CN105738546B

CN105738546B - 毛郁金药材指纹图谱的建立方法及其指纹图谱

Info

Publication number: CN105738546B
Application number: CN201410767332.2A
Authority: CN
Inventors: 张恩德; 黄景华; 王习著; 臧成旭
Original assignee: Guilin Eight Plus One Pharmaceutical Ltd By Share Ltd
Current assignee: Guilin Eight Plus One Pharmaceutical Ltd By Share Ltd
Priority date: 2014-12-12
Filing date: 2014-12-12
Publication date: 2020-01-21
Anticipated expiration: 2034-12-12
Also published as: CN105738546A

Abstract

本发明公开了一种毛郁金药材指纹图谱的建立方法及其指纹图谱，具体是建立HPLC指纹图谱以控制毛郁金药材的质量，包括以下步骤：(1)对照品溶液的制备：配制莪术二酮、莪术二醇、原莪术醇对照品溶液；(2)供试品溶液的制备：取毛郁金药材进行提取，提取液经过滤即得；(3)采用HPLC测定得到指纹图谱：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，流动相为乙腈‑四氢呋喃‑0.1％磷酸水系统，采用梯度洗脱，柱温：30℃；紫外检测波长230～250nm，时间60min～65min(4)相似度评价：得到的药材指纹图谱导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2004A版相似度软件进行相似度评价。本发明方法简便、快速、准确、重现性好；为毛郁金药材质量的全面有效控制提供了有力保障。

Description

毛郁金药材指纹图谱的建立方法及其指纹图谱

技术领域

本发明属于药物分析技术领域，涉及中药药材的质量控制方法，尤其涉及毛郁金药材HPLC指纹图谱的建立方法及其指纹图谱。

背景技术

中药指纹图谱是指某些中药材或中药制剂经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示其化学特征的色谱图或光谱图。它可以较全面地反映药材所含化学成分的种类和数量，有效地体现中药成分的整体性和综合作用，以其快速、准确等特点已被广泛运用于中药分析鉴定和质量控制等方面。

毛郁金为姜科植物毛郁金Curcuma aromatica Salisb.的干燥根茎，是我国重要的民族药材之一，主要分布于广西横县、灵山、南宁等地，具有破血行气，通经止痛作用，主治胸肋刺痛、经闭、风湿肩臂疼痛、跌扑肿痛等，等[1]。现代药理实验证明，毛郁金还具有抗炎[2]、免疫抑制[3]、镇痛止血[4]、抗氧化[5]等作用。毛郁金根茎化学成分较为复杂，根茎含挥发油，油中α-，β-蒎烯，奥、姜烯、1-αγ-姜黄烯、1-β-姜黄烯、樟脑、松油醇、枯茗醇(Cumiyl aleohol)，d-龙脑、姜醇(zingiberol)和少量姜黄素。挥发性成分中主要含有桉叶素(Eucalypto1)、榄香烯(Elemene)、莪术烯(Curzerene)、B-榄烯酮(p-Elemenone)、吉马酮(Germacrone)、莪术二酮(Curdione)、新莪术二酮(Neocurdione)，此外还包括树脂类、甾醇类、多肽类、三萜类等成分。由于受气候、产地等因素的影响，不同毛郁金药材所含成分也存在一定差异。已有学者对毛郁金药理作用的研究和毛郁金中挥发油成分的GC-MS分析，但还未见其他质量方面的研究。本专利通过对十批来源不同的毛郁金进行HPLC指纹图谱进行研究，建立了毛郁金药材的指纹图谱，为该药材的质量控制提供有力保障。

发明内容

本发明的目的是提供一种毛郁金药材指纹图谱的建立方法，以及由此方法得到的毛郁金药材标准指纹图谱。本发明通过对毛郁金药材高效液相色谱指纹图谱的研究，得到了一种较好的毛郁金药材质量控制方法。

本发明的毛郁金药材高效液相色谱指纹图谱的方法包括以下步骤：

(1)对照品溶液的制备：精密称取莪术二酮、莪术二醇、原莪术醇对照品，分别用甲醇配制成每1mL含莪术二酮0.1～0.2mg、莪术二醇0.01～0.02mg、原莪术醇0.02～0.04mg的溶液，作为对照品溶液；

(2)供试品溶液的制备：精密称取毛郁金药材粗粉，加入甲醇超声提取30～60min，过滤，取续滤液作为供试品溶液；

(3)色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，采用梯度洗脱，流动相为乙腈-四氢呋喃-0.1％磷酸水系统组成的梯度洗脱液，紫外检测：波长为230～250nm；

(4)测定：精密吸取供试品溶液10～20μL注入高效液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到指纹图谱。

优选的，步骤(1)中莪术二酮对照品溶液的浓度为0.1990mg·mL^-1，莪术二醇对照品溶液的浓度为0.0152mg·mL^-1，原莪术醇对照品溶液的浓度为0.0295mg·mL^-1。

优选的，步骤(2)中毛郁金药材粗粉过40目筛，毛郁金药材称重量为约0.5g。

优选的，步骤(2)中提取步骤为采用甲醇超声提取，提取时间为30min。

优选的，步骤(3)中梯度洗脱的流动相为乙腈-四氢呋喃-0.1％磷酸水系统的梯度洗脱液；洗脱时间为65min；流速1.0mL·min^-1；柱温：30℃。

所述步骤(3)色谱条件中所述的梯度洗脱，梯度洗脱程序以如下体积浓度配置进行：0分钟时，流动相A为15％的乙腈-四氢呋喃(10:1)、流动相B为85％的0.1％磷酸水溶液；50分钟时，流动相A为85％的乙腈-四氢呋喃(10:1)、流动相B为15％的0.1％磷酸水溶液；50.1分钟时，流动相A为15％的乙腈-四氢呋喃(10:1)、流动相B为85％的0.1％磷酸水溶液；65分钟时，流动相A为15％的乙腈-四氢呋喃(10:1)、流动相B为85％的0.1％磷酸水溶液。

优选的，步骤(4)测定中，HPLC自动进样器进样20μL。

优选的，纹图谱中有12个特征共有峰，其中1号峰为莪术二醇参照峰，5号峰为原莪术醇，11号峰为莪术二酮，具体如下：

1号峰，平均保留时间为9.73min，峰面积为875.686；

2号峰，平均保留时间为13.71min，峰面积为403.140；

3号峰，平均保留时间为14.54min，峰面积为336.420；

4号峰，平均保留时间为15.52min，峰面积为118.226；

5号峰，平均保留时间为24.54min，峰面积为264.982；

6号峰，平均保留时间为30.12min，峰面积为104.990；

7号峰，平均保留时间为31.62min，峰面积为2344.064；

8号峰，平均保留时间为32.45min，峰面积为926.635；

9号峰，平均保留时间为33.65min，峰面积为166.430；

10号峰，平均保留时间为34.76min，峰面积为172.176；

11号峰，平均保留时间为37.48min，峰面积为415.697；

12号峰，平均保留时间为47.25min，峰面积为288.828。

本发明的另一目的在于提供前述得到的指纹图谱在毛郁金药材及毛郁金药材提取物和制剂检测中的应用。

作为本发明的优选实施方式，对10批毛郁金药材指纹图谱数据进行研究，建立了毛郁金药材高效液相色谱指纹图谱的方法，包括以下步骤：

(1)对照品溶液的制备：精密称取莪术二酮、莪术二醇、原莪术醇适量，分别加甲醇制成0.1990g·L^-1的莪术二酮对照品溶液，0.0152g·L^-1的莪术二醇对照品溶液0.0295g·L^-1的原莪术醇对照品溶液的对照品溶液。

(2)供试品溶液的制备：取毛郁金药材粉末约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，密塞，称定质量，超声提取30min,放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液用0.45μm微孔滤膜滤过即得。

(3)高效液相色谱分析：Agela Promosil C₁₈色谱柱；乙腈-四氢呋喃(10：1)(A)-0.1％磷酸水(B)梯度洗脱；流速1.0mL·min^-1；检测波长250nm；柱温30℃；进样量20μL，按表1进行梯度洗脱：

表1 流动相洗脱程序

在此条件下进行HPLC分析，得到毛郁金药材的指纹图谱。

(4)标准指纹图谱的确定：按照本发明提供的方法，对不同来源的10批毛郁金药材建立了HPLC指纹图谱，通过分析比较，确定了12个共有特征峰，以参照物1号峰即莪术二醇峰为S峰，计算各共有特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±5％内，规定值为：1.000(峰1)、1.410(峰2)、1.495(峰3)、1.596(峰4)、2.523(峰5)、3.097(峰6)、3.251(峰7)、3.336(峰8)、3.460(峰9)、3.575(峰10)、3.854(峰11)、4.858(峰12)，这些共有特征峰构成了毛郁金药材的指纹特征，可作为毛郁金药材的标准指纹图谱。

(5)相似度评价：10批药材样品指纹图谱采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2004A版相似度软件进行评价，结果表明供试品指纹图谱相似度均大于0.90。

(6)系统聚类分析：将不同来源的毛郁金HPLC图谱中12个共有峰峰面积标准化组成10×12阶原始数据矩阵，运用SPSS19.0软件，采用组间联接法，利用Euclidean距离为测度，进行系统聚类分析，将来自不同产地的10批药材分为3类。

本发明的优点和有益效果为：

1.本发明制备方法所采用的供试品制备简单，色谱条件易于实现；该方法快速、准确，精密度，重现性和稳定性良好，色谱峰信息丰富且分离度好，所建立的指纹图谱能够有效地表征毛郁金药材的质量。

2.本发明将毛郁金药材作为一个整体对待，通过比较其共有峰可以找出不同药材之间的细微差异，适用于对毛郁金药材真伪、产地和品质的鉴别和控制。

附图说明

图1、10批毛郁金药材HPLC指纹图谱

图2、毛郁金药材标准指纹图谱

图3、10批毛郁金药材指纹图谱聚类分析

具体实施方式

实施例1:毛郁金药材HPLC指纹图谱的方法建立与验证

1.仪器和材料

1.1仪器：戴安P680型高效液相色谱仪，包括P680型输液泵、ASI-100自动进样器、柱温箱及紫外检测器，chromeleon色谱工作站。BK-240A型超声波清洗机(巴克超声波科技集团有限公司)，BP211型电子分析天平(德国赛多利斯)。

1.2对照品与试剂：莪术二酮对照品(成都普菲德生物技术有限公司，批号130713)，莪术二醇对照品、原莪术醇对照品均为自制，所有对照品纯度均大于98％。乙腈(美国Fisher化学试剂公司，色谱纯)，磷酸(天津市康科德科技有限公司分析纯)，甲醇(天津市康科德科技有限公司，分析纯)，水为纯净水(杭州娃哈哈集团限公司)。

1.3药材：毛郁金药材共10批，分别记为S1-S10,其中S1、S6来自广西横县，S2、S4、S7来自广西桂林，S3、S8、S9、S10来自湖北黄冈，S5来自湖南新田。

2.高效液相色谱

2.1色谱条件：Agela Promosil C₁₈色谱柱；乙腈-四氢呋喃(10：1)(A)-0.1％磷酸水(B)梯度洗脱；流速1.0mL·min^-1；检测波长250nm；柱温30℃；进样量20μL。

流动相洗脱程序如表1：

表1 流动相洗脱程序

2.2对照品溶液的制备：精密称取莪术二酮、莪术二醇、原莪术醇适量，分别加甲醇制成0.1990mg·mL^-1的莪术二酮对照品溶液，0.0152mg·mL^-1的莪术二醇对照品溶液0.0295mg·mL^-1的原莪术醇对照品溶液的对照品溶液。

2.3供试品溶液的制备：取毛郁金药材粉末约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，密塞，称定质量，超声提取30min,放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液用0.45μm微孔滤膜滤过即得。

3.方法学验证

3.1精密度试验：取毛郁金(S1)供试品溶液，连续进样6次，分别对共有峰的相对保留时间和相对峰面积进行考察。结果表明，各共有峰的相对保留时间的RSD均＜1.5％，相对峰面积的RSD均＜3.4％。表明该方法精密度良好。

3.2重复性试验：取毛郁金(S1)药材样品6份，按2.3项下方法操作制备供试品溶液，进样分析，测得各共有峰的相对保留时间的RSD均＜1.8％，相对峰面积的RSD均＜3.8％。表明该方法重复性良好。

3.3稳定性试验：取毛郁金(S1)供试品溶液,分别于0,2,4,6,12,24h进行分析，考察其共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果表明，各共有峰的相对保留时间的RSD均＜1.6％，相对峰面积的RSD均＜3.5％，表明供试品溶液在24h内基本稳定。

4.测定：精密吸取供试品溶液与对照品溶液各20μL注入高效液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到指纹图谱。

实施例2：10批毛郁金药材指纹图谱的检测及数据分析

1.1毛郁金药材指纹图谱测定：取10批毛郁金药材，按实施例1条件进行测定，得10批样品的HPLC图谱。将1号峰(莪术二醇)作为参照，确定了12个共有峰，如图1。对各共有峰的相对保留时间和相对峰面积进行计算，其中各共有峰相对保留时间的RSD均＜0.15％，但各相对峰面积的RSD均较大，说明不同产地的药材成分含量相差较大，结果见表2～3。

表2 10批药材HPLC指纹图谱的相对保留时间

表3 10批药材HPLC指纹图谱的相对峰面积

1.2相似度评价：将10批毛郁金药材色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2004A版相似度软件，采用均值法自动匹配生成对照图谱R，如图2。l0批样品与对照指纹图谱相似度在0.943～0.995之间,提示药材质量相对较稳定，结果见表4。

表4 10批毛郁金药材指纹图谱相似度评价

1.3聚类分析：将不同来源的毛郁金HPLC图谱中12个共有峰峰面积标准化组成10×12阶原始数据矩阵，运用SPSS19.0软件，采用组间联接法，利用Euclidean距离为测度，进行系统聚类分析，见图3。根据聚类分析结果，可将10批毛郁金药材分为三类，其中S2、S3、S4、S6、S8、S9、S10聚为I类，S5、S7聚为II类，S1为III类。

相似度评价结果表明，10批药材相似度均大于0.9，表明不同产地的毛郁金药材质量比较稳定，但从相对峰面积比来看，药材成分含量差异较大。采用聚类分析将不同来源的毛郁金药材分为3类，发现分类结果与产地分布并不完全吻合，结合相似度评价结果说明来源不同的毛郁金药材的质量存在一定差异，可能还和药材的种植、采收和贮藏等因素有关，需进一步进行考察研究。

Claims

1.一种毛郁金药材指纹图谱的建立方法，其特征在于采用HPLC法，包括如下步骤：

(3)色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，采用梯度洗脱，紫外检测：波长为230～250nm；所述梯度洗脱以如下体积浓度配置进行：0分钟时，流动相A为15％的乙腈：四氢呋喃＝10:1、流动相B为85％的0.1％磷酸水溶液；50分钟时，流动相A为85％的乙腈：四氢呋喃＝10:1、流动相B为15％的0.1％磷酸水溶液；50.1分钟时，流动相A为15％的乙腈：四氢呋喃＝10:1、流动相B为85％的0.1％磷酸水溶液；65分钟时，流动相A为15％的乙腈：四氢呋喃＝10:1、流动相B为85％的0.1％磷酸水溶液；

2.根据权利要求1所述的毛郁金药材HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于：步骤(1)中所述莪术二酮对照品溶液的浓度为0.1990mg·mL^-1、莪术二醇对照品溶液的浓度为0.0152mg·mL^-1、原莪术醇对照品溶液的浓度为0.0295mg·mL^-1。

3.根据权利要求1所述的毛郁金药材HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于：步骤(2)中所述毛郁金药材粗粉过40目筛，毛郁金药材称重量为约0.5g。

4.根据权利要求1所述的毛郁金药材HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于：步骤(2)中所述甲醇超声提取的提取时间为30min。

5.根据权利要求1所述的毛郁金药材HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于：步骤(3)中所述梯度洗脱的洗脱时间为65min；流速1.0mL·min^-1；柱温：30℃。

6.根据权利要求1所述的毛郁金药材HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于：步骤(4)中所述测定中，HPLC自动进样器进样20μL。

7.根据权利要求1-6任一项所述的毛郁金药材HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于：所述指纹图谱中有12个特征共有峰，其中1号峰为莪术二醇参照峰，5号峰为原莪术醇，11号峰为莪术二酮，具体如下：