CN106892980B - 抗vegfr2单克隆抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于抗体药物领域，本发明公开了利用噬菌体抗体库技术筛选并利用基因工程方法制备的全人源抗人VEGFR2单克隆抗体，并公开了包含编码该单克隆抗体的多核苷酸的载体、宿主细胞及用途。本发明所述单克隆抗体通过结合VEGFR2，阻断VEGF与VEGR2结合，不再诱发受体二聚化，以及后续的胞内酪氨酸激酶结构域的酪氨酸残基磷酸化和激活下游信号通路，包括激活磷脂酶C，增加细胞内钙离子浓度等，引发包括血管内皮细胞增殖、存活、细胞骨架重排、细胞迁移、基因表达等，最终阻断由于VEGF结合VEGFR2并诱导其二聚化而引起血管增生。本发明所述单克隆抗体可用于治疗由肿瘤新生血管引起的疾病。

Description

抗VEGFR2单克隆抗体及其应用

本申请要求于2017年1月25日提交中国专利局、申请号为201710060867.X、发明名称为“抗VEGFR2单克隆抗体及其应用”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。

技术领域

本发明属于抗体药物领域，具体涉及全人源抗VEGFR2单克隆抗体及其应用。

背景技术

血管新生是指已存的血管(毛细血管和小静脉)通过出芽或分裂的方式产生新的血管，其在许多生理过程中发挥重要作用，如胚胎发生、伤口愈合、炎症反应和月经等。同时，血管新生在一些病理过程中同样扮演重要角色，如失控的血管新生是肿瘤增殖及转移的主要原因。血管新生也和糖尿病视网膜病变、风湿性关节炎及银屑病等其他疾病密切相关。所以抑制血管新生成为治疗这些疾病的可行方法。

在血管新生过程中，血管内皮细胞生长因子(VEGF)起着重要作用，能强烈地刺激血管内皮细胞增殖。VEGF结合的受体包括VEGFR1(也被称作Flt-1)和VEGFR2(也被称作Flk-1)。VEGFR1和VEGFR2属于III型受体酪氨酸激酶家族，胞外区由7个免疫球蛋白样结构域组成，含配体结合域和受体二聚化结构域，中间包含一个细胞跨膜区，胞内含有一个酪氨酸激酶结构域。VEGFR2介导VEGF的多种效应，包括内皮细胞增殖、血管增生和渗透，而VEGFR1似乎并没有直接参与内皮细胞增殖和血管增生。VEGF二聚体结合VEGFR2后诱发受体二聚化，胞内酪氨酸激酶结构域的酪氨酸残基磷酸化，从而激活下游信号通路，包括激活磷脂酶C，增加细胞内钙离子浓度等，引发包括血管内皮细胞增殖、存活、细胞骨架重排、细胞迁移、基因表达等，最终引起血管增生。

因此，VEGF及VEGFR2是很好的治疗靶点，抑制该信号通路理论上能够抑制血管新生，从而治疗血管新生相关的疾病。美国FDA于2004年批准靶向VEGF的抗体贝伐单抗(Avastin)，该药在临床与化疗药物联合治疗结肠癌时可明显延长病人生命，但因同时抑制了VEGF的正常生理功能，病人使用后出现高血压、出血、血栓形成等副反应。

鉴于VEGFR2在VEGF信号通路中的重要作用，抑制VEGFR2也是一种抑制血管新生的策略。相对于VEGF而言，靶向VEGFR2的药物针对性更强，安全性更好。FDA于2014年批准上市的Ramucirumab(IMC-1121B)就是靶向VEGFR2的抗体药物。

抗体是由抗原刺激机体后所形成的一类具有与该抗原发生特异性结合反应的免疫球蛋白(immunoglobubin，Ig)。已知有IgG、IgA、IgM、IgD和IgE等5类免疫球蛋白，普遍存在于生物体内的血液、体液、外分泌液及某些细胞(如淋巴细胞)的细胞膜上。作为生物药物的重要组成部分，抗体已经成为类别最大且发展最快的生物药物。而单克隆抗体更是由于其针对靶点的高度特异性而在临床上成功用于治疗肿瘤、自身免疫性疾病、感染性疾病和移植排斥反应等多种疾病。

在抗体药物发展初期，鼠源单克隆抗体为人类疾病的研究起到了重大的推动作用，但由于其是鼠源的，在病人中引发了严重的免疫反应，严重阻碍了抗体药物的发展。随着抗体人源化技术的发展，抗体药物产业化的瓶颈被打破。目前临床上使用的治疗性单克隆抗体包括人鼠嵌合抗体、人源化抗体及全人源抗体，其中全人源单克隆抗体由于高度的亲和力及低免疫原性备受青睐。

全人源的单克隆抗体可通过噬菌体展示技术、核糖体展示技术、抗体人源化小鼠技术等方法获得。其中，抗体的噬菌体展示技术(PDT)是将抗体V区片段融合噬菌体表面蛋白(g3)后展示到噬菌体表面，然后针对不同抗原对噬菌体库进行筛选，最终得到特异的抗体。该技术模拟了机体的免疫筛选，从人工建立的噬菌体文库中筛选得到抗体。抗体噬菌体展示技术除了能筛选针对不同抗原的特异抗体外，还能对抗体进一步突变高变区而提高其抗原亲和力。

尽管已经通过上述技术获得了一些在治疗上有很大优势的人源化单克隆抗体，但是筛选出具有所需性质和功能的人源化单克隆抗体绝非易事，现实中依然存在对这类人源化单克隆抗体的迫切需求。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供全人源抗人VEGFR2单克隆抗体，编码该单克隆抗体的多核苷酸的载体、宿主细胞及其用途。由本发明涉及的抗体基因可变区的序列，可构建全长抗体分子作为药物用于临床上由于新生血管生成所导致的适应症的使用。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明通过噬菌体展示技术筛选针对VEGFR2的人源化抗体，并利用基因工程方法得到完整抗体，从而提供用于治疗血管新生相关疾病的药物。具体的抗体的制造及相关检测方法如下：通过提取不同人的外周血淋巴细胞，提取总RNA并反转录成cDNA，然后用简并引物进行抗体可变区基因的扩增，并酶切连接到噬菌体展示载体pCANTAB5E，克隆转化到可用于噬菌体展示的TG1细胞，构建出10⁸的人重链可变区和轻链可变区组合的单链抗体库；通过噬菌体展示技术将单链抗体展示在噬菌体表面，再以VEGFR2抗原进行淘选、富集，筛选大量和VEGFR2抗原结合的单链抗体基因；然后将单个的单链抗体进行诱导表达，并使用VEGFR2进行ELISA筛选，筛选出和VEGFR2结合的全新人源抗体重链可变区；然后构建转换成全长IgG抗体，使用瞬时转染、培养和少量亲和纯化(Protein A)制备少量纯化抗体，以细胞毒功能测试(ADCC、CDC和凋亡实验)进行筛选鉴定。在经此筛选出来的一组有良好细胞毒功效的抗体分子，再对这些抗体可变区特别是CDRs区序列检索，确定该组具备VEGFR2特异性的细胞毒功效的抗体为首次发现的新分子。

本发明所述方法构建了高容量高多样性抗体库，从大容量抗体库中筛选出和VEGFR2结合且能阻断其与配体VEGF结合的抗体，且筛选出的抗体具有细胞活性。

本发明所述抗人VEGFR2单克隆抗体具有重链可变区和轻链可变区：

(Ⅰ)所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:1-6任一项所示；或者经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸，与(Ⅰ)所示的氨基酸序列至少有80％同源性的、且功能相同或相似的氨基酸序列；

和/或

(Ⅱ)所述轻链可变区的氨基酸序列，如SEQ ID No:7-12任一项所示；者经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸，与(Ⅱ)所示的氨基酸序列至少有80％同源性的、且功能相同或相似的氨基酸序列。

在本发明的一些具体实施方案中，所述多个为2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个或32个。

在本发明的一些具体实施方案中，所述抗VEGFR2单克隆抗体具有：

(ⅰ)氨基酸序列为SEQ ID NO:1,2,3,4,5,6的重链可变区，和氨基酸序列为SEQ IDNO:7的轻链可变区；或

(ii)氨基酸序列为SEQ ID NO:1,2,3,4,5,6的重链可变区，和氨基酸序列为SEQID NO:8的轻链可变区；或

(ⅲ)氨基酸序列为SEQ ID NO:1,2,3,4,5,6的重链可变区，和氨基酸序列为SEQID NO:9的轻链可变区；或

(ⅳ)氨基酸序列为SEQ ID NO:1,2,3,4,5,6的重链可变区，和氨基酸序列为SEQID NO:10的轻链可变区；或

(Ⅴ)氨基酸序列为SEQ ID NO:1,2,3,4,5,6的重链可变区，和氨基酸序列为SEQID NO:11的轻链可变区；或

(VI)氨基酸序列为SEQ ID NO:1,2,3,4,5,6的重链可变区，和氨基酸序列为SEQID NO:12的轻链可变区。

进一步的，优选的，所述抗VEGFR2单克隆抗体具有如下任一组重链可变区和轻链可变区：

1)重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO:9所示；

2)重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO:9所示；

3)重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO:12所示；

4)重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO:9所示；

5)重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO:11所示；

6)重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO:12所示。

本发明所述的单克隆抗体不仅包括可变区，还包括恒定区。优选的，所述的恒定区为人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的任意一种。

更优选的，所述恒定区为人IgG1。

本发明所述的单克隆抗体是全人源的。

本发明还提供了编码所述抗CD47单克隆抗体的核苷酸。

本发明提供了一种表达载体，包含编码所述单克隆抗体的核苷酸。

本发明提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞经由本发明所述的表达载体转化或转染而来，为原核细胞或真核细胞。

本发明还提供了一种结合物，包含与化学标记或生物标记共价连接的所述抗人VEGFR2单克隆抗体。

其中，所述化学标记包括但不限于同位素、免疫毒素、化学药物。

优选的，所述免疫毒素为黄曲霉毒素、白喉毒素、绿脓杆菌外毒素、蓖麻毒蛋白、相思子毒蛋白、槲寄生凝集素、蒴莲根毒素、PAP、造草素、白树毒素或丝瓜毒素。

所述生物标记包括但不限于生物素、亲和素或酶标记。

优选的，所述酶标记为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。

本发明还提供了一种偶联物，其由所述抗人VEGFR2单克隆抗体和/或所述结合物与固体介质或半固体介质偶联形成。

优选的，所述固体介质或非固体介质选自胶体金、聚苯乙烯平板或珠粒。

本发明还提供了一种药物组合物，包括所述抗人VEGFR2单克隆抗体和/或所述结合物和/或所述偶联物。

本发明还提供了一种试剂盒，包括所述抗人VEGFR2单克隆抗体和/或所述结合物和/或所述偶联物。

本发明还提供了所述抗人VEGFR2单克隆抗体和/或所述结合物和/或所述偶联物和/或所述药物组合物在制备治疗疾病的药物中的应用。

其中，所述疾病为血管新生相关的疾病，包括但不局限于非小细胞肺癌、转移性非小细胞肺癌、神经胶质瘤、结直肠癌、肝细胞癌、转移性肝细胞癌、HER2阴性的转移性乳腺癌、转移性胃腺癌、转移性结直肠癌、转移性黑色素瘤、转移性肾细胞癌。

本发明公开了利用噬菌体抗体库技术筛选并利用基因工程方法制备的全人源抗人VEGFR2单克隆抗体，并公开了包含编码该单克隆抗体的多核苷酸的载体、宿主细胞及用途。本发明所述单克隆抗体通过结合VEGFR2，阻断VEGF与VEGR2结合，不再诱发受体二聚化，以及后续的胞内酪氨酸激酶结构域的酪氨酸残基磷酸化和激活下游信号通路，包括激活磷脂酶C，增加细胞内钙离子浓度等，引发包括血管内皮细胞增殖、存活、细胞骨架重排、细胞迁移、基因表达等，最终阻断由于VEGF结合VEGFR2并诱导其二聚化而引起血管增生。本发明所述单克隆抗体可用于治疗由肿瘤新生血管引起的疾病，所述疾病包括但不局限于下列肿瘤：非小细胞肺癌、转移性非小细胞肺癌、肝细胞癌、转移性肝细胞癌、HER2阴性的转移性乳腺癌、转移性胃腺癌、转移性结直肠癌、转移性黑色素瘤、转移性肾细胞癌。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为PCAb抗体SDS-PAGE电泳检测图，其中，泳道M：蛋白质标记PageRulerPrestained Protein ladder(厂家：Thermo，货号：26616)；泳道1为还原PCAb；泳道2为非还原PCAb；

图2为噬菌粒载体pCANTAB5E-SF载体图谱；

图3为人PBMC总RNA电泳检测图，其中，泳道M：DNA标记DL2000；泳道1：总RNA；

图4为人VH、VL PCR扩增产物电泳检测图，其中，泳道M：DNA标记DL2000；泳道1～4：人VH PCR扩增产物；泳道5～8：人VL PCR扩增产物；

图5为6个优选抗体300ml瞬时转染表达纯化产物SDS-PAGE检测结图，其中，泳道M：蛋白质标记PageRuler Prestained Protein ladder(厂家：Thermo，货号：26616)；泳道1～6依次为还原043HAb-1～043HAb-6；泳道7～12依次为非还原043HAb-1～043HAb-6；

图6为优选抗体抗原表位竞争ELISA结果；

图7为优选抗体细胞活性检测结果，其中，7-A为优选抗体043HAb-1细胞活性检测结果；7-B为优选抗体043HAb-2细胞活性检测结果；7-C为优选抗体043HAb-3细胞活性检测结果；7-D为优选抗体043HAb-4细胞活性检测结果；7-E为优选抗体043HAb-5细胞活性检测结果；7-F为优选抗体043HAb-6细胞活性检测结果。

具体实施方式

本发明公开了全人源抗VEGFR2单克隆抗体及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

下面将结合实施例进一步阐述本发明。下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的原料及试剂如无特别说明，均可轻易从市场获取。

实施例1：阳性抗体(PCAb)基因合成、表达载体构建及抗体的制备

1、参考专利CN 1345334A，选择其生物学活性好的一个抗体作为阳性抗体(PCAb)，PCAb氨基酸序列如下：

PCAbH，如SEQ ID NO:13所示：

QVKLQQSGAELVGSGASVKLSCTTSGFNIKDFYMHWVKQRPEQGLEWIGWIDPENGDSDYAPKFQGKATMTADSSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCNAYYGDYEGYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

PCAbL，如SEQ ID NO:14所示：

DIELTQSPAIMSASPGEKVTITCSASSSVSYMHWFQQKPGTSPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRSSYPFTFGSGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

2、将上述抗体序列所对应的氨基酸序列进行密码子人工优化，并委托金斯瑞生物科技有限公司合成优化后的DNA，克隆到pUC57-Simple(金斯瑞生物科技有限公司提供)载体中，获得pUC57-Simple-PCAbH和pUC57-Simple-PCAbL质粒。

3、将质粒pUC57simple-PCAbH、pUC57simple-PCAbL进行Xba I和BamH I酶切后，琼脂糖凝胶电泳回收得到基因片段PCAbH、PCAbL，分别与pGS003载体进行连接，重组构建获得pGS003-PCAbH和pGS003-PCAbL表达载体。

4、将上面构建的重组质粒pGS003-PCAbH和pGS003-PCAbL转染FreeStyleTM293-F细胞7天后，将培养液进行高速离心、微孔滤膜抽真空过滤，根据厂家提供的操作方法采用Protein A柱(蛋白纯化液相色谱系统/AKTA Purifier 10，GE)进行纯化，得到纯化后的抗体PCAb，见图1泳道2。取纯化后抗体，采用还原条件的SDS-PAGE分析纯化产物，鉴定了抗体的性质和纯度，还原条件下重链为50KD，轻链为25KD，结果如图1泳道1所示。

实施例2：天然人源单链抗体噬菌体展示文库的构建

1、噬菌粒载体的构建

选择pCANTAB5E作为噬菌体展示载体，根据克隆及噬菌体展示需要进行载体改造，改造结果如图2。将SfiI-NcoI-XhoI+Linker+NheI-NotI序列(SED ID NO:15)进行基因合成，然后用SfiI和NotI进行酶切，并与pCANTAB5E载体进行连接反应重组构建获得改造后载体pCANTAB5E-SF。

2、PBMC分离及mRNA抽提

无菌抽取健康志愿者新鲜外周血，使用淋巴细胞分离液(GE)分离出其中的淋巴细胞，用Invitrogen公司的

reagent(15596-026)提取100×10⁶个细胞的总RNA，结果如图3所示。

3、抗体库引物设计、合成及RT-PCR

根据Kabat、V-base2及IMGT网站公布的抗体基因序列信息，设计用于扩增人抗体重链和轻链的引物以及正确的酶切位点，金斯瑞生物科技有限公司合成引物，PAGE纯化，引物序列见表1和表2：

表1、扩增人重链可变区的引物

注：R＝A/G，Y＝C/T，M＝A/C，K＝G/T，S＝C/G，W＝A/T，H＝A/C/T，B＝C/G/T，V＝A/C/G，D＝A/G/T

表2、扩增人轻链可变区的引物

引物名称	序列(5’→3’)
		h-k_F1	ggtggcggtggtagtgctagcGAWAYWGTGATGACMCAGYMTC
h-k_F2	ggtggcggtggtagtgctagcGAAGTTATGTTGATGCAGTCTCT
		h-k_F3	ggtggcggtggtagtgctagcGAWGTTGTGMTGACAYRGTC
h-k_F4	ggtggcggtggtagtgctagcRHCATCYRGATGACCCAGTCTSCA
		h-k_F5	ggtggcggtggtagtgctagcRACATCCAGATGAATTCAGTCTCC
h-k_F6	ggtggcggtggtagtgctagcGAMATTSTGYTGACHCAGWCTCCA
		h-k_F7	ggtggcggtggtagtgctagcGABAYTGTGATSRCCCAGACTCCA
h-k_F8	ggtggcggtggtagtgctagcRMCATCCAGDTGAYBCAGYCTCC
		h-k_F9	ggtggcggtggtagtgctagcGATGCTGYGAWGACCCAACCTCCA
h-k_R1	ATGAGTTTTTGTTCTGCGGCCGCTTTGATHTCCASYTTGGTCCCH
		h-k_R2	ATGAGTTTTTGTTCTGCGGCCGCTTTAATCTCCAGTCGTGTCCCT
h-λ_F1	ggtggcggtggtagtgctagcCAGYCTGYKCTGACYCAGV
		h-λ_F2	ggtggcggtggtagtgctagcCAGGCAGGGCWGACTCAGCMMC
h-λ_F3	ggtggcggtggtagtgctagcCAGCYTGTGCTGACTCARTCRYCC
		h-λ_F4	ggtggcggtggtagtgctagcCACGTTATACTGACTCAACCGCCC
h-λ_F5	ggtggcggtggtagtgctagcCRGCCYGTGCTGACTCARCYGCC
		h-λ_F6	ggtggcggtggtagtgctagcCTGSCTGTGCTRACTCAGGCCCC
h-λ_F7	ggtggcggtggtagtgctagcCAGBCTGTGCTGACTCAGCCR
		h-λ_F8	ggtggcggtggtagtgctagcCAGTCTGTSBTGACGCAGCCGCC
h-λ_R1	ATGAGTTTTTGTTCTGCGGCCGCKAGGACGGTSACCTTGGTSCCAST
		h-λ_R2	ATGAGTTTTTGTTCTGCGGCCGCTAGGACGGTCAGCTCSGTCCCCTC
h-λ_R3	ATGAGTTTTTGTTCTGCGGCCGCKAGGRCGGTCAGCTKGGTSCCTCC
		h-λ_R4	ATGAGTTTTTGTTCTGCGGCCGCTAAAATGATCAGCTGGGTTCCTCC

注：R＝A/G，Y＝C/T，M＝A/C，K＝G/T，S＝C/G，W＝A/T，H＝A/C/T，B＝C/G/T，V＝A/C/G，D＝A/G/T

采用Takara公司的PrimeScriptTMII第一链cDNA合成试剂盒(6210A)中的OligodT引物，以从PBMC中抽提的总RNA为模板，反转录合成第一链cDNA，使用上述表1和表2的引物通过PCR技术扩增得到抗体基因的重链可变区VH和轻链可变区VL，PCR扩增的条件为95℃5min，按下列参数循环25次：95℃变性30S，56℃退火30S，72℃延伸1min，最后一个循环72℃延伸3min。扩增完成后电泳检测，见图4。

4、人源VH和VL单链抗体库的构建

先将VL通过NheI和NotI克隆到pCANTAB5E-SF载体上，然后将VH通过NcoI和XhoI克隆到上一步的载体上。具体操作如下：

将pCANTAB5E-SF载体及扩增纯化好的人轻链可变区PCR产物用NheI和NotI进行酶切。将酶切好的4.4μg载体与1μg片段进行连接，连接产物经纯化后电转到10支200μl TG1电转感受态细胞(2.5kV，2cm规格电击杯)中，加入SOC后37℃培养1h，取少量复苏菌梯度稀释涂平板计算库容，剩余菌液涂布到10个Φ15cm平板上，过夜培养；第二天计算库容量为2.2×10⁸单个克隆，用50ml 2YT刮洗Φ15cm平板获取轻链抗体库，取部分菌液制备小提质粒，剩余文库菌液加入终浓度30％(V/V)的甘油保存于-80℃。

将上述轻链抗体库质粒及扩增纯化好的人重链可变区PCR产物用NcoI和XhoI进行酶切。将酶切好的5.8μg载体与1.2μg片段进行连接，连接产物经纯化后电转到20支200μlTG1电转感受态细胞(2.5kV，2cm规格电击杯)中，加入SOC后37℃培养1h，取部分复苏菌梯度稀释涂平板计算库容，剩余菌液涂布到20个Φ15cm平板上，过夜培养；第二天计算库容量为5.6×10⁸单个克隆，用50ml 2YT刮洗Φ15cm平板获取人源VH和VL单链抗体库，取部分菌液制备小提质粒，剩余文库菌液加入终浓度30％(V/V)的甘油保存于-80℃。

实施例3：人源抗体库的噬菌体展示及筛选

1、抗体库的噬菌体展示和淘选

取100倍库容量的上述人源VH和VL单链抗体库菌液接种880ml2YT-AG培养基(含100μg/ml氨苄青霉素和2％葡萄糖)，37℃、200rpm培养至OD600＝0.5～0.6，加入细胞密度100倍的辅助噬菌体，侵染1.5h，离心收集菌体，用400ml2YT-AK培养基(含100μg/ml氨苄青霉素和75μg/ml卡那霉素)重悬细胞，30℃、200rpm培养过夜。

将上一步培养物10000g、4℃离心20min，收集上清加入1/4体积的PEG/NaCl，混匀，冰上静置1h；12000g 4℃离心25min，弃上清，离心管倒扣在平板纸上，使液体除尽；用2ml预冷1×PBS重悬噬菌体沉淀，12000g 4℃离心10min；转移上清到新的15ml离心管中，加入终浓度为3％BSA，即获得第一轮起始噬菌体。以VEGFR2-His(Sino Biological)为抗原包被免疫管，采用2％的M-PBS封闭；然后加入10¹³的第一轮起始噬菌体进行抗体抗原结合，用PBST洗去未结合的噬菌体，用1ml Glycine-HCl(pH2.2)洗脱噬菌体，将洗脱下来的噬菌体重新感染TG1，进行洗脱产物的扩增，PEG/NaCl沉淀纯化噬菌体用于下一轮筛选。共进行4轮噬菌体库的富集筛选，抗原量依次降低，洗涤强度依次增强，每轮洗脱产物均进行滴度测定。

2、单克隆的诱导表达及ELISA筛选

将第1～4轮淘选后的菌液有限稀释涂布平板，培养过夜；挑取单克隆于分装有0.5ml/孔2YT-AG培养基的96孔深孔板培养过夜；然后将过夜培养物按照1:10转接至含有0.5ml/孔2YT-AG培养基的96孔深孔板中，培养至OD600＝0.5～0.6，3000g离心收集菌体，用2YT-AI培养基(含100μg/ml氨苄青霉素和1mM IPTG)重悬菌体，30℃诱导过夜，第二天离心转移上清至洁净的96孔深孔板，加入终浓度为3％BSA，获得单克隆噬菌体样品。

以VEGFR2-His为抗原包被96孔酶标板，封闭后向每孔中加入50μl单克隆噬菌体样品，25℃孵育1h；然后向每孔中加入200μl PBST，振荡5～10S，弃溶液，重复3～5次；之后向每孔中加入抗M13-HRP抗体PBS稀释液50μl，25℃孵育1h；然后向每孔中加入200μl PBST，振荡5～10S，弃溶液，重复5次；向每孔中加入50μl TMB显色液，显色3～10min(具体显色时间视显色速度而定)，之后向每孔中加入50μl 1M H₂SO₄终止显色；使用酶标仪测定OD450值。依据单克隆噬菌体ELISA数据选定360个ELISA测定阳性样品，进行竞争性ELISA筛选，将阳性对照抗体稀释至200μg/ml，取50μl稀释液与50μl单克隆噬菌体样品混合后，进行上面步骤的ELISA，结果显示其中有30个单克隆与阳性对照抗体存在表位竞争，选定这些克隆进行测序；取上述在96孔板深孔板2YT-AG培养基中的过夜培养菌液，进行测序分析，最终获得独特的单克隆抗体的可变区序列如SEQ ID NO:1～12所示。

实施例4：全长抗体制备

1、全长抗体瞬时转染表达载体的构建

分别选择pGS003-hIgG1CH和pGS003-hIgKCL作为构建抗人VEGFR2全长抗体的重链和轻链的表达载体。根据VH、VL的基因序列及载体中的多克隆位点设计引物。经PCR扩增后，使用体外重组的方法(苏州泓迅，iMulli多片段重组克隆试剂盒)将6个VH和6个VL抗体基因分别克隆到pGS003-hIgG1CH和pGS003-hIgKCL，如表3。测序鉴定抗体基因正确插入后，将重组表达载体转化大肠杆菌TOP10F’，挑取单菌落接种于含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃振荡培养16小时。使用Zymo Research的去内毒素大提试剂盒抽提质粒，最后将质粒溶于1ml超纯水，用分光光度计测定质粒浓度和OD260/280。OD260/280在1.8～1.9为纯度较高的质粒DNA。

表3、重链和轻链瞬时转染表达载体列表

重链表达载体名称	重链可变区序列	轻链表达载体名称	轻链可变区序列
				H1	SEQ ID NO:1	L1	SEQ ID NO:7
H2	SEQ ID NO:2	L2	SEQ ID NO:8
				H3	SEQ ID NO:3	L3	SEQ ID NO:9
H4	SEQ ID NO:4	L4	SEQ ID NO:10
				H5	SEQ ID NO:5	L5	SEQ ID NO:11
H6	SEQ ID NO:6	L6	SEQ ID NO:12

2、在哺乳动物细胞293E中的转染、表达和检测

将上述6个重链表达载体和6个轻链表达载体两两组合(共36种组合)后进行2ml293E体系的瞬时转染表达评估，检测表达量及抗体与VEGFR2结合的ELISA检测值，结果见表4。根据表达量及抗体与VEGFR2结合的ELISA检测值，选择相对低的EC50值、相对高的ELISARmax值，优选H1L3、H2L3、H3L6、H5L3、H5L5、H6L6这6个全长抗体，命名为043HAb-1、043HAb-2、043HAb-3、043HAb-4、043HAb-5、043HAb-6。

表4、6×6组合全长抗体小体系瞬时转染表达的表达量、EC50值及ELISA Rmax值

使用293E在Freestyle培养基中进行6个优选抗体的瞬时转染表达。转染前24小时，在1L细胞培养瓶中接种0.5×10⁶细胞/ml的293E细胞300ml，37℃5％CO₂温箱中120rpm摇床培养。转染时先取300μl的293fectin加入到5.7ml的OPtiMEM中，充分混匀后，室温孵育2分钟；同时将重链和轻链表达质粒各300μg使用OPtiMEM稀释至6ml。将上述稀释后的转染试剂及质粒充分混合，室温孵育15分钟，然后将混合物全部加入细胞中，混匀，37℃5％CO₂温箱中120rpm摇床培养7天。

3、抗体的纯化及检测

2000g、20min离心细胞培养液，收集上清，用Octet检测上清中抗体表达量，见表5。

表5、6个优选抗体300ml瞬时转染表达的表达量检测

将上清用0.22微米的滤膜过滤，然后过MabSelect SuRe亲和层析柱(GE)，20mM枸橼酸-枸橼酸纳，pH3.0洗脱，用1M Tris base调节pH至中性，加入10xPBS调节成等渗溶液。4～20％梯度胶(金斯瑞生物科技有限公司)进行SDS-PAGE检测纯化蛋白质，结果见图5泳道7～12。取纯化后抗体，采用还原条件的SDS-PAGE分析纯化产物，鉴定了抗体的性质和纯度，还原条件下重链为50KD，轻链为25KD，结果如图1泳道1～6所示。

实施例5：优选抗体抗原表位竞争ELISA

1、包被：人VEGFR2-His用PBS稀释成1μg/ml，加至96孔酶标板中，每孔50μl，4℃下孵育过夜。

2、封闭：洗板三次后用3％BSA封闭，每孔250μl，37℃条件下孵育2小时。

3、加候选抗体：洗板前分别使用0.5μg/ml生物素(Biotin)标记的阳性抗体与起始浓度为0.15mg/ml 2倍稀释12个梯度样品混合(阳性抗体起始浓度为0.3mg/ml)，洗板3次后，加入候选抗体样品或阳性对照或阴性对照。每孔50μl，25℃条件下1小时。

4、加二抗：洗板3次后，加入HRP标记链霉亲和素(1:10000)，每孔50μl，25℃条件下反应1小时。

5、显色：洗板4次后，加TMB显色液，每孔50μl，室温下避光显色10分钟。

6、终止：直接加入50μl每孔的终止液终止反应。

7、检测：终止反应后立即把酶标板放入酶标仪中，在450nm处测其OD值，保存原始数据整理如图6。043HAb-1～43HAb-6优选抗体均与阳性抗体有抗原表位竞争现象。

实施例6：优选抗体亲和力测定

使用Biacore T200仪器检测抗人VEGFR2全长抗体的亲和力。具体方法如下：使用GE Healthcare公司的人抗体捕获试剂盒将人的抗体偶联在CM5生物传感芯片(GE)上，芯片上的抗人Fc抗体捕获优选抗体或阳性抗体，不同浓度的人VEGFR2以30μl/min流速流过芯片上的候选抗体，人VEGFR2与候选抗体进行结合，结合时间为120s，解离时间为300s。用BIAevalution软件(GE)进行动力学拟合，获得亲和力常数结果如下表6，结果表明6个优选抗体均与人VEGFR2有良好的结合活性。

表6、候选抗体与人VEGFR2的亲和力测定结果

抗体名称	Ka(1/Ms)	Kd(1/s)	KD(M)
				043HAb-1	1.19E+05	6.72E-05	5.67E-10
043HAb-2	2.33E+05	4.92E-05	2.11E-10
				043HAb-3	1.75E+05	8.71E-05	4.98E-10
043HAb-4	1.53E+05	6.48E-05	4.25E-10
				043HAb-5	1.75E+05	8.69E-05	4.97E-10
043HAb-6	2.71E+05	7.51E-05	2.77E-10
				阳性抗体	1.03E+05	4.68E-05	4.57E-10

注：E+05：×10⁵；E-05：×10^-5；E-10：×10^-10

实施例7：优选抗体细胞活性检测

人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)表达VEGFR2，优选抗体或阳性抗体通过与VEGFR2特异性结合，阻断VEGFR2与VEGF的相互作用，从而抑制HUVEC的增殖。故可通过考察药物抑制HUVEC细胞的增殖来检测其细胞活性，具体步骤如下。

1、对照品溶液及供试品溶液的制备：取对照品(阳性抗体)及供试品(优选抗体)，根据蛋白标示量，用EBMTM-2基础培养基将对照品及供试品预稀释至800μg/ml，每次最大稀释倍数不超过25倍。以800μg/ml为最大浓度，在96孔细胞培养板中将对照品及供试品进行梯度稀释：前8个浓度进行4倍梯度稀释，后2个浓度进行10倍梯度稀释，每个浓度至少做2个复孔，终浓度分别为200000、50000、12500、3125、781.25、195.31、48.83、12.20、1.22、0.12ng/ml。

2、细胞铺板：取5代以内(包含5代)细胞活率大于或等于90％的HUVEC细胞，用EBM分析培养基配成每1ml含2.5×10⁴～3.5×10⁴个细胞的细胞悬液，以100μl/孔加入96孔细胞培养板-1，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养约3.5h。

3、对照品溶液及供试品溶液的加样：取细胞贴壁后的96孔细胞培养板-1，以50μl/孔将“对照品溶液及供试品溶液的制备”步骤中96孔细胞培养板中的稀释液依次加入到96孔细胞培养板-1，其余各孔则以50μl/孔加入EBMTM-2基础培养基。完成加样操作后，将细胞培养板-1置于37℃、5％CO₂培养箱中培养约1.5h。

4、VEGF的加样：将VEGF工作液以50μl/孔加入96孔细胞培养板-1第B～G行所对应的孔中，其余各孔则以50μl/孔加入EBMTM-2基础培养基。完成加样操作后，将96孔细胞培养板-1置于37℃、5％CO₂培养箱中培养92～94h。

5、显色及读板操作：每孔加入20μl CCK-8显色液，将96孔细胞培养板-1放入37℃、5％CO₂培养箱继续培养约3.5h。取出96孔细胞培养板-1，置于酶标仪中，设置读板前振动30S，以450nm为检测波长，以620nm为参比波长，测定吸光度。

以对照品或供试品浓度为横坐标，以平均吸光度为纵坐标，采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理，计算对照品和供试品的半效抑制浓度(IC50)，具体计算公式如下：

具体检测结果见表7和图7，在本实验条件下，043HAb-1、043HAb-2、043HAb-3、043HAb-4、043HAb-5、043HAb-6对VEGF诱导的HUVEC细胞增殖的50％抑制浓度，即IC50值分别为5.57、5.42、4.86、4.13、2.72、0.965μg/ml，而在相同实验条件下，阳性抗体的IC50值分别为2.92、2.75、2.47、2.06、3.07、2.76μg/ml，显示043HAb-6具有高于阳性抗体的体外抗血管内皮细胞增殖的活性。

表7、优选抗体细胞活性检测结果

对照品	IC50(nM？)	样品	IC50	活性
					阳性抗体	2.92	043HAb-1	5.57	52.4％
阳性抗体	2.75	043HAb-2	5.42	50.7％
					阳性抗体	2.47	043HAb-3	4.86	50.8％
阳性抗体	2.06	043HAb-4	4.13	49.9％
					阳性抗体	3.07	043HAb-5	2.72	112.9％
阳性抗体	2.76	043HAb-6	0.965	286.0％

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 长春金赛药业有限责任公司

<120> 抗VEGFR2单克隆抗体及其应用

<130> MP1706486

<160> 15

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Gln Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Ser Asn Ile Glu Asp Phe

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asp Gly Asp Ser Asp Tyr Ala Pro Met Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Ile Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Gly Leu Arg Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Asn Ala Tyr Tyr Gly Glu Tyr Glu Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ala

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 2

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Gln Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Ser Asn Ile Glu Asp Phe

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asp Gly Asp Ser Asp Tyr Ala Pro Met Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Ile Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Gly Leu Arg Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Asn Ala Tyr Tyr Gly Glu Tyr Glu Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ala

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 3

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Gln Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Ser Asn Ile Lys Asp Ile

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Trp Ile Asp Pro Gly Asp Gly Asp Ser Asp Tyr Ala Pro Met Phe

50 55 60

Gln Asp Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Ala Ser Ile Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Gly Leu Arg Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ile Ala Tyr Tyr Gly Glu Tyr Glu Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 4

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Gln Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Phe Asn Ile Glu Asp Ile

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asp Gly Asp Ser Asp Tyr Ala Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Asp Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Ile Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Gly Leu Arg Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Asn Ala Tyr Tyr Gly Glu Tyr Glu Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 5

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Gln Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Ser Asn Ile Glu Asp Phe

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Trp Ile Asp Pro Gly Asp Gly Asp Ser Asp Tyr Ala Pro Met Phe

50 55 60

Gln Asp Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Ile Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Gly Leu Arg Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

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Ile Ala Tyr Tyr Gly Glu Tyr Glu Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 6

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Gln Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Pro Asn Ile Glu Asp Ile

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Trp Ile Asp Pro Gly Tyr Gly Asp Ser Asp Tyr Ala Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Asp Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Ile Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Gly Leu Arg Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

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Ile Ala Tyr Tyr Gly Glu Tyr Asp Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 7

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp His Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Asn Val

20 25 30

His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Trp Ile Phe

35 40 45

Ser Thr Arg Asn Leu Val Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu

65 70 75 80

Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ile His Pro Tyr Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 8

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 8

Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Gly Val Ser Asn Thr

20 25 30

His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Trp Ile Tyr

35 40 45

Ser Thr Arg Asn Leu Ala Asn Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu

65 70 75 80

Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ile Tyr Pro Tyr Thr

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Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 9

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 9

Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Gly Val Ser Asn Thr

20 25 30

His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Trp Ile Tyr

35 40 45

Ser Thr Arg Asn Leu Val Asn Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu

65 70 75 80

Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser His Pro Tyr Thr

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100 105

<210> 10

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 10

Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ile Ala Ser Ser Gly Val Ser Asn Thr

20 25 30

His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Trp Ile Tyr

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100 105

<210> 11

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 11

Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ile Ala Ser Ser Gly Val Ser Asn Thr

20 25 30

His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Trp Ile Tyr

35 40 45

Ser Thr Ser Ser Leu Ala Asn Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu

65 70 75 80

Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Tyr Thr

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Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 12

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 12

Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Val Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Gly Val Ser Tyr Thr

20 25 30

His Arg Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Trp Ile Tyr

35 40 45

Ser Thr Arg Asn Leu Val Asn Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp His Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp

65 70 75 80

Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ile His Pro Tyr Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 13

<211> 447

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 13

Gln Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Gly Ser Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Thr Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Phe

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Ser Asp Tyr Ala Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Lys Ala Thr Met Thr Ala Asp Ser Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Asn Ala Tyr Tyr Gly Asp Tyr Glu Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 14

<211> 213

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 14

Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr

35 40 45

Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Phe Thr

85 90 95

Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro

100 105 110

Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr

115 120 125

Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys

130 135 140

Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu

145 150 155 160

Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser

165 170 175

Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala

180 185 190

Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe

195 200 205

Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 15

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

ggcccagccg gccatggcct aaggatccta aaccgtctcg agcggtggtg gcggtagtgg 60

cggtggtggt agcggtggcg gtggtagtgc tagcgacatc ctgcagtgaa aggcggccgc 120

Claims (8)

1.一种抗VEGFR2的单克隆抗体，其具有如下重链可变区和轻链可变区：

重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO:12所示。

2.根据权利要求1所述的抗VEGFR2单克隆抗体，所述的单克隆抗体还包括恒定区，所述的恒定区为人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的任意一种。

3.一种表达载体，包括编码权利要求1或2所述的单克隆抗体的核苷酸。

4.一种宿主细胞，所述的宿主细胞经由权利要求3所述的表达载体转化或转染而来，为原核细胞或真核细胞。

5.一种结合物，包含与化学标记或生物标记共价连接的权利要求1或2所述的抗VEGFR2单克隆抗体。

6.一种偶联物，其由权利要求1或2所述的抗VEGFR2单克隆抗体和/或权利要求5所述的结合物与固体介质或半固体介质偶联形成。

7.一种药物组合物，包括权利要求1或2所述的抗VEGFR2单克隆抗体和/或权利要求5所述的结合物和/或权利要求6所述的偶联物。

8.权利要求1或2所述的抗VEGFR2单克隆抗体和/或如权利要求5所述的结合物和/或如权利要求6所述的偶联物和/或如权利要求7所述的药物组合物在制备治疗与血管新生相关的疾病的药物中的应用，所述疾病为非小细胞肺癌、转移性非小细胞肺癌、肝细胞癌、转移性肝细胞癌、HER2阴性的转移性乳腺癌、转移性胃腺癌、转移性结直肠癌、转移性黑色素瘤和/或转移性肾细胞癌。

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