CN105745335A

CN105745335A - 用于对cMET核酸进行多模态分析的组合物及方法

Info

Publication number: CN105745335A
Application number: CN201480056221.9A
Authority: CN
Inventors: 乔克·诺林; 希兰·马登纳哈利·迪瓦卡
Original assignee: Qiagen Mansfield Inc
Current assignee: Qiagen Mansfield Inc
Priority date: 2013-08-14
Filing date: 2014-08-07
Publication date: 2016-07-06
Also published as: KR20160106040A; JP2016527900A; US20160130660A1; WO2015023503A3; SG11201600754PA; WO2015023503A2; CA2917924A1; BR112016003057A2; EP3033434A2

Abstract

本文描述了涉及对cMET的改变(例如拷贝数和表达水平的变异和/或突变(包括点突变)的存在)进行检测的方法和测定法。现有方法由于例如有限的灵敏度、实验室间不一致或不能提供必要的多重性能，在临床适用性方面受到限制。本文提供的方法和测定法允许对患者实施更快更经济的测试和筛查的多模态、多重测定法，使得健康护理得到改进。

Description

用于对cMET核酸进行多模态分析的组合物及方法

相关申请的交叉引用

根据35U.S.C.§119(e)，本申请要求2013年8月14日提交的美国临时申请号61/865,755的优先权，以引用的方式将其内容整体并入本文。

序列表

本申请包含序列表，所述序列表已经以ASCII格式电子提交，并在此以引用的方式将其整体并入。所述ASCII副本创建于2014年7月31日，命名为046264-077471-PCT_SL.txt，大小为97,800字节。

技术领域

本文所述的技术涉及使得能够对cMET的改变(例如拷贝数和表达水平的变异和/或突变(包括点突变)的存在)进行检测的测定法和方法。

背景技术

个性化医疗的发展使得鉴别了当被扰动或改变时可引起疾病的基因。然而，疾病相关的基因能够以多种方式改变，例如，在与野生型或健康受试者相比时，在患有给定疾病或具有发展为给定疾病风险的受试者中，基因的基因组拷贝数(拷贝数变异；“CNV”)能够改变、编码基因的序列能够改变和/或基因的表达水平能够改变。

例如，cMET与癌症相关，任何给定的癌细胞均可展示出此类cMET改变中的一种或多种。cMET表达产物HGFR(肝细胞生长因子受体)的活化促进细胞增殖、细胞存活、侵入、细胞运动性、转移和血管生成。HGFR的活化可由生长因子浓度失衡、基因扩增和/或突变导致的过表达引起。在实体瘤(例如肾癌、胃癌和肝细胞癌的肿瘤)、腺癌以及鳞状、大细胞和小细胞癌中已经发现cMET的这些改变。

通常使用不同的方法对这些改变类型各自进行检测，这些方法各自表现出限制临床适用性的弱点。例如，通常借助免疫组化来检测表达水平，该方法可受到抗体灵敏度低的影响，导致阳性样本表现出看起来较弱的表达水平。可借助FISH来检测CNV和基因表达水平，但这些测定法可表现出20％以上的实验室间不一致。可利用RT-PCR来实施突变和基因表达测定法，然而现有技术提供的多重性(multiplex)能力低于综合临床诊断所需的水平。多模态(multimodal)、多重测定法的开发可允许更快更经济地对患者进行测试和筛查，使得健康护理得到改进。

发明内容

本文所述的技术涉及用于对cMET的改变(例如序列(突变)、表达水平和/或基因拷贝数的改变)进行检测的方法和测定法。发明人开发了测定法并发现了方法，以在单个多重反应混合物中对cMET拷贝数和cMET表达水平进行可靠测定以及在包含低至两个独立反应的单个多重测定法中对cMET拷贝数、cMET表达水平和是否存在cMET突变进行测定。

一方面，本文描述了用于对cMET的改变进行检测的测定法，所述测定法包括：将核酸样本的部分与两个引物组相接触，其中，第一引物组检测cMET基因拷贝数变异的改变，第二引物组检测cMET基因表达水平的变化，其中，所述第一引物组包含对cMET的至少一种gDNA特异性序列和至少两个参照基因各自的至少一种gDNA特异性序列进行扩增的引物对亚组，其中，一个参照基因位于7号染色体，一个参照基因不位于7号染色体，从而对cMET基因拷贝数变异进行检测，其中，所述第二引物组包含对cMET的mRNA特异性序列和至少两个参照基因的mRNA特异性序列进行扩增的引物对亚组；对包含所述样本的所述部分和所述两个引物组的反应混合物实施PCR扩增方案(regimen)，所述扩增方案包括链分离、引物退火和引物延伸的循环；检测各引物对的扩增子(amplicon)水平；针对参照基因扩增子将cMET扩增子水平归一化；以及将归一化的cMET扩增子水平与参照水平进行比较，其中，与所述参照水平相比gDNA特异性cMET扩增子水平更高表明所述样本中存在cMET基因扩增的改变，与所述参照水平相比mRNA特异性cMET扩增子水平改变表明所述样本中存在cMET基因表达水平的改变。

在一些实施方式中，所述第一引物组进一步包含对EGFR的至少一种gDNA特异性序列进行扩增的引物对亚组，所述测定法进一步包括将归一化的EGFR扩增子水平与参照水平进行比较，其中，与所述参照水平相比gDNA特异性EGFR扩增子水平更高表明所述样本中存在EGFR基因扩增的改变。在一些实施方式中，所述第一引物组中位于7号染色体的参照基因是KDELR-2，所述测定法进一步包括将归一化的KDELR-2扩增子水平与参照水平进行比较，其中，与所述参照水平相比gDNA特异性KDELR-2扩增子水平更高表明所述样本中存在KDELR-2基因扩增的改变。在一些实施方式中，存在cMET、EGFR和KDELR-2基因扩增的改变表明存在7号染色体扩增。

在一些实施方式中，所述第一引物组中不位于7号染色体的参照基因是SOD1或SPG21。在一些实施方式中，所述第一引物组包含对SOD1和SPG21各自的至少一种gDNA特异性序列进行扩增的引物对亚组。

在一些实施方式中，引物组包含对各基因的至少一种扩增子进行扩增的引物对亚组。在一些实施方式中，引物组包含对各基因的至少两种扩增子进行扩增的引物对亚组。在一些实施方式中，引物组包含对各基因的至少三种扩增子进行扩增的引物对亚组。

在一些实施方式中，所述引物组包含对cMET、EGFR和KDELR-2各自的至少两种gDNA特异性扩增子以及对cMET、SOD1和SPG21各自的至少两种mRNA特异性扩增子进行扩增的引物对亚组。在一些实施方式中，所述引物组包含对cMET、EGFR和KDELR-2各自的至少三种gDNA特异性扩增子以及对cMET、SOD1和SPG21各自的至少三种mRNA特异性扩增子进行扩增的引物对亚组。

在一些实施方式中，所述测定法可进一步包括：将所述样本的第二部分与第三引物组相接触，其中，所述第三引物组包含对含有序列变异的cMET序列进行扩增的引物对亚组；对包含所述样本的所述第二部分和所述第三引物组的反应混合物实施PCR扩增方案，所述扩增方案包括链分离、引物退火和引物延伸的循环；检测各引物对的扩增子水平，其中，扩增子的存在表明存在该引物对对其具有特异性的序列变异。在一些实施方式中，cMET的一种或多种序列变异为SNP。在一些实施方式中，cMETSNP选自于由下列SNP所组成的组：S1058P、V1101I、H1112Y、H1124D、G1137V、M1149T、V1206L、L1213V、K1262R、M1268T、V1238I、Y1248C和D1246N。在一些实施方式中，对S1058P、V1101I、H1112Y、H1124D、G1137V、M1149T、V1206L、L1213V、K1262R、M1268T、V1238I、Y1248C和D1246N进行检测。

在一些实施方式中，对于两个反应均使用相同的PCR热循环方案。在一些实施方式中，所述核酸样本由FFPE肿瘤样本制备。在一些实施方式中，所述样本包含来自受试者的肿瘤细胞，所述受试者诊断患有选自于由如下病症所组成的组中的病症：胃癌、肾癌、胆管瘤、肺癌、脑癌、宫颈癌、结肠癌、头颈部癌、肝细胞瘤、非小细胞肺癌、黑色素瘤、间皮瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、肉瘤和甲状腺癌。

在一些实施方式中，一种或多种引物为双结构域引物。在一些实施方式中，来自引物对亚组的两种以上引物对的扩增产物为可区分的。在一些实施方式中，借助有区别的大小(distinctsizes)，将来自引物对亚组的两种以上引物对的扩增产物区分开。在一些实施方式中，通过用不同的可检测标记物进行标记，将来自引物对亚组的两种以上引物对的扩增产物区分开。在一些实施方式中，通过用不同的可检测标记物进行标记，将来自第一引物组和第二引物组的扩增产物区分开。

在一些实施方式中，一种或多种引物选自于由SEQIDNO：1-SEQIDNO：83所组成的组。在一些实施方式中，一种或多种引物包含SEQIDNO：89-SEQIDNO：124中的任何序列。在一些实施方式中，所述引物以约为表2的浓度存在于反应混合物中。

一方面，本文描述了用于对cMET的改变进行检测的方法，所述方法包括：将核酸样本的部分与对cMET基因拷贝数变异的改变进行检测的引物组相接触，其中，所述引物组包含对cMET的至少一种gDNA特异性序列和至少两个参照基因各自的至少一种gDNA特异性序列进行扩增的引物对亚组，其中，一个参照基因位于7号染色体，一个参照基因不位于7号染色体，从而对cMET基因拷贝数变异进行检测；对包含所述样本的所述部分和所述引物组的反应混合物实施PCR扩增方案，所述扩增方案包括链分离、引物退火和引物延伸的循环；检测各引物对的扩增子水平；针对参照基因扩增子将cMET扩增子水平归一化；以及将归一化的cMET扩增子水平与参照水平进行比较，其中，与所述参照水平相比gDNA特异性cMET扩增子水平更高表明所述样本中存在cMET基因扩增的改变。

在一些实施方式中，所述引物组进一步包含对EGFR的至少一种gDNA特异性序列进行扩增的引物对亚组，所述方法进一步包括将归一化的EGFR扩增子水平与参照水平进行比较，其中，与所述参照水平相比gDNA特异性EGFR扩增子水平更高表明所述样本中存在EGFR基因扩增的改变。在一些实施方式中，所述引物组中位于7号染色体的参照基因是KDELR-2，所述方法进一步包括将归一化的KDELR-2扩增子水平与参照水平进行比较，其中，与所述参照水平相比gDNA特异性KDELR-2扩增子水平更高表明所述样本中存在KDELR-2基因扩增的改变。在一些实施方式中，存在cMET、EGFR和KDELR-2基因扩增的改变表明存在7号染色体扩增。在一些实施方式中，所述引物组中不位于7号染色体的参照基因是SOD1或SPG21。在一些实施方式中，所述引物组包含对SOD1和SPG21的至少一种gDNA特异性序列进行扩增的引物对亚组。

在一些实施方式中，所述方法可进一步包括：将所述核酸样本的所述部分与第二引物组相接触，其中，所述第二引物组对cMET基因表达水平的变化进行检测；其中，所述第二引物组包含对cMET的mRNA特异性序列和至少两个参照基因的至少mRNA特异性序列进行扩增的引物对亚组；其中，与参照水平相比mRNA特异性cMET扩增子水平改变表明所述样本中存在cMET基因表达水平的改变。

在一些实施方式中，所述方法可进一步包括：将所述样本的第二部分与第三引物组相接触，其中，所述第三引物组包含对含有序列变异的cMET序列进行扩增的引物对亚组；对包含所述样本的所述第二部分和所述第三引物组的反应混合物实施PCR扩增方案，所述扩增方案包括链分离、引物退火和引物延伸的循环；检测各引物对的扩增子水平，其中，扩增子的存在表明存在该引物对对其具有特异性的序列变异。在一些实施方式中，cMET的一种或多种序列变异为SNP。在一些实施方式中，cMETSNP选自于由下列SNP所组成的组：S1058P、V1101I、H1112Y、H1124D、G1137V、M1149T、V1206L、L1213V、K1262R、M1268T、V1238I、Y1248C和D1246N。在一些实施方式中，对S1058P、V1101I、H1112Y、H1124D、G1137V、M1149T、V1206L、L1213V、K1262R、M1268T、V1238I、Y1248C和D1246N进行检测。

在一些实施方式中，一种或多种引物为双结构域引物。在一些实施方式中，来自引物对亚组的两种以上引物对的扩增产物为可区分的。在一些实施方式中，借助有区别的大小将来自引物对亚组的两种以上引物对的扩增产物区分开。在一些实施方式中，通过用不同的可检测标记物进行标记，将来自引物对亚组的两种以上引物对的扩增产物区分开。在一些实施方式中，通过用不同的可检测标记物进行标记，将来自第一引物组和第二引物组的扩增产物区分开。

附图说明

图1描绘了本文所述的引物靶标的示例性实施方式的示意图。

图2和图3分别展示了使用表2中具体指定的表1的引物进行的测定法中对胃癌细胞进行的单管CNV和基因表达分析，并分别描绘了该测定法中在TYE和FAM通道中进行的检测。

图4和图5分别展示了使用表2中具体指定的表1的引物进行的测定法中对肺癌细胞进行的单管CNV和基因表达分析，并分别描绘了该测定法中在TYE和FAM通道中进行的检测。

图6描绘了对cMET表达和CNV水平实施示例性测定法的定量结果的图。

图7描绘了7号染色体多体性(polysomy)分析的图。

图8描绘了用于检测cMET点突变(例如SNP)的供选择的引物组的示意图。图8公开了SEQIDNO：132。

图9描绘了使用表4的较短的扩增子引物对各个靶标实施多重测定法的结果。

图10描绘了使用表3的较长的扩增子引物对各个靶标实施多重测定法的结果。

图11描绘了实施例1和2的测定法所使用的热循环参数。

具体实施方式

本文所述技术的实施方式涉及用于对cMET的改变(例如序列(突变)、表达水平和/或基因拷贝数的改变)进行检测的方法和测定法，特别是用于对cMET的改变进行检测的多重和多模态测定法和方法。

本文使用的术语“HGFR”、“肝细胞生长因子受体”或“cMET”是指通过与肝细胞生长因子(HGF)结合而活化的具有酪氨酸激酶活性的跨膜受体。cMET序列为本领域所熟知，例如人cMET(NCBI基因ID：4233；SEQIDNO：84(mRNA)；SEQIDNO：125(多肽))。

当涉及基因或基因表达产物而使用时，本文使用的“改变”指的是与该基因或基因表达产物的参照(例如野生型)版本相比而言的可检测的变化，所述变化包括但不限于基因拷贝数的变化、表达水平的变化和/或序列的变化(例如序列变异或突变)。

本文使用的“基因拷贝数”指的是给定基因在基因组中出现的拷贝的数量。在一些实施方式中，单个基因和/或染色体区域可为重复的，例如，将发现包含一个或多个基因的核酸序列的拷贝在基因组中彼此相邻、或者处于基因组的多个位置，而在参照基因组中，在相应的染色体上存在该序列的一个拷贝(在正常的二倍体基因组中为两个拷贝)。在一些实施方式中，整个染色体都是重复的(例如多体性)。

本文使用的“表达水平”指的是存在于细胞或样本中的由给定基因编码的mRNA分子的数量。相对于参照水平，表达水平可升高或降低。cMET的改变与癌症相关，并且，对此类改变进行的检测可被用于诊断、预后和/或治疗选择中。

在一些实施方式中，本文所述的用于对cMET的改变进行检测的测定法和/或方法可包括：将核酸样本的部分与对cMET基因拷贝数变异的改变进行检测的引物组相接触，其中，所述引物组包含对cMET的至少一种gDNA特异性序列和至少两个参照基因各自的至少一种gDNA特异性序列进行扩增的引物对亚组，其中，一个参照基因位于7号染色体，一个参照基因不位于7号染色体，从而对cMET基因拷贝数变异进行检测；对包含所述样本的所述部分和所述引物组的反应混合物实施PCR扩增方案，所述扩增方案包括链分离、引物退火和引物延伸的循环；检测各引物对的扩增子水平；针对参照基因扩增子将cMET扩增子水平归一化，从而确定cMET拷贝数的相对水平。在一些实施方式中，可将cMET拷贝数的相对水平与参照水平(例如预先确定的参照水平)进行比较，其中，与所述参照水平相比一种或多种gDNA特异性cMET扩增子的相对水平更高表明所述样本中存在cMET基因扩增的改变。在一些实施方式中，所述方法和测定法可进一步包括：将核酸样本的部分与第二引物组相接触，其中，所述第二引物组对cMET基因表达水平的变化进行检测，其中，所述第二引物组包含对cMET的mRNA特异性序列和任选的至少两个参照基因的至少mRNA特异性序列进行扩增的引物对亚组；以及针对参照基因扩增子将cMET扩增子水平归一化，从而确定cMET表达的相对水平。在一些实施方式中，可将cMET表达的相对水平与参照水平(例如预先确定的参照水平)进行比较，其中，与所述参照水平相比一种或多种mRNA特异性cMET扩增子的相对水平更高表明所述样本中存在cMET基因表达的改变。

在一些实施方式中，本文所述的用于对cMET的改变进行检测的测定法和/或方法包括：将核酸样本的部分与两个引物组相接触，其中，第一引物组检测cMET基因拷贝数变异的改变，第二引物组检测cMET基因表达水平的变化，其中，所述第一引物组包含对cMET的至少一种gDNA特异性序列和至少两个参照基因各自的至少一种gDNA特异性序列进行扩增的引物对亚组，其中，一个参照基因位于7号染色体，一个参照基因不位于7号染色体，从而对cMET基因拷贝数变异进行检测，其中，所述第二引物组包含对cMET的mRNA特异性序列和至少两个参照基因的至少mRNA特异性序列进行扩增的引物对亚组；对包含所述样本的所述部分和所述两个引物组的反应混合物实施PCR扩增方案，所述扩增方案包括链分离、引物退火和引物延伸的循环；检测各引物对的扩增子水平；针对参照基因扩增子将cMET扩增子水平归一化；以及将归一化的cMET扩增子水平与cMET的参照水平进行比较，其中，与所述cMET的参照水平相比gDNA特异性cMET扩增子水平更高表明所述样本中存在cMET基因扩增的改变，与所述cMET的参照水平相比mRNA特异性cMET扩增子水平改变表明所述样本中存在cMET基因表达水平的改变。

在一些实施方式中，本文所述的测定法在单管中实施，例如，所述第一引物组和所述第二引物组存在于单个反应混合物和/或器皿或容器中。因此，在所述实施方式中，单个扩增方案将提供关于基因拷贝数和基因表达水平的数据。

在一些实施方式中，所述第一引物组进一步包含对EGFR的至少一种gDNA特异性序列进行扩增的引物对亚组；所述方法包括将归一化的EGFR扩增子水平与参照水平进行比较，其中，与所述参照水平相比gDNA特异性EGFR扩增子水平更高表明所述样本中存在EGFR基因扩增的改变。本文使用的术语“EGFR”或“表皮生长因子受体”指的是与包括表皮生长因子“EGF”和TGFα在内的配体结合的跨膜受体。配体识别引起EGFR的自磷酸化，并活化MAPK、Akt和/或JNK通路，导致细胞增殖。EGFR的序列为本领域所熟知，例如人EGFR(NCBI基因ID：1956；SEQIDNO：85(mRNA)；SEQIDNO：126(多肽))。

EGFR的改变(例如EGFR基因拷贝数的升高)与癌症相关，并且，对此类改变进行的检测可被用于诊断、预后和/或治疗选择中。在一些实施方式中，在相同的反应混合物中(例如在相同的管、孔或器皿中)对cMET和EGFR的基因拷贝数进行检测。

为了可靠地检测cMET(以及任选的EGFR)的水平(例如基因拷贝数水平和/或表达产物水平)，可分别针对一个或多个参照基因的拷贝数或表达水平将样本中cMET的水平归一化。在一些实施方式中，参照基因可以是在癌细胞中通常不被改变的基因。随后可将归一化水平与靶基因的参照水平(例如在正常、健康和/或参照样本中基因的水平)进行比较。

术语“参照水平”和“参照样本”在本文中可互换使用，指的是第二样本(即获得自受试者的样本)与之进行比较的已知样本中基因拷贝数信号的表达水平。就对包含核酸的生物样本中例如cMET的改变的存在和量级(magnitude)进行确定而言，参照水平是有用的。参照值用作进行比较的参照水平，使得能够将样本归一化至合适的标准，以推断样本中改变的存在、不存在或程度。在一些实施方式中，参照水平可以是之前确定的水平，例如参照水平可以是预先确定的数量或比例，而不需要以本文所述的测定法的相同的物理迭代(physicaliteration)进行确定。

参照水平可由例如来自受试者的已知生物样本获得，所述受试者例如为实质上未患癌症和/或未表现出任何患有癌症的症状或风险因素的受试者。还可通过将来自多个个体的样本合并来获得已知样本，以产生群体平均化的参照值或值的范围，其中，参照值代表个体的群体(例如未患癌症的个体的群体)中例如基因拷贝数或表达水平的平均水平。因此，通过这种方式获得的参照中基因拷贝数或基因表达的水平代表了未患癌症的个体的普通群体的平均水平。在一些实施方式中，参照值可为从健康成体受试者获得的等同样本中的水平。本文使用的“健康成体受试者”可为不表现出癌症的任何标志物、迹象或症状以及未处于患癌风险中的受试者。在一些实施方式中，健康成体受试者的群体可包括与所述受试者具有相似的人口统计学特征(例如具有相似的年龄、相似的种族背景、相似的饮食等)的受试者。

在本文所述的方法和测定法中，如下文所述，可通过与参照基因进行比较，确定靶基因(例如cMET)的相对拷贝数和/或表达水平。优选地，参照基因可以是相对于健康细胞而言在受到感兴趣的疾病影响的细胞中(表达水平或拷贝数)通常不改变的基因。

参照基因可以是与健康(例如非癌)细胞相比，在患病细胞(例如癌细胞、胃癌细胞、肾癌细胞、胆管瘤细胞、肺癌细胞、脑癌细胞、宫颈癌细胞、结肠癌细胞、头颈部癌细胞、肝细胞瘤癌细胞、非小细胞肺癌细胞、黑色素瘤细胞、间皮瘤细胞、多发性骨髓瘤细胞、卵巢癌细胞、肉瘤细胞和/或甲状腺癌细胞)中不被改变的基因。

当参照基因是不位于7号染色体的多体性参照基因时，与健康(例如非癌)细胞相比，优选该多体性参照基因在患病细胞(例如癌细胞、胃癌细胞、肾癌细胞、胆管瘤细胞、肺癌细胞、脑癌细胞、宫颈癌细胞、结肠癌细胞、头颈部癌细胞、肝细胞瘤癌细胞、非小细胞肺癌细胞、黑色素瘤细胞、间皮瘤细胞、多发性骨髓瘤细胞、卵巢癌细胞、肉瘤细胞和/或甲状腺癌细胞)中位于未被多体化的染色体上、或者位于并不知晓其被多体化的染色体上。

当对靶基因(例如cMET)的基因拷贝数水平进行检测时，可将由特异性针对靶基因的gDNA特异性序列的引物对亚组生成的扩增子的水平与来自相同样本的两个多体性参照各自进行比较。第一多体性参照为由特异性针对存在于与靶基因相同的染色体上的基因的gDNA特异性序列的引物对亚组生成的扩增子的水平。第二多体性参照为由特异性针对存在于与靶基因和第一多体性参照基因不同的染色体上的基因的gDNA特异性序列的引物对亚组生成的扩增子的水平。若检测到的靶基因的水平高于检测到的第一多体性参照基因的水平，说明基因组中存在靶基因的额外拷贝或者包含该靶基因但不包含相同染色体上的参照基因的染色体部分的额外拷贝。若检测到的靶基因和第一参照基因的水平高于检测到的第二参照基因的水平，说明样本中存在包含该靶基因和第一多体性参照基因的染色体的额外拷贝(例如说明包含该靶基因的染色体的多体性)。

例如，在一些实施方式中，存在cMET基因拷贝数的改变、但存在于7号染色体的任何多体性参照基因不存在改变表明cMET基因扩增。在一些实施方式中，存在存在于7号染色体的多体性参照基因基因拷贝数的改变、但不存在于7号染色体的任何多体性参照基因不存在改变表明存在7号染色体多体性，例如，细胞(从其中获取核酸样本)中存在7号染色体的整体或部分的额外拷贝。在一些实施方式中，若检测到cMET和存在于7号染色体的多体性参照基因二者的基因拷贝数改变，可表明核酸样本中的cMET(或包含cMET的区域)扩增和多体性。当将给定基因(例如cMET、EGFR和/或KDELR-2)的gDNA特异性扩增子水平与多体性参照基因和/或多体性参照水平进行比较时，可确定7号染色体上的基因和参照的基因拷贝数水平之间的差别水平的量级(倍数差别)。

可利用相似的方式检测基因表达改变的存在和/或量级。当对靶基因(例如cMET)的表达水平进行检测时，可针对来自相同样本的至少一种参照基因的表达水平将由特异性针对靶基因的mRNA特异性序列的引物对亚组生成的扩增子的水平归一化。一旦针对参照基因的表达水平进行了归一化，可将靶基因的表达水平与靶基因的参照表达水平(例如在健康的非癌细胞和/或组织样本中靶基因的表达水平)进行比较。在一些实施方式中，参照水平可为预先确定的。

在一些实施方式中，用于确定cMET基因表达水平的参照基因可为SOD1和/或SPG21。在一些实施方式中，本文所述的测定法或方法可包括对核酸样本中SOD1和/或SPG21mRNA的水平进行确定，例如，将所述样本与特异性针对SOD1和/或SPG21序列的引物组相接触，实施SOD1和/或SPG21靶标的PCR扩增，并对获得的扩增子的水平进行检测。

本文使用的“超氧化物歧化酶1”或“SOD1”指的是破坏超氧化物自由基的歧化酶。SOD1的序列为本领域所熟知，例如人SOD1(NCBI基因ID：6647；SEQIDNO：87(mRNA)；SEQIDNO：127(多肽))。

本文使用的“痉挛性截瘫21”或“SPG21”指的是直接结合至CD4的CD4负调控子。SPG21的序列为本领域所熟知，例如人SPG21(NCBI基因ID：51324；SEQIDNO：88(mRNA)；SEQIDNO：128(多肽))。

在一些实施方式中，用于确定cMET基因拷贝数水平的参照基因可包括至少一个位于7号染色体的参照基因和至少一个不位于7号染色体的参照基因。在一些实施方式中，用于确定cMET基因拷贝数水平的参照基因可包括一个位于7号染色体的参照基因和一个不位于7号染色体的参照基因。在一些实施方式中，用于确定cMET基因拷贝数水平的参照基因可包括两个位于7号染色体的参照基因和两个不位于7号染色体的参照基因。在一些实施方式中，存在于7号染色体上的参照基因可为EGFR和/或KDELR-2。在一些实施方式中，不存在于7号染色体上的参照基因可为SOD1和/或SPG21。

本文使用的“ER腔蛋白滞留受体2(ERlumenproteinretainingreceptor2)”或“KDELR-2”指的是借助四肽信号(KDEL(SEQIDNO：130))结合至高尔基体顺面或前高尔基体隔室中的蛋白并引起结合的蛋白移送至ER腔的受体。KDELR-2的序列为本领域所熟知，例如人KDELR-2(NCBI基因ID：11014；SEQIDNO：86(mRNA)；SEQIDNO：129(多肽))。

在一些实施方式中，不位于7号染色体上的参照基因可为SOD1和/或SPG21。在一些实施方式中，所述第一引物组包含特异性针对SOD1或SPG21的gDNA特异性序列的至少一个引物组。在一些实施方式中，所述第一引物组包含特异性针对SOD1和SPG21各自的gDNA特异性序列的至少一个引物组。

在一些实施方式中，其中，KDELR-2为位于7号染色体上的参照基因，并将归一化的KDELR-2扩增子水平与参照水平进行比较，与所述参照水平相比gDNA特异性KDELR-2扩增子水平更高表明样本中存在KDELR-2基因拷贝数的改变和/或存在7号染色体的多体性。

在一些实施方式中，可通过检测来自各靶基因内的多个序列，对本文所述的测定法和方法的精确度和可靠性进行改进，例如，引物组可包含特异性针对同一基因的不同序列的多个引物亚组，从而，在PCR扩增后，存在来自于各靶基因的多个扩增子。期望这样来改进测定法的精确度。在一些实施方式中，可在例如归一化和与参照水平进行比较之前，对多个扩增子的水平进行平均和/或取其几何平均数，来确定给定靶基因的水平(例如基因拷贝数水平或基因表达水平)。

在一些实施方式中，引物组可包含对各基因的至少一种扩增子进行扩增的引物对亚组。在一些实施方式中，引物组可包含对各基因的至少两种扩增子进行扩增的引物对亚组。在一些实施方式中，引物组可包含对各基因的至少三种扩增子进行扩增的引物对亚组。

在一些实施方式中，所述引物组可包含对cMET、EGFR和KDELR-2各自的至少两种gDNA特异性扩增子以及对cMET、SOD1和SPG21各自的至少两种mRNA特异性扩增子进行扩增的引物对亚组。在一些实施方式中，所述引物组可包含对cMET、EGFR和KDELR-2各自的至少三种gDNA特异性扩增子以及对cMET、SOD1和SPG21各自的至少三种mRNA特异性扩增子进行扩增的引物对亚组。

在一些实施方式中，本文所述的测定法和方法可进一步包括对cMET中序列变异的存在进行检测。本文使用的“序列变异”可以指替换、插入、缺失、重复或重排。

序列变异(包括例如点突变、例如单核苷酸多态性(SNP))可以是表型上中性的，或者可具有将其与该基因座处的优势(predominant)序列所表现的表型相区别的相关变异表型。本文使用的“中性多态性”指的是序列变异不改变基因功能的多态性，“突变”或“功能多态性”指的是改变基因功能并因此具有相关表型的序列变异。群体中发生的基因座的序列变异被称为等位基因。当在群体内特定的基因座处出现两个以上等位基因的情况下提及个体的基因型时，“优势等位基因”为在所考虑的群体中出现频率最高的等位基因(即，当存在两个等位基因时，在超过50％的群体中出现的等位基因为优势等位基因；当存在多于两个等位基因时，“优势等位基因”为在目标群体中出现频率最高的等位基因(例如相对于该位点处的其它等位基因而言频率高至少5％))。术语“变体等位基因(variantallele)”用于指在该群体中出现频率低于优势等位基因的一个或多个等位基因(例如，当存在两个等位基因时，变体等位基因为在少于50％的目标群体中出现的等位基因；当存在多于两个等位基因时，变体等位基因为出现频率较低的全部等位基因(例如与优势等位基因相比频率低至少5％))。序列变异可存在于基因的gDNA和/或mRNA中(并因此可在基因的gDNA和/或mRNA中检测到)。

在一些实施方式中，序列变体可为点突变。本文使用的“点突变”指的是存在于基因组基因座的突变拷贝中的突变位点(包括插入和缺失)处的核苷酸种类，即，点突变指的是相比野生型序列而言核苷酸序列在单个碱基位置处的改变。SNP(单核苷酸多态性)是一类发生于群体中不同个体之间的相同基因组基因座处的点突变。点突变可为体细胞性的(somatic)(点突变发生于相同个体的不同细胞间)。

在一些实施方式中，序列变异可为单核苷酸多态性(SNP)。本文使用的“单核苷酸多态性”或“SNP”指的是在单个核苷酸残基处的核酸序列变异，包括单个核苷酸缺失、插入或碱基变化或替换。SNP可为等位的(allelic)。一些SNP具有确定的表型(例如疾病表型)，而其它SNP不具有已知的相关表型。本文所述的SNP检测方法可用于预测表型特征(例如预测对药物的响应性或药敏性)。在这一方面，本文所述的和本领域已知的SNP基因分型对于疾病或疾病易感性而言并不必然是诊断性的。

如所指出的，在一些实施方式中，改变包含SNP。虽然靶点处仅在两种核苷酸间变化的SNP并非不常见，SNP基因座处可为至少四种等位基因。在一些实施方式中，本文所述的方法和组合物涉及能够对SNP基因座的一种等位基因进行检测的引物对亚组。在一些实施方式中，本文所述的方法和组合物涉及能够对SNP基因座的两种等位基因进行检测的引物组(即，所述方法和组合物可涉及允许对两种SNP等位基因进行肯定性检测(affirmativedetection)或对该SNP进行“双相(biphasic)”基因分型的测定法)。在一些实施方式中，本文所述的方法和组合物涉及能够对SNP基因座的三种等位基因进行检测的引物组(即，所述方法和组合物可涉及允许对三种SNP等位基因进行肯定性检测或对该SNP进行“三相(triphasic)”基因分型的测定法)。在一些实施方式中，本文所述的方法和组合物涉及允许对SNP基因座的四种等位基因进行肯定性检测的测定法(即，所述方法和组合物可涉及四种SNP等位基因的多重检测或对该SNP进行“四相(quaduphasic)”基因分型)。在一些实施方式中，对SNP的优势等位基因和/或野生型等位基因进行检测。在一些实施方式中，不对SNP的优势等位基因和/或野生型等位基因进行检测。“肯定性检测”意味着该测定法允许对该特定等位基因进行扩增。例如当已知在该SNP位点仅存在两种可能时，可使用肯定性检测的替代法。在这种情况下，可对所述测定法进行设计，从而对两个变体中的一个进行扩增，而不对另一个进行扩增；所述测定法可肯定性地检测被扩增的变体并被动地检测另一个(即，缺少产物意味着存在另一等位基因或变体)。

在一些实施方式中，本文所述的测定法或方法可进一步包括：将样本的第二部分与第三引物组相接触，其中，所述第三引物组包含对含有序列变异的cMET序列进行扩增的引物对亚组；对包含所述样本的所述第二部分和所述第三引物组的反应混合物实施PCR扩增方案，所述扩增方案包括链分离、引物退火和引物延伸的循环；以及检测各引物对的扩增子水平，其中，扩增子的存在表明存在该引物对对其具有特异性的序列变异。在一些实施方式中，包含样本的第一部分和第一(和任选的第二)引物组的反应以及包含样本的第二部分和第三引物组的反应可利用相同的热循环条件进行，例如可在相同的多孔板的不同孔中同时进行两个反应，或者在相同的机器上在不同的管中同时进行两个反应，或者在使用相同热循环条件设置的平行机器上进行两个反应。

在一些实施方式中，cMET的一种或多种序列变异可为SNP。在一些实施方式中，cMETSNP可为导致如下氨基酸残基变化的SNP：S1058P、V1101I、H1112Y、H1124D、G1137V、M1149T、V1206L、L1213V、K1262R、M1268T、V1238I、Y1248C和/或D1246N。在一些实施方式中，本文所述的测定法或方法包含第三引物组，所述第三引物组能够对导致如下氨基酸残基变化的SNP中的一种或多种进行特异性扩增：S1058P、V1101I、H1112Y、H1124D、G1137V、M1149T、V1206L、L1213V、K1262R、M1268T、V1238I、Y1248C和/或D1246N。

在多个实施方式中，本文所述的方法和组合物涉及利用至少一组寡核苷酸引物实施PCR扩增方案。本文使用的“引物”指的是能够序列特异性地与多核苷酸模板退火，并提供3'端作为模板依赖型聚合酶的底物，以生成与多核苷酸模板互补的延伸产物的DNA或RNA多核苷酸分子或它们的类似物。起始和延伸的条件通常包括在合适的缓冲液(在该上下文中，“缓冲液”包括溶剂(通常为水性)并添加必要的辅因子和影响pH、离子强度等的试剂)中存在至少一种但更优选全部四种不同的脱氧核糖核苷三磷酸和聚合诱导剂(例如DNA聚合酶或逆转录酶)并处于合适的温度。本文所述的方法中有用的引物一般为单链，且引物及其互补链可退火形成双链多核苷酸。根据本文所述的方法和组合物的引物的长度可为小于或等于300个核苷酸，例如长度小于或等于300个、或250个、或200个、或150个、或100个、或90个、或80个、或70个、或60个、或50个、或40个核苷酸，并优选长度为30个以下、或20个以下、或15个以下的核苷酸，但长度至少为10个核苷酸。

本文使用的术语“组(set)”意味着核酸样本、引物或其它实体的集合。组将包含已知数目的至少两个此类实体。引物组包含特异性针对靶序列的至少一个正向引物和至少一个反向引物。引物组将包含至少一个引物对亚组，例如一个引物对亚组、两个引物对亚组、三个引物对亚组、四个引物对亚组、五个引物对亚组、六个引物对亚组或更多引物对亚组。引物组包含检测相同类型改变的引物对亚组(例如能够检测基因拷贝数水平、表达水平或序列变异的引物对亚组)的集合。引物组可包含检测不同基因中的相同类型改变的引物对亚组，例如引物组可包含两个引物对亚组，其中一个检测cMET的基因拷贝数水平，另一个检测KDELR-2的基因拷贝数水平。

因此，本文使用的“引物对亚组”指的是至少两个引物的集合，所述至少两个引物包括正向引物和反向引物，其中一个与靶核酸序列的第一链退火，另一个与第一链的互补链退火。在一些实施方式中，引物对亚组的第一引物可退火至靶核酸序列的第一链，引物对亚组的第二引物(例如反向引物)可退火至该链的互补链。当退火至靶标和/或其互补链时，引物的取向可为使得从引物对亚组的一个引物的引物延伸开始进行的核酸合成将生成与引物对亚组的第二引物的至少一个区域互补的核酸序列。核酸靶标和/或序列的“第一链”可为包含靶核苷酸和/或靶点基因座序列的双链核酸的任一链，但一旦选定，便定义其互补链为第二链。因此，本文使用的“正向引物”为退火至核酸靶标第一链的引物，而同组的“反向引物”为退火至该核酸靶标第一链的互补链的引物。

在特异性针对靶核酸的引物的上下文中使用时，本文使用的“特异性”指的是引物和靶标间的互补性水平，这样的互补性水平使得存在这样的退火温度：在该退火温度下，引物将退火至靶核酸并介导靶核酸的扩增，而并不退火至样本中存在的非靶标序列或介导非靶标序列的扩增。在对序列变异进行扩增的引物对亚组的上下文中，亚组中引物的至少一个对该序列变异具有特异性，例如该引物对亚组将不扩增不包含该序列变异的野生型序列。

在一些实施方式中，为了在gDNA的存在下特异性地检测mRNA或cDNA，一种或多种mRNA特异性引物可为跨越内含子的引物。如本文所使用的，如果引物对亚组对来自mRNA和/或cDNA的扩增子进行扩增而不对来自gDNA的扩增子进行扩增，或者如果由mRNA和/或cDNA扩增而来的扩增子在大小上与由gDNA扩增而来的扩增子是可区分的，该引物对亚组为“mRNA特异性的”。对来自mRNA和/或cDNA的扩增子进行扩增而不对来自gDNA的扩增子进行扩增的mRNA特异性引物对亚组可包括例如特异性结合至mRNA或cDNA的外显子-外显子边界的至少一种引物，例如从而使得它能够特异性地结合至内含子被去除的mRNA或cDNA，而不能结合至存在内含子的gDNA。对来自mRNA和/或cDNA的扩增子(该扩增子在大小上与由gDNA扩增而来的扩增子是可区分的)进行扩增的mRNA特异性引物对亚组可包括例如特异性结合至位于一个或多个内含子侧翼的序列的引物，从而与缺少所述一个或多个内含子的mRNA或cDNA相比，引物对亚组在gDNA中特异性结合的序列间的距离更长。在一些实施方式中，为了在RNA或cDNA的存在下特异性地检测gDNA，一种或多种gDNA特异性引物可特异性地退火至靶核酸序列的内含子。如本文所使用的，如果引物对亚组对来自gDNA的扩增子进行扩增而不对来自mRNA或cDNA的扩增子进行扩增，该引物对亚组为“gDNA特异性的”。在一些实施方式中，为了检测短的靶多核苷酸(例如miRNA或降解的靶多核苷酸)以及较长的靶多核苷酸(例如mRNA或基因组DNA中的靶点基因座)，用于至少较短的靶多核苷酸的引物可包含标签序列，从而使得扩增产物具有与靶序列相比更大的、不同的大小。可对标签进行设计，从而使得反应中全部扩增产物均具有有区别的大小。

制备引物的方法为本领域所熟知，多种商用资源提供适于提供根据本文所述方法和组合物的引物的寡核苷酸合成服务，例如INVITROGEN^TM的定制DNA寡核苷酸(LifeTechnologies；GrandIsland，NY)或来自IDT，Coralville，IA的定制DNA寡核苷酸。

在一些实施方式中，一种或多种引物可为双结构域引物。双结构域引物在2013年2月22日提交的PCT/US13/27383中具体描述；以引用的方式将其内容整体并入本文。

本文描述了引物的示例性实施方式。在一些实施方式中，一种或多种引物可选自于由SEQIDNO：1-SEQIDNO：83所组成的组。在一些实施方式中，第一引物组的一种或多种引物可选自于由SEQIDNO：10-SEQIDNO：18以及SEQIDNO：28-SEQIDNO：36所组成的组。在一些实施方式中，第二引物组的一种或多种引物可选自于由SEQIDNO：1-SEQIDNO：10、SEQIDNO：19-SEQIDNO：27以及SEQIDNO：37-SEQIDNO：45所组成的组。用于第一引物组和第二引物组的示例性引物对亚组在表2中描述。在一些实施方式中，第三引物组的一种或多种引物可选自于由SEQIDNO：46-SEQIDNO：64所组成的组。在一些实施方式中，第三引物组的一种或多种引物可选自于由SEQIDNO：64-SEQIDNO：83所组成的组。在一些实施方式中，引物可以约为表2的浓度存在于反应混合物中。在一些实施方式中，一种或多种引物包含SEQIDNO：89-SEQIDNO：124中的任何序列。

本文所述的方法和组合物涉及实施聚合酶链式反应(PCR)扩增方案。本文使用的术语“扩增方案”指的是特异性扩增感兴趣的核酸序列(即，使得感兴趣的核酸序列的丰度升高)的过程，更具体地，指的是当之前的聚合酶延伸产物作为后续轮延伸的模板时发生的指数扩增。根据本发明的PCR扩增方案包含至少2个、并优选至少5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个以上的重复循环(iterativecycles)，其中，各循环包括如下步骤：1)链分离(例如热变性)；2)寡核苷酸引物退火至模板分子；以及3)退火引物的核酸聚合酶延伸。这些步骤各自所需的条件和时间可由本领域技术人员设计。根据本文所述方法的扩增方案优选在热循环仪中进行，许多热循环仪为商购可得的。

在一些实施方式中，例如当待如本文所述对mRNA水平进行测定时，可在本文所述的PCR扩增方案之前对核酸样本进行逆转录。逆转录方案和试剂为本领域所熟知，并为商购可得的。逆转录方案的示例性实施方式如下：将5μL包含RNA和gDNA二者(例如25ngRNA和2.5nggDNA)的核酸样本加入至反应混合物，所述反应混合物包含RT缓冲液、0.5mMdNTP、5nMRT引物以及20单位SuperScriptIII^TM逆转录酶(RNA依赖型DNA聚合酶)。随后将反应在50℃孵育30分钟、在90℃孵育5分钟并在4℃孵育5分钟。适用于本发明方法和测定法的RT引物的示例性实施方式在本文的实施例中描述，例如SEQIDNO：1-SEQIDNO：9。

PCR需要使用核酸聚合酶。本文使用的短语“核酸聚合酶”指的是催化核苷三磷酸的模板依赖型聚合，以形成与模板核酸序列互补的引物延伸产物的酶。核酸聚合酶在退火引物的3'端起始合成，并在朝向模板5'端的方向继续。多种核酸聚合酶为本领域所知晓并为商购可得的。一组优选的核酸聚合酶为热稳定的，即，其在被置于足以使得退火的互补核酸链变性的温度下(例如94℃或有时更高)维持功能。在一些实施方式中，聚合酶可为delta-exo-AptaTaq聚合酶。

如本领域所理解的，PCR需要包含链分离步骤(通常涉及对反应混合物进行加热)在内的循环。本文使用的术语“链分离”或“使链分离”意味着对核酸样本进行处理，使得互补的双链分子分离为两个单链，从而能够用于退火至寡核苷酸引物。更具体地，根据本文所述方法的链分离通过将核酸样本加热至高于其T_m来实现。一般而言，对于处于适于核酸聚合酶的缓冲液中的含有核酸分子的样本而言，加热到94℃足以实现链分离。示例性的缓冲液含有50mMKC1、10mMTric-HCl(25℃时pH为8.8)、0.5mM至3mMMgCl₂和0.1％BSA。

同样如本领域所理解的，PCR需要将引物退火至模板核酸。本文使用的“退火”指的是允许两条互补或实质上互补的核酸链杂交，更具体地，当在PCR的上下文中使用时，杂交使得形成模板依赖型聚合酶的引物延伸底物。引物-靶核酸的退火条件根据引物的序列和长度而改变，并以所计算的引物的T_m为基础。一般而言，扩增方案中的退火步骤涉及在链分离步骤后将温度降低至以所计算的引物序列的T_m为基础的温度，保持足以允许此类退火的时间。

本领域技术人员可利用多种广泛可得的算法中的任何算法容易地预测T_m，所述算法例如OLIGO^TM(MolecularBiologyInsightsInc.，Colorado)引物设计软件和VENTRONTI^TM(InvitrogenInc.，California)引物设计软件以及可在互联网上获得的程序(包括Primer3和OligoCalculator)。例如，可用NetPrimer软件(PremierBiosoft；PaloAlto，CA；并在万维网http://www.premierbiosoft.com/netprimer/netprlaunch/Help/xnetprlaunch.html上免费可得)对T_m进行计算。还可使用如下公式对引物的T_m进行计算(该公式为NetPrimer软件所使用，并在Frieir等，PNAS198683：9373-9377中更详细地描述，以引用的方式将其整体并入本文)。

T_m＝ΔH/(ΔS+R*ln(C/4))+16.6log([K⁺]/(1+0.7[K⁺]))-273.15

其中，ΔH为螺旋形成的焓；ΔS为螺旋形成的熵；R为摩尔气体常数(1.987cal/℃*mol)；C为核酸浓度；[K⁺]为盐浓度。对于大部分扩增方案而言，将退火温度选择为比预测的T_m低约5℃，然而，可使用接近和高于T_m(例如比预测的T_m低1℃-5℃，或者比预测的T_m高1℃-5℃)的温度，也可使用例如比预测的T_m低超过5℃(例如比预测的T_m低6℃、低8℃、低10℃或更低)的温度。一般而言，退火温度越接近T_m，退火的特异性越高。在PCR扩增方案中允许引物退火的时间很大程度上依赖于反应的体积(更大的体积需要更长的时间)，也依赖于引物和模板的浓度(与较低的相对浓度相比，引物相对于模板的相对浓度越高所需的时间越少)。依赖于体积和引物/模板的相对浓度，扩增方案中的引物退火步骤可为约1秒至5分钟，然而通常为10秒至2分钟、优选约30秒至2分钟。

本文使用的“实质上退火”指的是在PCR扩增方案过程中足以生成可检测水平的特异性扩增产物的退火程度。

PCR还依赖于各循环时退火引物的聚合酶延伸。本文使用的术语“聚合酶延伸”意味着借助核酸聚合酶，以模板依赖型方式将至少一个互补核苷酸掺入至退火引物的3'端。聚合酶延伸优选添加超过一个核苷酸、优选上至并包括对应于模板全长的核苷酸。聚合酶延伸的条件随聚合酶的种类而改变。聚合酶延伸所使用的温度通常以酶的已知活性性质为基础。虽然退火温度需要例如处于低于酶的最佳温度，使用较低的延伸温度通常是可接受的。一般而言，虽然在低于酶的最佳延伸温度的温度下该酶保留有至少部分的活性，最常用的热稳定性聚合酶(例如Taq聚合酶和其变体)参与的聚合酶延伸在65℃-75℃、优选在约68℃-72℃进行。

引物延伸在允许退火的寡核苷酸引物延伸的条件下进行。本文使用的术语“允许退火的寡核苷酸延伸从而生成延伸产物的条件”指的是包括例如温度、盐与辅因子浓度、pH和酶浓度在内的条件组，在此类条件组之下核酸聚合酶催化引物延伸。此类条件将随所用核酸聚合酶的种类而改变，然而用于大量有用聚合酶的条件为本领域技术人员所熟知。一个示例性的条件组为50mMKCl、10mMTric-HCl(25℃时pH为8.8)、0.5mM-3mMMgCl₂、200μM每种dNTP和0.1％BSA，72℃，在该条件下Taq聚合酶催化引物延伸。

在一些实施方式中，热循环条件可与图11中所描述的方案一致。

在一些实施方式中，本文所述的方法和测定法所使用的缓冲液可包含Tris缓冲液、海藻糖、乙酸钾、甘油、甜菜碱、氯化镁、氯化钾、硫酸铵、DMSO、DTT、BSA、dNTP、吐温-20和聚合酶。在一些实施方式中，本文所述的方法和测定法所使用的缓冲液可包含10mM-400mMTris缓冲液(pH7.5至9.5)、2％-20％海藻糖、10mM-300mM乙酸钾、1％-7.5％甘油、100mM-2M甜菜碱、2.5mM-12.5mM氯化镁、1mM-10mM氯化钾、1mM-10mM硫酸铵、0.1％-2％DMSO、1mM-10mMDTT、10μg/mL-1,000μg/mLBSA、50mM-400mMdNTP、0-1％吐温-20和1个酶单位-10个酶单位的聚合酶。

本文使用的“扩增产物”或“扩增子”指的是由PCR反应产生的多核苷酸，该多核苷酸是特定靶核酸序列和/或其互补序列的部分的拷贝，其核苷酸序列对应于模板核酸序列和/或其互补序列。虽然可提及双链DNA的各条链，本文所述的扩增产物将一般为双链DNA。

本文所述的方法利用PCR对基因拷贝数及其变异进行定量或评估，并对基因表达和/或基因突变进行定量或评估。对于本文所述的任何方法，可通过在多个循环处从PCR反应中取出样本，分离所取出的样本中的扩增子并检测扩增子的量来实现。以这一方式测量的各扩增子的扩增谱允许对初始模板进行定量。参见例如美国专利号8,321,140和美国专利申请号2013/0053274；以引用的方式将它们整体并入本文。

在一些实施方式中，本文所述的方法和组合物涉及多重PCR。本文使用的“多重PCR”指的是能够通过使用引物组中的多于一对引物(例如至少多于一种正向引物和/或多于一种反向引物)，实现在一个反应器皿中对多于一种靶核酸序列进行同时扩增，并随后或同时对多个产物进行检测的PCR变型。多重扩增不仅对于检测多个靶标的存在是有用的，对于缺失、突变以及多态性和/或表达水平的分析、检测和/或基因分型和/或定量测定法而言也是有用的。多重可以指在单个反应中检测2-1,000种不同的靶序列和/或靶核酸序列的改变。本文使用的多重指的是在单个反应中检测2-1,000间的任意范围(例如5-500、25-1000或10-100)种的不同靶序列等。以非限制性实例的方式，作为本文所述方法的一部分的多重PCR反应能够在单个反应中对至少两个不同的等位靶点基因座处的至少两个SNP的两种以上可能的等位基因的存在进行肯定性检测。当用于PCR时，术语“多重”隐含了在同一PCR反应中存在特异性针对至少两种不同的靶序列的引物。因此，即便在给定样本中实际检测到的仅是所述至少两种靶序列中的一种(或甚至没有)，认为其中存在特异性针对两种不同的靶序列的引物组的反应为多重扩增。因此，在一些实施方式中，多重PCR也可以指包含多对引物的反应，其中，当反应中存在一种或多种靶标时，所述反应可产生一种或多种特异性扩增产物。

在一些实施方式中，本文所述的方法和组合物涉及多模态PCR。本文使用的“多模态”指的是对多于一种或一类分子或改变的同时扩增发生在一个反应器皿中的多重PCR变型。多模态扩增在一些实施方式中对于基因拷贝数、表达水平和/或序列变异的分析可以是有用的。多模态可以指对至少两种不同类型的靶标(即，2种不同类型的靶标或3种不同类型的靶标)进行检测。以非限制性实例的方式，多模态PCR反应可在单个反应中对基因拷贝数的水平和mRNA表达产物的水平进行检测，包括对此类靶标进行定量。

例如，可通过在扩增反应期间或之后的任何时间进行重复采样，随后对扩增产物进行分离和检测，从而促进定量这个方面。采样例如可包括移出反应的等分试样(aliquot)。采样可在例如每个循环结束或者在每数个循环(例如每两个循环、每三个循环、每四个循环等)结束时发生。虽然均匀采样间隔是最常期望的，并不要求采样以均匀间隔实施。仅作为一个实例，采样程序可涉及在最初的五个循环的每个循环后采样，随后在每隔一个循环后采样，反之亦然。

可利用数种不同通用模式中的任意模式实施从扩增反应中对等分试样的采样或配分(dispensing)。采样或移出方法可依赖于多种因素中的任意因素，包括但不限于可用的设备、待分析的样本数以及检测相对于样本收集的时机(例如同时vs.连续)。移出或挤出样本的确切方法并不必然对本文所述的方法构成限制。特别是在高通量应用中，优选利用自动化设备进行采样。还可通过从PCR反应直接电动注射或流体动力学注射至毛细管电泳设备中来进行采样。本发明方法中使用的采样方法优选适合于尽可能减少循环反应中的污染，例如通过使用在取出单个等分试样后弃去的移液管头或针，或者通过使用相同的头或针来配分来自同一PCR反应器皿的样本。同时采样和检测的方法为本领域技术人员所知晓(参见例如美国专利申请公开2004/0166513，以引用的方式并入本文)。

采样步骤所配分的核酸的量和/或等分试样的体积可根据例如扩增反应的总体积、产物检测的灵敏度以及所使用的采样和/或分离类型而改变。扩增体积可在数微升至数百微升间变化(例如5μl、10μl、20μl、40μl、60μl、80μl、100μl、120μl、150μl、或200μl以上)，优选在10μl-150μl范围内、更优选在10μl-100μl范围内变化。扩增反应的确切体积并不限制本发明。等分试样的体积可在反应混合物的0.01％-30％间变化。电动注射至毛细管电泳通常将核酸加样至毛细管，但不明显降低被采样反应的体积。可在多个独立的核酸扩增混合物中实施扩增方案，任选地在多孔容器中进行。在其中进行扩增反应的容器并不必然限制本文所述的方法。

在多个实施方式中，本文所述的方法和组合物涉及对各个靶核酸序列(例如对各个靶改变)的扩增产物(例如扩增子)进行检测。在一些实施方式中，对各个靶核酸序列的扩增产物的检测肯定性地表明样本中该靶核酸序列的存在。在一些实施方式中，对各个靶核酸序列的扩增产物的定量检测表明样本中该靶核酸序列的水平。

在一些实施方式中，本文所述的方法和组合物涉及两个以上引物对亚组的扩增产物，所述扩增产物彼此间应是可区分的。在一些实施方式中，本文所述的方法和组合物涉及PCR扩增方案，其中，可借助有区别的大小将两个以上引物对亚组的扩增产物区分开。如本文所使用的，如果能够从具有不同大小(differentsize)的核酸中将其分辨出，则该核酸具有“有区别的大小”。“不同大小”指的是长度至少存在一个核苷酸的差异的核酸分子。一般而言，对于本文所述方法有用的具有有区别的大小的扩增产物的核苷酸数量差异高于或等于给定分离或检测方法中使用的分离过程的分辨极限。例如，当分离的分辨极限是一个碱基时，具有有区别的大小的扩增产物的长度具有至少一个碱基的不同，但也可以具有2个碱基、5个碱基、10个碱基、20个碱基、50个碱基、100个碱基或更多碱基的不同。当分辨极限是例如10个碱基时，具有有区别的大小的扩增产物将具有至少10个碱基的不同，然而也可以具有11个碱基、15个碱基、20个碱基、30个碱基、50个碱基、100个碱基或更多碱基的不同。

在一些实施方式中，引物或其任意部分的长度及与其退火的靶核酸序列的片段的长度均可改变。所扩增的靶序列长度的变化(例如通过将正向引物和反向引物的位置选择为彼此更远离或更接近)是保证使来自不同靶标的产物之间易于区分的直接方法。引物长度的变化(特别是双结构域引物的5'尾区长度的变化)对于例如在测定法中将给定靶基因座的特定等位基因的产物区分开而言是特别有效的。

在一些实施方式中，通过用不同的可检测标记物进行标记，将扩增产物区分开。在一些实施方式中，将标记物掺入至引物。在一些实施方式中，将标记物缀合至引物。

在一些实施方式中，在PCR扩增方案完成后，标记物结合至引物。在一些实施方式中，标记物缀合至与引物特异性结合的抗体或其部分或寡核苷酸、或者缀合至附着至引物的部分(moiety)。

如果来自一种标记物的信号能够与来自另一种标记物的信号相区别，认为两种可检测标记物不同。可检测标记物可包括例如吸光染料、荧光染料或放射性标记物。荧光染料是优选的。一般而言，如果荧光信号与另一荧光信号的峰值发射波长分开有至少20nm，则该荧光信号与另一荧光信号是可区分的。与窄峰或更陡峭的峰相反，特别是当给定反应中荧光团的发射峰较宽时，更大的峰间隔是优选的。

可检测标记物、对所述可检测标记物进行检测的方法以及将所述可检测标记物掺入或偶联和/或结合至扩增产物的方法为本领域所熟知。以非限制性实例的方式提供以下内容。

在一些实施方式中，可检测标记物可包括能够通过光谱学、光化学、生物化学、免疫化学、电磁、放射化学或化学手段(如荧光、化学荧光或化学发光)或任何其它适当的手段检测的标记物。

本文所述方法中使用的可检测标记物可为一级(primary)标记物(其中，该标记物包含可直接检测的部分或产生可直接检测部分的部分)或二级(secondary)标记物(其中，该可检测标记物结合至产生可检测信号的另一部分，例如，如在免疫标记中常见的使用二抗和三抗)。

可借助共价或非共价手段将可检测标记物连接至核酸。或者，可通过例如对经由配体-受体结合对设置实现与另一核酸的结合的分子或其它此类特异性识别分子进行直接标记而将可检测标记物连接。可检测标记物可包括但不限于放射性同位素、生物发光化合物、发色团、抗体、化学发光化合物、荧光化合物、金属螯合物和酶。

在一些实施方式中，可检测标记物可为荧光染料分子或荧光团，包括但不限于荧光素、藻红蛋白、Cy3^TM、Cy5^TM、别藻蓝蛋白、德克萨斯红(Texasred)、多甲藻素叶绿素(peridininchlorophyll)、青色素(cyanine)、串联缀合物(例如藻红蛋白-Cy5^TM)、绿色荧光蛋白、罗丹明、异硫氰酸荧光素(FITC)和OregonGreen^TM、罗丹明及衍生物(例如德克萨斯红和四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC))、生物素、藻红蛋白、AMCA、CyDyes^TM、6-羧基荧光素(一般以缩写FAM和F表示)、6-羧基-2',4',7',4,7-六氯荧光素(HEX)、6-羧基-4'5'-二氯-2'7'-二甲氧基荧光素(JOE或J)、N,N,N',N'-四甲基-6羧基罗丹明(TAMRA或T)、6-羧基-X-罗丹明(ROX或R)、5-羧基罗丹明-6G(R6G5或G5)、6-羧基罗丹明-6G(R6G6或G6)以及罗丹明110；青色素染料，例如Cy3、Cy5和Cy7染料；香豆素，例如伞形酮(umbelliferone)；苯甲酰亚胺染料，例如Hoechst33258；菲啶(phenanthridine)染料，例如德克萨斯红；乙锭(ethidium)染料；吖啶染料；咔唑染料；吩噁嗪染料；卟啉染料；多甲川(polymethine)染料，例如青色素染料(如Cy3、Cy5等)；BODIPY染料和喹啉染料。

在一些实施方式中，可检测标记物可为放射性标记物，包括但不限于³H、¹²⁵I、³⁵S、¹⁴C、³²P和³³P。

在一些实施方式中，可检测标记物可为酶，包括但不限于辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶。酶标记物可以产生例如化学发光信号、有色信号或荧光信号。

在一些实施方式中，可检测标记物为化学发光标记物，包括但不限于鲁米诺、萤光素或光泽精(lucigenin)。

在一些实施方式中，可检测标记物可为光谱比色标记物(spectralcolorimetriclabel)，包括但不限于胶体金或有色玻璃或塑料(例如聚苯乙烯、聚丙烯和胶乳(latex))珠。

在一些实施方式中，本文所述的组合物和方法涉及PCR扩增方案，其中，可通过测序将两个以上引物对亚组的扩增产物区分开。核酸测序方法为本领域所熟知，商业测序服务广泛可得(例如Genscript；Piscataway，NJ)。

在一些实施方式中，本文所述的方法和组合物涉及PCR扩增方案，其中，可借助熔解曲线分析(melting-curveanalysis)将两个以上引物对亚组的扩增产物区分开。熔解曲线分析的方法为本领域所熟知(例如Ririe等，AnalyticalBiochemistry1997245：154-160；Wittwer等，ClinicalChemistry200349：853-860；以及Liew等，ClinicalChemistry200750：1156-1164；以引用的方式将它们整体并入本文)。

优选对通过大小分离的扩增产物进行直接检测。然而，在一些实施方式中，本文所述的方法和组合物涉及PCR扩增方案，其中，可借助寡核苷酸杂交将两个以上引物对亚组的扩增产物区分开。具有本领域普通技术的人员能够利用靶核酸序列的序列信息，设计与单个靶标完全互补而不与其它靶核酸序列互补的探针。可对杂交条件进行常规优化，将不完全互补杂交的背景信号最小化。可将杂交探针设计为与引物序列杂交，或与扩增产物中不含引物的部分杂交，只要是探针所杂交的序列将该扩增产物与反应中存在的至少一种其它扩增产物区分开即可。

在一些实施方式中，本文所述的PCR扩增方案为多重和/或多模态方案。在一些实施方式中，能够通过至少两种方式将一个引物对亚组的扩增产物与其它引物对亚组的扩增产物区分开。以非限制性实例的方式，可用一种通用标记物对扩增cMET的gDNA特异性靶标的引物组的全部产物进行标记，并可通过有区别的大小将各独特的扩增产物与相同引物组的其它扩增产物区分开。

本文所述的方法和组合物涉及对样本中靶核酸序列的存在和/或水平(例如基因改变的存在和/或水平)进行检测。靶核酸可为RNA或DNA。靶核酸可为双链(ds)核酸或单链(ss)核酸，例如dsRNA、ssRNA、dsDNA或ssDNA。如本文所指出的，特别考虑的是，本文所述的方法允许在同一反应中对这些类型的靶标中多于一种类型的靶标进行检测和/或定量，即多模态扩增和检测。靶核酸的非限制性实例包括核酸序列、包含突变的核酸序列、包含缺失的核酸序列、包含插入的核酸序列、序列变体、等位基因、多态性、点突变、SNP、microRNA、编码蛋白的RNA、非编码蛋白的RNA、mRNA、来自病原体(例如细菌、病毒或寄生虫)的核酸、与疾病相关或与患有或发展为疾病的可能性相关的核酸(例如与疾病相关或与患有或发展为疾病的可能性相关的多态性、标志物基因，或者其表达与疾病相关或与患有或发展为疾病的可能性相关的RNA)。

本文有用的样本包含核酸。在一些实施方式中，样本可进一步包含蛋白、细胞、流体、生物流体、保护剂和/或其它物质。在一些实施方式中，样本可获取自受试者。在一些实施方式中，样本可为获取自受试者的生物样本。在一些实施方式中，样本可为获取自受试者的诊断样本。以非限制性实例的方式，样本可为面颊拭子(cheekswab)、血液、血清、血浆、痰液、脑脊液、尿液、泪液、肺泡分离物、胸膜液、心包液、囊液(cystfluid)、肿瘤组织、组织、活组织切片(biopsy)、唾液、抽出物，或上述物质的组合。在一些实施方式中，样本可通过切除术或活组织切片获得。

在一些实施方式中，样本是澄清流体样本，例如经离心而来的澄清流体样本。在一些实施方式中，通过低速离心(例如3,000×g以下)并收集含有澄清流体样本的上清液来使样本澄清。

在一些实施方式中，样本可为新鲜收集的。在一些实施方式中，可在将样本用于本文所述的方法和组合物中之前，将所述样本储存。在一些实施方式中，样本为未经处理的样本。本文使用的“未经处理的样本”指的是除了稀释于溶液中和/或悬浮于溶液中外，未曾进行任何事先的样本预处理的生物样本。

在一些实施方式中，样本可获取自受试者，并在用于本文所述的方法和组合物之前对其进行保存或加工。以非限制性实例的方式，可将样本包埋于石蜡中、冷藏或冷冻。可在根据本文所述的方法和组合物测定核酸的存在之前，将冷冻的样本解冻。在一些实施方式中，样本可为加工过的或处理过的样本。用于对样本进行处理或加工的示例性方法包括但不限于离心、过滤、超声、均质化、加热、冷冻和解冻、与保护剂(例如抗凝血剂或核酸酶抑制剂)接触，以及上述方法的任意组合。在一些实施方式中，可利用化学试剂和/或生物试剂对样本进行处理。可采用化学试剂和/或生物试剂在加工和/或存储期间保护和/或保持样本或样本中所含核酸的稳定性。可替代地或额外地，可采用化学试剂和/或生物试剂使核酸从样本的其它组分中释放出。以非限制性实例的方式，在用于本文所述的方法和组合物之前，可用抗凝血剂处理血液样本。本领域技术人员熟知用于核酸分析的样本加工、保存或处理方法和过程。

在一些实施方式中，核酸样本可由FFPE肿瘤样本制备。在一些实施方式中，样本可包含来自受试者的肿瘤细胞，所述受试者患有或诊断患有如下疾病：胃癌、肾癌、胆管瘤、肺癌、脑癌、宫颈癌、结肠癌、头颈部癌、肝细胞瘤、非小细胞肺癌、黑色素瘤、间皮瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、肉瘤和/或甲状腺癌。参见例如Sattler等，TherAdvMedOncol20113：171-184；以引用的方式将其整体并入本文。

在一些实施方式中，在用于本文所述的方法和组合物之前，对样本中存在的核酸进行分离、富集或纯化。从样本中分离、富集或纯化核酸的方法是本领域普通技术人员所公知的。以非限制性实例的方式，用于从各种样本类型中分离基因组DNA的试剂盒是可商购的(例如，目录号51104、51304、56504和56404；Qiagen；Germantown，MD)。

术语“受试者”和“个体”在本文中可互换使用，指的是从中获取样本的生物体。受试者可为期望对生物体内或者包含该生物体的一个或多个细胞或该生物体内含有的一个或多个细胞中核酸的存在进行测定的任何生物体。本文使用的“受试者”可意味着生物体，例如细菌、寄生虫、植物或动物。在一些实施方式中，受试者可为人或动物。通常，所述动物为脊椎动物，如灵长类动物、啮齿动物、家畜或狩猎动物(gameanimal)。灵长类动物包括黑猩猩、食蟹猴、蜘蛛猴和猕猴(如恒河猴)。啮齿动物包括例如小鼠、大鼠、旱獭(woodchucks)、雪貂(ferrets)、兔和仓鼠。家畜和狩猎动物包括牛(cows)、马、猪、鹿、野牛、水牛、猫科物种(如家猫)、犬科物种(如狗、狐狸、狼)、鸟类物种(如鸡、鸸鹋(emu)、鸵鸟)和鱼类(如鳟鱼(trout)、鲶鱼和鲑鱼)。个体或受试者包括前面所述的任何子集，例如上述的所有。

为方便起见，下文提供了在说明书、实施例以及所附权利要求书中使用的一些术语和短语的含义。除非另有说明或在上下文中有所暗示，下列术语和短语包括下文提供的含义。提供此类定义以辅助描述具体实施方式，而由于本发明的范围仅受权利要求所限，因此并不意味着限制所请求保护的发明。除非另有定义，本文所使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属技术领域中的普通技术人员通常所理解的相同的含义。如果在本领域中术语的使用和本文所提供的该术语的定义之间存在明显不一致，应以本说明书中所提供的定义为准。

为方便起见，在此收集了本文在说明书、实施例和所附权利要求书中采用的某些术语。

术语“降低/下降(decrease)”、“减少(reduced/reduction)”或“抑制(inhibit)”在本文中都用于表示降低了统计学显著的量。在一些实施方式中，“减少”或“降低/下降”或“抑制”通常是指与参照水平(例如不进行指定治疗)相比降低至少10％，并且可以包括例如降低至少约10％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或更多。本文所使用的“减少”或“抑制”不包括与参照水平相比完全抑制或减少。“完全抑制”是指相比于参照水平而言100％抑制。降低/下降可优选低至对于未患有指定疾病的个体而言被认可为正常范围内的水平。

术语“增加/提高(increased/increase)”、“增强(enhance)”或“活化(activate)”在本文中都用于表示增加了统计学显著的量。在一些实施方式中，术语“增加/提高”、“增强”或“活化”可以是指与参照水平相比增加至少10％，例如与参照水平相比增加至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％、或上至并包括增加100％、或10％-100％之间的任何增加，或与参照水平相比至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍、或至少约10倍的增加、或2倍至10倍之间的任何增加或更高量的增加。在标志物或症状的情况下，“增加/提高”指此类水平的统计学显著增加。

本文使用的“改变”可以指例如与参照相比水平或数量(例如基因表达水平或基因拷贝数)的统计学显著变化或与参照相比序列的变化(例如核酸序列中的至少单个核苷酸变化)。

本文使用的“归一化”指的是用第一值除以第二值(例如获得每y水平的x水平)的过程。x通常为被测量的项目(例如cMET的拷贝数或表达水平)，而y为参照(例如参照基因的拷贝数或表达水平)。归一化允许通过为例如存在于样本中的核酸的水平以及反应间的效率差异提供对照，对多个样本和/或反应中测得的水平进行比较。参照基因的选择和对不同值进行归一化的优选方式在本文其它位置描述。

本文使用的“部分(portion)”指的是整体的一部分(part/fraction)，例如整个分子的一部分。具体的分子可具有多个部分，例如两个部分、三个部分、四个部分、五个部分或更多部分。

在核酸的情况下，本文所使用的术语“分离的”或“部分纯化的”涉及从在其天然来源中与核酸一起存在的至少一种其它成分(例如，核酸或多肽)中分离出的核酸；和/或从当由细胞表达时会与核酸一起存在的至少一种其它成分(例如，核酸或多肽)中分离出的核酸。化学合成的核酸或使用体外转录/翻译合成的核酸被认为是“分离的”。

本文所使用的术语“核酸”或“核酸序列”指的是包含核糖核酸、脱氧核糖核酸或它们的类似物的单元的聚合分子。所述核酸可为单链的或双链的。单链核酸可为变性双链DNA的一条链。或者，单链核酸可为不衍生自任何双链DNA的单链核酸。在一个方面，模板核酸为DNA。在另一方面，模板为RNA。合适的核酸分子包括DNA，包括基因组DNA和cDNA。其它合适的核酸分子包括RNA，包括mRNA、rRNA和tRNA。核酸分子可为天然存在的(如在基因组DNA中)，或者可为合成的(即，基于人的行为制备)，或者可为两者的组合。核酸分子也可具有某些修饰，例如2'-脱氧、2'-脱氧-2'-氟代、2'-O-甲基、2'-O-甲氧基乙基(2'-O-MOE)、2'-O-氨基丙基(2'-O-AP)、2'-O-二甲基氨基乙基(2'-O-DMAOE)、2'-O-二甲基氨基丙基(2'-O-DMAP)、2'-O-二甲基氨基乙基氧乙基(2'-O-DMAEOE)或2'-O-N-甲基乙酰氨基(2'-O-NMA)、胆固醇添加以及硫代磷酸酯骨架(如美国专利申请20070213292中所述的)以及2'-氧和4'-碳原子之间通过亚甲基单元连接的某些核糖核苷(如美国专利号6,268,490中所述的)，将该专利和专利申请以引用的方式整体并入本文。

术语“基因”是指当可操作地连接至合适调控序列时在体外或体内转录(DNA)成RNA的核酸序列。所述基因可包含编码区域之前和之后的调控区域，例如，5'非翻译(5'UTR)序列或“前导(leader)”序列；以及3'UTR或“尾随(trailer)”序列；以及各编码片段(外显子)之间的间插序列(interveningsequences)(内含子)。

本文所使用的术语“互补”指的是核苷酸碱基G、A、T、C和U之间的氢键碱基配对形成偏好的层级(hierarchy)，以使得当两种给定的多核苷酸或多核苷酸序列彼此退火时，在DNA中A与T配对、G与C配对，在RNA中G与C配对、A与U配对。本文所使用的“基本上互补”指的是引物在引物的全长内与第二核苷酸序列具有至少90％的互补性，例如，90％互补、95％互补、98％互补、99％互补或100％互补。

术语“统计学显著的(statisticallysignificant)”或“显著地(significantly)”指统计显著性，并且通常意味着两个标准差(2SD)或更大的差别。

除了在操作实施例中或另有指示的地方，本文所用的表示成分的量或反应条件的全部数值在所有情况下都应该被理解为被术语“约”修饰。与百分比相连使用的术语“约”可意味着±1％。

本文所使用的术语“包含/包括/含有(comprising或comprises)”用于表示对本发明方法或组合物必要的组合物、方法及其各自的组成部分，并且无论是否必要都仍然对纳入未指定的要素保持开放。

术语“由…组成”涉及本文所述的组合物、方法及其各自的组成部分，排除没有在实施方式描述中详述的任何要素。

本文所使用的术语“基本上由…组成”涉及给定实施方式所需的那些要素。该术语允许存在实质上不影响该实施方式的基础和新颖性或起作用的特征的要素。

除非上下文中明确地另有所指，单数术语“一(a/an)”和“该/所述(the)”涵盖复数的所指物。相似地，除非上下文中明确地另有所指，单词“或(or)”意在涵盖“和(and)”。尽管与本文所述的方法和材料相似或等同的方法和材料可用于本文公开的实践或测试中，合适的方法和材料在下文有所描述。缩写“e.g.”源自拉丁文的例如(exempligratia)，并在本文中用于表示非限制性实例。因此，缩写“e.g.”与术语“例如(forexample)”同义。

细胞生物学和分子生物学中常用术语的定义可以在如下著作中找到：“TheMerckManualofDiagnosisandTherapy”，第19版，MerckResearchLaboratories出版，2006(ISBN0-911910-19-0)；RobertS.Porter等(著)，TheEncyclopediaofMolecularBiology，BlackwellScienceLtd.出版，1994(ISBN0-632-02182-9)；BenjaminLewin，GenesX，Jones&BartlettPublishing出版，2009(ISBN-10:0763766321)；以及Kendrew等(著)，MolecularBiologyandBiotechnology:aComprehensiveDeskReference，VCHPublishers,Inc.出版，1995(ISBN1-56081-569-8)。

除非另有说明，使用例如如下著作中所述的标准程序来实施本发明：Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual(第三版)，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，N.Y.，USA(2001)；Davis等，BasicMethodsinMolecularBiology，ElsevierSciencePublishing,Inc.，NewYork，USA(1995)；或MethodsinEnzymology：GuidetoMolecularCloningTechniques第152卷，S.L.Berger和A.R.Kimmel著，AcademicPressInc.，SanDiego，USA(1987)；以引用的方式将它们全部整体并入本文。

其它术语在本发明各个方面的描述中进行定义。

出于描述和公开的目的，在此以引用的方式将本申请通篇所引用的所有专利与其它出版物(包括参考文献、授权专利、公开的专利申请以及共同的未决(co-pending)专利申请)明确地并入本文，例如在此类出版物中描述的可用于本文所述技术的方法学。这些出版物仅仅由于它们的公开早于本申请的申请日而提供。在这一方面不应当视作承认本发明人没有权利借助于先前的发明或因为任何其它原因而将公开的内容提前。所有关于这些文件的日期的声明或这些文件的内容的表述是基于申请人可得的信息，并不构成关于这些文件的日期或这些文件的内容的正确性的任何承认。

对本公开的实施方式的描述不意味着穷举或将本公开限制在所公开的确切形式。尽管本文出于说明目的对本公开的具体实施方式和实施例进行了描述，本领域技术人员将会认识到，可在本公开范围内作出多种等同修改。例如，虽然将方法步骤或功能以给定顺序给出，其它实施方式可以不同顺序来实施功能、或可以基本上同时实施这些功能。本文所提供的本公开的教导可以适当的方式应用于其它程序或方法。可将本文所述的各种实施方式组合以提供进一步的实施方式。如有需要的话，可对本公开的方面进行修改，以利用上述参考文献和申请中的组合物、功能和构思，来提供本公开更进一步的实施方式。可根据详细描述来对本公开进行上述改变和其它改变。所有此类修改都旨在落入所附权利要求书的范围之内。

任何前述实施方式中的具体要素均可进行组合或替代其它实施方式中的要素。此外，尽管与本公开的特定实施方式相关的优势已经在这些实施方式的上下文中描述，其它实施方式也可表现出此类优势，但不是所有实施方式都必须展现出此类优势，才能落入本公开的范围。

本文所述的技术进一步由以下实施例予以说明，但决不应当理解为本文所述的技术被进一步限定。

可根据任何以下编号段落对本文所述技术的一些实施方式进行定义：

1.一种用于对cMET的改变进行检测的测定法，所述测定法包括：

将核酸样本的部分与两个引物组相接触，其中，第一引物组检测cMET基因拷贝数变异的改变，第二引物组检测cMET基因表达水平的变化；

其中，所述第一引物组包含对cMET的至少一种gDNA特异性序列和至少两个参照基因各自的至少一种gDNA特异性序列进行扩增的引物对亚组，其中，一个参照基因位于7号染色体，一个参照基因不位于7号染色体，从而对cMET基因拷贝数变异进行检测；

其中，所述第二引物组包含对cMET的mRNA特异性序列和至少两个参照基因的mRNA特异性序列进行扩增的引物对亚组；

对包含所述样本的所述部分和所述两个引物组的反应混合物实施PCR扩增方案，所述扩增方案包括链分离、引物退火和引物延伸的循环；

检测各引物对的扩增子水平；

针对参照基因扩增子将cMET扩增子水平归一化；以及

将归一化的cMET扩增子水平与参照水平进行比较，其中，与所述参照水平相比gDNA特异性cMET扩增子水平更高表明所述样本中存在cMET基因扩增的改变，与所述参照水平相比mRNA特异性cMET扩增子水平改变表明所述样本中存在cMET基因表达水平的改变。

2.如段落1所述的测定法，其中，所述第一引物组进一步包含对EGFR的至少一种gDNA特异性序列进行扩增的引物对亚组；以及

所述测定法进一步包括将归一化的EGFR扩增子水平与参照水平进行比较，其中，与所述参照水平相比gDNA特异性EGFR扩增子水平更高表明所述样本中存在EGFR基因扩增的改变。

3.如段落1或2所述的测定法，其中，所述第一引物组中位于7号染色体的参照基因是KDELR-2；以及

所述测定法进一步包括将归一化的KDELR-2扩增子水平与参照水平进行比较，其中，与所述参照水平相比gDNA特异性KDELR-2扩增子水平更高表明所述样本中存在KDELR-2基因扩增的改变。

4.如段落1-3中任一项所述的测定法，其中，存在cMET、EGFR和KDELR-2基因扩增的改变表明存在7号染色体扩增。

5.如段落1-4中任一项所述的测定法，其中，所述第一引物组中不位于7号染色体的参照基因是SOD1或SPG21。

6.如段落5所述的测定法，其中，所述第一引物组包含对SOD1和SPG21各自的至少一种gDNA特异性序列进行扩增的引物对亚组。

7.如段落1-6中任一项所述的测定法，其中，所述引物组包含对各基因的至少一种扩增子进行扩增的引物对亚组。

8.如段落1-7中任一项所述的测定法，其中，所述引物组包含对各基因的至少两种扩增子进行扩增的引物对亚组。

9.如段落1-8中任一项所述的测定法，其中，所述引物组包含对各基因的至少三种扩增子进行扩增的引物对亚组。

10.如段落1-9中任一项所述的测定法，其中，所述引物组包含对cMET、EGFR和KDELR-2各自的至少两种gDNA特异性扩增子以及对cMET、SOD1和SPG21各自的至少两种mRNA特异性扩增子进行扩增的引物对亚组。

11.如段落1-10中任一项所述的测定法，其中，所述引物组包含对cMET、EGFR和KDELR-2各自的至少三种gDNA特异性扩增子以及对cMET、SOD1和SPG21各自的至少三种mRNA特异性扩增子进行扩增的引物对亚组。

12.如段落1-11中任一项所述的测定法，所述测定法进一步包括：

将所述样本的第二部分与第三引物组相接触，其中，所述第三引物组包含对含有序列变异的cMET序列进行扩增的引物对亚组；

对包含所述样本的所述第二部分和所述第三引物组的反应混合物实施PCR扩增方案，所述扩增方案包括链分离、引物退火和引物延伸的循环；

检测各引物对的扩增子水平，其中，扩增子的存在表明存在该引物对对其具有特异性的序列变异。

13.如段落12所述的测定法，其中，cMET的一种或多种序列变异为SNP。

14.如段落12或13所述的测定法，其中，cMETSNP选自于由下列SNP所组成的组：

S1058P、V1101I、H1112Y、H1124D、G1137V、M1149T、V1206L、L1213V、K1262R、M1268T、V1238I、Y1248C和D1246N。

15.如段落12-14中任一项所述的测定法，其中，对S1058P、V1101I、H1112Y、H1124D、G1137V、M1149T、V1206L、L1213V、K1262R、M1268T、V1238I、Y1248C和D1246N进行检测。

16.如段落12-15中任一项所述的测定法，其中，对于两个反应均使用相同的PCR热循环方案。

17.如段落1-16中任一项所述的测定法，其中，所述核酸样本由FFPE肿瘤样本制备。

18.如段落1-17中任一项所述的测定法，其中，所述样本包含来自受试者的肿瘤细胞，所述受试者诊断患有选自于由如下病症所组成的组中的病症：

胃癌、肾癌、胆管瘤、肺癌、脑癌、宫颈癌、结肠癌、头颈部癌、肝细胞瘤、非小细胞肺癌、黑色素瘤、间皮瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、肉瘤和甲状腺癌。

19.如段落1-18中任一项所述的测定法，其中，一种或多种所述引物为双结构域引物。

20.如段落1-19中任一项所述的测定法，其中，来自引物对亚组的两种以上引物对的扩增产物为可区分的。

21.如段落1-20中任一项所述的测定法，其中，借助有区别的大小将来自引物对亚组的两种以上引物对的扩增产物区分开。

22.如段落1-21中任一项所述的测定法，其中，通过用不同的可检测标记物进行标记，将来自引物对亚组的两种以上引物对的扩增产物区分开。

23.如段落1-22中任一项所述的测定法，其中，通过用不同的可检测标记物进行标记，将来自所述第一引物组和所述第二引物组的扩增产物区分开。

24.如段落1-23中任一项所述的测定法，其中，一种或多种所述引物选自于由SEQIDNO：1-SEQIDNO：83所组成的组。

25.如段落1-24中任一项所述的测定法，其中，一种或多种所述引物包含SEQIDNO：89-SEQIDNO：124中的任何序列。

26.如段落1-25中任一项所述的测定法，其中，所述引物以约为表2的浓度存在于所述反应混合物中。

27.一种用于对cMET的改变进行检测的方法，所述方法包括：

将核酸样本的部分与对cMET基因拷贝数变异的改变进行检测的引物组相接触；

其中，所述引物组包含对cMET的至少一种gDNA特异性序列和至少两个参照基因各自的至少一种gDNA特异性序列进行扩增的引物对亚组，其中，一个参照基因位于7号染色体，一个参照基因不位于7号染色体，从而对cMET基因拷贝数变异进行检测；

对包含所述样本的所述部分和所述引物组的反应混合物实施PCR扩增方案，所述扩增方案包括链分离、引物退火和引物延伸的循环；

检测各引物对的扩增子水平；

针对参照基因扩增子将cMET扩增子水平归一化；以及

将归一化的cMET扩增子水平与参照水平进行比较，其中，与所述参照水平相比gDNA特异性cMET扩增子水平更高表明所述样本中存在cMET基因扩增的改变。

28.如段落27所述的方法，其中，所述引物组进一步包含对EGFR的至少一种gDNA特异性序列进行扩增的引物对亚组；以及

所述方法进一步包括将归一化的EGFR扩增子水平与参照水平进行比较，其中，与所述参照水平相比gDNA特异性EGFR扩增子水平更高表明所述样本中存在EGFR基因扩增的改变。

29.如段落27或28所述的方法，其中，所述引物组中位于7号染色体的参照基因是KDELR-2；以及

所述方法进一步包括将归一化的KDELR-2扩增子水平与参照水平进行比较，其中，与所述参照水平相比gDNA特异性KDELR-2扩增子水平更高表明所述样本中存在KDELR-2基因扩增的改变。

30.如段落27-29中任一项所述的方法，其中，存在cMET、EGFR和KDELR-2基因扩增的改变表明存在7号染色体扩增。

31.如段落27-30中任一项所述的方法，其中，所述引物组中不位于7号染色体的参照基因是SOD1或SPG21。

32.如段落31所述的方法，其中，所述引物组包含对SOD1和SPG21的至少一种gDNA特异性序列进行扩增的引物对亚组。

33.如段落27-32中任一项所述的方法，所述方法进一步包括将所述核酸样本的所述部分与第二引物组相接触，其中，所述第二引物组对cMET基因表达水平的变化进行检测；

其中，所述第二引物组包含对cMET的mRNA特异性序列和至少两个参照基因的至少mRNA特异性序列进行扩增的引物对亚组；以及

其中，与参照水平相比mRNA特异性cMET扩增子水平改变表明所述样本中存在cMET基因表达水平的改变。

34.如段落27-33中任一项所述的方法，其中，所述第一引物组包含对SOD1和SPG21各自的至少一种gDNA特异性序列进行扩增的引物对亚组。

35.如段落27-34中任一项所述的方法，其中，所述引物组包含对各基因的至少一种扩增子进行扩增的引物对亚组。

36.如段落27-35中任一项所述的方法，其中，所述引物组包含对各基因的至少两种扩增子进行扩增的引物对亚组。

37.如段落27-36中任一项所述的方法，其中，所述引物组包含对各基因的至少三种扩增子进行扩增的引物对亚组。

38.如段落27-37中任一项所述的方法，其中，所述引物组包含对cMET、EGFR和KDELR-2各自的至少两种gDNA特异性扩增子以及对cMET、SOD1和SPG21各自的至少两种mRNA特异性扩增子进行扩增的引物对亚组。

39.如段落27-38中任一项所述的方法，其中，所述引物组包含对cMET、EGFR和KDELR-2各自的至少三种gDNA特异性扩增子以及对cMET、SOD1和SPG21各自的至少三种mRNA特异性扩增子进行扩增的引物对亚组。

40.如段落27-39中任一项所述的方法，所述方法进一步包括：

41.如段落40所述的方法，其中，cMET的一种或多种序列变异为SNP。

42.如段落39-41中任一项所述的方法，其中，cMETSNP选自于由下列SNP所组成的组：

43.如段落39-42中任一项所述的方法，其中，对S1058P、V1101I、H1112Y、H1124D、G1137V、M1149T、V1206L、L1213V、K1262R、M1268T、V1238I、Y1248C和D1246N进行检测。

44.如段落39-43中任一项所述的方法，其中，对于两个反应均使用相同的PCR热循环方案。

45.如段落39-44中任一项所述的方法，其中，所述核酸样本由FFPE肿瘤样本制备。

46.如段落27-45中任一项所述的方法，其中，所述样本包含来自受试者的肿瘤细胞，所述受试者诊断患有选自于由如下病症所组成的组中的病症：

47.如段落27-46中任一项所述的方法，其中，一种或多种所述引物为双结构域引物。

48.如段落27-47中任一项所述的方法，其中，来自引物对亚组的两种以上引物对的扩增产物为可区分的。

49.如段落27-48中任一项所述的方法，其中，借助有区别的大小将来自引物对亚组的两种以上引物对的扩增产物区分开。

50.如段落27-49中任一项所述的方法，其中，通过用不同的可检测标记物进行标记，将来自引物对亚组的两种以上引物对的扩增产物区分开。

51.如段落27-50中任一项所述的方法，其中，通过用不同的可检测标记物进行标记，将来自所述第一引物组和所述第二引物组的扩增产物区分开。

52.如段落27-51中任一项所述的方法，其中，一种或多种所述引物选自于由SEQIDNO：1-SEQIDNO：83所组成的组。

53.如段落27-52中任一项所述的方法，其中，一种或多种所述引物包含SEQIDNO：89-SEQIDNO：124中的任何序列。

54.如段落27-53中任一项所述的方法，其中，所述引物以约为表2的浓度存在于所述反应混合物中。

实施例

实施例1

开发了与ICEPlex系统相容的、设计用于对cMET和EGFR基因的扩增、cMET表达以及7号染色体多体性进行检测的18靶标单管多模态测定法。使用之前在文献中表征的细胞系对该测定法进行测试。

已知cMET扩增存在于SNU-5和H1993细胞系中。已知在SNU-5中出现cMET过表达，而在SNU-1中未报道过cMET的表达。已知7号染色体多体性存在于SNU-5细胞系，并可能存在于H1993细胞系。使用表2示出的浓度，利用表1的引物实施该测定法；并且，如图2-图7所描绘的，证实了所述细胞系先前的表征(表5)。

进而，本文所述的测定法显示在正常组织或单个临床FFPE样品中无异常的cMET水平或7号染色体多体性(数据未示出)。当在正常肺组织和胃组织或在临床FFPE胃癌样品上对该测定法进行测试时，显示无cMET、EGFR或7号染色体异常状况(数据未示出)。

合适的缓冲液可包含如下：Tris缓冲液(50-200mM，pH8-9)、海藻糖(5-15％)、乙酸钾(25-150mM)、甘油(1-7.5％)和甜菜碱(250-1250mM)。使用delta-exo-AptaTaq聚合酶(每个PCR反应1-10U)。热循环条件在图11中描绘。

表1：引物序列

表2：多重引物对组和浓度的示例性实施方式

实施例2

使用实施例1的缓冲液、酶和热循环参数实施对cMETSNP(snips)的检测。如图9-图10所示，对供选择的两组引物(图8)进行测试，一组对较长的扩增子进行扩增(表3)，一组对较短的扩增子进行扩增(表4)。

实施例3：对cMET和EGFR拷贝数变异及cMET基因表达的相对定量

根据Livak和Schmittgen，2001，使用delta-deltaCt法对cMET和EGFR拷贝数变异及cMET基因表达的相对定量进行计算。将测定法优化为对于不同的靶标获得范围为90-110％的类似PCR效率，并如下所述实施对拷贝数变异和靶标表达的相对定量：

步骤1：计算cMET基因表达靶标、或者cMET或EGFRCNV靶标的平均Ct。

步骤2：计算参照基因的平均Ct。将两个基因用于拷贝数变异计算，并使用各自具有两个扩增子的两个基因来测量cMET基因表达。

步骤3：通过使用如下公式计算相对定量：

使用如下公式计算cMET或EGFRCNV、或者cMET基因表达相对于参照的倍数差异：

＝2^{(cMET或EGFR或cMET基因表达的平均Ct－参照基因的平均Ct)}

表3：检测cMETSNP的引物-较长的扩增子

表4：检测cMETSNP的引物-较短的扩增子

表5：样本特征

表6：引物

Claims

检测各引物对的扩增子水平；

针对参照基因扩增子将cMET扩增子水平归一化；以及

2.如权利要求1所述的测定法，其中，所述第一引物组进一步包含对EGFR的至少一种gDNA特异性序列进行扩增的引物对亚组；以及

3.如权利要求1或2所述的测定法，其中，所述第一引物组中位于7号染色体的参照基因是KDELR-2；以及

4.如权利要求1-3中任一项所述的测定法，其中，存在cMET、EGFR和KDELR-2基因扩增的改变表明存在7号染色体扩增。

5.如权利要求1-4中任一项所述的测定法，其中，所述第一引物组中不位于7号染色体的参照基因是SOD1或SPG21。

6.如权利要求5所述的测定法，其中，所述第一引物组包含对SOD1和SPG21各自的至少一种gDNA特异性序列进行扩增的引物对亚组。

7.如权利要求1-6中任一项所述的测定法，其中，所述引物组包含对各基因的至少一种扩增子进行扩增的引物对亚组。

8.如权利要求1-7中任一项所述的测定法，其中，所述引物组包含对各基因的至少两种扩增子进行扩增的引物对亚组。

9.如权利要求1-8中任一项所述的测定法，其中，所述引物组包含对各基因的至少三种扩增子进行扩增的引物对亚组。

10.如权利要求1-9中任一项所述的测定法，其中，所述引物组包含对cMET、EGFR和KDELR-2各自的至少两种gDNA特异性扩增子以及对cMET、SOD1和SPG21各自的至少两种mRNA特异性扩增子进行扩增的引物对亚组。

11.如权利要求1-10中任一项所述的测定法，其中，所述引物组包含对cMET、EGFR和KDELR-2各自的至少三种gDNA特异性扩增子以及对cMET、SOD1和SPG21各自的至少三种mRNA特异性扩增子进行扩增的引物对亚组。

12.如权利要求1-11中任一项所述的测定法，所述测定法进一步包括：

13.如权利要求12所述的测定法，其中，cMET的一种或多种序列变异为SNP。

14.如权利要求12或13所述的测定法，其中，cMETSNP选自于由下列SNP所组成的组：

S1058P、V1101I、H1112Y、H1124D、G1137V、M1149T、V1206L、L1213V、K1262R、M1268T、V1238I、Y1248C和D1246N(SEQIDNO：131)。

15.如权利要求12-14中任一项所述的测定法，其中，对S1058P、V1101I、H1112Y、H1124D、G1137V、M1149T、V1206L、L1213V、K1262R、M1268T、V1238I、Y1248C和D1246N(SEQIDNO：131)进行检测。

16.如权利要求12-15中任一项所述的测定法，其中，对于两个反应均使用相同的PCR热循环方案。

17.如权利要求1-16中任一项所述的测定法，其中，所述核酸样本由FFPE肿瘤样本制备。

18.如权利要求1-17中任一项所述的测定法，其中，所述样本包含来自受试者的肿瘤细胞，所述受试者诊断患有选自于由如下病症所组成的组中的病症：

19.如权利要求1-18中任一项所述的测定法，其中，一种或多种所述引物为双结构域引物。

20.如权利要求1-19中任一项所述的测定法，其中，来自引物对亚组的两种以上引物对的扩增产物为可区分的。

21.如权利要求1-20中任一项所述的测定法，其中，借助有区别的大小将来自引物对亚组的两种以上引物对的扩增产物区分开。

22.如权利要求1-21中任一项所述的测定法，其中，通过用不同的可检测标记物进行标记，将来自引物对亚组的两种以上引物对的扩增产物区分开。

23.如权利要求1-22中任一项所述的测定法，其中，通过用不同的可检测标记物进行标记，将来自所述第一引物组和所述第二引物组的扩增产物区分开。

24.如权利要求1-23中任一项所述的测定法，其中，一种或多种所述引物选自于由SEQIDNO：1-SEQIDNO：83所组成的组。

25.如权利要求1-24中任一项所述的测定法，其中，一种或多种所述引物包含SEQIDNO：89-SEQIDNO：124中的任何序列。

26.如权利要求1-25中任一项所述的测定法，其中，所述引物以约为表2的浓度存在于所述反应混合物中。

27.一种用于对cMET的改变进行检测的方法，所述方法包括：

检测各引物对的扩增子水平；

针对参照基因扩增子将cMET扩增子水平归一化；以及

28.如权利要求27所述的方法，其中，所述引物组进一步包含对EGFR的至少一种gDNA特异性序列进行扩增的引物对亚组；以及

29.如权利要求27或28所述的方法，其中，所述引物组中位于7号染色体的参照基因是KDELR-2；以及

30.如权利要求27-29中任一项所述的方法，其中，存在cMET、EGFR和KDELR-2基因扩增的改变表明存在7号染色体扩增。

31.如权利要求27-30中任一项所述的方法，其中，所述引物组中不位于7号染色体的参照基因是SOD1或SPG21。

32.如权利要求31所述的方法，其中，所述引物组包含对SOD1和SPG21的至少一种gDNA特异性序列进行扩增的引物对亚组。

33.如权利要求27-32中任一项所述的方法，所述方法进一步包括将所述核酸样本的所述部分与第二引物组相接触，其中，所述第二引物组对cMET基因表达水平的变化进行检测；

34.如权利要求27-33中任一项所述的方法，其中，所述第一引物组包含对SOD1和SPG21各自的至少一种gDNA特异性序列进行扩增的引物对亚组。

35.如权利要求27-34中任一项所述的方法，其中，所述引物组包含对各基因的至少一种扩增子进行扩增的引物对亚组。

36.如权利要求27-35中任一项所述的方法，其中，所述引物组包含对各基因的至少两种扩增子进行扩增的引物对亚组。

37.如权利要求27-36中任一项所述的方法，其中，所述引物组包含对各基因的至少三种扩增子进行扩增的引物对亚组。

38.如权利要求27-37中任一项所述的方法，其中，所述引物组包含对cMET、EGFR和KDELR-2各自的至少两种gDNA特异性扩增子以及对cMET、SOD1和SPG21各自的至少两种mRNA特异性扩增子进行扩增的引物对亚组。

39.如权利要求27-38中任一项所述的方法，其中，所述引物组包含对cMET、EGFR和KDELR-2各自的至少三种gDNA特异性扩增子以及对cMET、SOD1和SPG21各自的至少三种mRNA特异性扩增子进行扩增的引物对亚组。

40.如权利要求27-39中任一项所述的方法，所述方法进一步包括：

41.如权利要求40所述的方法，其中，cMET的一种或多种序列变异为SNP。

42.如权利要求39-41中任一项所述的方法，其中，cMETSNP选自于由下列SNP所组成的组：

43.如权利要求39-42中任一项所述的方法，其中，对S1058P、V1101I、H1112Y、H1124D、G1137V、M1149T、V1206L、L1213V、K1262R、M1268T、V1238I、Y1248C和D1246N(SEQIDNO：131)进行检测。

44.如权利要求39-43中任一项所述的方法，其中，对于两个反应均使用相同的PCR热循环方案。

45.如权利要求39-44中任一项所述的方法，其中，所述核酸样本由FFPE肿瘤样本制备。

46.如权利要求27-45中任一项所述的方法，其中，所述样本包含来自受试者的肿瘤细胞，所述受试者诊断患有选自于由如下病症所组成的组中的病症：

47.如权利要求27-46中任一项所述的方法，其中，一种或多种所述引物为双结构域引物。

48.如权利要求27-47中任一项所述的方法，其中，来自引物对亚组的两种以上引物对的扩增产物为可区分的。

49.如权利要求27-48中任一项所述的方法，其中，借助有区别的大小将来自引物对亚组的两种以上引物对的扩增产物区分开。

50.如权利要求27-49中任一项所述的方法，其中，通过用不同的可检测标记物进行标记，将来自引物对亚组的两种以上引物对的扩增产物区分开。

51.如权利要求27-50中任一项所述的方法，其中，通过用不同的可检测标记物进行标记，将来自所述第一引物组和所述第二引物组的扩增产物区分开。

52.如权利要求27-51中任一项所述的方法，其中，一种或多种所述引物选自于由SEQIDNO：1-SEQIDNO：83所组成的组。

53.如权利要求27-52中任一项所述的方法，其中，一种或多种所述引物包含SEQIDNO：89-SEQIDNO：124中的任何序列。

54.如权利要求27-53中任一项所述的方法，其中，所述引物以约为表2的浓度存在于所述反应混合物中。