjugation)시켜서 글라이신(glycine)이나 타우린(taurine)이 분리된 유리 담즙산(bile acid)으로 전환되는 것이 확인되고 있으며(Klaver, F.A.M. and R. van der Meer. 1993. The assumed assimilation of cholesterol by Lactobacilli and Bifidobacterium bifidum is due to their bile salt deconjugating activity. Appl. Environ. Microbio. 59:1120-1124), 유리된 담즙산은 접합된 담즙산보다 재흡수력이 떨어지므로써, 결론적으로 콜레스트롤을 흡수시키는 담즙산이 줄어들어 재흡수되는 콜레스테롤량이 적어지고 따라서 간의 콜레스테롤 수요를 증가시킴으로써 혈중 콜레스테롤의 함량이 적어진다는 보고가 있다.

이에 본 발명자들은, 상기 <실시예 1>에서 분리한 비피도박테리움 균주에 의한 콜레스테롤 억제능(분해능)을 확인하기 위하여 루델과 모리스 (Rudel L.L., M.D. Morris. Determination of cholesterol using o-phthalaldehyde. J. Lipid Res. 1973, 14:364-366)의 방법으로 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, 가용성 콜레스테롤(7.2 mg)이 함유된 MRS-Cys 배지에 상기 본 발명의 비피도박테리움 균주를 37℃에서 배양하였다. 24시간 배양한 후 원심분리하여(4℃, 13,000 rpm) 0.5 ml의 상등액을 분리하고 분리된 상등액을 50% KOH 2 mL와 95% 에탄올 3 mL를 첨가하여 60℃에서 10분간 유지하였다. 이것을 냉각한 후 5 mL의 헥산(hexane)을 첨가하여 잘 혼합하고 다시 3 mL의 증류수를 첨가한 후 잘 섞어주었다. 이것을 상온에서 15분간 방치하여 층이 분리되면 헥산 층을 질소가스를 이용하여 60℃에서 증발시키고 o-phthaladehyde reagent(0.5 mg o-phthalaldehyde/glacial acetic acid 1 mL) 4 mL를 첨가하고 10분간 방치하였다. 여기에 진한 황산 2 ml를 천천히 첨가하여 잘 섞어주고 10분 후 550 nm에서 흡광도(Optical Density)를 측정하여 잔존하는 콜레스테롤의 함량을 나타내었다.

그 결과, 표 10에 나타낸 바와 같이 본 발명의 균주가 첨가된 경우 참조 균주가 첨가된 경우보다 배지 내 잔존하는 콜레스테롤의 함량이 줄어든 것으로 보아 본 발명의 균주인 BI9988 균주는 콜레스테롤의 억제능(분해능)이 뛰어난 것을 확인하였다(표 10).

본 발명의 비피도박테리움 균주 BI9988의 콜레스테롤 억제능.

	MRS	MRS+Bile
Bifidobacterium longum ssp. longum ATCC 15707	5.75 mg	6.00 mg
Bifidobacterium longum ssp. infantis ATCC 15697	5.49 mg	5.49 mg
Bifidobacterium longum ssp. infantis BI9988	4.47 mg	5.49 mg

* 7.2 mg의 콜레스테롤을 첨가한 후 남은 콜레스테롤 함량.

< 제제예 1> 식품의 제조

본 발명의 비피도박테리움 BI9988 균주 및 이의 배양액을 포함하는 식품들을 다음과 같이 제조하였다.

<1-1> 조리용 양념의 제조

조리용 양념 100 중량부에 본 발명의 비피도박테리움 BI9988 균주 및 이의 배양액 1 내지 12 중량부로 혼합하여 장 기능 개선용 조리용 양념을 제조하였다.

<1-2> 스프 및 육즙(gravies)의 제조

본 발명의 비피도박테리움 BI9988 균주 및 이의 배양액 1 내지 12 중량부를 스프 및 육즙 100 중량부에 첨가하여 장 기능 개선용 육가공 제품, 면류의 스프 및 육즙을 제조하였다.

<1-3> 유제품(dairy products)의 제조

본 발명의 비피도박테리움 BI9988 균주 및 이의 배양액 1 내지 12 중량부를 우유 100 중량부에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.

<1-4> 선식의 제조

본 발명의 비피도박테리움 BI9988 균주 및 이의 배양액을 진공 농축기에 감압, 농축하고 분무, 열풍 건조기로 건조하여 얻은 건조물을 분쇄기로 입도 60 메쉬로 분쇄하여 건조분말을 얻었다.

상기에서 제조한 곡물류, 종실류, 및 본 발명의 비피도박테리움 BI9988 균주 및 이의 배양액을 배합하여 선식을 제조하였다.

< 제제예 2> 음료의 제조

<2-1> 탄산음료의 제조

설탕 5 내지 10 중량부, 구연산 0.05 내지 0.3 중량부, 카라멜 0.005 내지 0.02 중량부, 비타민 C 0.1 내지 1 중량부, 본 발명의 비피도박테리움 BI9988 균주 및 이의 배양액 10 중량부의 첨가물을 혼합하고 여기에 PL9039 내지 94 중량부의 정제수를 섞어서 시럽을 만들고, 상기 시럽을 95 내지 98℃에서 20 내지 180 초간 살균하여 냉각수와 1:4의 비율로 혼합한 다음 탄산가스를 0.5 내지 0.82 중량부를 주입하여 탄산음료를 제조하였다.

<2-2> 기능성 음료의 제조

비타민 C 0.1 중량부, 과당 5.8 중량부, 백설탕 3.8 중량부, 구연산 0.12 중량부, 사과산 0.03 중량부, 구연산 나타륨 0.04 중량부 및 치자청색소 0.02 중량부에 본 발명의 비피도박테리움 BI9988 균주 및 이의 배양액 10 중량부를 배합하여 계량된 물에 완전히 용해시켰다. 상기 용해된 음료를 총량이 100 중량부가 되도록 계량된 정제수로 조정하였다.

<2-3> 건강 음료의 제조

액상과당 0.5 중량부, 올리고당 2 중량부, 설탕 2 중량부, 식염 0.5 중량부, 물 75 중량부과 같은 부재료와 본 발명의 비피도박테리움 BI9988 균주 및 이의 배양액 10 중량부를 균질하게 배합하여 순간 살균을 한 후 이를 유리병, 패트병 등 소포장 용기에 포장하여 건강 음료를 제조하였다.

<2-4> 야채 주스의 제조

본 발명의 비피도박테리움 BI9988 균주 및 이의 배양액의 진공건조물 10 g을 토마토 또는 당근 주스 1 ℓ에 가하여 건강 증진용 야채 주스를 제조하였다.

<2-5> 과일 주스의 제조

본 발명의 비피도박테리움 BI9988 균주 및 이의 배양액의 진공건조물 10 g, 을 사과 또는 포도 주스 1 ℓ에 가하여 건강 증진용 과일 주스를 제조하였다.

< 제제예 3> 발효유의 제조

탈지분유를 이용하여 무지유 고형분 함량을 8 내지 20 중량부로 조정한 원료유를 72 내지 75℃에서 15초간 살균하였다. 살균된 원료유를 일정 온도까지 냉각시킨 후 비피도박테리움 BI9988 균주를 10⁶ CFU/㎖의 농도로 접종하여 pH 4 내지 5가 될 때까지 배양하였다. 배양완료 후 배양액을 냉각시켰다. 과즙농축액 0.1 내지 50 중량부, 식이섬유 0.1 내지 20 중량부, 포도당 0.5 내지 30 중량부, 올리고당 0.1 내지 15 중량부, 칼슘 0.001 내지 10 중량부, 비타민 0.0001 내지 5 중량부 등을 녹여 시럽을 제조하였다. 이렇게 제조된 시럽을 살균한 후 냉각하여 상기 배양액과 일정 비율로 혼합, 교반하여 균질화시킨 용기에 포장하여 발효유를 제조하였다.

< 제제예 4> 유산균 균말의 제조

비피도박테리움 BI9988 균주를 MRS 배지에 10⁶ CFU/㎖의 농도로 접종하여 37℃에서 18 내지 24 시간 동안 pH-조절 발효(pH-control fermentation)를 실시하였다. 배양완료 후 4℃에서 10,000 × g로 원심분리하여 균체를 회수하였다. 회수된 균체는 5% 스킴 밀크(skim milk)에 2.5% 유장(whey), 5% 수크로오스(sucrose)가 함유된 보호제와 동량으로 혼합된 후 동결건조기를 통해 분말화하였다. 이렇게 제조된 비피도박테리움 BI9988의 건조분말을 트레할로스로 희석하여 1 ×10¹¹ CFU/g 이상의 생균수를 갖도록 제조하였다.

< 제제예 5> 유산균 제제의 제조

<제제예 4>에서 제조한 유산균 균말을 이용하여 유산균 식품, 정장제 등의 유산균 제제를 제조하였다. 비피도박테리움 BI9988의 건조 분말(생균수 1 ×10¹⁰ CFU/g 이상) 20 중량부에 올리고당 10 중량부, 무수포도당 20 중량부, 결정과당 5 중량부, 비타민 C 2 중량부, 과일분말향 5 중량부, 알로에 5 중량부, 식이섬유 15 중량부, 차전자피 18 중량부를 혼합하여 스틱 또는 병에 일정량 분주하여 포자하였다. 이렇게 제조된 유산균 제제는 5 ×10⁸ CFU/g 이상의 생균수를 유지하였다.

한국생명공학연구원

KCTC12747BP

20150122

<110> LEE, Yeonhee <120> Bifidobacterium longum ssp. infantis BI9988 isolated from Korean longevity village and having high nutraceutical activities <130> 2015P-01-027 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 613 <212> DNA <213> Bifidobacterium longum subsp. infantis <400> 1 ggctttgctt ggtggtgaga gtggcgaacg ggtgagtaat gcgtgaccga cctgccccat 60 acaccggaat agctcctgga aacgggtggt aatgccggat gctccagttg atcgcatggt 120 cttctgggaa agctttcgcg gtatgggatg gggtcgcgtc ctatcagctt gacggcgggg 180 taacggccca ccgtggcttc gacgggtagc cggcctgaga gggcgaccgg ccacattggg 240 actgagatac ggcccagact cctacgggag gcagcagtgg ggaatattgc acaatgggcg 300 caagcctgat gcagcgacgc cgcgtgaggg atggaggcct tcgggttgta aacctctttt 360 atcggggagc aagcgtgagt gagtttaccc gttgaataag caccggctaa ctacgtgcca 420 gcagccgcgg taatacgtag ggtgcaagcg ttatccggaa ttattgggcg taaagggctc 480 gtaggcggtt cgtcgcgtcc ggggtgaaag tccatcgctt aacggtggat ccgcgccggg 540 tacgggcggg cttgagtgcg gtaggggaga ctggaattcc cggtgtaacg gtggaatgtg 600 tagatatcgg gaa 613

Claims

수탁번호 KCTC 12747BP로 기탁된 신규한 비피도박테리움 롱검 아종 인판티스(Bifidobacterium longum ssp. infantis) 균주.
제 1항에 있어서, 상기 균주는 서열번호 1로 기재되는 16S rRNA 서열을 가지는 균주.
제 1항의 균주, 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 생균제 조성물.
삭제
제 3항에 있어서, 상기 균주 또는 이의 배양액은 항균 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 생균제 조성물.
제 3항에 있어서, 상기 균주 또는 이의 배양액은 내산성 및 내담즙성이 우수한 것을 특징으로 하는 생균제 조성물.
제 3항에 있어서, 상기 균주 또는 이의 배양액은 장 세포 부착능이 우수한 것을 특징으로 하는 생균제 조성물.
제 3항에 있어서, 상기 균주 또는 이의 배양액은 면역증강 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 생균제 조성물.
제 3항에 있어서, 상기 균주 또는 이의 배양액은 면역세포의 TNF-α, IL-6, 또는 IL-1β의 분비를 증가시켜 면역증강 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 생균제 조성물.
제 3항에 있어서, 상기 균주 또는 이의 배양액은 콜레스테롤을 억제하는 것을 특징으로 하는 생균제 조성물.
제 1항의 균주, 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 건강식품.
제 11항에 있어서, 상기 균주 또는 이의 배양액은 장내 병원성 미생물 성장 억제를 통한 장 건강 활성을 증진시키는 것을 특징으로 하는 건강식품.
제 11항에 있어서, 상기 식품은 아이스크림류, 우유, 두유, 요구르트, 치즈를 포함하는 유제품, 및 두유제품, 육류, 소세지, 빵, 초콜릿 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 각종 수프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료, 캡슐 또는 스틱 포장의 유산균 제제로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 건강식품.