CN105758834A - 一种激光诱导与ccd采集的生物芯片检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种激光诱导与CCD采集的生物芯片检测方法，提供生物芯片二维扫描装置以及CCD相机这几个部分，具有固定功率的激光光源发射出激光通过二维扫描振镜的控制在生物芯片的X方向和Y方向按照一定的规律进行二维扫描，激光在二维扫描振镜的工作下斜向45度照射到生物芯片平面，并且激发CY3或者CY5荧光染料产生荧光信号通过冷却型CCD相机的成像和多像素并行积分的方式对信号进行采集。本发明所提出的方法既避免了激光共聚焦方法的复杂光路和高压氙气灯的照明问题，也能够保证较高的检测速度和灵敏度。

Description

一种激光诱导与CCD采集的生物芯片检测方法

技术领域

本发明涉及生物芯片检测，特别是一种激光诱导与CCD采集的生物芯片检测方法。

背景技术

专利(申请号：CN200410009044.7)提出一种具有光强实时检测的生物芯片检测方法以及检测系统，使得生物芯片检测系统在检测过程中出现光源光强变动情况时能及时被检测出处理使得检测数据准确。专利(申请号：CN03112771.1)提出一种低密度生物芯片检测系统，结合激发光系统、荧光信号收集系统和信号检测系统，主要关键技术是用光导纤维束将芯片上产生的荧光信号收集到光电倍增管表面并转化成电信号，得出一种成本低、适用于检测低密度生物芯片荧光信号的方法。专利(申请号：CN201110398112.3)提出一种生物芯片检测装置及生物芯片检测方法，藉由判断辨识信息来确定生物芯片是否可进行检测，并透过控制器自动调整检测模块的设定减少错误。

上述常见的生物芯片检测方法大致有两种，其中一种是采用激光共聚焦扫描和光电倍增管采集的方式进行生物芯片检测，但是该种方法由于将扩束后的激光聚焦到只有几微米级别的斑点，并且依靠二维扫描装置对生物芯片进行扫描所以会导致一个比较令人担心的问题那就是检测的速度比较慢。另一种方法则是采用基于冷却型CCD和高压氙气灯的检测方式，但是该种检测方法有一个比较严重的缺点就是它的扫描灵敏度比较低还有一个问题就是它所采用的高压氙气灯的照明光源寿命比较短。

发明内容

本发明的目的在于提供一种采用激光扩束的平行光并经振镜扫描和冷却型CCD采集受激荧光相结合的生物芯片检测方法，以克服现有技术中存在的缺陷。

为实现上述目的，本发明的技术方案是：一种激光诱导与CCD采集的生物芯片检测方法,提供一包括一CCD相机以及一对设置于所述CCD相机两侧的第一振镜以及第二振镜的激光诱导CCD采集扫描仪；通过所述第一振镜以及所述第二振镜控制具有固定功率的激光光源发射出激光，沿X方向和Y方向在设置于所述CCD相机正下方处的生物芯片的进行二维扫描，且激光在所述第一振镜以及所述第二振镜的控制下照射到生物芯片平面，并且激发所述生物芯片内的荧光染料产生荧光信号；所述CCD相机通过成像以及多像素并行积分的方式对所述荧光信号进行采集，并将所采集的图像传输至与所述CCD相机相连的计算机。

在本发明一实施例中，所述CCD相机包括由下至上依次设置的收光镜头以及冷却型CCD相机；所述收光镜头包括微距镜头以及窄带镀膜滤光片。

在本发明一实施例中，所述第一振镜以及所述第二振镜相互成90度正交设置。

在本发明一实施例中，激光在所述第一振镜以及所述第二振镜的控制下斜向45度照射到生物芯片平面。

在本发明一实施例中，所述第一振镜以及所述第二振镜均为高速振镜，且均与高速振镜驱动电路相连；所述高速振镜驱动电路依次与放大减法电路、控制电路以及所述计算机相连。

在本发明一实施例中，所述激光光源中的平行光激光器激光束经准直扩束，通过正方形光阑形成矩形光斑分别在所述第一振镜以及所述第二振镜的二维扫描下对所述生物芯片平面均匀照明；激光束先沿X方向经所述第一振镜偏转到预设的初始步进位置，所述第二振镜再沿Y方向对该行进行扫描，按此方式逐行平行扫描生物芯片点阵平面。

在本发明一实施例中，通过三角函数数学模型对由生物芯片探针平面与激光束投射方向不垂直而导致的不垂直的二维扫描模型来进行修正，且通过修正后的二维扫描模型设定第一振镜以及第二振镜的扫描步进间距以及振镜偏转的角速度，用以计算该生物芯片检测方法的检测速度。

在本发明一实施例中，所述通过三角函数数学模型修正二维扫描模型按照如下步骤实现：

步骤S1：记入射强度为I，经所述第一振镜以及所述第二振镜偏转倾斜投射到探针平面上，激光束的投影面积增大倍，δ为所述第一振镜的偏转角，为所述第二振镜的偏转角，且光强变为：

步骤S2：所述第二振镜偏转β角度，使激光束沿Y方向进行行扫描，且：

$L=\frac{h_z}{cos(45+\mathrm{\β})}$

其中，h_z为所述第二振镜镜片中心点高度；

步骤S3：调整所述第一振镜的角度δ，使得激光束沿X方向进行步进偏转，且偏转量：

x＝(L+e)tanδ

由于L+e≈L，tanδ≈δ，由上式可得：

$\mathrm{\δ}=\frac{x}{h_z}\·\frac{180}{\mathrm{\π}}\·cos(45+\mathrm{\β});$

步骤S4：将所述第一振镜的偏转角度δ跟随着所述第二振镜的偏转角β作余弦调整，以保证激光束在所述第二振镜作用下沿Y方向扫描的轨迹是水平平行直线，且激光束在X方向的偏转量为定值，则激光束从第一振镜到生物芯片的光程l：

记出射激光束的扫描角速度为ω_y，对应所述第二振镜的角速度为ω_y/2，且扫描物理分辨率为A_s＝d(um)×d(um)，则激光束在Y方向的扫描的线速度为：

v＝ω_y·l

生物芯片A_s面积的平均照射时间为：

对应扫描分辨率A_s面积的荧光染料受激发产生的光致荧光光子数为：

其中，荧光分子的量子效率φ，荧光染料截面σ，q_em为激发的荧光光子数，I为激光束入射强度，ω_y为出射激光束的扫描角速度，c为光速，λ为激发光波长，τ为荧光寿命，荧光染料浓度C_s，

步骤S5：在X方向步进间距对应的第一振镜偏转角为δ时，则在Y方向对每行进行扫描时，第二振镜的角速度ω_y/2对自身偏转角β进行余弦调整，以保持荧光响应q_em的一致性：

${{\mathrm{\ω}}_y}^{,}=\frac{1}{2}{\mathrm{\ω}}_y{\cos }^2\mathrm{\δ}\·{\cos }^2(45+\mathrm{\β})$

则光致荧光光子数q_em为：

$q_{em}=\frac{{\mathrm{\φI\σ\λdA}}_s}{{\mathrm{hch}}_z}\·\frac{1}{2{{\mathrm{\ω}}_y}^{,}}\·C_s.$

在本发明一实施例中，所述CCD相机每次扫描整幅生物芯片荧光图像中的一部分，对该部分荧光图像进行图像采集，且通过消除其余没有扫描到的生物芯片探针平面的灰度值，以减少噪声的积累，提高信噪比；按照该采集方式采集多幅荧光图像，并滤除噪声后线性叠加形成完整的一幅生物芯片荧光图像，完成对整幅生物芯片荧光图像的采集。

在本发明一实施例中，所述荧光染料为CY3或CY5。

相较于现有技术，本发明具有以下有益效果：本发明所提出的一种激光诱导与CCD采集的生物芯片检测方法，既避免激光共聚焦方法的复杂光路和高压氙气灯的照明问题，也能够保证较高的检测速度和灵敏度，可以使得检测的灵敏度优于1flour/um²，单通道扫描22mm*22mm的检测时间不超过55秒，相比于主流应用的激光共聚焦扫描检测方式来说结构简单，扫描速度快。该产品可以广泛应用于疾病诊断、药物筛选、预防医学等方面，能够解决一些传统检测方式所做不到的效果。

附图说明

图1为本发明中激光诱导与CCD采集的生物芯片检测装置的结构示意图。

图2为本发明中二维扫描振镜的驱动控制电路示意图。

图3为本发明中X方向步进扫描剖面示意图。

图4为本发明中Y方向连续扫描剖面示意图。

图5为本发明中激光诱导与CCD采集的生物芯片检测方法的扫描仪的工作流程图。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明的技术方案进行具体说明。

本发明提供一种激光诱导与CCD采集的生物芯片检测装置，包括激发光源、生物芯片二维扫描装置、收光镜头、冷却型CCD相机这几个部分，其系统框图如图1所示。通过在计算机中配置预先设置的二维扫描模型,使得具有固定功率的激光光源发射出激光通过二维扫描振镜的控制在生物芯片的X方向和Y方向按照一定的规律进行二维扫描，激光在二维扫描振镜的工作下斜向45度照射到生物芯片平面，并且激发CY3或者CY5荧光染料产生荧光信号通过冷却型CCD相机的成像和多像素并行积分的方式对信号进行采集。这样既避免激光共聚焦方法的复杂光路和高压氙气灯的照明问题，也能够保证较高的检测速度和灵敏度。

进一步的，在本实施例中，通过利用CY3和CY5荧光染料在受到激发光激发后的斯托克斯位移的原理，对已经标记CY3或者CY5荧光染料的生物芯片进行激发光照射，可以通过激发光对荧光染料激发所产生的荧光分字数进行理论推算，再结合冷却型CCD相机能够探测到的最小的荧光光强系数，可以计算出采用激光扩束的平行光并经振镜扫描和冷却型CCD采集受激荧光相结合的生物芯片检测方法的检测灵敏度的理论数值。

进一步的，在本实施例中，荧光染料受激发所产生的荧光强度与激发光强度I、波长λ_exc，以及荧光分子的量子效率φ、消光系数ε和染料浓度C_s有着密切关系。在荧光染料浓度较低时，忽略猝灭效应，其受激发时，每个处于基态的荧光分子的激发速率可以表示为：

$\mathrm{\α}=\frac{I\mathrm{\σ}}{h\mathrm{\ν}}---\left(1\right)$

$\mathrm{\ν}=\frac{c}{{\mathrm{\λ}}_{exc}}---\left(2\right)$

式中c为光速，λ_exc激发光波长，光强I的单位为W/cm²，hv为吸收光子的能量，荧光染料截面σ的单位为cm²，σ与消光系数ε的关系式：

σ＝3.8×10^-21ε(cm²)(3)

设τ为荧光寿命，1/τ为荧光分子的弛豫速率，N为激发光所照射的荧光分子总数，N₁为处于激发态的荧光分子数。当荧光染料激发过程达到稳定状态时，受激速率和消激速率相等：

$\frac{{\mathrm{dN}}_1}{dt}=(N-N_1)\mathrm{\α}-N_1\frac{1}{\mathrm{\τ}}---\left(4\right)$

$\frac{d(N-N_1)}{dt}=N_1\frac{1}{\mathrm{\τ}}-(N-N_1)\mathrm{\α}---\left(5\right)$

即有归一化的荧光激发比率：

$N_f=\frac{N_1}{N}=\frac{\mathrm{\α}\mathrm{\τ}}{1+\mathrm{\α}\mathrm{\τ}}---\left(6\right)$

因此受激产生荧光速率(归一化)为：

$p_f=\frac{\mathrm{\φ}\·N_f}{\mathrm{\τ}}---\left(7\right)$

式中φ为荧光染料的量子效率。

设CCD的一个像素成像对应的生物芯片的面积区域(物理分辨率)为A_s(um²)，荧光染料浓度C_s(flour/um²)，扫描时间t_s(s)，则可激发的荧光光子数q_em为：

q_em＝p_f·A_s·C_s·t_s(8)

荧光光子通过光学镜头成像光路到达CCD像素所形成响应电子数q_s为：

$q_s=D_{ccd}\·K_{em}\·\frac{1-cos\mathrm{\θ}}{2}\·q_{em}---\left(9\right)$

θ＝sin^-1(NA)(10)

式中D_ccd为CCD的量子效率，K_em为光学镜片的透光效率，NA为物镜的数值孔径。

其中，式8和式9中关于CCD的响应电子数q_s与生物芯片点阵的荧光浓度C_s的关系是扫描仪设计的基础。

进一步的，在本实施例中，平行光激光器的光束经准直扩束，通过正方形光阑形成矩形光斑在振镜的二维扫描下实现生物芯片平面的均匀照明，扫描仪工作室，激光束先沿X方向经二维扫描振镜中的振镜a偏转到确定的初始步进位置，二维扫描振镜中的振镜b再对Y方向进行一行的扫描，如此可以逐行平行扫描生物芯片点阵平面。由于生物芯片探针平面和激光束投射方向不垂直，所以在生物芯片探针平面的各位置的投射距离和投射角度均不同，导致激光束投射的面积和强度不一致，可以采用三角函数关系式的数学模型来对该不垂直的二维扫描模型来进行修正。通过修正后的二维扫描模型可以设定其扫描步进间距和振镜偏转的角速度来推算出采用激光扩束的平行光并经振镜扫描和冷却型CCD采集受激荧光相结合的生物芯片检测方法的检测速度。

如图2所示，为振镜a以及振镜b的驱动控制电路示意图。由于激光是典型的点光源，激光器的光束经准直扩束形成平行光，通过截面为的内切正方形光阑后形成矩形光斑，在振镜a以及振镜b的二维扫描下实现平面的均匀照明。双振镜90度正交安装，振镜a负责X方向扫描，振镜b负责Y方向扫描。振镜a与振镜b的镜片中心间距e，其中X方向步进扫描剖面如图3所示，Y方向连续扫描剖面如图4所示：扫描仪工作时，先由振镜a偏转激光束沿X方向到确定的初始步进位置，振镜b再对Y方向进行一行连续扫描。振镜a可步进调整到达新的位置，振镜b依次逐行平行扫描生物芯片探针平面。

进一步的，在本实施例中，设定生物芯片有效探针平面22×22mm²，振镜b镜片的中心点高度h_z＝55mm，振镜镜片的中心间距e＝8mm。激光束沿方向投射，在Y方向，光程L为70.0至85.9mm，振镜b的投射角度为38.66至50.20度；在X方向，振镜a的偏转角δ为-8.03至8.03度。

在本实施例中，由于生物芯片探针平面和激光束投射方向不垂直，在生物芯片探针平面的各位置的投射距离和投射角度均不同，导致激光束投射的面积和强度不一致。

设激光束入射强度为I，经振镜a和b偏转倾斜投射到探针平面上，激光束的投影面积增大倍，其光强变为：

如图4所示，振镜b偏转β角度，可以实现激光束沿Y方向由y1扫描到y2一行，其中有：

$L=\frac{h_z}{cos(45+\mathrm{\β})}---\left(13\right)$

如图3所示，激光束由x1位置，通过调整振镜a的角度δ，可以按设定的步进间距，由x1至x2方向进行步进偏转，其偏转量：

x＝(L+e)tanδ(15)

如图3并结合式13，相对于L，e和δ均较小，则L+e≈L，tanδ≈δ，由式15可得：

$\mathrm{\δ}=\frac{x}{h_z}\·\frac{180}{\mathrm{\π}}\·cos(45+\mathrm{\β})---\left(16\right)$

为保证激光束在振镜b作用下沿Y方向扫描的轨迹y1至y2是水平平行直线，即激光束在X方向的偏移量x为定值，则振镜a的偏转角度δ应跟随着振镜b的偏转角β作余弦调整。

如图3所示，激光束从振镜a到生物芯片的光程l：

设出设激光束的扫描角速度为ω_y(对应振镜b的角速度为ω_y/2)，扫描的物理分辨率为A_s＝d(um)×d(um)，则激光束在Y方向的扫描的线速度为：

v＝ω_y·l(18)

生物芯片A_s面积的平均照射时间为：

由式8和式12可得对应扫描分辨率A_s面积的荧光染料受激发产生的光致荧光光子数：

为保持荧光响应q_em的一致性，在X方向步进间距对应的振镜a偏转角确定为δ时，Y方向每扫描一行时振镜b的角速度ω_y/2应进行自身偏转角β的余弦调整，即根据式20有：

${{\mathrm{\ω}}_y}^{,}=\frac{1}{2}{\mathrm{\ω}}_y{\cos }^2\mathrm{\δ}\·{\cos }^2(45+\mathrm{\β})---\left(21\right)$

所以光致荧光光子数的关系式改写为：

$q_{em}=\frac{{\mathrm{\φI\σ\λdA}}_s}{{\mathrm{hch}}_z}\·\frac{1}{2{{\mathrm{\ω}}_y}^{,}}\·C_s---\left(22\right)$

即在振镜b的扫描角速度ω_y'的荧光响应q_em与探针染料浓度C_s为确定的线性关系。

进一步的，在本实施例中，图像的采集系统由微距镜头、窄带镀膜滤光片还有冷却型CCD相机构成，通过扫描整幅生物芯片荧光图像中的一部分并且及时对其进行图像采集，通过消除其余没有扫描到的生物芯片探针平面的灰度值可以大大减少噪声的积累提高信噪比，通过此采集方式可以采集到多幅荧光图像并对在滤除噪声后线性叠加形成完整的一幅生物芯片荧光图像。

进一步的，在本实施例中，激光诱导与CCD采集的生物芯片检测方法的扫描仪的工作流程图如图5所示。放置好待检测的生物芯片后，通过对计算机进行配置,利用经上述方法修正后的二维扫描模型,控制二维扫描高速振镜，对生物芯片探针平面进行二维扫描，在扫描整个探针平面的一部分后停止扫描一段时间并进行图像采集，采集到图像后立即将数据传送到计算机中进行储存，储存完毕后再继续进行二维扫描如此循环直至将整个生物芯片探针平面扫描完毕，到计算机系统中进行图像的去噪处理并且将分块的图像整合成一幅完整的生物芯片荧光图像。

以上是本发明的较佳实施例，凡依本发明技术方案所作的改变，所产生的功能作用未超出本发明技术方案的范围时，均属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种激光诱导与CCD采集的生物芯片检测方法,其特征在于,提供一包括一CCD相机以及一对设置于所述CCD相机两侧的第一振镜以及第二振镜的激光诱导CCD采集扫描仪；通过所述第一振镜以及所述第二振镜控制具有固定功率的激光光源发射出激光，沿X方向和Y方向在设置于所述CCD相机正下方处的生物芯片的进行二维扫描，且激光在所述第一振镜以及所述第二振镜的控制下照射到生物芯片平面，并且激发所述生物芯片内的荧光染料产生荧光信号；所述CCD相机通过成像以及多像素并行积分的方式对所述荧光信号进行采集，并将所采集的图像传输至与所述CCD相机相连的计算机。

2.根据权利要求1所述的一种激光诱导与CCD采集的生物芯片检测方法，其特征在于，所述CCD相机包括由下至上依次设置的收光镜头以及冷却型CCD相机；所述收光镜头包括微距镜头以及窄带镀膜滤光片。

3.根据权利要求1所述的一种激光诱导与CCD采集的生物芯片检测方法，其特征在于，所述第一振镜以及所述第二振镜相互成90度正交设置。

4.根据权利要求3所述的一种激光诱导与CCD采集的生物芯片检测方法，其特征在于，激光在所述第一振镜以及所述第二振镜的控制下斜向45度照射到生物芯片平面。

5.根据权利要求1所述的一种激光诱导与CCD采集的生物芯片检测方法，其特征在于，所述第一振镜以及所述第二振镜均为高速振镜，且均与高速振镜驱动电路相连；所述高速振镜驱动电路依次与放大减法电路、控制电路以及所述计算机相连。

6.根据权利要求1所述的一种激光诱导与CCD采集的生物芯片检测方法，其特征在于，所述激光光源中的平行光激光器激光束经准直扩束，通过正方形光阑形成矩形光斑分别在所述第一振镜以及所述第二振镜的二维扫描下对所述生物芯片平面均匀照明；激光束先沿X方向经所述第一振镜偏转到预设的初始步进位置，所述第二振镜再沿Y方向对该行进行扫描，按此方式逐行平行扫描生物芯片点阵平面。

7.根据权利要求4所述的一种激光诱导与CCD采集的生物芯片检测方法，其特征在于，通过三角函数数学模型对由生物芯片探针平面与激光束投射方向不垂直而导致的不垂直的二维扫描模型进行修正，且通过修正后的二维扫描模型设定第一振镜以及第二振镜的扫描步进间距以及振镜偏转的角速度，用以计算该生物芯片检测方法的检测速度。

8.根据权利要求5所述的一种激光诱导与CCD采集的生物芯片检测方法，其特征在于，所述通过三角函数数学模型修正二维扫描模型按照如下步骤实现：

步骤S1：记入射强度为I，经所述第一振镜以及所述第二振镜偏转倾斜投射到探针平面上，激光束的投影面积增大倍，δ为所述第一振镜的偏转角，为所述第二振镜的偏转角，且光强变为：

步骤S2：所述第二振镜偏转β角度，使激光束沿Y方向进行行扫描，且：

$L=\frac{h_z}{cos(45+\mathrm{\β})}$

其中，h_z为所述第二振镜镜片中心点高度；

步骤S3：调整所述第一振镜的角度δ，使得激光束沿X方向进行步进偏转，且偏转量：

x＝(L+e)tanδ

由于L+e≈L，tanδ≈δ，由上式可得：

$\mathrm{\δ}=\frac{x}{h_z}\·\frac{180}{\mathrm{\π}}\·cos(45+\mathrm{\β});$

步骤S4：将所述第一振镜的偏转角度δ跟随着所述第二振镜的偏转角β作余弦调整，以保证激光束在所述第二振镜作用下沿Y方向扫描的轨迹是水平平行直线，且激光束在X方向的偏转量为定值，则激光束从第一振镜到生物芯片的光程l：

记出射激光束的扫描角速度为ω_y，对应所述第二振镜的角速度为ω_y/2，且扫描物理分辨率为A_s＝d(um)×d(um)，则激光束在Y方向的扫描的线速度为：

v＝ω_y·l

生物芯片A_s面积的平均照射时间为：

对应扫描分辨率A_s面积的荧光染料受激发产生的光致荧光光子数为：

其中，荧光分子的量子效率φ，荧光染料截面σ，q_em为激发的荧光光子数，I为激光束入射强度，ω_y为出射激光束的扫描角速度，c为光速，λ为激发光波长，τ为荧光寿命，荧光染料浓度C_s，

步骤S5：在X方向步进间距对应的第一振镜偏转角为δ时，则在Y方向对每行进行扫描时，第二振镜的角速度ω_y/2对自身偏转角β进行余弦调整，以保持荧光响应q_em的一致性：

${{\mathrm{\ω}}_y}^{,}=\frac{1}{2}{\mathrm{\ω}}_y{\cos }^2\mathrm{\δ}\·{\cos }^2(45+\mathrm{\β})$

则光致荧光光子数q_em为：

$q_{em}=\frac{{\mathrm{\φI\σ\λdA}}_s}{{\mathrm{hch}}_z}\·\frac{1}{2{{\mathrm{\ω}}_y}^{,}}\·C_s.$

9.根据权利要求1所述的一种激光诱导与CCD采集的生物芯片检测方法，其特征在于，所述CCD相机每次扫描整幅生物芯片荧光图像中的一部分，对该部分荧光图像进行图像采集，且通过消除其余没有扫描到的生物芯片探针平面的灰度值，以减少噪声的积累，提高信噪比；按照该采集方式采集多幅荧光图像，并滤除噪声后线性叠加形成完整的一幅生物芯片荧光图像，完成对整幅生物芯片荧光图像的采集。

10.根据权利要求1所述的一种激光诱导与CCD采集的生物芯片检测方法，其特征在于，所述荧光染料为CY3或CY5。