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CN105753987A - 抗il-4r单链抗体的制备方法及其在抗肿瘤上的应用 - Google Patents

抗il-4r单链抗体的制备方法及其在抗肿瘤上的应用 Download PDF

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CN105753987A
CN105753987A CN201610310687.8A CN201610310687A CN105753987A CN 105753987 A CN105753987 A CN 105753987A CN 201610310687 A CN201610310687 A CN 201610310687A CN 105753987 A CN105753987 A CN 105753987A
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scfv
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CN201610310687.8A
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杨光勇
郭海涛
刘茜明
田维毅
蔡琨
王文佳
梁建东
王平
韩洁
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Guiyang College of Traditional Chinese Medicine
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Guiyang College of Traditional Chinese Medicine
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Abstract

本发明公开了一种抗IL?4R单链抗体的制备方法及其在抗肿瘤上的应用，其制备方法包括动物免疫、构建pCANTAB5E?scFv重组质粒、构建抗IL?4R抗体库、噬菌体抗体库的富集与筛选、scFv序列优化和pET?32a?scFv重组质粒的构建、pET?32a?scFv重组质粒酶切鉴定、cFv重组蛋白的表达、SDS?PAGE分析、表达蛋白的复性与纯化和Western blot分析等步骤。本发明建立了稳定而特异抗IL?4R单链抗体的制备方法，可用于以纯化蛋白在体内外对肺癌进行干预，为治疗肺癌提供新的实验依据，为进一步研制新型的抗肿瘤药物打下了良好的基础。

Description

抗IL-4R单链抗体的制备方法及其在抗肿瘤上的应用
技术领域
本发明涉及一种抗IL-4R单链抗体的制备方法及其在抗肿瘤上的应用，属于生物医学技术领域。
背景技术
肺癌是发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，对人类生命和健康有着非常大威胁，是恶性肿瘤死亡的首位原因，其发病率仍呈持续上升趋势。目前，治疗肿瘤依然以手术切除肿瘤、放射疗法及化学疗法为主要手段，但是，这些疗法易造成气血亏损、免疫力低下等各种副作用且手术及放化疗手段费用昂贵，成为许多人的经济负担。因此，寻找高效低毒的中医药来治疗肿瘤已经成为国内外医药学家追寻的目标，但真正能够达到高效低毒目标的药物甚少。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种抗IL-4R单链抗体的制备方法及其在抗肿瘤上的应用，为开发利用抗IL-4R单链抗体提供依据，为进一步研制新型的抗肿瘤药物打基础。
为解决上述技术问题，本发明采用如下的技术方案：
抗IL-4R单链抗体的制备方法，包括以下步骤：
(1)动物免疫：取8只18～22g的BALB/c小鼠进行免疫，将100μg/mL的Human IL-4R/CD124蛋白与Freund完全佐剂等体积混匀乳化进行初次免疫，腹部注射0.5mL乳剂/每只；2周后，对小鼠进行第1次加强免疫，2周后，对小鼠进行第2次加强免疫，1周后，眼眶取血和取脾脏，血液经过3500r/min离心15min，取血清，-80℃保存，脾脏用RNA保存液，-20℃保存；
(2)构建pCANTAB5E-scFv重组质粒：取40～80mg脾组织按照RNAiso Plus说明书方法操作提取总RNA；按照RevertAid First cDNASynthesis kit说明书方法进行cDNA第1链合成；以逆转录产物cDNA为模板，重链、轻链可变区引物序列扩增目的基因VH和VL；以合成的linker单链为模板，采用linker引物序列扩增目的基因；将扩增出来的VH、VL和linker作为模板，以scFv引物序列，通过重叠延伸PCR反应体系拼接扩增scFv；参照Not Ⅰ酶和Sfi Ⅰ酶说明书分别对scFv与pCANTAB5E载体进行双酶切，参照T4连接酶说明书将双酶切过的scFv和pCANTAB5E载体进行插入连接；将pCANTAB5E-scFv重组质粒转入感受态TG1细菌，在含有200g/L MgCl2、50mg/L氨苄青霉素、20g/L葡萄糖的SOB-AG固体培养基上37℃培养16h，取阳性重组质粒TG1单菌落进行菌落PCR鉴定，提取pCANTAB5E-scFv重组质粒，按照Sfi Ⅰ酶和Not Ⅰ酶说明书操作进行双酶切鉴定；再取10个重组质粒，按照BstN Ⅰ内切酶说明操作进行抗体库多样性鉴定；
(3)构建抗IL-4R抗体库：：取含有pCANTAB5E-scFv重组质粒的转化菌1mL，加入含50mg/L氨苄青霉素、20g/L葡萄糖的2×YT-AG液体培养基至10mL，在37℃、250r/min振荡培养至A600≈0.5；加入辅助噬菌体M13K07，37℃、250r/min振荡1h，1000r/min离心10min弃上清；加入10mL2×YT-AK，37℃、250r/min振荡培养16h；1000r/min离心10min，取上清移至无菌15mL的离心管中，加入2mL PEG/NaCl混合液浓缩沉淀，置于冰上60min后离心弃上清；沉淀重悬于2mL含有20mg BSA的PBS溶液，用0.45μm滤膜过滤既获得噬菌体单链抗体库；取100μL噬菌体单链抗体库溶液，用2×YT-AG液体培养基连续3次进行10倍稀释，3个稀释度各取100μL，分别加入900μL新鲜制备的E.coli TG1，室温放置15min，并分别涂布于SOB-AG固体培养基上，37℃培养16h，计算抗体滴度；
(4)噬菌体抗体库的富集与筛选：用PBS把重组人IL-4R稀释到10μg/mL，取50μL稀释液包被96孔板，4℃孵育16h；每孔加入350μL PBS，清洗孔板后弃液，连续3次；用BSA-PBS封闭微孔室温孵育1h；每孔加入350μL PBS洗孔，弃液，连续3次；加入经过聚乙二醇沉淀的噬菌体单链抗体库，50μL/孔，37℃孵育2h弃液；先用PBS每孔洗10次再用PBST每孔洗10次；加入pH＝2.2的Gly-HCl洗脱液，50μL/孔；室温放置10min，迅速加入2mol/L，pH＝7.0的Tris 5μL/孔，吸取微孔板中的溶液到装有2mL TG1的15mL EP管中，室温放置20min；加入10mL2×YT-AG，37℃、250r/min振荡培养1h，加入4×1012噬斑形成单位的M13K07，并加入终剂量为50μg/mL的卡那霉素，37℃、250r/min振荡培养16h；离心沉淀细胞，用PEG/NaCl混合液沉淀细胞，并进行下一轮的富集筛选，如此“吸附-洗脱-感染扩增”共筛选3轮，选择抗原亲合力最强的克隆进行测序分析；
(5)scFv序列优化和pET-32a-scFv重组质粒的构建：为实现scFv基因的成功表达进行优化scFv序列，删除scFv序列上的信号肽和E-tag碱基；根据pET-32a载体上的酶切位点，将scFv基因片段上以前的酶切位点Sfi Ⅰ和Not Ⅰ酶切位点更换为Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ，选择表达His-tag作为检测标签；合成优化scFv基因片段并构建pET-32a-scFv重组质粒转导入感受态细胞E.coli BL21，取适量已转化的感受态细胞涂布含100μg/mL羧苄青霉素的TB平皿，37℃培养12～16h；
(6)pET-32a-scFv重组质粒酶切鉴定：挑取单菌落至装有15mL TB培养液的100mL培养瓶中，于37℃环境下震荡培养至0D600＝0.6～0.8，用高纯质粒小量制备试剂盒提取质粒；用限制性内切酶EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ对该质粒进行双酶切鉴定，酶切体系：重组质粒：10μL；内切酶Xho Ⅰ：2μL；10×Buffer Tango：2.5μL；ddH2O：35.5μL；酶切反应：37℃酶切4h，80℃，20min灭活Xho Ⅰ酶，待冷却至12℃，再加入2μL EcoR Ⅰ内切酶，37℃酶切4h，65℃，灭活20min，取5μL做1％琼脂糖凝胶电泳；将成功酶切的质粒测序，将测序结果进行BLAST比对，对测序结果进行预测蛋白质氨基酸序列；
(7)scFv重组蛋白的表达：挑取平板上的单个菌落接种至装有10mLTB培养基的50mL锥形瓶中，于37℃快速振荡培养至OD600＝0.2～0.4，将菌液4000rpm离心15min，取菌体用新鲜的TB培养基重悬，4000rpm离心15min以去除β-内酰胺酶，再用新鲜的TB培养基重悬，转移菌液至装有100mL TB培养基的500mL锥形瓶中，于37℃快速振荡培养至OD600＝0.4～0.6，加入终浓度为1mM的IPTG于37℃快速振荡培养诱导重组蛋白表达3h，离心取沉淀加入细菌裂解液、蛋白酶混合抑制剂及溶菌酶等裂解的细菌，于4℃条件下13000rpm离心得到不溶性的包涵体；将包涵体重悬于含有8M尿素的Binding Buffer中，置于冰浴中使包涵体溶解，取100μL包涵体混合液作为样品进行SDS-PAGE进行检测；
(8)SDS-PAGE分析：分别取诱导0h，1h，2h和3h时间段的样本用100μL PBS重悬，加入20μL的4×蛋白上样缓冲液混合均匀，于沸水中加热5～8min使菌体破裂并使菌体内的总蛋白变性，待样品冷却至常温后于4℃环境下12000rpm离心5min，取上清中的总蛋白小管分装保存于-80℃，取诱导0h，1h，2h和3h时间段的处理样本进行SDS-PAGE，电泳结束后取出凝胶进行考马斯亮蓝染色；同时以未诱导的含pET-32a-scFv的细菌表达蛋白为对照；
(9)表达蛋白的复性与纯化：经SDS-PAGE分析确定pET-32a-scFv重组质粒为包涵体表达；进行表达菌大量培养，加入终浓度为1mM的IPTG，于37℃快速振荡培养诱导重组蛋白表达3h，菌液4000rpm离心15min取菌体，按照PH0311细菌细胞总蛋白提取试剂盒说明书操作进行包涵体蛋白的提取处理后，将10mL包涵体装入截留分子量为10KD的透析袋内，将透析袋置于1000mL的复性液中，于4℃环境下作用2～4h后换新的复性液作用6～8h，再换用新的复性液作用至少2h甚至可以作用过夜；将透析袋内复性后的液体于4℃条件下13000rpm离心15min，取上清和沉淀，保留部分上清作为样本，按照Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒说明书操作，将复性后的上清过柱纯化；
(10)Western blot分析：选取纯化前后样本经过SDS-PAGE后，转膜并孵育一抗鼠源抗His-tag抗体、二抗兔抗鼠IgG抗体，最后的检测方法按照AEC底物显色试剂盒说明书操作制备显色液，用显色液将膜完全浸润，室温反应3～10min，用去离子水冲洗终止反应，观察结果。
抗IL-4R单链抗体作为制备抗肿瘤药物的应用。
理想的抗肿瘤分子靶点首先应具备特异性，即在肿瘤细胞有较高的表达，而在机体内各重要器官与组织无显著的表达。国外学者相继报告白介素-4受体(IL-4R)在体内外过量表达于多种肿瘤细胞表面，包括肺癌、乳腺癌结直肠癌、成胶质细胞瘤、头颈部鳞状细胞癌、肾细胞癌和前列腺癌等等。研究发现白介素-4(IL-4)可介导组织蛋白酶激活肿瘤相关巨噬细胞促进癌症的发生发展，甚至代替激活肿瘤相关巨噬细胞。IL-4能同时促发c-Jun氨基末端激酶信号转导通路激活和生存素上调引起癌细胞扩增。IL-4R在多种肿瘤细胞表面过量表达，作为IL-4拮抗剂在临床前阶段的肿瘤模型中表现出了高效性。研究报道IL-4R(interleukin-4receptor)信号能够促进癌细胞增殖，虽然IL-4R并非胚胎型横纹肌肉瘤的生存所必须，但抑制IL-4R信号通路可以成为阻止肿瘤生长的一种方法。
人类IL-4R属于红细胞生成素受体超家族成员，与IL-4特异性结合后发挥其生物学功能，在机体免疫应答中有着至关重要的作用。研究证实IL-4R也表达于许多正常的造血细胞和非造血细胞。静止性的造血细胞如T细胞、B细胞、CD34+前体细胞等仅有很小的敏感性，因为这些细胞表达的IL-4R水平很低；对非造血细胞(表达高水平的IL-4R)没有表现出明显的毒性反应。人们发现白介素-4(IL-4)在体内外研究中都对肿瘤生长有着中等强度、直接的抑制作用。因此，我们确定以IL-4R作为治疗肺癌的作用靶标。那么，我们大胆设想：抗IL-4R抗体与抗原IL-4R结合能抑制IL-4R信号通路可以成为阻止肿瘤生长。如果制备抗IL-4R单克隆抗体，但单克隆抗体的临床应用时还存在人抗鼠抗体反应反应和肿瘤部位药物量不足等问题。
单链抗体(single-chain antibody fragment，scFv)是利用基因工程技术在大肠杆菌中表达的人工合成抗体，只有完整抗体的一条链，由抗体重链可变区和轻链可变区通过15～20个氨基酸的短肽(linker)连接而成，因此得名为单链抗体。噬菌体展示技术将表型和基因型联系在一起，不经人体免疫，绕过杂交瘤技术，通过几轮“吸附-洗脱-扩增”的体外筛选富集过程，即可得到人源的基因工程抗体。scFv具有分子质量小，免疫原性低，无Fc端，不易与具有Fc受体的靶细胞结合，对肿瘤组织的穿透力强等特点，是保持抗体亲和性和特异性的最小功能性抗体片段。单链抗体(scFv)噬菌体抗体库技术的建立，被誉为又一次革命性进展，其产生依赖于RT-PCR扩增全套免疫球蛋白可变区基因、大肠杆菌表达分泌功能性免疫球蛋白分子片段和噬菌体表面展示技术的成功建立。单链抗体重组蛋白具有很大的开发研究空间，能够用于临床治疗，为病患带来新希望。但目前尚未有构建抗IL-4R单链抗体用于抗肿瘤的相关报道。通过本发明成功制备抗IL-4R单链抗体，在成功制备抗IL-4R单链抗体的基础上使用它在体内外作用于肺癌并取得一定的效果。
有益效果：与现有技术相比，单克隆抗体在临床应用时还存在人抗鼠抗体反应反应和肿瘤部位药物量不足等问题。相比之下，重组单链抗体免疫源性小，可消除人抗鼠的排异反应，在体内循环的半衰期短，易清除，利于解毒排出、对肿瘤组织的穿透力强等特点优势。本发明制备抗IL-4R单链抗体，构建重组质粒pET-32a-scFv，转入BL21(DE3)原核表达菌进行诱导表达，对表达蛋白并进行纯化和复性，通过SDS-PAGE分析抗IL-4R单链抗体的分子量，运用Western-blot检测融合蛋白的特异性。将人肺腺癌细胞株H460悬液接种小鼠建立小鼠实体瘤模型，分别用不同剂量抗IL-4R单链抗体接种实验荷瘤小鼠，根据瘤重和小鼠存活时间计算抑瘤率和对荷瘤小鼠生命延长率。本研究为开发利用抗IL-4R单链抗体提供依据，为进一步研制新型的抗肿瘤药物打下了良好的基础。
附图说明
图1是VH和VL基因PCR产物琼脂糖电泳图，图中1～2:VH；3:VL；M:DL2000marker；
图2是scFv基因PCR产物琼脂糖电泳图，图中1～2：scFv；M：DL2000marker；
图3是重组质粒pCANTAB5E-scFv酶切后图谱，图中M：DL2000marker；1：pCANTAB5E-scFv；
图4是抗体库多样性鉴定，图中M：DL2000marker；1～10：pCANTAB5E-scFv载体BstN Ⅰ酶切；
图5是重组质粒pET-32a-scFv酶切鉴定图，图中M：DL2000marker；1～2：pCANTAB5E空载体对照；3～4:pCANTAB5E-scFv；
图6是优化后的scFv基因序列；
图7是优化后的scFv基因氨基酸序列预测；
图8是scFv表达蛋白SDS-PAGE分析，图中M:MarkerPR1910(11KD-180KD)；1：未诱导的含pET-32a-scFv重组质粒细菌表达蛋白；2：诱导1h的pET-32a-scFv重组质粒细菌表达蛋白；3：诱导2h的pET-32a-scFv重组质粒细菌表达蛋白；4：诱导3h的pET-32a-scFv重组质粒细菌表达蛋白；
图9是scFv表达Western-blot分析，图中M:MarkerPR1910(11KD-180KD)；1：未纯化的scFv表达蛋白；2：纯化scFv表达蛋白。
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步的说明。
具体实施方式
实施例1：
一、抗IL-4R单链抗体的制备
1材料
1.1主要试剂与设备：PCR仪购自美国Bio-Rad公司；生化培养箱购自广东省医疗器械厂，全波长酶标仪、凝胶成像仪\RevertAid First cDNASynthesis kit，Mval(BstN Ⅰ)均购自Thermo公司。rh-IL-4R蛋白购自北京义翘神州生物技术有限公司；Freund不完全佐剂、Freund完全佐剂均购自Sigma公司；RNAiso Plus均购自TaKaRa公司；快捷型琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒Ⅱ、高纯质粒小量制备试剂盒、2×Power Taq PCR MasterMix均购自北京百泰克生物技术有限公司；DNA Marker、氨苄青霉素、卡那霉素、PEG8000、萘啶酮酸均购自北京索莱宝生物科技有限公司；Not Ⅰ、Sfi Ⅰ、TransStart Fast Pfu DNA聚合酶，均购自北京全式金生物科技有限公司；T4DNA连接酶购自NEB公司；pCANTAB-5E、E.coli TG1、辅助噬菌体M13K07均购自杭州宝赛生物科技有限公司。pET-32a由贵州大学动物疫病研究所馈赠；E.coli BL21(DE3)由贵阳中医学院实验室制备保存；Anti-6×His抗体[GT359](HRP)(ab184607)(GR212114-6)，HRP标记的二抗兔抗鼠IgG(批号：990150311)，Abcam公司产品；羧苄青霉素(4240320)、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒(0020150129)、彩虹180广谱蛋白Marker PR1910(11KD-180KD)(PR1920)、考马斯亮蓝R250(416B035)、AEC底物显色试剂盒、ECL Plus荧光检测试剂(ECL超敏发光液)(20150128)、JMD18-10-0.5透析袋(截留分子量10000，20150317)、PVDF膜(K4CA1978G)，Millipore公司产品；Triton X-100(78200)、DNAMarker5000(NO.20141022)购自北京索莱宝生物科技有限公司；Xho Ⅰ enzyme(批号：00238777)、EcoR Ⅰ enzyme(00189088)，美国Thermo Scientific公司产品；高纯质粒小量制备试剂盒(0020141129)购自北京百泰克生物技术有限公司；Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒(包涵体蛋白)(00091512)购自康为世纪生物技术有限公司。
1.2实验动物与癌细胞株：无特定病原体(specefic pathogen free，SP)级BALB/c小鼠购自重庆腾鑫比尔实验动物销售有限公司，批号：SCXK-(军)2012-0003，体质量18～22g；健康昆系小鼠(4-6周龄、体重18-20g的雄性清洁级)；人肺腺癌细胞株H460，购自中科院生物化学与细胞生物学研究所。
2制备方法
2.1动物免疫：取8只18～22g(7周龄左右)的BALB/c小鼠进行免疫(6只免疫，2只阴性对照)，将100μg/mL的Human IL-4R/CD124蛋白(购自北京义翘神州生物技术有限公司)与Freund完全佐剂等体积混匀乳化进行初次免疫，腹部注射0.5mL乳剂/每只。2周后，对小鼠进行第1次加强免疫(50μg/mLRh-IL-4R蛋白与Freund不完全佐剂等体积混匀乳化)。2周后，对小鼠进行第2次加强免疫。1周后，眼眶取血和取脾脏。血液经过3500r/min，离心15min，取血清，-80℃保存。脾脏用RNA保存液，-20℃保存。
2.2构建pCANTAB5E-scFv重组质粒：取40～80mg脾组织按照RNAiso Plus说明书方法操作提取总RNA。按照RevertAid First cDNASynthesis kit说明书方法进行cDNA第1链合成。以逆转录产物cDNA为模板，重链、轻链可变区引物序列(表1)扩增目的基因VH和VL。以合成的linker单链为模板，采用表1中的linker引物序列扩增目的基因，结果见图1。将扩增出来的VH、VL和linker作为模板，以表1中的scFv引物序列，通过重叠延伸PCR反应体系拼接扩增scFv。VH和VL的PCR扩增结果：通过网格筛选，确定扩增VH的最佳退火温度为63.3℃，VL的最佳退火温度为62.4℃。VL最佳扩增引物为MJK5前端。扩增产物进行凝胶电泳VH的基因和VL的基因片段在300～500bp。scFv的PCR扩增结果：用纯化的VH和VL通过linker进行连接后通过电泳可见scFv基因片段长度为750bp左右，其结果见图2。参照Not Ⅰ酶和Sfi Ⅰ酶说明书分别对scFv与pCANTAB5E载体进行双酶切，参照T4连接酶说明书将双酶切过的scFv和pCANTAB5E载体进行插入连接。将pCANTAB5E-scFv重组质粒转入感受态TG1细菌，在SOB-AG固体培养基上(含有200g/L MgCl2、50mg/L氨苄青霉素、20g/L葡萄糖)37℃培养16h，取重组质粒TG1单菌落进行菌落PCR鉴定，提取pCANTAB5E-scFv重组质粒，按照Sfi Ⅰ酶和Not Ⅰ酶说明书操作进行双酶切鉴定，结果见图3。再取10个重组质粒，按照Mval(BstN Ⅰ)内切酶说明操作进行抗体库多样性鉴定，结果见图4。
表1引物序列
注：其中S＝G，C；M＝A，C；R＝A，G；W＝A，T；下划线粗体部分为Sfi Ⅰ和Not Ⅰ酶切位点。
2.3构建抗IL-4R抗体库：取含有pCANTAB5E-scFv重组质粒的转化菌1mL，加入2×YT-AG液体培养基(含50mg/L氨苄青霉素、20g/L葡萄糖)至10mL，在37℃、250r/min振荡培养至A600≈0.5；加入辅助噬菌体M13K07，37℃、250r/min振荡1h，1000r/min离心10min弃上清。加入10mL2×YT-AK(含氨苄青霉素，卡那霉素)37℃、250r/min振荡培养16h；1000r/min离心10min，取上清移至无菌15mL的离心管中。加入2mL PEG/NaCl混合液浓缩沉淀，置于冰上60min后离心弃上清；沉淀重悬于2mL含有20mg BSA的PBS溶液，用0.45μm滤膜过滤既获得噬菌体单链抗体库。取100μL噬菌体单链抗体库溶液，用2×YT-AG液体培养基连续3次进行10倍稀释，3个稀释度各取100μL，分别加入900μL新鲜制备的E.coliTG1(A600＝0.35)，室温放置15min，并分别涂布于SOB-AG固体培养基上，37℃培养16h，计算抗体滴度。根据培养细菌生长情况，估测提取的初级噬菌体抗体库库容。根据公式库容＝菌落数目×涂版菌液稀释倍数×涂布菌体体积×转化细菌总体积，得出噬菌体单链抗体库原始库容为1.14×1012。
2.4噬菌体抗体库的富集与筛选：用PBS把重组人IL-4R稀释到10μg/mL，取50μL稀释液包被96孔板，4℃孵育16h；每孔加入350μL PBS，清洗孔板后弃液，连续3次；用BSA-PBS封闭微孔室温孵育1h；每孔加入350μL PBS洗孔，弃液，连续3次。加入经过聚乙二醇沉淀的噬菌体单链抗体库，50μL/孔。37℃孵育2h弃液；先用PBS每孔洗10次再用PBST每孔洗10次；加入Gly-HCl(pH＝2.2)洗脱液，50μL/孔。室温放置10min，迅速加入Tris(2mol/L，pH＝7.0)5μL/孔。吸取微孔板中的溶液到装有2mL TG1(A600＝1.0)的15mL EP管中，室温放置20min。加入10mL 2×YT-AG，37℃、250r/min振荡培养1h。加入4×1012噬斑形成单位(plaque forming units，pfu)的M13K07，并加入终剂量为50μg/mL的卡那霉素，37℃、250r/min振荡培养16h；离心沉淀细胞，用PEG/NaCl混合液沉淀细胞，并进行下一轮的富集筛选，如此“吸附-洗脱-感染扩增”共筛选3轮。选择抗原亲合力最强的克隆进行测序分析。
以重组人可溶性IL-4R蛋白对噬菌体单链抗体库进行3轮筛选富集。第1轮的获得率为3.2×10-8，到第3轮时，变成了3.25×10-6，对比第1轮，比率提高了100倍(表2)。取单克隆菌落送生物公司测序，结果为该质粒含有scFv全长741bp，编码247个氨基酸。其中VH序列357个碱基，编码119个氨基酸，VL序列339个碱基，编码112个氨基酸；两者之间的柔性连接肽片段长45bp，编码15个氨基酸。采用NCBI对核苷酸和免疫球蛋白序列BLAST分析VH同源序列均为小鼠Ig重链可变区基因，VL同源序列均为小鼠Ig轻链可变区基因，同源性均达80％以上。VBASE2数据库(http://www.vbase2.org/vbase2.php)对VH和VL分析，结果表明VH和VL各含有3个抗原互补决定区(complementarity-determining region，CDR)和4个框架区。
表2噬菌体单链抗体库筛选表
淘洗轮次 加入噬菌体量(pfu) 洗脱噬菌体量(pfu) 获得率％
1 1×1012 3.2×104 3.2×10-8
2 4×1011 1.2×105 3×10- 7
3 2×1010 6.5×104 3.25×10-6
2.5 scFv序列优化和pET-32a-scFv重组质粒的构建：为实现scFv基因的成功表达进行优化scFv序列，删除scFv序列上的信号肽和E-tag碱基。根据pET-32a载体上的酶切位点，将scFv基因片段上以前的酶切位点Sfi Ⅰ和Not Ⅰ酶切位点更换为Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ，选择表达His-tag作为检测标签。委托上海英骏生物公司合成优化scFv基因片段，并构建pET-32a-scFv重组质粒转导入感受态细胞E.coli BL21，取适量已转化的感受态细胞涂布含100μg/mL羧苄青霉素的TB平皿，37℃培养12～16h。
2.6 pET-32a-scFv重组质粒酶切鉴定：挑取单菌落至装有15mL TB培养液(羧苄青霉素100μg/mL)的100mL培养瓶中，于37℃环境下震荡培养至0D600＝0.6～0.8，用高纯质粒小量制备试剂盒提取质粒。用限制性内切酶EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ对该质粒进行双酶切鉴定，通过1％琼脂糖凝胶进行电泳后在750bp处有明显的条带，与预期插入的pET-32a的scFv片段长度761bp相似；酶切体系：重组质粒：10μL；内切酶Xho Ⅰ：2μL；10×Buffer Tango：2.5μL；ddH2O：35.5μL。酶切反应：37℃酶切4h，80℃，20min灭活Xho Ⅰ酶。待冷却至12℃，再加入2μL EcoR Ⅰ内切酶，37℃酶切4h，65℃，灭活20min。取5μL做1％琼脂糖凝胶电泳。胶回收目的基因进行pET-32a-scFv重组质粒酶切鉴定，结果见图5。将成功酶切的质粒送上海英骏生物公司测序，将测序结果在NCBI网站进行BLAST比对(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)，利用DNAStar7.10软件对测序结果进行预测蛋白质氨基酸序列。优化后的scFv序列本身有750bp，编码250个氨基酸，因pET-32a本身自带His-tag，且是以T7启动子作为翻译起始点，能翻译出的重组蛋白将多出17KD的分子量，故总分子量将为45KD左右，结果见图6，7。
2.7 scFv重组蛋白的表达：挑取平板上的单个菌落接种至装有10mLTB培养基(羧苄青霉素200μg/mL)的50mL锥形瓶中，于37℃快速振荡培养至OD600＝0.2～0.4。将菌液4000rpm离心15min，取菌体用新鲜的TB培养基重悬，4000rpm离心15min以去除β-内酰胺酶，再用新鲜的TB培养基重悬，转移菌液至装有100mL TB培养基(羧苄青霉素200μg/mL)的500mL锥形瓶中，于37℃快速振荡培养至OD600＝0.4～0.6。加入终浓度为1mM的IPTG于37℃快速振荡培养诱导重组蛋白表达3h。离心取沉淀加入适当比例细菌裂解液、蛋白酶混合抑制剂及溶菌酶等裂解的细菌，于4℃条件下13000rpm离心得到不溶性的包涵体。将包涵体重悬于含有8M尿素的Binding Buffer中，置于冰浴中使包涵体溶解，取100μL包涵体混合液作为样品进行SDS-PAGE检测。
2.8 SDS-PAGE分析：分别取诱导0h，1h，2h和3h时间段的样本用100μL PBS重悬，加入20μL的4×蛋白上样缓冲液(含DTT)混合均匀，于沸水中加热5～8min使菌体破裂并使菌体内的总蛋白变性。待样品冷却至常温后于4℃环境下12000rpm离心5min，取上清中的总蛋白小管分装保存于-80℃。取诱导0h，1h，2h和3h时间段的处理样本进行SDS-PAGE，电泳结束后取出凝胶进行考马斯亮蓝染色。结果显示scFv以包涵体形式表达，且表达量大于50％。分别取诱导表达1h，2h和3h的菌液离心取菌体于沸水中加热使菌体破裂蛋白变性，取其蛋白用SDS-PAGE检测，结果表明含pET-32a-scFv细菌在35～48KD之间(约在45KD处出现明显条带)，结果见图8。诱导表达的最佳方案为IPTG浓度1mM，37℃环境下保持一定通气量振荡培养3h。
2.9表达蛋白的复性与纯化：经SDS-PAGE分析确定pET-32a-scFv重组质粒为包涵体表达。将含pET-32a-scFv重组质粒的菌株大量培养，加入终浓度为1mM的IPTG，于37℃快速振荡培养诱导重组蛋白表达3h。菌液4000rpm离心15min取菌体。按照PH0311细菌细胞总蛋白提取试剂盒说明书操作进行包涵体蛋白的提取处理后，将10mL包涵体装入截留分子量为10KD的透析袋内，将透析袋置于1000mL的复性液中，于4℃环境下作用2～4h后换新的复性液作用6～8h，再换用新的复性液作用至少2h甚至可以作用过夜。将透析袋内复性后的液体于4℃条件下13000rpm离心15min，取上清和沉淀。保留部分上清作为样本，按照Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒(可溶性蛋白)说明书操作，将复性后的上清过柱纯化。
2.10 Western blot分析：选取纯化前后样本经过SDS-PAGE后，转膜并孵育一抗鼠源抗His-tag抗体(1:3000)、二抗兔抗鼠IgG抗体(1:3000)(参照说明书使用剂量)。最后的检测方法按照AEC底物显色试剂盒说明书操作制备显色液，用显色液将膜完全浸润，室温反应3～10min，用去离子水冲洗终止反应观察结果，结果见图9。
二、抗IL-4R单链抗体在靶向抗肺癌上的应用
1采用MTT法测定抗IL-4R单链抗体体外抗肺癌细胞作用
取人肺腺癌细胞株H460用低血清1640培养基稀释成1～2×105个细胞/mL，接种96孔培养板，每孔100微升，经37℃5％CO2培养箱培养至细胞贴壁，弃去培养液。分为三个组：空白对照组、环磷酰胺对照组和抗IL-4R单链抗体组。抗IL-4R单链抗体组每孔加入用低血清1640培养基配置成终浓度分别为4.0、2.0、1.0mg/mL，空白对照组加入等量的低血清1640培养基。每组每个浓度设3个平行孔，37℃5％CO2培养4h，取出培养板，每孔加入MTT的50μL/孔(1mg/mL)，37℃4h后弃去MTT，加入DMSO 100uL/孔溶解formazan结晶。环磷酰胺对照组用药剂量2.0mg/mL按上述同样方法作用于细胞。每组均用酶标仪检测每孔的吸光度OD492值，根据吸光度计算不同浓度的抗IL-4R单链抗体对肺癌细胞的增殖抑制率。增殖抑制率(IR)仅(％)＝[(对照组OD值—药物作用组OD值)/(对照组OD值—本底对照组OD值)]×100％。
研究结果表明：抗IL-4R单链抗体对肺癌细胞有明显抑制作用，各纯化抗IL-4单链抗体组与模型对照组相比为差异极显著(P<0.01)，且随着剂量的增加，抑制作用迅速增强，呈明显的剂量依赖性(表3)
表3抗IL-4单链抗体对肺癌细胞荷瘤小鼠抑瘤率的影响(n＝8)
注：与空白对照组比较，##P<0.01。
2抗IL-4单链抗体对人肺腺癌细胞株H460荷瘤小鼠抑瘤率和生命延长率影响
分别取出冻存人肺腺癌细胞株H460复苏后进行培养。用0.2℅台盼蓝染色计数活细胞率。当活细胞率≧95％时，调整细胞数为1×106个/mL，分别于小鼠右腋下注射接种0.2mL/只，以建立小鼠肺癌实体瘤模型。将健康昆系小鼠动物随机分6组，每组16只，其中1个组为抗IL-4单链抗体组(48只)，每组8只，分别为重组蛋白高、中、低剂量三个小组(100、50和20mg/kg)；另外2个组分别为小鼠肺癌实体瘤模型(16只)和CTX阳性对照组腹腔注射(0.1mL/10g体重)(16只)。所有动物每天给药1次，连续10d。停药第7d后，每组取8只小鼠进行脱颈骨处死，剖取瘤块进行称重，采用肿瘤抑制率(％)＝(对照组平均瘤重－给药组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100公式计算抑瘤率。每组余下小鼠8只停药后，继续观察小鼠存活天数，计算小鼠生命延长率。生命延长率(％)＝(给药组平均存活天数－对照组平均存活天数)/对照组平均存活天数×100。
研究结果表明：纯化抗IL-4单链抗体对荷瘤小鼠抑瘤率实验结果表明，小鼠灌服抗IL-4单链抗体后，低、中、高3个剂量组(20、50、100mg/kg体重，此剂量为换算成药物剂量)对小鼠实体瘤均有明显的抑制作用。结果分析显示：在对荷瘤小鼠抑瘤方面，各纯化抗IL-4单链抗体组与模型对照组相比为差异极显著(P<0.01)(表4)；对肺癌荷瘤小鼠生命延长的影响方面，各纯化抗IL-4单链抗体组与模型对照组相比为差异极显著(P<0.01)(表5)。
表4抗IL-4单链抗体对肺癌细胞荷瘤小鼠抑瘤率的影响(n＝8)
注：与模型组比较，##P<0.01。
表5抗IL-4单链抗体对肺癌荷瘤小鼠生命延长率的影响(n＝8)
注：与模型组比较，**P<0.01。

Claims (2)

1.抗IL-4R单链抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)动物免疫：取8只18～22g的BALB/c小鼠进行免疫，将100μg/mL的Human IL-4R/CD124蛋白与Freund完全佐剂等体积混匀乳化进行初次免疫，腹部注射0.5mL乳剂/每只；2周后，对小鼠进行第1次加强免疫，2周后，对小鼠进行第2次加强免疫，1周后，眼眶取血和取脾脏，血液经过3500r/min离心15min，取血清，-80℃保存，脾脏用RNA保存液，-20℃保存；
(2)构建pCANTAB5E-scFv重组质粒：取40～80mg脾组织按照RNAiso Plus说明书方法操作提取总RNA；按照RevertAid First cDNASynthesis kit说明书方法进行cDNA第1链合成；以逆转录产物cDNA为模板，重链、轻链可变区引物序列扩增目的基因VH和VL；以合成的linker单链为模板，采用linker引物序列扩增目的基因；将扩增出来的VH、VL和linker作为模板，以scFv引物序列，通过重叠延伸PCR反应体系拼接扩增scFv；参照Not Ⅰ酶和Sfi Ⅰ酶说明书分别对scFv与pCANTAB5E载体进行双酶切，参照T4连接酶说明书将双酶切过的scFv和pCANTAB5E载体进行插入连接；将pCANTAB5E-scFv重组质粒转入感受态TG1细菌，在含有200g/L MgCl2、50mg/L氨苄青霉素、20g/L葡萄糖的SOB-AG固体培养基上37℃培养16h，取阳性重组质粒TG1单菌落进行菌落PCR鉴定，提取pCANTAB5E-scFv重组质粒，按照Sfi Ⅰ酶和Not Ⅰ酶说明书操作进行双酶切鉴定；再取10个重组质粒，按照BstN Ⅰ内切酶说明操作进行抗体库多样性鉴定；
(3)构建抗IL-4R抗体库：取含有pCANTAB5E-scFv重组质粒的转化菌1mL，加入含50mg/L氨苄青霉素、20g/L葡萄糖的2×YT-AG液体培养基至10mL，在37℃、250r/min振荡培养至A600≈0.5；加入辅助噬菌体M13K07，37℃、250r/min振荡1h，1000r/min离心10min弃上清；加入10mL2×YT-AK，37℃、250r/min振荡培养16h；1000r/min离心10min，取上清移至无菌15mL的离心管中，加入2mL PEG/NaCl混合液浓缩沉淀，置于冰上60min后离心弃上清；沉淀重悬于2mL含有20mg BSA的PBS溶液，用0.45μm滤膜过滤既获得噬菌体单链抗体库；取100μL噬菌体单链抗体库溶液，用2×YT-AG液体培养基连续3次进行10倍稀释，3个稀释度各取100μL，分别加入900μL新鲜制备的E.coli TG1，室温放置15min，并分别涂布于SOB-AG固体培养基上，37℃培养16h，计算抗体滴度；
(4)噬菌体抗体库的富集与筛选：用PBS把重组人IL-4R稀释到10μg/mL，取50μL稀释液包被96孔板，4℃孵育16h；每孔加入350μL PBS，清洗孔板后弃液，连续3次；用BSA-PBS封闭微孔室温孵育1h；每孔加入350μL PBS洗孔，弃液，连续3次；加入经过聚乙二醇沉淀的噬菌体单链抗体库，50μL/孔，37℃孵育2h弃液；先用PBS每孔洗10次再用PBST每孔洗10次；加入pH＝2.2的Gly-HCl洗脱液，50μL/孔；室温放置10min，迅速加入2mol/L，pH＝7.0的Tris 5μL/孔，吸取微孔板中的溶液到装有2mL TG1的15mL EP管中，室温放置20min；加入10mL2×YT-AG，37℃、250r/min振荡培养1h，加入4×1012噬斑形成单位的M13K07，并加入终剂量为50μg/mL的卡那霉素，37℃、250r/min振荡培养16h；离心沉淀细胞，用PEG/NaCl混合液沉淀细胞，并进行下一轮的富集筛选，如此“吸附-洗脱-感染扩增”共筛选3轮，选择抗原亲合力最强的克隆进行测序分析；
(5)scFv序列优化和pET-32a-scFv重组质粒的构建：为实现scFv基因的成功表达进行优化scFv序列，删除scFv序列上的信号肽和E-tag碱基；根据pET-32a载体上的酶切位点，将scFv基因片段上以前的酶切位点Sfi Ⅰ和Not Ⅰ酶切位点更换为Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ，选择表达His-tag作为检测标签；合成优化scFv基因片段并构建pET-32a-scFv重组质粒转导入感受态细胞E.coli BL21，取适量已转化的感受态细胞涂布含100μg/mL羧苄青霉素的TB平皿，37℃培养12～16h；
(6)pET-32a-scFv重组质粒酶切鉴定：挑取单菌落至装有15mL TB培养液的100mL培养瓶中，于37℃环境下震荡培养至0D600＝0.6～0.8，用高纯质粒小量制备试剂盒提取质粒；用限制性内切酶EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ对该质粒进行双酶切鉴定，酶切体系：重组质粒：10μL；内切酶Xho Ⅰ：2μL；10×Buffer Tango：2.5μL；ddH2O：35.5μL；酶切反应：37℃酶切4h，80℃，20min灭活Xho Ⅰ酶，待冷却至12℃，再加入2μL EcoR Ⅰ内切酶，37℃酶切4h，65℃，灭活20min，取5μL做1％琼脂糖凝胶电泳；将成功酶切的质粒测序，将测序结果进行BLAST比对，对测序结果进行预测蛋白质氨基酸序列；
(7)scFv重组蛋白的表达：挑取平板上的单个菌落接种至装有10mLTB培养基的50mL锥形瓶中，于37℃快速振荡培养至OD600＝0.2～0.4，将菌液4000rpm离心15min，取菌体用新鲜的TB培养基重悬，4000rpm离心15min以去除β-内酰胺酶，再用新鲜的TB培养基重悬，转移菌液至装有100mL TB培养基的500mL锥形瓶中，于37℃快速振荡培养至OD600＝0.4～0.6，加入终浓度为1mM的IPTG于37℃快速振荡培养诱导重组蛋白表达3h，离心取沉淀加入细菌裂解液、蛋白酶混合抑制剂及溶菌酶等裂解的细菌，于4℃条件下13000rpm离心得到不溶性的包涵体；将包涵体重悬于含有8M尿素的Binding Buffer中，置于冰浴中使包涵体溶解，取100μL包涵体混合液作为样品进行SDS-PAGE进行检测；
(8)SDS-PAGE分析：分别取诱导0h，1h，2h和3h时间段的样本用100μL PBS重悬，加入20μL的4×蛋白上样缓冲液混合均匀，于沸水中加热5～8min使菌体破裂并使菌体内的总蛋白变性，待样品冷却至常温后于4℃环境下12000rpm离心5min，取上清中的总蛋白小管分装保存于-80℃，取诱导0h，1h，2h和3h时间段的处理样本进行SDS-PAGE，电泳结束后取出凝胶进行考马斯亮蓝染色；同时以未诱导的含pET-32a-scFv的细菌表达蛋白为对照；
(9)表达蛋白的复性与纯化：经SDS-PAGE分析确定pET-32a-scFv重组质粒为包涵体表达；进行表达菌大量培养，加入终浓度为1mM的IPTG，于37℃快速振荡培养诱导重组蛋白表达3h，菌液4000rpm离心15min取菌体，按照PH0311细菌细胞总蛋白提取试剂盒说明书操作进行包涵体蛋白的提取处理后，将10mL包涵体装入截留分子量为10KD的透析袋内，将透析袋置于1000mL的复性液中，于4℃环境下作用2～4h后换新的复性液作用6～8h，再换用新的复性液作用至少2h甚至可以作用过夜；将透析袋内复性后的液体于4℃条件下13000rpm离心15min，取上清和沉淀，保留部分上清作为样本，按照Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒说明书操作，将复性后的上清过柱纯化；
(10)Western blot分析：选取纯化前后样本经过SDS-PAGE后，转膜并孵育一抗鼠源抗His-tag抗体、二抗兔抗鼠IgG抗体，最后的检测方法按照AEC底物显色试剂盒说明书操作制备显色液，用显色液将膜完全浸润，室温反应3～10min，用去离子水冲洗终止反应，观察结果。
2.抗IL-4R单链抗体作为制备抗肿瘤药物的应用。
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