CN105510488B

CN105510488B - 一种止痛贴剂的指纹图谱及其质量检测方法

Info

Publication number: CN105510488B
Application number: CN201610049485.2A
Authority: CN
Inventors: 周海燕; 周丽娟; 杨芮平; 张超
Original assignee: Shanxi Yabao Pharmaceutical Group Corp
Current assignee: Yabao Pharmaceutical Group Corp
Priority date: 2016-01-25
Filing date: 2016-01-25
Publication date: 2017-10-03
Anticipated expiration: 2036-01-25
Also published as: CN105510488A

Abstract

本发明提供了一种止痛贴剂有效成分的测定方法及指纹图谱的建立方法，包括对照品溶液的制备、供试品溶液的制备、测定等步骤，其中高效液相色谱仪的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为乙腈‑0.2％甲酸，按照特定程序进行梯度洗脱，流动相的流速为0.8‑1.2ml/min，柱温30‑40℃，检测波长：290±3nm。本发明所选择的流动相和洗脱梯度是经过实验验证的，和现有技术比较，能够同时满足止痛贴剂中指纹图谱检测和两种黄酮类有效成分的含量测定。

Description

一种止痛贴剂的指纹图谱及其质量检测方法

技术领域

本发明涉及药品检测领域，尤其是涉及一种中成药的高效液相色谱检测。

背景技术

消肿止痛贴是以地方药材沙蒿子为主要原料药的外用贴剂，经动物实验和多年临床使用验证，疗效确切，具有非常好的消炎止痛功效。临床用于疖疮初起，关节肿痛的辅助治疗。自该品种上市以来，经过不断地技术升级，在产品品质和生产工艺方面都得到了大幅度地改进。

但是对于该产品的质量控制方面，缺乏系统地研究和统一的、适用于工业生产的标准。张媛媛等人曾经研究沙蒿子的指纹图谱条件(张媛媛，乔延江，HPLC法测定沙蒿子种子中两种二氢黄酮的含量，北京中医药大学学报，2008，31(1)：58～60.)。但是按照其条件检测消肿止痛贴中的沙蒿子有效成分时，发现其峰型很差，分离度不好，达不到中国药典要求，不利于企业大生产适用。李莎莎等研究了沙蒿子中有效成分的含量测定，但其采用的是等度洗脱，不能满足指纹图谱检测的要求。(李莎莎，史新元，展晓日等，沙蒿子子中总黄酮及圣草酚-7-甲醚、异樱花素的含量测定，中华中医药杂志，2009,24(9):1223～1225.)

因此，需要提供一种新的检测方法，能同时满足沙蒿子种子中多种有效成分的含量测定和指纹图谱检测。

发明内容

为了解决上述至少一个技术问题，本发明提供了一种消肿止痛贴剂有效成分的测定方法。

本发明提供的测定方法，包括如下步骤：

(1)对照品溶液的制备：称取圣草酚-7-甲醚、异樱花素对照品，加乙醇制得混合对照品溶液。

(2)供试品溶液的制备：取消肿止痛贴的药贴，粉碎，过筛，加入乙醇溶液，提取20-50min，放至室温，加入乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取滤液，蒸干，残渣加入乙醇溶解，摇匀即得供试品溶液。

(3)测定法：吸取混合对照品溶液和供试品溶液，注入高效液相色谱仪，得到色谱图，其中，高效液相色谱仪的色谱条件如下：

色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，

流动相：乙腈-0.2％甲酸为流动相，进行梯度洗脱，梯度程序如下表

流动相的流速为0.8-1.2ml/min，柱温30-40℃，

检测波长：290±3nm。

本发明所选择的流动相和洗脱梯度是经过实验验证的，和现有技术比较，能够同时满足消肿止痛贴剂中指纹图谱检测和两种黄酮类有效成分的含量测定。

根据本发明实施方式之一，步骤(1)中混合对照品溶液中圣草酚-7-甲醚和异樱花素的浓度分别为40μg/ml和20μg/ml。

根据本发明实施方式之一，洗脱梯度程序可以为：0～10min,乙腈12％；10～15min,乙腈12％～16％；15～30min,乙腈16％；30～65min,乙腈16％～30％；65～80min,乙腈30％～35％；80～110min,乙腈35％。也就是采用如下表所示的洗脱梯度。

根据本发明实施方式之一，乙醇的浓度为55～85％。

根据本发明实施方式之一，乙醇的浓度优选为80％。

根据本发明实施方式之一，步骤(2)中所述药贴经粉碎、过筛后加入乙醇，使得每100ml提取溶剂中所含药粉为1g～5g。

根据本发明实施方式之一，步骤(2)中提取方法为超声提取或加热回流提取。

根据本发明实施方式之一，步骤(2)中提取方法为超声提取25～35min。进一步地，超声功率可以为500W，频率为40kHz。

根据本发明实施方式之一，色谱柱可以为Agilent ZORBAX SB-C₁₈柱。

根据本发明实施方式之一，柱温优选35℃。

根据本发明实施方式之一，流动相的流速优选1ml/min。

根据本发明实施方式之一，检测波长为290nm。

本发明还提供了一种消肿止痛贴剂高效液相指纹图谱的建立方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)对照品溶液的制备：称取圣草酚-7-甲醚、异樱花素对照品，加入浓度为55～85％的乙醇制得混合对照品溶液。

(2)供试品溶液的制备：取消肿止痛贴的药贴，粉碎，过筛，加入浓度为55～85％的乙醇溶液，使得每100ml提取溶剂中所含药粉为1g～5g，超声提取或加热回流提取20-50min，放至室温，加入浓度为55～85％的乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取滤液，蒸干，残渣加入浓度为55～85％的乙醇溶解，摇匀即得供试品溶液。

(3)获得色谱图：以对照品溶液作为参照物，将供试品溶液和对照品溶液注入高效液相色谱仪，得到色谱图，其中，所述高效液相色谱仪的色谱条件如下：

色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，

流动相：乙腈-0.2％甲酸为流动相，进行梯度洗脱，梯度程序如下：

流动相的流速为0.8-1.2ml/min，柱温30-40℃，

检测波长：290±3nm。

(4)生成对照指纹图谱：选择合格的多批消肿止痛贴剂的指纹图谱，以圣草酚-7-甲醚为参比峰，得到11个共有峰的图谱，按中位数法计算生成标准对照指纹图谱，其中，指纹图谱相对保留时间为：

图形见附图2。

根据本发明的实施方式之一，乙醇的浓度为80％。

根据本发明的实施方式之一，色谱柱可以为Agilent ZORBAX SB-C₁₈柱。

根据本发明的实施方式之一，步骤(1)中混合对照品溶液中圣草酚-7-甲醚和异樱花素的浓度分别为40μg/ml和20μg/ml。

根据本发明的实施方式之一，检测波长为290nm。

根据本发明的实施方式之一，步骤(2)中提取方法为超声提取25～35min。

需要说明的是，本发明中所采用的消肿止痛贴是以地方药材沙蒿子为主要原料药的外用贴剂，例如，亚宝药业集团股份有限公司生产的批号为1504288、1505048、1505201、1505202、1505203、1505204、1505205、1505206、1505207、1505208、1505209、1505210、1505211、1505212、1505213、1505214、1505215、1505216、1505219、1505221、1505223、1505224的消肿止痛贴。

本发明对现有技术中的HPLC指纹图谱方法进行了优化，经过对流动相和梯度洗脱条件等方法进行改进，使得图谱的主峰分离度明显改善，达到药典要求，同时对照峰的峰形也明显变好，可以满足工业化大生产的需要。

本发明附加的方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从下面结合附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1根据本发明提供方法所得对照品指纹图谱；

图2根据本发明实施例所得供试品色谱图；

图3圣草酚-7-甲醚标准品紫外吸收图；

图4异樱花素标准品紫外吸收图；

图5消肿止痛贴剂紫外吸收图；

图6不同浓度提取溶剂所得供试品色谱图；

图7不同提取溶剂用量所得供试品色谱图；

图8不同提取方式所得供试品色谱图；

图9不同提取时间所得供试品色谱图；

图10不同超声条件所得供试品色谱图；

图11不同品牌色谱柱所得供试品色谱图；

图12不同柱温所得供试品色谱图；

图13不同流速所得供试品色谱图；

图14精密度试验指纹图谱；

图15重复性试验指纹图谱；

图16中间精密度试验指纹图谱；

图17稳定性试验指纹图谱；

图18不同仪器耐用性试验指纹图谱；

图19色谱柱耐用性试验指纹图谱；

图20消肿止痛贴剂标准指纹图谱；

图21圣草酚-7-甲醚对照品标准曲线；

图22异樱花素对照品标准曲线；

图23文献方法梯度洗脱所得对照品色谱图；

图24文献方法梯度洗脱所得样品色谱图；

图25本发明优化方法梯度洗脱所得对照品色谱图；

图26本发明优化方法梯度洗脱所得样品色谱图；

图27流动相为乙腈-0.1％甲酸所得样品色谱图；

图28流动相为乙腈-0.2％甲酸所得样品色谱图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能解释为对本发明的限制。

实施例1指纹图谱建立

1.1仪器

Agilent 1260高效液相色谱仪，岛津LC-20AT高效液相色谱仪，色谱柱(AgilentZORBAX SB-C18，4.6×250mm，5μm，S/N:USCL060354)，色谱柱(Agilent ZORBAX SB-C18，4.6×250mm，5μm，S/N:USCL058060)，色谱柱(Agilent ZORBAX SB-C18，4.6×250mm，5μm，S/N:USCL059648)，色谱柱(Phenomenex Gemiri C18，4.6×250mm，5μm，S/N:696685-14)，色谱柱(Inertsil ODS-3C18，4.6×250mm，5μm，S/N:1A7143425)。分析天平AB204-L(METTLERTOLEDO)，分析天平XP-6(METTLER TOLEDO)，LQ-500超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2试剂

甲酸(AR，国药集团化学试剂有限公司)，乙醇(AR，北京化工厂)，乙腈(HPLC，Honeywell)，甲醇(HPLC，Honeywell)。

对照品：圣草酚-7-甲醚对照品，纯度90.0％，自制；异樱花素对照品，纯度93.5％，ChromaDex。

1.3检测样品

消肿止痛贴，批号1505048，由亚宝药业集团股份有限公司提供。

1.4测试方法

照高效液相色谱法(中国药典2015年版四部通则0512)测定。

取消肿止痛药贴，照以下方法试验。

对照品溶液的制备取圣草酚-7-甲醚、异樱花素对照品适量，精密称定，加80％乙醇制成每1ml含圣草酚-7-甲醚40μg、异樱花素20μg的溶液，摇匀，即得。

供试品溶液的制备取药贴，粉碎，过三号药典筛。取粉末约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加80％乙醇100ml，密塞，称定重量，超声处理(功率500W，频率40kHz)30分钟，取出，放至室温，用80％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液50ml，蒸干，残渣加80％乙醇溶解，转移至10ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，即得。

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(AgilentZORBAX SB-C18色谱柱，柱长为250mm，内径为4.6mm，S/N:USCL059648)，以乙腈为流动相A，0.2％甲酸为流动相B，按下表进行梯度洗脱:

流速1.0ml/min；检测波长为290nm；柱温为35℃。理论塔板数以圣草酚-7-甲醚计应不低于50000。

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，记录110分钟内的色谱峰，即得。

附图1为对照品指纹图谱，其中峰8为圣草酚-7-甲醚，峰11为异樱花素。附图2可见供试品色谱图中，呈现与圣草酚-7-甲醚对照品色谱峰保留时间一致的色谱峰，并应呈现11个与对照指纹图谱相对应的特征峰。

实施例2最佳色谱条件考察

仪器和试剂同实施例1。

2.1检测波长的选择

取圣草酚-7-甲醚对照品溶液，在200～600nm范围内扫描，结果在288nm处有最大吸收，结果见图3。

取异樱花素对照品溶液，在200～600nm范围内扫描，结果在292nm处有最大吸收，结果见图4。

取消肿止痛贴剂供试品溶液，在200～600nm范围内扫描，结果在293nm及329nm处有最大吸收，结果见图5。

因为两个含量测定成分圣草酚-7-甲醚和异樱花素在290nm附近均有最大吸收，且290nm处色谱峰信息丰富，故选择290nm作为最佳检测波长。

2.2供试品溶液的制备考察

对照品溶液的制备、色谱条件和测定法同实施例1。

(1)提取溶剂浓度考察

检测药贴批号1505205，粉碎，过三号药典筛。取粉末12份，每份约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分成六组，分别精密加甲醇、95％乙醇、80％乙醇、60％乙醇、30％乙醇、水各150ml，密塞，称定重量，超声处理(功率500W，频率40kHz)30分钟，取出，放至室温，分别用相应溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液75ml，蒸干，残渣加80％乙醇溶解，转移至10ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，即得。

测定结果见表1、表2，图6。

表1不同浓度提取溶剂所得色谱峰面积

表2不同浓度提取溶剂提取率

以上结果表明，80％乙醇为溶剂提取时，所获取指纹图谱信息量较多，峰响应值较大，且提取率最高，故优选80％乙醇为提取溶剂。

(2)溶剂用量考察

取检测药贴(批号1505205)，粉碎，过三号药典筛。取粉末8份，每份约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分成四组，分别精密加入80％乙醇50ml、100ml、150ml、200ml，密塞，称定重量，分别超声处理(功率500W，频率40kHz)30分钟，取出，放至室温，分别用80％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，分别精密量取续滤液25ml、50ml、75ml、100ml，蒸干，残渣加80％乙醇溶解，转移至10ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，滤过，精密吸取续滤液10μl，注入液相色谱仪，测定，计算，即得。结果见表3、表4，图7。

表3不同提取溶剂用量所得色谱峰面积

表4不同提取溶剂用量提取率

以上结果表明，80％乙醇100ml提取所获得的信息量大，峰响应值高，且提取率最高，故确定优选的提取溶剂用量为100ml。

(3)提取方式考察

取检测药贴(批号1505205)，粉碎，过三号药典筛。取粉末4份，每份约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入80％乙醇100ml，密塞，称定重量，分为两组，第一组加热回流30分钟；第二组用超声处理(功率500W，频率40kHz)30分钟提取，取出，放至室温，分别用80％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液50ml，蒸干，残渣加80％乙醇溶解，转移至10ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，滤过，精密吸取续滤液10μl，注入液相色谱仪，测定，计算，即得。结果见表5、表6，图8。

表5不同提取方式所得色谱峰面积

表6不同提取方式提取率

以上结果表明，超声提取与回流提取结果基本一致，对提取效率影响不大。

(4)提取时间考察

取检测药贴(批号1505205)，粉碎，过三号药典筛。取粉末6份，每份约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分成三组，分别精密加入80％乙醇100ml，密塞，称定重量，分别超声处理(功率500W，频率40kHz)第一组10分钟、第二组30分钟、第三组50分钟，取出，放至室温，分别用80％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液50ml，蒸干，残渣加80％乙醇溶解，转移至10ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，滤过，精密吸取续滤液10μl，注入液相色谱仪，测定，计算，即得。结果见表7、表8，图9。

表7不同提取时间所得色谱峰面积

表8不同提取时间提取率

以上结果表明，超声提取30分钟即可获得最多的信息量，峰响应值也较大，且提取最完全，故优选超声时间30分钟。

(5)超声功率、频率考察

取检测药贴(批号1505205)，粉碎，过三号药典筛。取粉末6份，每份约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分成三组，分别精密加入80％乙醇100ml，密塞，称定重量，超声提取30分钟，第一组超声功率500W/频率40kHz、第二组超声功率250W/频率40kHz、第三组超声功率50W/频率53kHz，取出，放至室温，分别用80％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，分别精密量取续滤液50ml，蒸干，残渣加80％乙醇溶解，转移至10ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，滤过，精密吸取续滤液10μl，注入液相色谱仪，测定，计算，即得。结果见表9、表10，图10。

表9不同超声条件所得色谱峰面积

表10不同超声条件提取率

以上结果表明，超声波功率与频率对本品提取率影响较小，但是相对而言，选用超声功率500W、频率40kHz时可获得最佳的色谱信息。

将以上制备方法所得到的色谱图中主要色谱峰进行积分，对比各保留时间下的峰面积，选择色谱峰信息丰富，提取效率高，总峰面积较大的方法。

综合上述实验结果，最终可以确定本发明提供的优选的供试品制备方法为：取药贴，粉碎，过三号药典筛。取粉末约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加80％乙醇100ml，密塞，称定重量，超声处理(功率500W，频率40kHz)30分钟，取出，放至室温，用80％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液50ml，蒸干，残渣加80％乙醇溶解，转移至10ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3色谱柱的选择

色谱柱的填料和装填方式可能对药品化学成分分离效果产生影响。发明人对Agilent、岛津及Phenomenex三个不同品牌的C18色谱柱(5μm，250×4.6mm)进行考察，其它条件同实施例1。结果如附图11所示。Agilent ZORBAX SB-C18柱的分离效果和峰型均优于其余两种，故选择Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱。

2.4柱温的选择

在色谱指纹图谱测定中，柱温往往会影响分离效果，发明人分别在30℃、35℃、40℃三个柱温条件下，对消肿止痛贴供试品溶液的指纹图谱进行分析，其它条件同实施例1。结果见附图11。表明在35℃时各个色谱峰的分离效果比较好，故选择35℃为合适的柱温。

2.5流速考察

在色谱指纹图谱测定中，流速在一定程度上会影响分离效果，本试验分别在0.8ml/min、1.0ml/min、1.2ml/min三个流速条件下，对消肿止痛贴供试品溶液的指纹图谱进行分析，其它条件同实施例1。结果见附图13。表明在1.0ml/min时各个色谱峰的分离效果比较好，故选择1.0ml/min为合适的流速。

实施例3指纹图谱方法学验证

3.1空白试验

取80％乙醇，按实施例1色谱条件直接进样，记录110分钟的色谱图，结果表明体系不存在残留和干扰。

3.2精密度试验

取检测药贴(批号1505205)，按照实施例1方法制备成供试品溶液，按照实施例1色谱条件直接进样6次，以8号峰圣草酚-7-甲醚为参照物，计算各主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积。结果显示11个共有峰的相对保留时间稳定，RSD％均小于1％，相对峰面积相对恒定，RSD％均小于2％；表明该仪器的精密度良好。结果见表11、表12，图14。

表11精密度试验相对保留时间

表12精密度试验相对峰面积

3.3重复性试验

取同一批次消肿止痛贴剂，按照实施例1方法制备成六份供试品溶液，按照实施例1色谱条件检测，以8号峰圣草酚-7-甲醚为参照物，计算各主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积。结果显示11个共有峰的相对保留时间稳定，RSD％均小于1％，相对峰面积相对恒定，RSD％均小于3％；表明该该方法重复性良好。结果见表13、表14、图15。

表13重复性试验相对保留时间

表14重复性试验相对峰面积

3.4中间精密度

取同一批次消肿止痛贴剂，按照实施例1方法制备成六份供试品溶液，按照实施例1色谱条件检测，以8号峰圣草酚-7-甲醚为参照物，计算各主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积。结果显示11个共有峰的相对保留时间稳定，RSD％均小于1％，相对峰面积相对恒定，RSD％均小于1％；表明该该方法重复性良好。结果见表15、表16、图16。

表15中间精密度试验相对保留时间

表16中间精密度试验相对峰面积

3.5稳定性试验

取待测药贴，批号1505205，按照实施例1方法制备成供试品溶液，按照实施例1色谱条件分别于0、4、8、12、18、24、32、40、48、60、72小时进样检测，以8号峰圣草酚-7-甲醚为参照物，计算各主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积。结果显示11个共有峰的相对保留时间稳定，RSD均小于1％，相对峰面积相对恒定，RSD均小于4％；表明本品的供试品溶液至少在72小时内稳定。结果见表17、表18、图17。

表17稳定性试验相对保留时间

表18稳定性试验相对峰面积

3.6耐用性研究

3.6.1不同型号HPLC耐用性

按实施例1指纹图谱测定方法，使用不同型号的仪器对同一批次消肿止痛贴(批号1505205)进行检测，以Agilent 1260仪器图谱为参照，以参照图谱计算不同仪器之间图谱的相似度。结果表明，不同仪器间测定结果大致相同，指纹图谱相似度均大于0.99，说明高效液相色谱仪的型号对本指纹图谱方法影响不大。结果见表19、图18。

表19不同仪器耐用性试验结果

3.6.2不同批次色谱柱耐用性

按实施例1指纹图谱测定方法，使用不同批次色谱柱对同一批次消肿止痛贴进行检测，以其中一个批次色谱柱(序列号USCL059648)图谱为参照，计算相似度。结果表明，不同批次色谱柱间测定结果大致相同，指纹图谱相似度均大于0.99，说明色谱柱的批次对本方法影响不大。结果见表20、图19。

表20色谱柱耐用性试验结果

实施例4标准指纹图谱的建立

对亚宝药业集团股份有限公司生产的批号为1504288、1505048、1505201、1505202、1505203、1505204、1505205、1505206、1505207、1505208、1505209、1505210、1505211、1505212、1505213、1505214、1505215、1505216、1505219、1505221、1505223、1505224的消肿止痛贴，共计22批次样品，分别按实施例1的指纹图谱测定方法进行检测，采用国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012.0版本)拟合生成消肿止痛贴标准指纹图谱，见图20。

实施例5消肿止痛贴剂有效成分含量测定

按照实施例1的方法，测定22批消肿止痛贴中圣草酚-7-甲醚和异樱花素的含量，结果见表21。

表21样品含量测定结果

结果：以上22批消肿止痛贴中圣草酚-7-甲醚平均含量为0.386mg/g(相当于0.1544mg/贴)，异樱花素平均含量为0.173mg/g(相当于0.0692mg/贴)。

实施例6方法学验证

6.1专属性试验

因消肿止痛贴海绵状药贴只有沙蒿子一味药材，且没有辅料，故不存在其他成分的干扰；取沙蒿子药材，按供试品制备方法制成药材供试液；取对照品溶液、供试品溶液、药材供试液及溶剂(即：80％乙醇)，分别进样10μl，色谱条件同实施例1，记录色谱图。结果表明，供试品溶液和沙蒿子药材供试液在与对照品溶液色谱图相应的位置上呈现色谱峰；而溶剂色谱图在相应位置上未出现色谱峰。表明该方法无干扰，以本法测定本品中圣草酚-7-甲醚和以异樱花素的含量具有专属性。

6.2峰纯度检查

按实施例1方法，制备供试品溶液和对照品溶液，采用PDA检测器进行全波长检测，计算峰纯度，结果为杂质峰未检测到；圣草酚-7-甲醚和异樱花素的峰纯度指数均在0.999以上，证明该色谱条件下圣草酚-7-甲醚和异樱花素色谱峰的峰纯度均符合要求。

6.3系统适用性试验

按实施例1方法，制备供试品溶液和对照品溶液，分别进样6次，记录圣草酚-7-甲醚和异樱花素的峰面积，计算相对标准偏差，结果见表22、表23。

表22圣草酚-7-甲醚系统适用性试验结果

表23异樱花素系统适用性试验结果

结果，在上述色谱条件下，圣草酚-7-甲醚和异樱花素色谱峰与样品中相邻色谱峰均可达基线分离，分离度大于1.5；理论板数以圣草酚-7-甲醚峰计达50000以上；拖尾因子均在0.95～1.15之间；峰面积RSD％均小于1.0％。以上结果表明，圣草酚-7-甲醚和异樱花素在上述色谱条件下，仪器的精密度和重复性良好，系统适用性符合要求。

6.4线性关系考察

(1)圣草酚-7-甲醚线性试验

取圣草酚-7-甲醚对照品6.947mg(纯度90.0％)，精密称定，置25ml量瓶中，加80％乙醇至刻度，摇匀，即得0.2501mg/ml的储备液。

精密吸取上述溶液0.5、1.0、1.0、2.0、4.0ml，分别置于10ml、10ml、5ml、5ml、5ml量瓶中，用80％乙醇稀释至刻度，摇匀，配制成12.5046、25.0092、50.0184、100.0368和200.0736μg/ml的对照品溶液，摇匀。分别精密吸取上述溶液各10μl，注入液相色谱仪，按实施例1色谱条件测定。以进样量(μg)为横坐标，峰面积为纵坐标作图，绘制标准曲线。见表24、图21。

表24圣草酚-7-甲醚对照品线性试验结果

结果：回归方程y＝3844.11x+16.60，相关系数R2＝1.00，表明圣草酚-7-甲醚进样量在0.1250μg～2.0007μg范围内线性关系良好。

(2)异樱花素线性试验

取异樱花素对照品3.417mg(纯度93.5％)，精密称定，置25ml量瓶中，加80％乙醇至刻度，摇匀，即得0.1278mg/ml的储备液。

精密吸取上述溶液0.5、1.0、1.0、2.0、4.0ml，分别置于10ml、10ml、5ml、5ml、5ml、量瓶中，用80％乙醇稀释至刻度，摇匀，配制成6.3898、12.7796、25.5592、51.1183和102.2366μg/ml的对照品溶液，摇匀。分别精密吸取上述溶液各10μl，注入液相色谱仪，按实施例1色谱条件测定。以进样量(μg)为横坐标，峰面积为纵坐标作图，绘制标准曲线。见表25、图22。

表25异樱花素对照品线性试验结果

结果：回归方程y＝3524.12x-2.31，相关系数R2＝1.00，表明异樱花素进样量在0.0639μg～1.0224μg范围内线性关系良好。

6.5溶液稳定性试验

取待测药贴(批号1505048)，按实施例1方法操作，分别于0、4、8、12、18、24、32、40、48、60、72小时进样检测，记录圣草酚-7-甲醚和异樱花素的峰面积。测定结果见表26。

表26稳定性试验结果

结果表明，RSD％<1.0％，供试品溶液中圣草酚-7-甲醚和异樱花素在72小时内稳定性良好。

6.6精密度试验

6.6.1重复性试验

取待测药贴(批号1505048)，由实验人员A按实施例1测定法操作，制备六份供试品溶液，进样检测。结果见表27。

表27重复性试验结果

结果：本品圣草酚-7-甲醚的平均含量为0.331mg/g，RSD％小于2.0％；异樱花素的平均含量为0.136mg/g，RSD％小于2.0％。结果表明，本方法的重复性良好。

6.6.2中间精密度

选择不同的测定的时间、不同的高效液相色谱仪、不同的实验人员(B)，按实施例1测定法操作，测定同一批样品中圣草酚-7-甲醚和异樱花素的含量，综合A和B的测定结果，见表28、表29。

表28圣草酚-7-甲醚中间精密度结果

表29异樱花素中间精密度结果

结果，A和B测定的样品中圣草酚-7-甲醚平均含量为0.326mg/g、异樱花素的平均含量为0.138mg/g，RSD％均小于3.0％。结果表明，本方法中间精密度良好。

6.7准确度试验

采用加样回收法测定准确度。精密称取圣草酚-7-甲醚对照品3.893mg，置10ml量瓶中，加80％乙醇适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成0.3504mg/ml的对照品溶液；精密称取异樱花素对照品1.512mg，置10ml量瓶中，加80％乙醇适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成0.1414mg/ml的对照品溶液。

取待测药贴(批号1505048)，粉碎，过三号药典筛，取粉末9份，各约1g，精密称定，分置具塞锥形瓶中，分成3组，每组3份，各组分别精密加入上述两个对照品溶液各0.8、1.0、1.2ml，蒸干溶剂，分别精密加入80％乙醇100ml，称定重量，超声处理(功率500W，频率40kHz)30分钟，取出，放至室温，用80％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液50ml，蒸干，残渣加80％乙醇溶解，转移至10ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液，即得。

分别精密吸取上述溶液各10μl，注入液相色谱仪，按实施例1色谱条件测定，结果见表30、表31。

本批次消肿止痛贴中圣草酚-7-甲醚的含量为0.331mg/g、异樱花素含量0.136mg/g。

注：回收率(％)＝(测得总量-样品中的量)/对照加入量×100％。

表30圣草酚-7-甲醚加样回收试验结果

表31异樱花素加样回收试验结果

结果：圣草酚-7-甲醚和异樱花素的回收率均在95％～105％之间。结果表明，本方法加样回收率良好。

6.8范围考察

(1)高限采用加样回收法，精密称取异樱花素对照品7.042mg，置50ml量瓶中，加80％乙醇适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成浓度为0.131685mg/ml的异樱花素对照品溶液。取待测药贴(批号1505048)，粉碎，过三号药典筛，取粉末6份，各约5g，精密称定，分别置具塞锥形瓶中；分别精密称取并加入圣草酚-7-甲醚对照品1.982、1.986、1.909、1.897、1.994、1.861mg；分别精密量取并加入上述异樱花素对照品溶液5ml；蒸干溶剂，分别精密加入80％乙醇100ml，称定重量，超声处理(功率500W，频率40kHz)30分钟，取出，放至室温，用80％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液50ml，蒸干，残渣加80％乙醇溶解，转移至10ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液，即得。

分别精密吸取上述溶液各10μl，注入液相色谱仪，按实施例1色谱条件测定，结果见表32、表33。

表32圣草酚-7-甲醚高限考察试验结果

表33异樱花素高限考察试验结果

结果：圣草酚-7-甲醚和异樱花素的回收率均在95％～105％之间。

(2)低限采用加样回收法，精密称取圣草酚-7-甲醚对照品1.858mg，置10ml量瓶中，加80％乙醇适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成浓度为0.1672mg/ml的圣草酚-7-甲醚对照品溶液；精密称取异樱花素对照品1.756mg，置50ml量瓶中，加80％乙醇适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成浓度为0.0328mg/ml的异樱花素对照品溶液。取待测药贴(批号1505048)，粉碎，过三号药典筛，取粉末6份，各约0.5g，精密称定，分别置具塞锥形瓶中；分别精密量取并加入上述圣草酚-7-甲醚对照品溶液1ml、异樱花素对照品溶液2ml；蒸干溶剂，分别精密加入80％乙醇100ml，称定重量，超声处理(功率500W，频率40kHz)30分钟，取出，放至室温，用80％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液50ml，蒸干，残渣加80％乙醇溶解，转移至10ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液，即得。

分别精密吸取上述溶液各10μl，注入液相色谱仪，按实施例1色谱条件测定，结果见表34、表35。

表34圣草酚-7-甲醚低限考察试验结果

表35异樱花素低限考察试验结果

范围考察结果表明，消肿止痛贴中圣草酚-7-甲醚的含量在0.16mg/g～1.77mg/g(相当于0.064mg/贴～0.708mg/贴)、异樱花素的含量在0.07mg/g～0.69mg/g(相当于0.028mg/贴～0.276mg/贴)范围内，测定准确度良好。

6.9耐用性试验

考察不同柱温、流速、波长、酸浓度和不同厂家色谱柱对本色谱条件的耐用性。取待测药贴(批号1505048)，粉碎，过三号药典筛，取粉末约2g，精密称定，按实施例1方法操作。结果见表36、表37。

表36圣草酚-7-甲醚耐用性试验结果

表37异樱花素耐用性试验结果

结果：在已确定的色谱条件下，测得待测药贴(批号：1505048)中圣草酚-7-甲醚含量为0.331mg/g、异樱花素含量为0.136mg/g，改变柱温、流速、波长、酸浓度和不同生产厂家色谱柱，各考察项下测定的含量的RSD％均小于4.0％。结果表明，该色谱条件的耐用性良好。

实施例7与文献方法比较研究

将文献《沙漠嘎种子平喘活性成分筛选及其质量研究》(张媛媛，硕士研究生学位论文，2006)方法与本发明实施例1所提供的方法进行比较研究。

7.1流动相组成及梯度列表比较：

参考文献中指纹图谱条件，对消肿止痛贴剂进行检测。

色谱柱ZORBAX Eclipse XDB-C18(4.6×250mm，5μm)；检测波长：288nm；柱温:30℃；进样量：10μL。流动相：乙腈－0.1％甲酸水溶液；流速1mL·min-1；流动相按下表进行梯度洗脱：

对照品溶液的制备：取圣草酚-7-甲醚、异樱花素对照品适量，精密称定，加80％乙醇制成每1ml含圣草酚-7-甲醚40μg、异樱花素20μg的溶液，摇匀，即得。

供试品溶液的制备：取本品海绵状药贴，粉碎，过三号药典筛。取粉末约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加80％乙醇100ml，密塞，称定重量，超声处理(功率500W，频率40kHz)30分钟，取出，放至室温，再称定重量，用80％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液50ml，蒸干，残渣加80％乙醇溶解，转移至10ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，即得。

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。结果见附图23、24。

结果显示，圣草酚-7-甲醚峰对称因子0.74；异樱花素峰对称因子0.76，分离度1.47，尚达不到药典所要求的“待测组分与相邻共存物之间的分离度应大于1.5”的要求。(《中华人民共和国药典》(2010年版)一部附录Ⅵ之D)。因为这两个成分要列入含测指标，所以需要对色谱条件进行优化。另外15.183min的色谱峰较大，占总峰面积的57.76％，但是峰型很差，分离度不好，需要优化色谱条件来改善峰型及分离度。

按照本发明所提供的优化后的色谱条件，对消肿止痛贴剂再次进行检测。

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(色谱柱Agilent ZORBAX SB-C18 250mm×4.6mm，5μm)，以乙腈为流动相A，以0.2％甲酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速1.0ml/min；检测波长为290nm；柱温为35℃。理论塔板数以圣草酚-7-甲醚计应不低于50000。

供试品溶液的制备取本品海绵状药贴，粉碎，过三号药典筛。取粉末约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加80％乙醇100ml，密塞，称定重量，超声处理(功率500W，频率40kHz)30分钟，取出，放至室温，再称定重量，用80％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液50ml，蒸干，残渣加80％乙醇溶解，转移至10ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，即得。

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。见附图25、26。

结果显示，圣草酚-7-甲醚对称因子0.84；异樱花素对称因子0.84，分离度1.59，高于药典标准。与文献方法的图谱相比，这两个成分的峰型均有明显的改善，分离度也可以达到含量测定要求。另外文献方法的图谱中15.183min的色谱峰在该图中的保留时间为33.013min，与前后的色谱峰均达到分离效果，且峰型也有明显的改善。色谱峰整体分离效果要比文献方法要好，基线也更加平稳。

7.2流动相酸浓度比较：

参考文献中流动相组成，比较了流动相乙腈-0.1％甲酸与乙腈-0.2％甲酸的差别，结果见附图27、28。

结果显示，0.1％甲酸的色谱图中保留时间为32.602min的色谱峰，存在一个肩峰，峰型不好，在0.2％甲酸的色谱图中，该色谱峰峰型有明显改善，对称因子由1.18变为0.93；另外37.741min的峰的对称因子也由1.30变为1.07，峰型改善。故选择乙腈-0.2％甲酸作为流动相更有利于检测。

7.3色谱柱型号比较：

由于与ZORBAX Eclipse XDB-C18(4.6×250mm，5μm)相比，ZORBAX SB-C18在较低pH条件下进行分离，具有更长的色谱柱寿命和更佳的重现性，更符合最终确定的流动相环境，故优选可以为ZORBAX SB-C18(4.6×250mm，5μm)色谱柱。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims

1.一种应用高效液相指纹图谱测定消肿止痛贴剂有效成分的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)对照品溶液的制备

称取圣草酚-7-甲醚、异樱花素对照品，加乙醇制得混合对照品溶液；

(2)供试品溶液的制备

取消肿止痛贴的药贴，粉碎，过筛，加入乙醇溶液，提取20-50min，放至室温，加入乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取滤液，蒸干，残渣加入乙醇溶解，摇匀即得供试品溶液；

(3)测定法：

吸取混合对照品溶液和供试品溶液，注入高效液相色谱仪，得到色谱图，

其中，所述高效液相色谱仪的色谱条件如下：

色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C₁₈柱，

流动相的流速为0.8-1.2ml/min，柱温30-40℃，

检测波长：290±3nm；建立指纹图谱，其中圣草酚-7-甲醚和异樱花素峰分离度大于1.5，检测有效成分含量。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中，步骤(1)中混合对照品溶液中圣草酚-7-甲醚和异樱花素的浓度分别为40μg/ml和20μg/ml。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，乙醇的浓度为55～85％。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，乙醇的浓度为80％。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述药贴经粉碎、过筛后加入乙醇，使得每100ml提取溶剂中所含药粉为1g～5g。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中提取方法为超声提取或加热回流提取。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中提取方法为超声提取25～35min。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，超声功率为500W，频率为40kHz。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，柱温为35℃。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，流动相的流速为1ml/min。

11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，检测波长为290nm。

12.一种消肿止痛贴剂高效液相指纹图谱的建立方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)对照品溶液的制备

称取圣草酚-7-甲醚、异樱花素对照品，加入浓度为55～85％的乙醇制得混合对照品溶液；

(2)供试品溶液的制备

取消肿止痛贴的药贴，粉碎，过筛，加入浓度为55～85％的乙醇溶液，使得每100ml提取溶剂中所含药粉为1g～5g，超声提取或加热回流提取20-50min，放至室温，加入浓度为55～85％的乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取滤液，蒸干，残渣加入浓度为55～85％的乙醇溶解，摇匀即得供试品溶液；

(3)获得色谱图

以对照品溶液作为参照物，将供试品溶液和对照品溶液注入高效液相色谱仪，得到色谱图，

其中，所述高效液相色谱仪的色谱条件如下：

色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，

流动相的流速为0.8-1.2ml/min，柱温30-40℃，

检测波长：290±3nm；

(4)生成对照指纹图谱：

选择合格的多批消肿止痛贴剂的指纹图谱，以圣草酚-7-甲醚为参比峰，得到11个共有峰的图谱，按中位数法计算生成标准对照指纹图谱，其中，指纹图谱相对保留时间为：

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，乙醇的浓度为80％。

14.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C₁₈柱。

15.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，步骤(1)中混合对照品溶液中圣草酚-7-甲醚和异樱花素的浓度分别为40μg/ml和20μg/ml。

16.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，检测波长为290nm。

17.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中提取方法为超声提取25～35min。