CN105683390A - 使用作用于糖基化肽的阿马多里酶的HbA1c测定方法 - Google Patents
使用作用于糖基化肽的阿马多里酶的HbA1c测定方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供阿马多里酶，其特征在于，该酶与将血红蛋白A1c(HbA1c)的β链水解而生成的各种各样的糖基化肽作用，生成过氧化氢，本发明提供使用该酶的HbA1c的测定方法和测定试剂盒。使用阿马多里酶的HbA1c的测定方法和含有该阿马多里酶的测定试剂盒，其特征在于，阿马多里酶是在与选自来自锥毛壳(Coniochaeta)属等的阿马多里酶的62位、63位、102位、106位、110位、113位、355位中的氨基酸对应的位置通过取代1个或1个以上的氨基酸残基而得到的阿马多里酶，该酶将各种各样的糖基化肽氧化生成过氧化氢。本发明能够提供能以少的蛋白酶的处方量迅速、简便且精度良好地将HbA1c定量的测定方法、测定试剂盒，或可迅速、简便、高精度且高灵敏度地将HbA1c定量的测定方法、测定试剂盒。
Description
技术领域
本发明涉及试样中的血红蛋白A1c的测定方法和用于该测定方法的测定用试剂盒。
背景技术
糖化蛋白质是葡萄糖等醛糖(潜在地具有醛基的单糖及其衍生物)的醛基与蛋白质的氨基以非酶形式形成共价键并进行阿马多里重排而生成的。作为蛋白质的氨基，可举出氨基末端的α-氨基、蛋白质中的赖氨酸残基侧链的ε氨基。作为生物体内产生的糖化蛋白质，已知有血液中的血红蛋白被糖化而成的糖化血红蛋白、白蛋白被糖化而成的糖化白蛋白等。
这些在生物体内生成的糖化蛋白质中，在糖尿病的临床诊断领域中，作为用于糖尿病患者的诊断、症状管理的重要的血糖控制标记物，血红蛋白A1c(HbA1c)受到关注。HbA1c是血红蛋白“β链”的N末端(氨基末端)的Val(缬氨酸)的α－氨基结合有葡萄糖的蛋白质。由于血液中的HbA1c浓度反映了过去的一定期间的平均血糖值，因此HbA1c的值在糖尿病的症状的诊断、管理中成为重要的指标。
作为迅速且简便地测定该HbA1c的方法，以往，已知使用阿马多里酶的多种酶方法。
阿马多里酶是催化以下反应的酶的总称，所述反应是在氧的存在下将亚氨基二乙酸或其衍生物(也称为“阿马多里化合物”)氧化而生成乙醛酸或α－酮醛、氨基酸或肽、和过氧化氢。已知阿马多里酶是用于通过酶方法测定HbA1c的有用的酶。作为被阿马多里酶氧化的底物，例如，已知α－果糖基缬氨酰基组氨酸(以下记为αFVH)。
目前为止，阿马多里酶从细菌、酵母、真菌中发现，例如报告了来自锥毛壳(Coniochaeta)属、正青霉(Eupenicillium)属、棘壳孢菌(Pyrenochaeta)属、节菱孢菌(Arthrinium)属、弯孢菌(Curvularia)属、新赤壳菌(Neocosmospora)属、隐球菌(Cryptococcus)属、暗球腔菌(Phaeosphaeria)属、曲霉(Aspergillus)属、翘孢霉属(Emericella)属、细基格孢(Ulocladium)属、青霉(Penicillium)属、镰刀菌(Fusarium)属、锥毛毛壳(Achaetomiella)属、毛毛壳(Achaetomium)属、梭孢壳(Thielavia)属、毛壳(Chaetomium)属、五谷麻孢壳(Gelasinospora)属、小囊菌(Microascus)属、小球腔菌(Leptosphaeria)属、蛇孢腔菌(Ophiobolus)属、格孢腔菌(Pleospora)属、闭毛孢壳(Coniochaetidium)属、毕赤酵母(Pichia)属、德巴利酵母(Debaryomyces)属、棒状杆菌(Corynebacterium)属、土壤杆菌(Agrobacterium)属、节杆菌(Arthrobacter)属的阿马多里酶(例如，参照专利文献1、6～15，非专利文献1～9)。这些属在本说明书有时称为锥毛壳(Coniochaeta)属等。应予说明，上述报告例中，阿马多里酶根据文献不同，有时也被记载为酮胺氧化酶、果糖基氨基酸氧化酶、果糖基肽氧化酶、果糖基胺氧化酶等表述。这些表述在本说明书中同义使用。
作为使用上述各种阿马多里酶迅速且简便地测定HbA1c的方法，已知利用蛋白酶等切出用酶将HbA1c分解，从HbA1c的β链氨基末端使特定的测定用物质游离，使用上述阿马多里酶将游离的测定用物质进行定量的方法(例如，参照专利文献1～7)。
具体而言，已知利用特定的蛋白酶等将HbA1c分解，从其β链氨基末端游离αFVH后，将游离的αFVH定量的方法，该测定方法成为现在的HbA1c酶测定方法的主流。
但是，为了在短时间内将HbA1c的β链充分水解为αFVH，测定试剂中需要配合大量的蛋白酶、和/或配合反应性不同的多种蛋白酶。这根据以下所述的理由原本不优选。
蛋白酶由于具有水解蛋白质的作用，作为蛋白质的酶也被蛋白酶水解。因此，阿马多里酶也被蛋白酶水解而失活，最终，消耗糖基化肽和氧而生成过氧化氢的反应被阻碍。作为针对其的处理方法，可以考虑增加阿马多里酶的处方量，在阿马多里酶完全失活之前结束测定，但是阿马多里酶的增量导致与HbA1c相比蛋白酶优先水解阿马多里酶，原本不优选。
另外，使阿马多里酶与αFVH作用将生成的过氧化氢定量而测定HbA1c时，过氧化氢的定量有时使用过氧化酶。此时，由于过氧化酶也会被蛋白酶水解而失活，因此不优选。
另外作为另一侧面，常见的是利用酶的HbA1c测定中使用自动分析装置，此时，使用一个试样，同时测定以HbA1c为首的各个生物标记物。此时，由于各生物标记物利用酶或抗体测定，因此如果发生蛋白酶污染，则各生物标记物测定试剂所含有的酶或抗体被水解，存在不能正确测定HbA1c以外的生物标记物的可能。因此，在用于自动分析装置的试剂中，原本优选不含有蛋白酶。
基于以上理由，利用特定的蛋白酶等将HbA1c分解，从其β链氨基末端游离αFVH后，将游离的αFVH定量的方法中，优选极力减少处方的蛋白酶的量和种类。但是，如果极力减少处方的蛋白酶的量和种类，则HbA1c的β链不会被充分水解成αFVH，最终，混和存在在水解反应的中途阶段生成的各种各样的糖基化肽。
此外，另一方面，利用蛋白酶的水解反应的反应速度由于依赖于其底物浓度，因此HbA1c的大部分被水解时，蛋白酶的反应速度非常低。因此，预计在HbA1c的测定、即αFVH的定量结束的时刻，虽然HbA1c的大部分被水解成αFVH，但是未被水解成αFVH的糖基化肽也会残存。
因此，如果也能够同时定量未被水解成αFVH而残存的来自HbA1cβ链的糖基化肽，则能够期待蛋白酶处方量的减少和/或利用阿马多里酶的HbA1c测定方法的高灵敏度化。但是，对各种各样的糖基化肽具有酶活性的阿马多里酶目前为止还没有发现。
现有技术文献
专利文献
专利文献1国际公开第2004/104203号
专利文献2国际公开第2005/49857号
专利文献3日本特开2001－95598号公报
专利文献4日本特公平05－33997号公报
专利文献5日本特开平11－127895号公报
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专利文献7日本特开2011－229526号公报
专利文献8日本特开2003－235585号公报
专利文献9日本特开2004－275013号公报
专利文献10日本特开2004－275063号公报
专利文献11日本特开2010－35469号公报
专利文献12日本特开2010－57474号公报
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专利文献14国际公开第2010/41419号
专利文献15国际公开第2011/15325号
非专利文献
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发明内容
本发明要解决的课题在于发现对各种各样的糖基化肽具有酶活性的阿马多里酶，构建利用其的HbA1c测定方法。
本发明人等为解决上述课题进行深入研究，最终发现在来自锥毛壳(Coniochaeta)属等的阿马多里酶中导入几个氨基酸取代的修饰型阿马多里酶具有氧化各种各样的糖基化肽而生成过氧化氢的活性，并实现利用其的HbA1c测定方法，从而完成本发明。
即，本发明包含以下内容。
[1]一种试样中的α－果糖基低聚肽的测定方法，其特征在于，使阿马多里酶与含有以下αF3P～αF16P中任1个以上的试样作用，测定通过该作用生成的过氧化氢或被消耗的氧，所述阿马多里酶作用于αF3P～αF16P中任1个以上的α－果糖基低聚肽。
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酸(αF3P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酸(αF4P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酸(αF5P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酸(αF6P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酸(αF7P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酸(αF8P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酸(αF9P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酸(αF10P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酸(αF11P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酸(αF12P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酸(αF13P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酰基亮氨酸(αF14P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酰基亮氨酰基色氨酸(αF15P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酰基亮氨酰基色氨酰基甘氨酸(αF16P)。
[2]一种试样中的α－果糖基肽的测定方法，其特征在于，使阿马多里酶与含有(a)～(f)中任1个以上的试样作用，测定通过该作用生成的过氧化氢或被消耗的氧，所述阿马多里酶作用于(a)～(f)中任1个以上的α－果糖基肽。
(a)α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酸(αF3P)，
(b)α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酸(αF4P)，
(c)α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酸(αF5P)，
(d)α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酸(αF6P)，
(e)α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酸(αF8P)，
(f)α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酰基亮氨酰基色氨酰基甘氨酸(αF16P)。
[3]根据[1]或[2]记载的方法，其特征在于，试样进一步含有α－果糖基缬氨酸(αF1P)或α－果糖基缬氨酰基组氨酸(αF2P)，阿马多里酶进一步作用于α－果糖基缬氨酸(αF1P)或α－果糖基缬氨酰基组氨酸(αF2P)，也测定通过该作用生成的过氧化氢或被消耗的氧。
[3－2]根据[3]记载的方法，其特征在于，试样进一步含有α－果糖基缬氨酰基组氨酸(αF2P)，阿马多里酶进一步作用于α－果糖基缬氨酰基组氨酸(αF2P)，也测定通过该作用生成的过氧化氢或被消耗的氧。
[4]一种试样中的血红蛋白A1c的测定方法，其特征在于，利用蛋白酶处理试样，使含有以下αF3P～αF16P中任1个以上的α－果糖基低聚肽游离，使阿马多里酶与其作用，测定通过该作用生成的过氧化氢或被消耗的氧，所述阿马多里酶将游离的α－果糖基低聚肽中任1个以上氧化。
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酸(αF3P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酸(αF4P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酸(αF5P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酸(αF6P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酸(αF7P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酸(αF8P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酸(αF9P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酸(αF10P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酸(αF11P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酸(αF12P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酸(αF13P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酰基亮氨酸(αF14P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酰基亮氨酰基色氨酸(αF15P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酰基亮氨酰基色氨酰基甘氨酸(αF16P)。
[5]一种试样中的血红蛋白A1c的测定方法，其特征在于，利用蛋白酶处理试样，使含有(a)～(f)中任1个以上的糖基化肽游离，使阿马多里酶作用，测定通过该作用生成的过氧化氢或被消耗的氧，所述阿马多里酶将游离的含有(a)～(f)中任1个以上的糖基化肽氧化。
(a)α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酸(αF3P)，
(b)α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酸(αF4P)，
(c)α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酸(αF5P)，
(d)α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酸(αF6P)，
(e)α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酸(αF8P)，
(f)α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酰基亮氨酰基色氨酰基甘氨酸(αF16P)。
[6]根据[4]或[5]记载的方法，其特征在于，通过利用蛋白酶处理试样进一步使α－果糖基缬氨酸(αF1P)或α－果糖基缬氨酰基组氨酸(αF2P)游离，阿马多里酶进一步作用于α－果糖基缬氨酸(αF1P)或α－果糖基缬氨酰基组氨酸(αF2P)，也测定通过该作用生成的过氧化氢或被消耗的氧。
[6－2]根据[6]记载放热方法，其特征在于，通过利用蛋白酶处理试样，进一步使α－果糖基缬氨酰基组氨酸(αF2P)游离，阿马多里酶进一步作用于α－果糖基缬氨酰基组氨酸(αF2P)，也测定通过该作用生成的过氧化氢或被消耗的氧。
[7]根据[1]～[6]中任一项记载的测定方法，其中，阿马多里酶来自锥毛壳(Coniochaeta)属、正青霉(Eupenicillium)属、棘壳孢菌(Pyrenochaeta)属、节菱孢菌(Arthrinium)属、弯孢菌(Curvularia)属、新赤壳菌(Neocosmospora)属、隐球菌(Cryptococcus)属、暗球腔菌(Phaeosphaeria)属、曲霉(Aspergillus)属、翘孢霉(Emericella)属、细基格孢(Ulocladium)属或青霉(Penicillium)属。
[8]根据[1]～[6]中任一项记载的测定方法，阿马多里酶来自锥毛壳属(Coniochaetasp.)、土正青霉(Eupenicilliumterrenum)、棘壳孢菌属(Pyrenochaetasp.)、节菱孢菌属(Arthriniumsp.)、棒弯孢(Curvulariaclavata)、侵管新赤壳菌(Neocosmosporavasinfecta)、新型隐球菌(Cryptococcusneoformans)、颖枯壳针孢(Phaeosphaerianodorum)、构巢曲霉(Aspergillusnidulans)、构巢裸胞壳(Emericellanidulans)属、细基格孢属(Ulocladiumsp.)或微紫青霉菌(Penicilliumjanthinellum)。
[9]根据[1]～[6]中任一项记载的测定方法，其中，阿马多里酶是选自以下的阿马多里酶。
(i)具有在序列号141表示的氨基酸序列进行1个或多个氨基酸的取代、缺失或添加而成的氨基酸序列的阿马多里酶。
(ii)上述(i)的阿马多里酶中，该阿马多里酶的全长氨基酸序列与序列号141的氨基酸序列具有70％以上的序列同源性，且由序列号141的第10位～32位、36～41位、49～52位、54～58位、73～75位、84～86位、88～90位、120～122位、145～150位、156～162位、164～170位、180～182位、202～205位、207～211位、214～224位、227～230位、236～241位、243～248位、258～261位、266～268位、270～273位、275～287位、295～297位、306～308位、310～316位、324～329位、332～334位、341～344位、346～355位、357～363位、370～383位、385～387位、389～394位、405～410位和423～431位的氨基酸序列构成的相同性区域的氨基酸序列和该阿马多里酶的对应位置的相同性区域的氨基酸序列具有90％以上的序列同源性的阿马多里酶。
[10]根据[1]、[2]、[4]、[5]和[7]～[9]中任一项记载的方法，进一步使用氧化α－果糖基缬氨酸或α－果糖基缬氨酰基组氨酸的阿马多里酶。
[11]一种试样中的α－果糖基肽测定用试剂盒，其特征在于，含有以下的成分(1)和(2)。
(1)阿马多里酶，其具有将以下αF3P～αF16P中任1个以上氧化而生成过氧化氢的作用，和
(2)用于测定过氧化氢的试剂。
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酸(αF3P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酸(αF4P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酸(αF5P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酸(αF6P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酸(αF7P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酸(αF8P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酸(αF9P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酸(αF10P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酸(αF11P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酸(αF12P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酸(αF13P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酰基亮氨酸(αF14P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酰基亮氨酰基色氨酸(αF15P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酰基亮氨酰基色氨酰基甘氨酸(αF16P)。
[12]一种试样中的α－果糖基肽测定用试剂盒，其特征在于，含有以下的成分(1)和(2)。
(1)阿马多里酶，其具有将含有(a)～(f)中任1个以上的糖基化肽氧化而生成过氧化氢的作用，和
(2)用于测定过氧化氢的试剂。
(a)α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酸(αF3P)，
(b)α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酸(αF4P)，
(c)α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酸(αF5P)，
(d)α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酸(αF6P)，
(e)α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酸(αF8P)，
(f)α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酰基亮氨酰基色氨酰基甘氨酸(αF16P)。
[13]根据[11]或[12]记载的试剂盒，阿马多里酶进一步具有将α－果糖基缬氨酸(αF1P)或α－果糖基缬氨酰基组氨酸(αF2P)氧化而生成过氧化氢的作用。
[13－2]根据[13]记载的试剂盒，阿马多里酶进一步具有氧化α－果糖基缬氨酰基组氨酸(αF2P)而生成过氧化氢的作用。
[14]一种试样中的血红蛋白A1c的测定用试剂盒，其特征在于，含有以下的(1)～(3)的成分。
(1)蛋白酶，其水解HbA1c的β链，使含有以下αF3P～αF16P中任1个以上的糖基化肽游离，
(2)阿马多里酶，其具有将以下的αF3P～αF16P中任1个以上氧化而生成过氧化氢的作用，和
(3)用于测定过氧化氢的试剂。
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酸(αF3P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酸(αF4P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酸(αF5P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酸(αF6P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酸(αF7P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酸(αF8P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酸(αF9P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酸(αF10P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酸(αF11P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酸(αF12P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酸(αF13P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酰基亮氨酸(αF14P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酰基亮氨酰基色氨酸(αF15P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酰基亮氨酰基色氨酰基甘氨酸(αF16P)。
[15]一种试样中的血红蛋白A1c的测定用试剂盒，其特征在于，含有以下的(1)～(3)的成分。
(1)蛋白酶，其水解HbA1c的β链，使含有(a)～(f)中任1个以上的糖基化肽游离，
(2)阿马多里酶，其具有将含有(a)～(f)中任1个以上的糖基化肽氧化而生成过氧化氢的作用，和
(3)用于测定过氧化氢的试剂。
(a)α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酸(αF3P)，
(b)α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酸(αF4P)，
(c)α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酸(αF5P)，
(d)α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酸(αF6P)，
(e)α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酸(αF8P)，
(f)α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酰基亮氨酰基色氨酰基甘氨酸(αF16P)。
[16]根据[14]或[15]记载的试剂盒，其中，(1)蛋白酶进一步水解HbA1c的β链，使α－果糖基缬氨酸(αF1P)或α－果糖基缬氨酰基组氨酸(αF2P)游离，(2)阿马多里酶进一步具有将α－果糖基缬氨酸(αF1P)或α－果糖基缬氨酰基组氨酸(αF2P)氧化而生成过氧化氢的作用。
[16－2]根据[16]记载的试剂盒，其中，(1)蛋白酶进一步水解HbA1c的β链，使α－果糖基缬氨酰基组氨酸(αF2P)游离，(2)阿马多里酶进一步具有氧化α－果糖基缬氨酰基组氨酸(αF2P)而生成过氧化氢的作用。
[17]根据[11]～[16]中任一项记载的试剂盒，其中，阿马多里酶来自锥毛壳(Coniochaeta)属、正青霉(Eupenicillium)属、棘壳孢菌(Pyrenochaeta)属、节菱孢菌(Arthrinium)属、弯孢菌(Curvularia)属、新赤壳菌(Neocosmospora)属、隐球菌(Cryptococcus)属、暗球腔菌(Phaeosphaeria)属、曲霉(Aspergillus)属、翘孢霉(Emericella)属、细基格孢(Ulocladium)属或青霉(Penicillium)属。
[18]根据[11]～[16]中任一项记载的试剂盒，其中，阿马多里酶是选自以下的阿马多里酶。
(i)具有在序列号141表示的氨基酸序列进行1个或多个氨基酸的取代、缺失或添加而成的氨基酸序列的阿马多里酶。
(ii)上述(i)的阿马多里酶中，该阿马多里酶的全长氨基酸序列与序列号141的氨基酸序列具有70％以上的序列同源性，且由序列号141的第10位～32位、36～41位、49～52位、54～58位、73～75位、84～86位、88～90位、120～122位、145～150位、156～162位、164～170位、180～182位、202～205位、207～211位、214～224位、227～230位、236～241位、243～248位、258～261位、266～268位、270～273位、275～287位、295～297位、306～308位、310～316位、324～329位、332～334位、341～344位、346～355位、357～363位、370～383位、385～387位、389～394位、405～410位和423～431位的氨基酸序列构成的相同性区域的氨基酸序列和该阿马多里酶的对应位置的相同性区域的氨基酸序列具有90％以上的序列同源性的阿马多里酶。
[19]一种试样中的α－果糖基低聚肽的测定方法，其特征在于，使阿马多里酶与含有以下αF1P～αF32P中任1个以上的试样作用，测定通过该作用生成的过氧化氢或被消耗的氧，所述阿马多里酶作用予αF1P～αF32P中任1个以上的α－果糖基低聚肽。
α－果糖基缬氨酸(αF1P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酸(αF2P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酸(αF3P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酸(αF4P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酸(αF5P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酸(αF6P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酸(αF7P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酸(αF8P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酸(αF9P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酸(αF10P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酸(αF11P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酸(αF12P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酸(αF13P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酰基亮氨酸(αF14P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酰基亮氨酰基色氨酸(αF15P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酰基亮氨酰基色氨酰基甘氨酸(αF16P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酰基亮氨酰基色氨酰基甘氨酰基赖氨酸(αF17P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酰基亮氨酰基色氨酰基甘氨酰基赖氨酰基缬氨酸(αF18P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酰基亮氨酰基色氨酰基甘氨酰基赖氨酰基缬氨酰基天冬酰胺(αF19P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酰基亮氨酰基色氨酰基甘氨酰基赖氨酰基缬氨酰基天冬酰胺酰基缬氨酸(αF20P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酰基亮氨酰基色氨酰基甘氨酰基赖氨酰基缬氨酰基天冬酰胺酰基缬氨酰基天冬氨酸(αF21P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酰基亮氨酰基色氨酰基甘氨酰基赖氨酰基缬氨酰基天冬酰胺酰基缬氨酰基天冬氨酰基谷氨酸(αF22P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酰基亮氨酰基色氨酰基甘氨酰基赖氨酰基缬氨酰基天冬酰胺酰基缬氨酰基天冬氨酰基谷氨酰基缬氨酸(αF23P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酰基亮氨酰基色氨酰基甘氨酰基赖氨酰基缬氨酰基天冬酰胺酰基缬氨酰基天冬氨酰基谷氨酰基缬氨酰基甘氨酸(αF24P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酰基亮氨酰基色氨酰基甘氨酰基赖氨酰基缬氨酰基天冬酰胺酰基缬氨酰基天冬氨酰基谷氨酰基缬氨酰基甘氨酰基甘氨酸(αF25P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酰基亮氨酰基色氨酰基甘氨酰基赖氨酰基缬氨酰基天冬酰胺酰基缬氨酰基天冬氨酰基谷氨酰基缬氨酰基甘氨酰基甘氨酰基谷氨酸(αF26P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酰基亮氨酰基色氨酰基甘氨酰基赖氨酰基缬氨酰基天冬酰胺酰基缬氨酰基天冬氨酰基谷氨酰基缬氨酰基甘氨酰基甘氨酰基谷氨酰基丙氨酸(αF27P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酰基亮氨酰基色氨酰基甘氨酰基赖氨酰基缬氨酰基天冬酰胺酰基缬氨酰基天冬氨酰基谷氨酰基缬氨酰基甘氨酰基甘氨酰基谷氨酰基丙氨酰基亮氨酸(αF28P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酰基亮氨酰基色氨酰基甘氨酰基赖氨酰基缬氨酰基天冬酰胺酰基缬氨酰基天冬氨酰基谷氨酰基缬氨酰基甘氨酰基甘氨酰基谷氨酰基丙氨酰基亮氨酰基甘氨酸(αF29P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酰基亮氨酰基色氨酰基甘氨酰基赖氨酰基缬氨酰基天冬酰胺酰基缬氨酰基天冬氨酰基谷氨酰基缬氨酰基甘氨酰基甘氨酰基谷氨酰基丙氨酰基亮氨酰基甘氨酰基精氨酸(αF30P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酰基亮氨酰基色氨酰基甘氨酰基赖氨酰基缬氨酰基天冬酰胺酰基缬氨酰基天冬氨酰基谷氨酰基缬氨酰基甘氨酰基甘氨酰基谷氨酰基丙氨酰基亮氨酰基甘氨酰基精氨酰基亮氨酸(αF31P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酰基亮氨酰基色氨酰基甘氨酰基赖氨酰基缬氨酰基天冬酰胺酰基缬氨酰基天冬氨酰基谷氨酰基缬氨酰基甘氨酰基甘氨酰基谷氨酰基丙氨酰基亮氨酰基甘氨酰基精氨酰基亮氨酰基亮氨酸(αF32P)。
本说明书包含作为本申请优先权基础的日本国专利申请2013-222789号的说明书和/或附图记载的内容。
根据本发明，能够提供具有氧化各种各样的糖基化肽而生成过氧化氢的活性的阿马多里酶。如果使用这类阿马多里酶，能够提供可以少的蛋白酶的处方量迅速、简便且精度良好地将HbA1c定量的测定方法、测定试剂盒，或者可迅速、简便、高精度且高灵敏度地将HbA1c定量的测定方法、测定试剂盒。另外，作用于HbA1c的蛋白酶中，也可以使用切断特异性低的酶或切断效率差的酶。进一步也能够将难以作用于阿马多里酶、过氧化酶的蛋白酶用于HbA1c的切断。例如即使减少蛋白酶的处方量，HbA1c的β链未被充分水解成αFVH，最终混合存在有在水解反应的中间阶段生成的各种各样的糖基化肽，如果使用本发明的阿马多里酶，不仅可作用于αFV、αFVH，而且也可作用于范围广的糖基化肽(αF1P～αF32P，例如αF1P～αF16P)，因此，能够高精度地将HbA1c定量。
附图说明
图1－1是例示各种公知的阿马多里酶的氨基酸序列的同源性的第1幅图。将Co(锥毛壳属)、Et(土正青霉)、Py(棘壳孢菌属)、Ar(节菱孢菌属)、Cc(棒弯孢)、Nv(侵管新赤壳菌)以及Cn(新型隐球菌)、Pn(颖枯壳针孢)、An(构巢曲霉)、En(构巢裸胞壳)、Ul(细基格孢属)和Pj(微紫青霉菌)进行比对。
图1－2是图1－1的续。
图1－3是图1－2的续。
图1－4是图1－3的续。
图1－5是图1－4的续。
图2－1是例示各种公知的阿马多里酶的氨基酸序列的同源性和类似氨基酸的第2幅图。将Co、Et、Py、Ar、Cc、Nv以及Cn、Pn、An、En、Ul和Pj进行比对。
图2－2是图2－1的续。
图2－3是图2－2的续。
图2－4是图2－3的续。
图2－5是图2－4的续。
图3－1表示使用本发明的阿马多里酶的αF3P的测定结果。
图3－2表示使用本发明的阿马多里酶的αF4P的测定结果。
图3－3表示使用本发明的阿马多里酶的αF5P的测定结果。
图3－4表示使用本发明的阿马多里酶的αF6P的测定结果。
图3－5表示使用本发明的阿马多里酶的αF8P的测定结果。
图3－6表示使用本发明的阿马多里酶的αF16P的测定结果。
具体实施方式
以下，对本发明做详细说明。
(糖化蛋白质、血红蛋白A1c)
本发明的糖化蛋白质是指非酶方式糖化的蛋白质。糖化蛋白质不管生物体内、外均存在，作为在生物体内存在的例子，有血液中的糖化血红蛋白、糖化白蛋白等，在糖化血红蛋白中将血红蛋白的β链氨基末端的缬氨酸被糖化的糖化血红蛋白特别称为血红蛋白A1c(HbA1c)。作为生物体外存在的例子，有蛋白质、肽和糖共存的液状调味料等饮品食品、输液等。
(糖基化肽、果糖基肽)
本发明的糖基化肽中，包括肽直接以非酶方式被糖化的物质、通过蛋白酶等糖化蛋白质被分解最终生成的物质、构成糖化蛋白质的(多)肽被糖化的物质。也有时也将糖基化肽记为果糖基肽。本发明的糖基化肽，更具体而言，是α－糖基化肽(α－果糖基肽)。例如，对象糖化蛋白质为血红蛋白A1c(HbA1c)时，该α－糖基化肽是指含有被糖化的N末端的被糖化的肽，特别从将HbA1c定量的目的出发，是指从N末端被糖化的HbA1c的β链切出的被糖化的肽。作为从N末端被糖化的HbA1c的β链切出的被糖化的肽，包括肽链长度为2的α－果糖基缬氨酰基组氨酸(αFVH)，此外可举出肽链长度为3的α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酸(αF3P)、肽链长度为4的α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酸(αF4P)、肽链长度为5的α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酸(αF5P)、肽链长度为6的α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酸(αF6P)、肽链长度为8的α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酸(αF8P)、肽链长度为16的α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酰基亮氨酰基色氨酰基甘氨酸(αF16P)等。为了方便，本说明书中将αFV、αFVH、αF3P、αF4P、αF5P、αF6P、αF8P和αF16P总称，称为“αF6P等α－果糖基肽”或“αF6P等α－果糖基肽(αFV、αFVH、αF3P、αF4P、αF5P、αF6P、αF8P和αF16P)”。
进而，作为从N末端被糖化的血红蛋白β链切出的被糖化的肽，可举出
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酸(αF7P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酸(αF9P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酸(αF10P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酸(αF11P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酸(αF12P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酸(αF13P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酰基亮氨酸(αF14P)和
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酰基亮氨酰基色氨酸(αF15P)。
为了方便，本说明书中表示某一范围的α－果糖基肽时，像“αF1P～αF16P”这样表述，其包含从链长最短的肽开始，也包括中间的链长的肽、至链长最长的肽的全部的α－果糖基肽。例如本说明书中将αF3P～αF16P总称，称为“α－果糖基低聚肽”或“α－果糖基低聚肽(αF3P～αF16P)”，但是其包括从αF3P至αF16P的全部链长的α－果糖基肽。同样本说明书中“α－果糖基肽(αF1P～αF16P)”或“α－果糖基肽(αFV～αF16P)”，包括从αFV(αF1P)至αF16P的全部链长的α－果糖基肽。
例示时，同样也规定αF1P～αF8P、αF2P～αF8P、αF3P～αF8P、αF2P～F16P的范围。
应予说明，一般不将仅由1氨基酸构成化合物称为肽，但是本说明书中将作为α－果糖基氨基酸的α－果糖基缬氨酸(αFV)和具有2个以上的氨基酸残基的各种α－果糖基肽一同称为α－果糖基肽，因此，为了方便，如上述所示进行定义，αFV也包含于α－果糖基肽。
N末端被糖化的HbA1c的β链由146个氨基酸构成(参照序列号193)。即，从N末端被糖化的血红蛋白β链切出的被糖化的肽，存在直至由145个残基的氨基酸构成的αF145P的可能性。因此由145个残基的氨基酸构成的HbA1c的β链也属于α－糖基化肽(αF145P)。
本说明书中，特别是将从αFV(αF1P)至具有32个氨基酸序列的α－糖基化肽(αF32P)的物质进行总称时，称为“α－果糖基肽(αF1P～αF32P)”。另外，从αF3P至αF32P的α－糖基化肽记载为“α－果糖基肽(αF3P～αF32P)”。进行例示时，αF2P～αF32P、αF16P～αF32P、αF17P～αF32P的范围也同样记载。应予说明αF17P～αF32P如以下所示。
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酰基亮氨酰基色氨酰基甘氨酰基赖氨酸(αF17P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酰基亮氨酰基色氨酰基甘氨酰基赖氨酰基缬氨酸(αF18P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酰基亮氨酰基色氨酰基甘氨酰基赖氨酰基缬氨酰基天冬酰胺(αF19P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酰基亮氨酰基色氨酰基甘氨酰基赖氨酰基缬氨酰基天冬酰胺酰基缬氨酸(αF20P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酰基亮氨酰基色氨酰基甘氨酰基赖氨酰基缬氨酰基天冬酰胺酰基缬氨酰基天冬氨酸(αF21P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酰基亮氨酰基色氨酰基甘氨酰基赖氨酰基缬氨酰基天冬酰胺酰基缬氨酰基天冬氨酰基谷氨酸(αF22P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酰基亮氨酰基色氨酰基甘氨酰基赖氨酰基缬氨酰基天冬酰胺酰基缬氨酰基天冬氨酰基谷氨酰基缬氨酸(αF23P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酰基亮氨酰基色氨酰基甘氨酰基赖氨酰基缬氨酰基天冬酰胺酰基缬氨酰基天冬氨酰基谷氨酰基缬氨酰基甘氨酸(αF24P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酰基亮氨酰基色氨酰基甘氨酰基赖氨酰基缬氨酰基天冬酰胺酰基缬氨酰基天冬氨酰基谷氨酰基缬氨酰基甘氨酰基甘氨酸(αF25P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酰基亮氨酰基色氨酰基甘氨酰基赖氨酰基缬氨酰基天冬酰胺酰基缬氨酰基天冬氨酰基谷氨酰基缬氨酰基甘氨酰基甘氨酰基谷氨酸(αF26P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酰基亮氨酰基色氨酰基甘氨酰基赖氨酰基缬氨酰基天冬酰胺酰基缬氨酰基天冬氨酰基谷氨酰基缬氨酰基甘氨酰基甘氨酰基谷氨酰基丙氨酸(αF27P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酰基亮氨酰基色氨酰基甘氨酰基赖氨酰基缬氨酰基天冬酰胺酰基缬氨酰基天冬氨酰基谷氨酰基缬氨酰基甘氨酰基甘氨酰基谷氨酰基丙氨酰基亮氨酸(αF28P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酰基亮氨酰基色氨酰基甘氨酰基赖氨酰基缬氨酰基天冬酰胺酰基缬氨酰基天冬氨酰基谷氨酰基缬氨酰基甘氨酰基甘氨酰基谷氨酰基丙氨酰基亮氨酰基甘氨酸(αF29P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酰基亮氨酰基色氨酰基甘氨酰基赖氨酰基缬氨酰基天冬酰胺酰基缬氨酰基天冬氨酰基谷氨酰基缬氨酰基甘氨酰基甘氨酰基谷氨酰基丙氨酰基亮氨酰基甘氨酰基精氨酸(αF30P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酰基亮氨酰基色氨酰基甘氨酰基赖氨酰基缬氨酰基天冬酰胺酰基缬氨酰基天冬氨酰基谷氨酰基缬氨酰基甘氨酰基甘氨酰基谷氨酰基丙氨酰基亮氨酰基甘氨酰基精氨酰基亮氨酸(αF31P)，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酰基亮氨酰基色氨酰基甘氨酰基赖氨酰基缬氨酰基天冬酰胺酰基缬氨酰基天冬氨酰基谷氨酰基缬氨酰基甘氨酰基甘氨酰基谷氨酰基丙氨酰基亮氨酰基甘氨酰基精氨酰基亮氨酰基亮氨酸(αF32P)。
这些α－果糖基肽(αF1P～αF32P)，例如αF1P～αF16P等均能成为本发明的阿马多里酶的底物。
在一实施方式中，本发明提供一种试样中的α－果糖基低聚肽的测定方法，其特征在于，使阿马多里酶与含有αF3P～αF5P和αF7P～αF16P中任1个以上的试样作用，测定通过该作用生成的过氧化氢或被消耗的氧，该阿马多里酶作用于αF3P～αF5P和αF7P～αF16P中任1个以上的α－果糖基低聚肽。
在一实施方式中，本发明提供一种试样中的α－果糖基低聚肽的测定方法，其特征在于，使阿马多里酶与含有αF3P、αF4P、αF5P、αF6P、αF8P和αF16P中任1个以上的试样作用，测定通过该作用生成的过氧化氢或被消耗的氧，该阿马多里酶作用于αF3P、αF4P、αF5P、αF6P、αF8P和αF16P中任1个以上的α－果糖基低聚肽。
在一实施方式中，本发明提供一种试样中的α－果糖基低聚肽的测定方法，其特征在于，使阿马多里酶与含有αF3P、αF4P、αF5P、αF8P和αF16P中任1个以上的试样作用，测定通过该作用生成的过氧化氢或被消耗的氧，该阿马多里酶作用于αF3P、αF4P、αF5P、αF8P和αF16P中任1个以上的α－果糖基低聚肽。
在一实施方式中，本发明提供一种试样中的α－果糖基低聚肽的测定方法，其特征在于，使阿马多里酶与含有αF3P、αF4P和αF5P中任1个以上的试样作用，测定通过该作用生成的过氧化氢或被消耗的氧，该阿马多里酶作用于αF3P、αF4P和αF5P中任1个以上的α－果糖基低聚肽。
(阿马多里酶)
阿马多里酶也称为酮胺氧化酶、果糖基氨基酸氧化酶、果糖基肽氧化酶、果糖基胺氧化酶，其是指在氧的存在下，催化生成氧化亚氨基二乙酸或其衍生物(阿马多里化合物)、乙醛酸或α－酮醛、氨基酸或肽、和过氧化氢的反应的酶。阿马多里酶，在自然界广泛分布，通过探索微生物、动物或植物起源的酶，能够得到。微生物中，例如，能够从丝状菌、酵母、或细菌等得到。本发明的阿马多里酶，其特征在于，与多种糖基化肽具有反应性。
本发明的阿马多里酶作用于αF1P～αF32P，例如αF1P～αF16P。本说明书中，阿马多里酶作用于某一链长的α－果糖基肽是指，阿马多里酶在氧的存在下，与该链长的α－果糖基肽的果糖基作用，生成2-酮-D葡萄糖、过氧化氢、和与该链长对应的肽。但是这并没有排除该阿马多里酶与来自HbA1c的β链的更短链长的α－果糖基肽例如αFV、αFVH进行反应。即，本发明的阿马多里酶不仅作用于某一链长的α－果糖基肽(例如αF3P、αF4P、αF5P、αF6P、αF7P、αF8P、αF9P、αF10P、αF11P、αF12P、αF13P、αF14P、αF15P、αF16P等)，而且与来自HbA1c的β链的更短链长的α－果糖基肽例如αFV、αFVH也具有反应性。
(阿马多里酶修饰体)
本发明提供基于具有序列号1、序列号38、序列号40、序列号54、或序列号62、或序列号89或序列号99表示的氨基酸序列的野生型阿马多里酶而制作的、与αF6P等α－果糖基肽(αFV、αFVH、αF3P、αF4P、αF5P、αF6P、αF8P和αF16P)具有高的反应性的、底物特异性得到改变的阿马多里酶的修饰体。本说明书中修饰体是指与突变体能够交换使用，将阿马多里酶的氨基酸序列与野生型的序列比较时，一部分氨基酸被取代、缺失或添加的修饰体。此处所谓添加也包括插入的改性。认为该阿马多里酶修饰体不仅与αFV和αFVH，而且与α－果糖基低聚肽(αF3P～αF16P)也具有反应性。
本发明进一步提供基于具有序列号113、序列号115、序列号117、序列号119、序列号121、序列号123或序列号145或序列号149表示的氨基酸序列的野生型阿马多里酶，与αF6P等α－果糖基肽(αFV、αFVH、αF3P、αF4P、αF5P、αF6P、αF8P和αF16P)具有高的反应性的、底物特异性得到改变的阿马多里酶的修饰体。
另外，基于本发明的见解，基于来自锥毛壳(Coniochaeta)属等的其他的野生型阿马多里酶，能够得到与αF6P等α－果糖基肽(αFV、αFVH、αF3P、αF4P、αF5P、αF6P、αF8P和αF16P)，进一步与αF1P～αF32P具有高的反应性的、底物特异性得到改变的阿马多里酶的修饰体。
(基于来自锥毛壳属NISL9330的阿马多里酶的修饰体)
在一实施方式中，本发明的阿马多里酶是基于具有序列号1表示的氨基酸序列的来自锥毛壳属的阿马多里酶而制作的、与αF6P等α－果糖基肽(αFV、αFVH、αF3P、αF4P、αF5P、αF6P、αF8P和αF16P)具有高的反应性的、底物特异性得到改变的阿马多里酶的修饰体。认为该阿马多里酶修饰体与α－果糖基肽(αF1P～αF32P)也具有反应性。
作为上述这类突变体的例子，可举出具有与序列号151、序列号153、序列号155(单突变体)、序列号157、序列号159、序列号161和序列号163(二重突变体)、序列号137、序列号139、序列号165、序列号167、序列号169、序列号171、序列号173(三重突变体)、序列号133、序列号135、序列号175、序列号189(四重突变体)、序列号177、序列号179(五重突变体)、序列号143、序列号181、序列号183、序列号187、序列号191(六重突变体)、序列号141或序列号185(七重突变体)的氨基酸序列高的序列同源性(例如，50％以上，优选为60％以上，优选为70％以上，优选为75％以上，优选为80％以上，更优选为85％以上，进一步优选为90％以上，进一步优选为95％以上，进一步优选为98％以上，最优选为99％以上)的氨基酸序列，且具有对α－果糖基肽(αF1P～αF32P)或αF6P等α－果糖基肽(αFV、αFVH、αF3P、αF4P、αF5P、αF6P、αF8P和αF16P)的活性的阿马多里酶。
另外，作为这类突变体的例子，可举出具有在序列号151、序列号153、序列号155(单突变体)、序列号157、序列号159、序列号161、和序列号163(二重突变体)、序列号137、序列号139、序列号165、序列号167、序列号169、序列号171、序列号173(三重突变体)、序列号133、序列号135、序列号175、序列号189(四重突变体)、序列号177、序列号179(五重突变体)、序列号143、序列号181、序列号183、序列号187、序列号191(六重突变体)、序列号141或序列号185(七重突变体)的氨基酸序列中1个或多个氨基酸被改变或突变、或者、被缺失、取代、添加和/或插入的氨基酸序列，且具有对α－果糖基肽(αF1P～αF32P)或αF6P等α－果糖基肽(αFV、αFVH、αF3P、αF4P、αF5P、αF6P、αF8P和αF16P)的活性的阿马多里酶。此处1个或多个氨基酸，在提及全长超过400氨基酸的氨基酸序列时，是指为1～15个，优选为1～10个，更优选为1～5个，更优选为1～4个，更优选为1～3个，进一步优选为1或2个的氨基酸。另外，1个或多个氨基酸，在提及全长为200～400氨基酸的序列时，是指1～10个，优选为1～7个，优选为1～5个，优选为1～4个，更优选为1～3个，进一步优选为1或2个氨基酸。1个或多个氨基酸，在提及全长为40氨基酸以上且小于200氨基酸的序列时，是指1～5个，优选为1～4个，优选为1～3个，进一步优选为1或2个氨基酸。1个或多个氨基酸，在提及全长小于40氨基酸的序列时，是指1或2个氨基酸。
此外，作为这类突变体的例子，可举出在严格的条件下跟与序列号152、序列号154、序列号156(单突变体)、序列号158、序列号160、序列号162和序列号164(二重突变体)、序列号138、序列号140、序列号166、序列号168、序列号170、序列号172、序列号174(三重突变体)、序列号134、序列号136、序列号176、序列号190(四重突变体)、序列号178、序列号180(五重突变体)、序列号144、序列号182、序列号184、序列号188、序列号192(六重突变体)、序列号142或序列号186(七重突变体)表示的碱基序列互补的序列进行杂交的碱基序列所编码，且具有对α－果糖基肽(αF1P～αF32P)或αF6P等α－果糖基肽(αFV、αFVH、αF3P、αF4P、αF5P、αF6P、αF8P和αF16P)的活性的阿马多里酶。此处在严格的条件下的杂交，记载于Sambrook等,MolecularCloning第2版，(ColdSpringHarborLaboratorypress)、Currentprotocolsinmolecularbiology(FrederickM.Ausubel等,编,1987)等。作为严格的条件，例如，能够举出使用杂交液(50％甲酰胺，6～10×SSC(0.15～1.5MNaCl,15mMsodiumcitrate,pH7.0)、5×Denhardt溶液、1％SDS、10％硫酸葡聚糖、10μg/ml的变性鲑鱼精子DNA、50mM磷酸缓冲液(pH7.5))在约42℃～约50℃下孵育，然后使用0.1×SSC、0.1％SDS在约65℃～约70℃下清洗的条件。此外，在其他严格的条件下，能够举出作为杂交液使用50％甲酰胺、5×SSC(0.15MNaCl,15mMsodiumcitrate,pH7.0)、1×Denhardt溶液、1％SDS、10％硫酸葡聚糖、10μg/ml的变性鲑鱼精子DNA、50mM磷酸缓冲液(pH7.5))的条件。
应予说明，本发明的突变体只要满足要求保护的范围记载的、与底物特异性和/或氨基酸序列相关的条件即可，例如，可以是基于正青霉属、棘壳孢菌属、节菱孢菌属、弯孢菌属、新赤壳菌属、隐球菌属、暗球腔菌属、曲霉属、翘孢霉属属、细基格孢属、青霉属、镰刀菌属、锥毛毛壳属、毛壳属、梭孢壳属、毛壳属、五谷麻孢壳属、小囊菌属、小球腔菌属、蛇孢腔菌属、格孢腔菌属、闭毛孢壳属、毕赤酵母属、棒状杆菌属、土壤杆菌属或节杆菌属这类来自其他生物种的阿马多里酶而制作的突变体。
基于来自锥毛壳属NISL9330的阿马多里酶(序列号1)的修饰体是在以下位置具有1个或多个氨基酸取代的修饰体。此处，阿马多里酶修饰体所涉及使用的1个或多个氨基酸取代是指1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸取代。优选1个或多个氨基酸取代是1、2、3、4、5、6或7个氨基酸取代。
(a)62位的精氨酸
(b)63位的亮氨酸
(c)102位的谷氨酸
(d)106位的天冬氨酸
(e)110位的谷氨酰胺
(f)113位的丙氨酸
(g)355位的丙氨酸
(h)419位的丙氨酸
上述来自锥毛壳属NISL9330的阿马多里酶(序列号1)中，优选(a)62位的精氨酸被取代为丙氨酸、天冬酰胺或天冬氨酸。优选(b)63位的亮氨酸被取代为组氨酸或丙氨酸。优选(c)102位的谷氨酸被取代为赖氨酸。优选(d)106位的天冬氨酸被取代为丙氨酸、赖氨酸或精氨酸。优选(e)110位的谷氨酰胺被取代为亮氨酸或酪氨酸。优选(f)113位的丙氨酸被取代为赖氨酸或精氨酸。优选(g)355位的丙氨酸被取代为丝氨酸。有时(h)419位的丙氨酸可以被取代为赖氨酸。
基于来自颖枯壳针孢的阿马多里酶(PnFX、序列号38)的修饰体是在以下位置可以具有1个或多个氨基酸取代的阿马多里酶的修饰体：
(a)62位的丝氨酸
(b)63位的亮氨酸
(c)102位的赖氨酸
(d)106位的天冬氨酸
(e)110位的甘氨酸
(f)113位的丙氨酸
(g)351位的丙氨酸
(h)416位的丝氨酸
在上述来自颖枯壳针孢的阿马多里酶(序列号38)中，优选(a)62位的丝氨酸被取代为丙氨酸或天冬氨酸。优选(b)63位的亮氨酸被取代为组氨酸。有时(c)102位的赖氨酸可以不被取代。优选(d)106位的天冬氨酸被取代为赖氨酸。优选110位的甘氨酸被取代为亮氨酸。优选113位的丙氨酸被取代为赖氨酸。优选351位的丙氨酸被取代为丝氨酸。有时(h)416位的丝氨酸可以被取代为赖氨酸。
基于来自侵管新赤壳菌的阿马多里酶(NvFX、序列号54)的修饰体是在以下位置能够具有1个或多个氨基酸取代的修饰体：
(a)62位的精氨酸
(b)63位的亮氨酸
(c)102位的谷氨酸
(d)106位的甘氨酸
(e)110位的谷氨酸
(f)113位的赖氨酸
(g)355位的丝氨酸
(h)420位的丙氨酸
上述来自侵管新赤壳菌的阿马多里酶(序列号54)中，优选(a)62位的精氨酸被取代为丙氨酸或天冬氨酸。优选(b)63位的亮氨酸被取代为组氨酸。优选(c)102位的谷氨酸被取代为赖氨酸。优选(d)106位的甘氨酸被取代为赖氨酸。优选110位的谷氨酸被取代为亮氨酸。有时113位的赖氨酸可以不被取代。有时355位的丝氨酸可以不被取代。有时(h)420位的丙氨酸可以被取代为赖氨酸。
基于来自构巢曲霉的阿马多里酶(AnFX，序列号62)的修饰体是在以下位置能够具有1个或多个氨基酸取代的修饰体：
(a)61位的精氨酸
(b)62位的亮氨酸
(c)101位的谷氨酸
(d)105位的甘氨酸
(e)109位的赖氨酸
(f)112位的丝氨酸
(g)355位的丙氨酸
(h)420位的丙氨酸
上述来自构巢曲霉的阿马多里酶(序列号62)中，优选(a)61位的精氨酸被取代为丙氨酸或天冬氨酸。优选(b)62位的亮氨酸被取代为组氨酸。优选(c)101位的谷氨酸被取代为赖氨酸。优选(d)105位的甘氨酸被取代为赖氨酸。优选109位的赖氨酸被取代为亮氨酸。优选112位的丝氨酸被取代为赖氨酸。优选355位的丙氨酸被取代为丝氨酸。有时(h)420位的丙氨酸可以被取代为赖氨酸。
基于来自土正青霉的阿马多里酶(序列号40)的修饰体是在以下位置能够具有1个或多个氨基酸取代的修饰体：
(a)62位的精氨酸
(b)63位的亮氨酸
(c)102位的谷氨酸
(d)106位的天冬酰胺
(e)110位的赖氨酸
(f)113位的苏氨酸
(g)355位的丙氨酸
(h)419位的甘氨酸
上述来自EFP-T5的阿马多里酶(序列号40)中，优选(a)62位的精氨酸被取代为丙氨酸或天冬氨酸。优选(b)63位的亮氨酸被取代为组氨酸。优选(c)102位的谷氨酸被取代为赖氨酸。优选(d)106位的天冬酰胺被取代为赖氨酸。优选110位的赖氨酸被取代为亮氨酸。优选113位的苏氨酸被取代为赖氨酸。优选355位的丙氨酸被取代为丝氨酸。有时(h)419位的甘氨酸可以被取代为赖氨酸。
基于来自新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶(序列号89或149)的修饰体是在以下位置能够具有1个或多个氨基酸取代的修饰体：
(a)62位的精氨酸
(b)63位的异亮氨酸
(c)102位的谷氨酸
(d)106位的丝氨酸
(e)110位的丝氨酸
(f)113位的丙氨酸
(g)355位的丙氨酸
(h)420位的丙氨酸
上述来自新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶(CnFX、序列号89或149)中，优选(a)62位的精氨酸被取代为丙氨酸或天冬氨酸。优选(b)63位的异亮氨酸被取代为组氨酸。优选(c)102位的谷氨酸被取代为赖氨酸。优选(d)106位的丝氨酸被取代为赖氨酸。优选110位的丝氨酸被取代为亮氨酸。优选113位的丙氨酸被取代为赖氨酸。优选355位的丙氨酸被取代为丝氨酸。有时(h)420位的丙氨酸可以被取代为赖氨酸。
基于来自棘壳孢菌属的酮胺氧化酶(序列号113)的修饰体是在以下位置能够具有1个或多个的氨基酸取代的修饰体：
(a)62位的精氨酸
(b)63位的亮氨酸
(c)102位的赖氨酸
(d)106位的天冬氨酸
(e)110位的丙氨酸
(f)113位的苏氨酸
(g)353位的丙氨酸
(h)418位的丙氨酸
上述来自棘壳孢菌属的酮胺氧化酶(序列号113)中，优选(a)62位的精氨酸被取代为丙氨酸或天冬氨酸。优选(b)63位的亮氨酸被取代为组氨酸。有时(c)102位的赖氨酸可以不被取代。优选(d)106位的天冬氨酸被取代为赖氨酸。优选110位的丙氨酸被取代为亮氨酸。优选113位的苏氨酸被取代为赖氨酸。优选353位的丙氨酸被取代为丝氨酸。有时(h)418位的丙氨酸可以被取代为赖氨酸。
基于来自节菱孢菌属的酮胺氧化酶(序列号115)的修饰体是在以下位置能够具有1个或多个氨基酸取代的修饰体：
(a)62位的精氨酸
(b)63位的亮氨酸
(c)102位的赖氨酸
(d)106位的丙氨酸
(e)110位的谷氨酰胺
(f)113位的苏氨酸
(g)356位的丙氨酸
(h)421位的丙氨酸
上述来自节菱孢菌属的酮胺氧化酶(序列号115)中，优选(a)62位的精氨酸被取代为丙氨酸或天冬氨酸。优选(b)63位的亮氨酸被取代为组氨酸。有时(c)102位的赖氨酸可以不被取代为。优选(d)106位的丙氨酸被取代为赖氨酸。优选110位的谷氨酰胺被取代为亮氨酸。优选113位的苏氨酸被取代为赖氨酸。优选356位的丙氨酸被取代为丝氨酸。有时(h)421位的丙氨酸可以被取代为赖氨酸。
基于来自棒弯孢的酮胺氧化酶(序列号117)的修饰体是在以下位置能够具有1个或多个氨基酸取代的修饰体：
(a)62位的精氨酸
(b)63位的亮氨酸
(c)102位的谷氨酸
(d)106位的天冬氨酸
(e)110位的丙氨酸
(f)113位的丙氨酸
(g)353位的丙氨酸
(h)418位的丙氨酸
上述来自棒弯孢的酮胺氧化酶(序列号117)中，优选(a)62位的精氨酸被取代为丙氨酸或天冬氨酸。优选(b)63位的亮氨酸被取代为组氨酸。优选(c)102位的谷氨酸被取代为赖氨酸。优选(d)106位的天冬氨酸被取代为赖氨酸。优选110位的丙氨酸被取代为亮氨酸。优选113位的丙氨酸被取代为赖氨酸。优选353位的丙氨酸被取代为丝氨酸。有时(h)418位的丙氨酸可以被取代为赖氨酸。
基于与来自棒弯孢的酮胺氧化酶(序列号117)具有95％的氨基酸序列同源性的酮胺氧化酶(Cc95FX，序列号99)的修饰体是在以下位置能够具有1个或多个氨基酸取代的修饰体：
(a)62位的精氨酸
(b)63位的亮氨酸
(c)102位的谷氨酸
(d)106位的天冬氨酸
(e)110位的丙氨酸
(f)113位的丙氨酸
(g)353位的丙氨酸
(h)418位的丝氨酸
在与上述来自棒弯孢的酮胺氧化酶(序列号117)具有95％的氨基酸序列同源性的酮胺氧化酶(序列号99)中，优选(a)62位的精氨酸被取代为丙氨酸或天冬氨酸。优选(b)63位的亮氨酸被取代为组氨酸。优选(c)102位的谷氨酸被取代为赖氨酸。优选(d)106位的天冬氨酸被取代为赖氨酸。优选110位的丙氨酸被取代为亮氨酸。优选113位的丙氨酸被取代为赖氨酸。优选353位的丙氨酸被取代为丝氨酸。有时(h)418位的丝氨酸可以被取代为赖氨酸。
基于来自构巢裸胞壳的果糖基肽氧化酶(序列号119)的修饰体是在以下位置能够具有1个或多个氨基酸取代的修饰体：
(a)61位的精氨酸
(b)62位的亮氨酸
(c)101位的谷氨酸
(d)105位的赖氨酸
(e)109位的精氨酸
(f)112位的丝氨酸
(g)355位的丙氨酸
(h)420位的丙氨酸
在上述来自构巢裸胞壳的果糖基肽氧化酶(序列号119)中，优选(a)61位的精氨酸被取代为丙氨酸或天冬氨酸。优选(b)62位的亮氨酸被取代为组氨酸。优选(c)101位的谷氨酸被取代为赖氨酸。有时(d)105位的赖氨酸可以不被取代。优选109位的精氨酸被取代为亮氨酸。优选112位的丝氨酸被取代为赖氨酸。优选355位的丙氨酸被取代为丝氨酸。有时(h)420位的丙氨酸可以被取代为赖氨酸。
基于来自细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶(序列号121)的修饰体是在以下位置能够具有1个或多个氨基酸取代的修饰体：
(a)62位的精氨酸
(b)63位的亮氨酸
(c)102位的赖氨酸
(d)106位的天冬氨酸
(e)110位的丙氨酸
(f)113位的丙氨酸
(g)353位的丙氨酸
(h)418位的丙氨酸
在上述来自细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶(序列号121)中，优选(a)62位的精氨酸被取代为丙氨酸或天冬氨酸。优选(b)63位的亮氨酸被取代为组氨酸。有时(c)102位的赖氨酸可以不被取代。优选(d)106位的天冬氨酸被取代为赖氨酸。优选110位的丙氨酸被取代为亮氨酸。优选113位的丙氨酸被取代为赖氨酸。优选353位的丙氨酸被取代为丝氨酸。有时(h)418位的丙氨酸可以被取代为赖氨酸。
基于来自微紫青霉菌的果糖基氨基酸氧化酶(序列号123)的修饰体是在以下位置能够具有1个或多个氨基酸取代的修饰体：
(a)62位的精氨酸
(b)63位的亮氨酸
(c)102位的谷氨酸
(d)106位的丝氨酸
(e)110位的赖氨酸
(f)113位的天冬氨酸
(g)355位的丙氨酸
(h)419位的丝氨酸
在上述来自微紫青霉菌的果糖基氨基酸氧化酶(序列号123)中，优选(a)62位的精氨酸被取代为丙氨酸或天冬氨酸。优选(b)63位的亮氨酸被取代为组氨酸。优选(c)102位的谷氨酸被取代为赖氨酸。优选(d)106位的丝氨酸被取代为赖氨酸。优选110位的赖氨酸被取代为亮氨酸。优选113位的天冬氨酸被取代为赖氨酸。优选355位的丙氨酸被取代为丝氨酸。有时(h)419位的丝氨酸可以被取代为赖氨酸。
在一实施方式中，本发明的阿马多里酶优选将αF6P等α－果糖基肽、具体而言将αFV和αFVH以及以下的(a)～(f)的糖基化肽中任1个以上作为底物识别，
(a)α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酸(αF3P)，
(b)α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酸(αF4P)，
(c)α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酸(αF5P)，
(d)α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酸(αF6P)，
(e)α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酸(αF8P)，
(f)α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酰基亮氨酰基色氨酰基甘氨酸(αF16P)
作为作用将(a)～(f)中任1个以上氧化而生成过氧化氢，
在pH6～8的范围具有最佳pH范围，
在pH5～9的范围具有作用pH范围，
作用温度是25～40℃，
在SDS－PAGE上的分子量是约45～55KDa，例如约48～50KDa。
从本发明的阿马多里酶突变体或修饰体，将与αF3P、αF4P、αF5P、αF6P、αF8P和αF16P基本没有或完全没有活性的阿马多里酶，例如具有序列号1、序列号36、序列号38、序列号40、序列号54、序列号62、序列号89、序列号99、序列号145、序列号147、序列号149表示的氨基酸序列的阿马多里酶除去。从本发明的阿马多里酶突变体或修饰体，将野生型氨基酸序列的回复突变体除去。
(编码阿马多里酶的基因的取得)
在得到编码这些阿马多里酶的本发明基因(以下，简称为“阿马多里酶基因”)中，通常使用一般使用的基因的克隆方法。例如，从具有阿马多里酶生产能力的微生物菌体、各种细胞通过常规方法，例如CurrentProtocolsinMolecularBiology(WILEYInterscience，1989)记载的方法，能够提取染色体DNA或mRNA。进一步将mRNA作为模板能够合成cDNA。使用这样得到的染色体DNA或cDNA，能够制作染色体DNA或cDNA文库。
接下来，通过基于上述阿马多里酶的氨基酸序列，合成适当的探针DNA，使用其从染色体DNA或cDNA文库选拔阿马多里酶基因的方法，或基于上述氨基酸序列，制作适当的引物DNA，通过5’RACE法、3’RACE法等适当的聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction，PCR法)，使含有编码阿马多里酶的目的基因片段的DNA扩增，将这些DNA片段连接，能够得到包含目的阿马多里酶基因全长的DNA。
作为这样得到的编码阿马多里酶的基因的优选的一例，可举出来自锥毛壳属的阿马多里酶基因(日本特开2003－235585号公报)。
此外，作为其他优选的例子，可举出来自暗球腔菌属的阿马多里酶基因、来自新赤壳菌属的阿马多里酶基因、来自曲霉属的阿马多里酶基因、和来自隐球菌属的阿马多里酶基因、和来自弯孢菌属的阿马多里酶基因、和来自正青霉属的阿马多里酶基因。
这些阿马多里酶基因在处理上优选如常规方法所示与各种载体连接。例如，将含有编码来自锥毛壳属NISL9330株的阿马多里酶基因的DNA的重组质粒pKK223－3－CFP－T7(国际公开第2007/125779号)，通过使用GenElutePlasmidMiniprepKit(Sigma-Alcrich公司制)，能够提取、精制得到含有编码阿马多里酶基因的DNA的重组质粒pKK223－3－CFP－T7。对于来自其他生物的阿马多里酶基因，本领域技术人员通过惯用方法，按照同样的顺序能够取得DNA。具体而言，培养保有含有编码来自土正青霉ATCC18547株的阿马多里酶基因的DNA的重组质粒pUTE100K’－EFP－T5(国际公开第2007/125779号)的大肠杆菌，通过使用GenElutePlasmidMiniprepKit，从细胞提取、精制得到含有编码阿马多里酶基因的DNA的重组质粒pUTE100K’－EFP－T5。此外，培养保有含有编码来自构巢曲霉FGSCA26株的阿马多里酶基因的DNA的重组质粒pET22b－AnFX(国际公开第2012/018094号)的大肠杆菌，通过使用GenElutePlasmidMiniprepKit，能够提取、精制得到含有编码阿马多里酶基因的DNA的重组质粒pET22b－AnFX。此外，培养保有含有编码来自新型隐球菌的阿马多里酶基因的DNA的重组质粒pET22b－CnFX(国际公开第2012/018094号)的大肠杆菌，通过使用GenElutePlasmidMiniprepKit，能够提取、精制得到含有编码阿马多里酶基因的DNA的重组质粒pET22b－CnFX。此外，培养保有含有编码来自侵管新赤壳菌的阿马多里酶基因的DNA的重组质粒pET22b－NvFX(国际公开第2012/018094号)的大肠杆菌，通过使用GenElutePlasmidMiniprepKit，能够提取、精制得到含有编码阿马多里酶基因的DNA的重组质粒pET22b－NvFX。
(载体)
作为本发明中能够使用的载体，不局限于上述质粒，能够使用上述以外的例如噬菌体、柯斯质粒等本领域技术人员公知的任意的载体。具体而言，例如，优选为pBluescriptIISK+(Stratagene公司制)等。
(阿马多里酶基因的突变处理)
阿马多里酶基因的突变处理，能够利用与欲实现突变形态对应的、公知的任意的方法进行。即，能够广泛使用使阿马多里酶基因或导入该基因的重组体DNA和成为突变原的药剂接触·作用的方法；紫外线照射法；基因工程方法；或利用蛋白质工程方法的方法等。
作为上述突变处理所使用的成为突变原的药剂，例如，能够举出羟胺、N－甲基－N’－硝基－N－亚硝基胍、亚硝酸、亚硫酸、肼、甲酸、或5－溴尿嘧啶等。
该接触·作用的诸条件，能够采用与使用的药剂的种类等相应的条件，现实中只要能够在阿马多里酶基因中引起期望的突变即可，没有特别限制。通常，优选在0.5～12M的上述药剂浓度中，通过20～80℃的反应温度下接触·作用10分钟以上，优选为10～180分钟，能够引起期望的突变。进行紫外线照射时，也能够如上述所示根据常规方法进行(现代化学，024～30，1989年6月号)。
作为利用蛋白质工程方法的方法，通常能够使用作为定点突变(Site－SpecificMutagenesis)已知的方法。例如，可举出Kramer法(NucleicAcidsRes.，12，9441(1984)：MethodsEnzymol.，154，350(1987)：Gene，37，73(1985))、Eckstein法(NucleicAcidsRes.，13，8749(1985)：NucleicAcidsRes.，13，8765(1985)：NucleicAcidsRes，14，9679(1986))、Kunkel法(Proc.Natl.Acid.Sci.U.S.A.，82，488(1985)：MethodsEnzymol.，154，367(1987))等。
另外，也能够使用作为常见的PCR法已知的方法(参照Technique，1，11(1989))。应予说明，上述基因修饰法之外，通过有机合成法或酶合成法，也能够直接合成期望的修饰阿马多里酶基因。
进行通过上述方法得到的阿马多里酶基因的DNA碱基序列的确定或确认时，例如，能够通过使用多毛细管DNA解析系统AppliedBiosystems3130xl基因分析仪(LifeTechnologies公司制)等进行。
(转化·转导)
将如上述所示得到的阿马多里酶基因，通过常规方法，装入噬菌体、柯斯质粒、或原核细胞或真核细胞的转化所使用的质粒等载体，将与各个载体相对应的宿主通过常规方法进行转化或转导。例如，作为宿主，使用属于大肠杆菌属的微生物，例如使用得到的重组体DNA，将例如大肠杆菌K－12株、优选为大肠杆菌JM109株、大肠杆菌DH5α株(均是TAKARABIO公司制)等转化或转导至它们而得到各个菌株。
(氨基酸序列的相同性、同源性或类似性)
氨基酸序列的相同性、同源性或类似性，通过GENETYX(GENETYX公司制)的最大匹配、同源性搜索等程序、或DNASISPro(日立Solutions公司制)的最大匹配、多重比对，或CLUSTALW的多重比对等程序能够计算。为了计算氨基酸序列同源性，将2个以上的阿马多里酶进行比对时，能够研究该2个以上的阿马多里酶中相同的氨基酸位置。以这样的信息为基础，能够确定氨基酸序列中的相同区域。此处对于2个以上的氨基酸序列，同源性％是指利用Blosum62等算法进行2个以上的氨基酸序列的比对时，将能够比对的区域的总氨基酸数作为分母，其中由相同的氨基酸占据的位置的数作为分子时的百分比。因此，通常，2个以上的氨基酸序列中存在完全没有发现同源性新型隐球菌的区域时，例如C末端完全没有发现同源性的添加序列在一个氨基酸序列存在时，由于该不具有同源性的区域不能比对，因此，同源性％的计算中不能利用。
此外，也能够研究作为2个以上的阿马多里酶中类似的氨基酸的位置。例如使用CLUSTALW能够将多个氨基酸序列进行比对，此时，作为算法使用Blosum62，将多个氨基酸序列进行比对时，有时将被判断为类似(similar)的氨基酸称为类似氨基酸。本发明的突变体中，氨基酸取代是利用这类类似氨基酸之间的取代的突变体。通过这样比对，对于多个氨基酸序列，能够研究氨基酸序列相同的区域和由类似氨基酸占据的位置。基于这样的信息，能够确定氨基酸序列中的相同性区域(保守区域)。
本说明书中“相同性区域”是指，将2个以上的阿马多里酶进行比对时，成为某一基准的阿马多里酶和比较对象的阿马多里酶的对应位置中氨基酸相同或由类似氨基酸构成的区域，由连续的3个以上、4个以上、5个以上、6个以上、7个以上、8个以上、9个以上或10个以上的氨基酸构成的区域。例如，图1中将全长氨基酸序列的序列同源性为74％以上的阿马多里酶进行比对。其中，将序列号1表示的锥毛壳属阿马多里酶作为基准，第10位～32位由相同或类似氨基酸构成，因此属于相同性区域。同样，将序列号1表示的锥毛壳属阿马多里酶作为基准，36～41位、49～52位、54～58位、63～65位、73～75位、84～86位、88～90位、120～122位、145～150位、156～162位、164～170位、180～182位、202～205位、207～211位、214～224位、227～230位、236～241位、243～248位、258～261位、266～268位、270～273位、275～287位、295～297位、306～308位、310～316位、324～329位、332～334位、341～344位、346～355位、357～363位、370～383位、385～387位、389～394位、405～410位和423～431位属于相同性区域。
将序列号1表示的锥毛壳属阿马多里酶作为基准，优选阿马多里酶的相同性区域是由第11位～32位、36～41位、50～52位、54～58位、84～86位、88～90位、145～150位、157～168位、202～205位、207～212位、215～225位、236～248位、258～261位、266～268位、270～273位、275～287位、347～354位、357～363位、370～383位、385～387位和405～410位的氨基酸序列构成的区域。
将序列号1表示的锥毛壳属阿马多里酶作为基准，进一步优选阿马多里酶的相同性区域是由第11～18位、20～32位、50～52位、54～58位、266～268位、270～273位、277～286位和370～383位的氨基酸序列构成的区域。
本发明的阿马多里酶突变体，与具有序列号1或序列号141表示的氨基酸序列的阿马多里酶比对时，具有50％以上，优选为60％以上，优选为70％以上，优选为75％以上，优选为80％以上，优选为85％以上，更优选为90％以上，更优选为95％以上，最优选为99％以上的全长氨基酸序列同源性，对αF6P等α－果糖基肽(αFV、αFVH、αF3P、αF4P、αF5P、αF6P、αF8P和αF16P)具有高的反应性。进而，本发明的阿马多里酶突变体的相同性区域的氨基酸序列与序列号1或序列号141的相同性区域的氨基酸序列具有80％，优选为85％以上，优选为90％，优选为95％，优选为98％，进一步优选为99％以上的序列同源性。
在一实施方式中，将序列号141的阿马多里酶作为基准，阿马多里酶的相同性区域是由第10位～32位、36～41位、49～52位、54～58位、73～75位、84～86位、88～90位、120～122位、145～150位、156～162位、164～170位、180～182位、202～205位、207～211位、214～224位、227～230位、236～241位、243～248位、258～261位、266～268位、270～273位、275～287位、295～297位、306～308位、310～316位、324～329位、332～334位、341～344位、346～355位、357～363位、370～383位、385～387位、389～394位、405～410位和423～431位的氨基酸序列构成的区域，优选为由第11位～32位、36～41位、50～52位、54～58位、84～86位、88～90位、145～150位、157～168位、202～205位、207～212位、215～225位、236～248位、258～261位、266～268位、270～273位、275～287位、347～354位、357～363位、370～383位、385～387位和405～410位的氨基酸序列构成的区域，进一步优选为由第11～18位、20～32位、50～52位、54～58位、266～268位、270～273位、277～286位和370～383位的氨基酸序列构成的区域。
在一实施方式中，本发明的阿马多里酶为：
(i)具有在序列号141表示的氨基酸序列进行1个或多个氨基酸的取代、缺失或添加的氨基酸序列的阿马多里酶，或
(ii)上述(i)的阿马多里酶中，该阿马多里酶的全长氨基酸序列与序列号141的氨基酸序列具有70％以上的序列同源性，且由序列号141的第10位～32位、36～41位、49～52位、54～58位、73～75位、84～86位、88～90位、120～122位、145～150位、156～162位、164～170位、180～182位、202～205位、207～211位、214～224位、227～230位、236～241位、243～248位、258～261位、266～268位、270～273位、275～287位、295～297位、306～308位、310～316位、324～329位、332～334位、341～344位、346～355位、357～363位、370～383位、385～387位、389～394位、405～410位和423～431位的氨基酸序列构成的相同性区域的氨基酸序列和该阿马多里酶的对应位置的相同性区域的氨基酸序列具有90％以上的序列同源性的阿马多里酶。在一实施方式中，本发明的阿马多里酶是上述(ii)规定的相同性区域的氨基酸序列和该阿马多里酶的对应位置的相同性区域的氨基酸序列具有95％以上的序列同源性的阿马多里酶。
(与氨基酸对应的位置的确定)
本发明中，成为某一基础的氨基酸序列中的特定的位置的氨基酸与其他类似的氨基酸序列中的特定的位置的氨基酸对应时，将其称为对应的氨基酸，将该氨基酸的位置称为对应的位置或相当的位置。此外，作为确定“与氨基酸的位置对应的位置”的方法，例如可举出使用Lipman-Pearson法等公知的算法比较氨基酸序列，通过对各阿马多里酶的氨基酸序列中存在的保守氨基酸残基赋予最大的同源性而进行的方法。通过将阿马多里酶的氨基酸序列利用这类方法进行整列，无论氨基酸序列中具有的插入、缺失如何，都能够确定相同氨基酸残基在各阿马多里酶序列的序列中的位置。认为相同位置在三维结构中存在于相同位置，能够推定关于成为对象的阿马多里酶的特异功能具有类似的效果。
应予说明，本发明中，“与序列号1记载的氨基酸序列的62位的精氨酸对应的位置”的氨基酸是指将确定的阿马多里酶的氨基酸序列与序列号1表示的来自锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列进行比较时，与序列号1的阿马多里酶的62位的精氨酸对应的氨基酸。由此，利用上述确定“对应的位置的氨基酸残基”的方法进行氨基酸序列整列而能够进行确定。
即，“与序列号1记载的氨基酸序列的62位的精氨酸对应的位置”的氨基酸是来自土正青霉的阿马多里酶(序列号40和145)、来自棘壳孢菌属的酮胺氧化酶(序列号113)、来自节菱孢菌属的酮胺氧化酶(序列号115)、来自棒弯孢的酮胺氧化酶(序列号117)、来自侵管新赤壳菌的酮胺氧化酶(序列号54)、来自新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶(序列号89和149)、来自细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶(序列号121)、来自微紫青霉菌的果糖基氨基酸氧化酶(序列号123)中的62位的精氨酸，来自颖枯壳针孢的果糖基肽氧化酶(序列号38)中的62位的丝氨酸，来自构巢裸胞壳的果糖基肽氧化酶(序列号119)中的61位的精氨酸，来自构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶(序列号62和147)中的61位的精氨酸。
此外，本发明中，“与序列号1记载的氨基酸序列的63位的亮氨酸对应的位置”的氨基酸是指将确定的阿马多里酶的氨基酸序列与序列号1表示的来自锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列比较时，与序列号1的阿马多里酶的63位的亮氨酸对应的氨基酸。由此，利用上述确定“对应的位置的氨基酸残基”的方法将氨基酸序列整列而能够确定。
即，“与序列号1记载的氨基酸序列的63位的亮氨酸对应的位置”的氨基酸是来自土正青霉的阿马多里酶(序列号40和145)、来自棘壳孢菌属的酮胺氧化酶(序列号113)、来自节菱孢菌属的酮胺氧化酶(序列号115)、来自棒弯孢的酮胺氧化酶(序列号117)、来自侵管新赤壳菌的酮胺氧化酶(序列号54)、来自颖枯壳针孢的果糖基肽氧化酶(序列号38)、来自细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶(序列号121)、来自微紫青霉菌的果糖基氨基酸氧化酶(序列号123)中的63位的亮氨酸，来自新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶(序列号89和149)中的63位的异亮氨酸，来自构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶(序列号62和147)、来自构巢裸胞壳的果糖基肽氧化酶(序列号119)中的62位的亮氨酸。
此外，本发明中，“与序列号1记载的氨基酸序列的102位的谷氨酸对应的位置”的氨基酸是指将确定的阿马多里酶的氨基酸序列与序列号1表示的来自锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列进行比较时，与序列号1的阿马多里酶的102位的谷氨酸对应的氨基酸。由此，利用上述确定“对应的位置的氨基酸残基”的方法将氨基酸序列整列而能够确定。
即，“与序列号1记载的氨基酸序列的102位的谷氨酸对应的位置”的氨基酸是来自土正青霉的阿马多里酶(序列号40和145)、来自棒弯孢的酮胺氧化酶(序列号117)、来自侵管新赤壳菌的酮胺氧化酶(序列号54)、来自新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶(序列号89和149)、来自微紫青霉菌的果糖基氨基酸氧化酶(序列号123)中的102位的谷氨酸，来自棘壳孢菌属的酮胺氧化酶(序列号113)、来自节菱孢菌属的酮胺氧化酶(序列号115)、来自颖枯壳针孢的果糖基肽氧化酶(序列号38)、来自细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶(序列号121)中的102位的赖氨酸，来自构巢裸胞壳的果糖基肽氧化酶(序列号119)、来自构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶(序列号62和147)中的101位的谷氨酸。
此外，本发明中，“与序列号1记载的氨基酸序列的106位的天冬氨酸对应的位置”的氨基酸是指将确定的阿马多里酶的氨基酸序列与序列号1表示的来自锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列进行比较时，与序列号1的阿马多里酶的106位的天冬氨酸对应的氨基酸。由此，利用上述确定“对应的位置的氨基酸残基”的方法将氨基酸序列整列而能够确定。
即，“与序列号1记载的氨基酸序列的106位的天冬氨酸对应的位置”的氨基酸是来自土正青霉的阿马多里酶(序列号40和145)中的106位的天冬酰胺，来自棘壳孢菌属的酮胺氧化酶(序列号113)、来自棒弯孢的酮胺氧化酶(序列号117)、来自颖枯壳针孢的果糖基肽氧化酶(序列号38)、来自细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶(序列号121)中的106位的天冬氨酸，来自节菱孢菌属的酮胺氧化酶(序列号115)中的106位的丙氨酸，来自侵管新赤壳菌的酮胺氧化酶(序列号54)中的106位的甘氨酸，来自新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶(序列号89和149)、来自微紫青霉菌的果糖基氨基酸氧化酶(序列号123)中的106位的丝氨酸，来自构巢裸胞壳的果糖基肽氧化酶(序列号119)中的105位的赖氨酸，来自构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶(序列号62和147)中的105位的甘氨酸。
此外，本发明中，“与序列号1记载的氨基酸序列的110位的谷氨酰胺对应的位置”的氨基酸是指将确定的阿马多里酶的氨基酸序列与序列号1表示的来自锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列进行比较时，与序列号1的阿马多里酶的110位的谷氨酰胺对应的氨基酸。由此，利用上述确定“对应的位置的氨基酸残基”的方法将氨基酸序列整列而能够确定。
即，“与序列号1记载的氨基酸序列的110位的谷氨酰胺对应的位置”的氨基酸是来自土正青霉的阿马多里酶(序列号40和145)、来自微紫青霉菌的果糖基氨基酸氧化酶(序列号123)中的110位的赖氨酸，来自棘壳孢菌属的酮胺氧化酶(序列号113)、来自棒弯孢的酮胺氧化酶(序列号117)、来自细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶(序列号121)中的110位的丙氨酸，来自节菱孢菌属的酮胺氧化酶(序列号115)中的110位的谷氨酰胺，来自侵管新赤壳菌的酮胺氧化酶(序列号54)中的110位的谷氨酸，来自新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶(序列号89和149)中的110位的丝氨酸，来自颖枯壳针孢的果糖基肽氧化酶(序列号38)中的110位的甘氨酸，来自构巢裸胞壳的果糖基肽氧化酶(序列号119)中的109位的精氨酸，来自构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶(序列号62和147)中的109位的赖氨酸。
此外，本发明中，“与序列号1记载的氨基酸序列的113位的丙氨酸对应的位置”的氨基酸是指将确定的阿马多里酶的氨基酸序列与序列号1表示的来自锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列进行比较时，与序列号1的阿马多里酶的113位的丙氨酸对应的氨基酸。由此，利用上述确定“对应的位置的氨基酸残基”的方法将氨基酸序列整列而能够确定。
即，“与序列号1记载的氨基酸序列的113位的丙氨酸对应的位置”的氨基酸是来自土正青霉的阿马多里酶(序列号40和145)、来自棘壳孢菌属的酮胺氧化酶(序列号113)、来自节菱孢菌属的酮胺氧化酶(序列号115)中的113位的苏氨酸，来自棒弯孢的酮胺氧化酶(序列号117)、来自新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶(序列号89和149)、来自颖枯壳针孢的果糖基肽氧化酶(序列号38)、来自细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶(序列号121)中的113位的丙氨酸，来自侵管新赤壳菌的酮胺氧化酶(序列号54)中的113位的赖氨酸，来自构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶(序列号62和147)、来自构巢裸胞壳的果糖基肽氧化酶(序列号119)中的112位的丝氨酸，来自微紫青霉菌的果糖基氨基酸氧化酶(序列号123)中的113位的天冬氨酸。
此外，本发明中，“与序列号1记载的氨基酸序列的355位的丙氨酸对应的位置”的氨基酸是指将确定的阿马多里酶的氨基酸序列与序列号1表示的来自锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列进行比较时，与序列号1的阿马多里酶的355位的丙氨酸对应的氨基酸。由此，利用上述确定“对应的位置的氨基酸残基”的方法将氨基酸序列整列而能够确定。
即，“与序列号1记载的氨基酸序列的355位的丙氨酸对应的位置”的氨基酸是来自土正青霉的阿马多里酶(序列号40和145)、来自新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶(序列号89和149)、来自构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶(序列号62和147)、来自构巢裸胞壳的果糖基肽氧化酶(序列号119)、来自微紫青霉菌的果糖基氨基酸氧化酶(序列号123)中的355位的丙氨酸，来自棘壳孢菌属的酮胺氧化酶(序列号113)、来自棒弯孢的酮胺氧化酶(序列号117)、来自细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶(序列号121)中的353位的丙氨酸，来自节菱孢菌属的酮胺氧化酶(序列号115)中的356位的丙氨酸，来自侵管新赤壳菌的酮胺氧化酶(序列号54)中的355位的丝氨酸，来自颖枯壳针孢的果糖基肽氧化酶(序列号38)中的351位的丙氨酸。
此外，本发明中，“与序列号1记载的氨基酸序列的419位的丙氨酸对应的位置”的氨基酸是指将确定的阿马多里酶的氨基酸序列与序列号1表示的来自锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列进行比较时，与序列号1的阿马多里酶的419位的丙氨酸对应的氨基酸。由此，利用上述确定“对应的位置的氨基酸残基”的方法将氨基酸序列整列而能够确定。
即，“与序列号1记载的氨基酸序列的419位的丙氨酸对应的位置”的氨基酸是来自土正青霉的阿马多里酶(序列号40和145)中的419位的甘氨酸，来自棘壳孢菌属的酮胺氧化酶(序列号113)、来自棒弯孢的酮胺氧化酶(序列号117)、来自细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶(序列号121)中的418位的丙氨酸，来自节菱孢菌属的酮胺氧化酶(序列号115)中的421位的丙氨酸，来自侵管新赤壳菌的酮胺氧化酶(序列号54)、来自新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶(序列号89和149)、来自构巢裸胞壳的果糖基肽氧化酶(序列号119)中的420位的丙氨酸，来自颖枯壳针孢的果糖基肽氧化酶(序列号38)中的416位的丝氨酸，来自微紫青霉菌的果糖基氨基酸氧化酶(序列号123)中的419位的丝氨酸，来自构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶(序列号62和147)中的420位的丙氨酸。
(关于取代的协同效果)
本发明的阿马多里酶突变体，可以是单突变体，也可以是具有2个以上的氨基酸取代的多重突变体，例如二重～八重突变体。本发明人等发现，取代与序列号1的氨基酸序列的第62位、63位、102位、106位、110位、113位、355位和419位对应的位置的氨基酸而得的阿马多里酶对αF6P的活性增大。特别是发现随着单、二重、三重、四重、五重、六重和七重这样追加突变，突变体对αF6P的活性大大增大。从实施例表示的阿马多里酶突变体对αF6P的活性的增大来看，表明这些氨基酸取代具有协同效果。此外，本领域技术人员能够理解与序列号1的氨基酸序列的第62位、63位、102位、106位、110位、113位、355位和419位对应的位置的氨基酸取代的各种组合同样会带来对αF6P的活性的增大。
进一步，本发明人等发现，取代与序列号1的氨基酸序列的第62位、63位、102位、106位、110位、113位和355位对应的位置的氨基酸而得的阿马多里酶不仅对αFV和αFVH具有活性，而且对αF3P、αF4P、αF5P、αF6P、αF8P和αF16P也具有活性。因此，认为同样取代与序列号1的氨基酸序列的第62位、63位、102位、106位、110位、113位和355位对应的位置的氨基酸而得的Co、Et、Py、Ar、Cc、Nv、Cn、Pn、An、En、Ul和Pj等来自其他株的突变体也同样不仅对αFV和αFVH具有活性，而且对αF3P、αF4P、αF5P、αF6P、αF8P和αF16P也具有活性。此外，由于取代与序列号1的氨基酸序列的第62位、63位、102位、106位、110位、113位和355位对应的位置的氨基酸而得的阿马多里酶对αFV、αFVH、αF3P、αF4P、αF5P、αF6P、αF8P和αF16P具有活性，因此，认为该阿马多里酶对各种α－果糖基肽(αF1P～αF16P、αF1P～αF32P)也具有活性。
(关于预备取代)
关于阿马多里酶，报告了与序列号1的氨基酸序列的第60位对应的位置的氨基酸为丝氨酸时，通过将其取代为甘氨酸，取代前不具有αFVH活性的酶在取代后变为具有αFVH活性(参照日本特开2010－35469号公报、国际公开第2012/018094号)。因此，本发明所使用的阿马多里酶的与序列号1的第60位对应的位置的氨基酸为丝氨酸时，也能够将其预先取代为甘氨酸。或者，也可以使用野生型中与序列号1的60位对应的位置是甘氨酸的阿马多里酶，在与上述序列号1的第62位、63位、102位、106位、110位、113位、355位和419位对应的位置导入突变。本发明的阿马多里酶突变体，除非另有规定，包含与序列号1的第60位对应的位置的氨基酸是甘氨酸的阿马多里酶。例如，来自构巢曲霉的阿马多里酶，与序列号1的60位对应的序列号147中的第59位的氨基酸在野生型中是丝氨酸，可以使用将其取代为甘氨酸(序列号62)的阿马多里酶作为成为本发明的突变体的基础的阿马多里酶。对于来自微紫青霉菌(Pj)的阿马多里酶(序列号123)也是同样的。
(本发明的阿马多里酶的生产)
在使用具有如上述所示得到的底物特异性得到改善的阿马多里酶的生产能力的菌株来生产该阿马多里酶中，可以利用通常的固体培养法培养该菌株，但优选采用液体培养法培养。
即，本发明提供阿马多里酶的制造方法，其包括将具有底物特异性得到改善的阿马多里酶的生产能力的菌株，在能够表达阿马多里酶蛋白质的条件下培养的工序，和从培养物或培养液分离阿马多里酶的工序。该方法中，能够使用利用装入编码本发明阿马多里酶的基因的载体进行转化的宿主细胞。此处能够表达阿马多里酶蛋白质的条件是指阿马多里酶基因被转录、翻译，产生由该基因编码的多肽。
此外，作为培养上述菌株的培养基，例如，使用在酵母提取物、胰蛋白胨、蛋白胨、肉提取物、玉米浆或者大豆或小麦麸的浸出液等1种以上的氮源中，添加氯化钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化镁、氯化铁、硫酸铁或硫酸锰等无机盐类的1种以上，进一步根据需要适当添加糖质原料、维生素等的培养基。
此外，通过在培养基中添加该阿马多里酶能够作用的底物或其类似化合物，例如糖化氨基酸、糖基化肽类、糖化蛋白质分解物或糖化血红蛋白、糖化白蛋白等糖化蛋白质，能够提高目的酶的制造量。
培养基的初始pH调整为pH7～9是适当的。培养优选通过在20～42℃的培养温度、优选为25～37℃左右的培养温度下4～24小时，进一步优选为25～37℃左右的培养温度下8～16小时进行通气搅拌深部培养、振荡培养、静置培养等来实施。
培养结束后，从该培养物采取阿马多里酶中，使用通常的酶采取手段能够得到。例如，利用常规方法将菌体进行超声波破碎处理、磨碎处理等或使用溶菌酶等溶菌酶提取主酶，或在甲苯等的存在下振荡或放置进行溶菌，能够将该酶排出至菌体外。接着，将该溶液过滤、离心分离等将固体部分除去，根据需要利用链霉素硫酸盐、鱼精蛋白硫酸盐、或硫酸锰等将核酸除去后，向其添加硫酸铵、醇、丙酮等，分层，采取沉淀物，得到阿马多里酶的粗酶。
从上述阿马多里酶的粗酶进一步得到阿马多里酶精制酶标准品中，例如，通过适当选择使用葡聚糖、Superdex或Ultrogel等的凝胶过滤法，使用离子交换性载体、疏水性载体、羟基磷灰石的吸附洗脱法，使用聚丙烯酰胺凝胶等的电泳法、蔗糖密度梯度离心法等沈降法、亲和色谱法、使用分子筛膜或中空丝膜等的分离法等，或将它们组合实施，能够得到精制的阿马多里酶酶标准品。由此，能够得到期望的阿马多里酶。
(本发明的阿马多里酶的反应性的提高)
利用上述手段得到的本发明的阿马多里酶，其特征在于，通过基因修饰等，在该氨基酸序列产生突变，最终与修饰前的阿马多里酶相比，对α－果糖基低聚肽(αF3P～αF16P)或αF6P等α－果糖基肽(αFV、αFVH、αF3P、αF4P、αF5P、αF6P、αF8P和αF16P)的反应性提高。本发明中对α－果糖基低聚肽或αF6P等α－果糖基肽的“反应性提高”具体而言，是指与修饰前的阿马多里酶相比，“对α－果糖基低聚肽的反应性”或“对αF6P等α－果糖基肽的反应性”增大。应予说明，“对αFVH的反应性”有时也记为“αFVH氧化活性”、“αFVH活性”。对于αFV等也是同样的。
为了减少蛋白酶使用量，或为了不利用切断特异性高的蛋白酶也能够测定HbA1c，或为了即使没有利用蛋白酶完全分解为αFVH仍能够将HbA1c进行定量，因此需要取得不仅对αFVH而且对αF3P、αF4P、αF5P、αF6P、αF8P、αF16P等α－果糖基肽也容易作用的阿马多里酶。
关于本发明的阿马多里酶，将对αFVH的反应性作为1时的对αF6P的反应性的比例记为αF6P/αFVH。对于αF3P/αFVH、αF4P/αFVH、αF5P/αFVH、αF8P/αFVH、αF16P/αFVH也是同样的。对于其他α－果糖基低聚肽也是同样的。
此外，关于本发明的阿马多里酶，将对αFV的反应性作为1时的对αF6P的反应性的比例记为αF6P/αFV。应予说明，“对αFV的反应性”有时也记为“αFV氧化活性”。对于αF3P/αFV、αF4P/αFV、αF5P/αFV、αF8P/αFV、αF16P/αFV也是同样的。此外对于其他α－果糖基低聚肽也是同样的。
对αF6P的反应性相对于对αFVH的反应性的比例(对αF6P的反应性和对αFVH的反应性之比)，使用公知的阿马多里酶的测定方法，在任意的条件下测定，能够与修饰前的阿马多里酶进行比较。例如，通过在pH6.5求出添加1mM的αF6P而测定的活性除以添加1mM的αFVH而测定的活性所得到的比率，算出将对αFVH的反应性作为1时的对αF6P的反应性的比例，能够在修饰前的阿马多里酶和修饰后的阿马多里酶将其进行比较。此外，例如，通过在pH6.5求出添加1mM的αF6P而测定的活性除以添加1mM的αFV而测定的活性所得到的比率，算出将对αFV的反应性作为1时的对αF6P的反应性的比例，能够在修饰前的阿马多里酶和修饰后的阿马多里酶将其进行比较。对于αF3P/αFVH～αF16P/αFVH、αF3P/αFV～αF16P/αFV也是同样的。
在一实施方式中本发明的阿马多里酶对αFV的相对活性(U/mg)是1.0以上，5.0以上，10以上，例如13以上。在一实施方式中本发明的阿马多里酶对αFVH的相对活性(U/mg)是1.0以上，1.5以上，例如1.90以上。在一实施方式中本发明的阿马多里酶对αF3P的相对活性(U/mg)是1.0以上，例如1.20以上。在一实施方式中本发明的阿马多里酶对αF4P的相对活性(U/mg)是0.1以上，0.2以上，0.3以上，例如0.35以上。在一实施方式中本发明的阿马多里酶对αF5P的相对活性(U/mg)是1.0以上，2.0以上，例如2.10以上。在一实施方式中本发明的阿马多里酶对αF6P的相对活性(U/mg)是1.0以上，2.0以上，3.0以上，4.0以上，例如4.2以上。在一实施方式中本发明的阿马多里酶对αF8P的相对活性(U/mg)是1.0以上，例如1.5以上。在一实施方式中本发明的阿马多里酶对αF16P的相对活性(U/mg)是0.1以上，0.2以上，例如0.24以上。
作为本发明的阿马多里酶的一例，可举出由大肠杆菌JM109(pKK223－3－CFP－T7－H35)株生产的阿马多里酶。该阿马多里酶不仅与αFV和αFVH反应，而且与修饰前的阿马多里酶比较，对αF3P、αF4P、αF5P、αF6P、αF8P和αF16P的反应性也提高。这类修饰的阿马多里酶，即使不使用Glu－C蛋白酶这种切断特异性高的蛋白酶，也可以通过测定利用生成各种长度的α－果糖基低聚肽的切断特异性低的蛋白酶来处理HbA1c而生成的α－果糖基低聚肽或αF6P等α－果糖基肽从而实现HbA1c定量。即，大范围的蛋白酶可用于HbA1c定量，在工业利用上非常有利。此外即使使用切断特异性低、切断效率高的蛋白酶而没有完全分解为αFVH，也因为该阿马多里酶(CFP-T7-H35)不仅与αFV和αFVH反应，而且与α－果糖基肽(αF3P～αF16P)也反应，因此能够精度良好地进行HbA1c定量。此时，也能够减少蛋白酶的使用量，由此能够避免蛋白酶与其他蛋白质试剂的不希望的反应。
(阿马多里酶活性的测定方法)
作为阿马多里酶的活性的测定方法，能够使用各种方法，作为一例，以下对本发明使用的阿马多里酶活性的测定方法进行说明。
作为本发明的阿马多里酶的酶活性的测定方法，可举出测定通过酶的反应生成的过氧化氢量的方法、测定通过酶反应消耗的氧量的方法等为主的测定方法。以下，作为一例，对测定过氧化氢量的方法进行说明。
本发明的阿马多里酶的活性测定中，除非另有规定，使用αFV、或αFVH、或αF3P、或αF4P、或αF5P、或αF6P、或αF8P或αF16P作为底物。应予说明，酶效价是将αFV、或αFVH、或αF3P、或αF4P、或αF5P、或αF6P、或αF8P或αF16P作为底物测定时将1分钟内生成1μmol的过氧化氢的酶量定义为1U。αF7P、αF9P～αF15P、αF17P～αF32P也同样能够用于活性测定，其酶量(U)也同样进行定义。
此外，相对活性(U/mg)是每1mg酶的酶效价(U)。
αFV、αFVH等糖基化肽，例如能够使用基于阪上等的方法合成、精制而成的糖基化肽(参照日本特开2001－95598号公报)。此外，能够使用作为合成底物被提供的αF3P、αF4P、αF5P、αF6P、αF8P和αF16P(全部为肽研究所制造)。αF7P、αF9P～αF15P、αF17P～αF32P也同样通过获得合成底物来制备。
A：试剂的制备
(阿马多里酶活性的测定用试剂的制备例)
(试剂1)：含有5U/ml过氧化酶、0.49mM4－氨基安替比林的0.1M磷酸缓冲液pH6.5
将5.0kU的过氧化酶(KIKKOMAN公司制)、100mg的4－氨基安替比林(和光纯药工业公司制)溶解于0.1M的磷酸钾缓冲液(pH6.5)，定容为1000ml。
(试剂2)：15mMTOOS溶液
将500mg的TOOS(N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-间甲基苯胺钠，同仁化学研究所制)溶解于离子交换水，定容为100ml。
(试剂3)：底物溶液(30mM；终浓度1mM)
将αFV(KIKKOMAN公司制)83.8mg、或αFVH(KIKKOMAN公司制)125mg、或αF3P(肽研究所制)159mg、或αF4P(肽研究所制)189mg、或αF5P(肽研究所制218mg、或αF6P(肽研究所制)257mg、或αF8P(肽研究所制)334mg、或αF16P(肽研究所制)570mg溶解于离子交换水，定容为10ml。αF7P、αF9P～αF15P、αF17P～αF32P也同样可通过获得合成底物进行制备而包含于试剂3。
B：活性测定方法
(阿马多里酶活性的测定方法的例子)
将2.7ml的试剂1、100μl的试剂2和100μl的酶液混和，37℃下预加温5分钟。然后，添加100μl试剂3充分混合后，通过分光光度计(U－3010A，日立Technologies公司制)，观测555nm的吸光度的经时变化，测定555nm的吸光度的每1分钟的变化量(ΔAs)。应予说明，对照液，除代替100μl试剂3而添加100μl离子交换水以外与上述同样进行，测定555nm的吸光度每1分钟的变化量(ΔA0)。将37℃下每1分钟生成的过氧化氢的微摩尔数作为酶液中的活性单位(U)，按照下述式计算。
活性(U/ml)＝{(ΔAs－ΔA0)×3.0×df}÷(39.2×0.5×0.1)
ΔAs：反应液的每1分钟的吸光度变化
ΔA0：对照液的每1分钟的吸光度变化
39.2：通过反应生成的醌亚胺色素的毫摩尔吸光系数(mM-1·cm-1)
0.5：由1mol的过氧化氢生成的醌亚胺色素的mol数
df：稀释系数
(含有α－果糖基低聚肽的测定用试样的制备)
在一实施方式中，本发明的测定方法中，使阿马多里酶(α－果糖基肽氧化酶)与含有来自糖化蛋白质的α－果糖基低聚肽的试样作用，测定该作用所致的生成物或消耗物。以HbA1c等糖化蛋白质的测定为目的，作为从测定对象的糖化蛋白质切出α－果糖基低聚肽的合适的方法，可举出使用蛋白酶、肽酶的消化。作为蛋白酶或肽酶，只要是能够用于临床检查，从HbA1c的β链(146氨基酸残基，序列号193)有效切出至少1种以上的α－果糖基低聚肽(αFV～αF145P)的酶即可，可以使用任意的蛋白酶。作为能够从HbA1c的β链切出至少1种以上的α－果糖基低聚肽(αFVH～αF145P)的蛋白酶的例子，可举出末端蛋白酶Glu－C、V8蛋白酶、蛋白酶K、蛋白酶P、链霉蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、羧基肽酶、糜蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶、菠萝蛋白酶、氨基肽酶等蛋白酶或肽酶等，日本特开2005-110657的表1记载的各种蛋白酶，例如来自曲霉的IP酶(KIKKOMAN)、AO蛋白酶(KIKKOMAN)、肽酶(KIKKOMAN)、蛋白酶A5(协和化成)、Umamizyme(天野)、蛋白酶A(天野)、蛋白酶M(天野)、蛋白酶P(天野)、SumizymeMP(新日本化学工业)、SumizymeLP-20(新日本化学工业)、蛋白酶6(Fluka)；来自根霉属菌的肽酶R(天野)；来自芽孢杆菌的中性蛋白酶(Roche)、蛋白酶N(Fluka)、蛋白酶TypeVII(Sigma)、蛋白酶BacterialSubtilisin(Fluka)、蛋白酶N(天野)、蛋白酶S(天野)、蛋白酶TypeX(Sigma)、嗜热菌蛋白酶(大和化成)、链霉蛋白酶E(科研化学)、中性蛋白酶(东洋纺)；来自链霉菌属的链霉蛋白酶(Boehringer)、蛋白酶TypeXIV(Sigma)、碱性蛋白酶(东洋纺)；来自腐生真菌的蛋白酶K(Roche)、蛋白酶K(和光)；来自木瓜的木瓜蛋白酶(Roche)、木瓜蛋白酶(和光)、木瓜蛋白酶(Sigma)、木瓜蛋白酶W40(天野)、木瓜蛋白酶(Asahi)；来自无花果的无花果蛋白酶(Sigma)；来自猪胰脏的胰酶(和光)；和来自牛脾脏的组织蛋白酶B(Sigma)等，但不局限于这些。此外可以将2个以上的适当蛋白酶组合。
试样的蛋白酶处理或肽酶处理的条件只要是使用的蛋白酶与测定对象的糖化蛋白质作用，短时间内效率良好地游离α－糖化六肽的条件即可，可以是任意的条件。使用的蛋白酶的量，根据试样中含有的HbA1c的含量或处理条件等适当选择，例如，作为一例，将蛋白酶以终浓度变为0.1～50U/mL、优选为1～10U/mL的方式添加。进一步根据需要可以适当添加其他蛋白酶。利用蛋白酶处理时的pH，可以不调整，也可以以成为适合于使用的蛋白酶的作用的pH方式，例如利用适当的pH调节剂例如盐酸、乙酸、硫酸、氢氧化钠、氢氧化钾等而调整为pH2～9、优选为pH3～8。处理温度，例如可以在20～50℃下进行，根据使用的酶，可以在更高温度区域45～70℃下进行。此时的处理时间是对分解HbA1c充分的时间即可，例如，在5秒钟～180分钟，优选为1～60分钟，进一步优选为1～10分钟能够进行。将得到的处理液直接或根据需要适当进行加热、离心分离、浓缩、稀释等后，作为含有α－果糖基低聚肽的试样提供于糖化六肽氧化酶的反应。
(游离的α－果糖基肽的测定)
使本发明的测定方法使用的阿马多里酶(α－果糖基肽氧化酶)与上述含有α－果糖基肽的试样作用。α－果糖基低聚肽的切出和α－果糖基肽氧化酶的作用的时期可以是连续的，也可以是同时，也可以结束切出后使α－果糖基肽氧化酶作用。α－果糖基肽氧化酶对α－果糖基肽的作用时间，例如可设定为5秒以上，10秒以上，或20秒以上，小于180分钟或小于150分钟分，例如0.5～120分钟，优选为0.5～60分钟，更优选为1～30分钟。作用时间过短时，无法充分测定试样中的糖化六肽，不能进行良好的测定。另一方面，作用时间过长时，除了测定时间延长，测定处理的效率差的问题之外，试样和测定试剂长时间暴露在测定条件下，最终产生导致试样中的底物或试剂中的成分分解、变性的问题。进一步，特别是在微量测定系统中，长时间所致的干燥所引起的试样容量的减少所导致的浓度变化等也成为误差的原因。通过将α－果糖基肽氧化酶作用时间设定为0.5～60分钟，更优选为1～30分钟，进一步优选为1～10分钟，能够迅速且良好地测定α－果糖基肽。作用温度，根据使用的酶的最适温度而设定，例如，为20～45℃，能够适当选择通常的酶反应所使用的温度。
本发明使用的阿马多里酶(α－果糖基肽氧化酶)的合适的使用量取决于试样溶液中含有的α－果糖基肽的量，例如，可以以终浓度变为0.1～50U/mL、优选为0.2～10U/mL的方式添加。作用时的pH，优选以考虑到α－果糖基肽氧化酶的最适pH，成为适合于反应的pH的方式使用缓冲剂调整，但只要是能够作用的pH即可不局限于此。例如，pH3～11，特别优选为pH5～9，例如为pH6～8。
本发明的测定方法中，为了出于酶、试剂的稳定化、反应性提高等目的而调节和/或维持pH，根据需要优选适当使用各种缓冲剂。作为能够使用的缓冲剂，例如，可举出N－[三(羟基甲基)甲基]甘氨酸、磷酸盐、乙酸盐、碳酸盐、三(羟基甲基)－氨基甲烷、硼酸盐、柠檬酸盐、二甲基谷氨酸盐、N-三(羟甲基)甲基甘氨酸、HEPES、MES、Bis－Tris、ADA、PIPES、ACES、MOPSO、BES、MOPS、TES、DIPSO、TAPSO、POPSO、HEPPSO、EPPS、Tricine、Bicine、TAPS、邻苯二甲酸、酒石酸等。进一步根据需要，作为溶解辅助剂、稳定化剂、反应性提高剂等，可以适当添加表面活性剂(正辛基－β－D－葡萄糖苷、正辛基－β－D－硫代葡萄糖苷、正十二烷基－β－D－麦芽糖苷、正十四烷基－β－D－麦芽糖苷、正辛基－β－D－麦芽糖苷、1－十二烷基吡啶盐、十六烷基三甲基季铵盐、十四烷基三甲基季铵盐、十二烷基三甲基季铵盐、TritonX－100、BRIJ35、吐温80、胆酸盐、正庚基－β－D－硫代葡萄糖苷、3－氧杂十三烷基－α－D－甘露糖苷、正壬基－β－D－硫代麦芽糖苷、正癸基－β－D－麦芽糖苷、正十一烷基－β－D－麦芽糖苷、海藻糖C8、海藻糖C10、海藻糖C12、海藻糖C14、海藻糖C16、BIGCHAP、deoxy－BIGCHAP、MEGA－8、MEGA－9、MEGA－10、十六烷基吡啶盐、十八烷基三甲基季铵盐、癸基三甲基季铵盐、壬基三甲基季铵盐、辛基三甲基季铵盐、己基三甲基季铵盐、十二烷基硫酸钠等)、还原剂(二硫苏糖醇、巯基乙醇、L－半胱氨酸等)、牛血清白蛋白、糖类(甘油、乳糖、蔗糖等)等。
在一实施方式中本发明提供，通过测定阿马多里酶(α－果糖基肽氧化酶)的作用所致的生成物或消耗物来测定α－果糖基肽(αF1P～αF32P，例如αF1P～αF16P)的方法，作为容易测定的生成物，作为优选成为测定对象的物质，可举出过氧化氢。通过α－果糖基肽氧化酶的作用生成的过氧化氢，可以通过显色底物等检测，作为本发明使用的显色底物，除了4－氨基安替比林之外，例如，可举出ADOS(N－乙基－N－(2－羟基－3－磺丙基)－间甲氧基苯胺)、ALOS(N－乙基－N－(2－羟基－3－磺丙基)苯胺)、TOOS(N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-间甲基苯胺钠)、DA－67(10－(羧甲基氨基羰基)－3、7－双(二甲基氨基)－吩噻嗪)、DA－64(N－(羧甲基氨基羰基)－4、4’－双(二甲基氨基)－二苯胺)等。ADOS、ALOS、TOOS与4－氨基安替比林缩合时显色。DA－64、DA－67不需要4－氨基安替比林，仅仅单独配合就会显色。在任何情形中，显色反应被过氧化酶催化。过氧化氢的测定，通常优选与生成过氧化氢的工序同时进行，优选与α－果糖基肽氧化酶作用时同时进行。此外，作为测定的消耗物，可举出溶解氧，使用溶解氧计等能够测定反应液中的溶解氧量。
本发明中，能够得到添加有上述阿马多里酶(α－果糖基肽氧化酶)和过氧化氢测定用试剂、根据需要向其加入的缓冲剂等的α－果糖基肽或HbA1c测定用试剂。该试剂中，能够适当选择各种已知的成分例如表面活性剂、盐类、缓冲剂、pH调节剂、防腐剂等进行添加。上述本发明的测定用试剂，可以以各试剂在不同的容器中包含的形式制备，例如也能够以液状品和液状品的冷冻物或冷冻干燥品的形式提供。此外，这些测定用试剂，可以在干燥物或溶解的状态下使用，也可以使其含浸于薄膜上的载体例如板含浸性纸等而使用。此外，测定用试剂所使用的酶类也能够通过常规方法使其固定化而反复使用。本发明的测定用试剂，可构成组合有用于从糖化蛋白质切出α－果糖基肽的蛋白酶的试剂盒的一部分。
本发明的测定用试剂的使用规范、使用条件，可以根据其含有成分等选择最适的使用规范、使用条件，例如，能够以使测定在20～45℃下进行的方式设定。测定需要的时间也能够根据各种测定条件适当选择，例如，0.5～60分钟，优选为0.5～30分钟，进一步优选为1～10分钟。例如，通过分光光度计测定上述测定试剂的显色程度(吸光度变化量)，与基准的吸光度进行比较，能够测定试样中含有的糖基化肽或糖化蛋白质。测定中，也能够使用通常的自动分析装置。
(HbA1c的定量)
本发明的HbA1c测定方法可以是定性的，但也能够设定为定量的测定方法。此处HbA1c的定量的测定方法是指确定试样中的HbA1c的浓度的方法。即，本发明的一实施方式提供试样中的HbA1c的定量法，该方法包括使用阿马多里酶突变体。该定量法包括：使含有来自HbA1c的α－果糖基肽的试样与本发明的阿马多里酶接触的工序，和测定该阿马多里酶与来自HbA1c的α－果糖基肽的作用所致的生成物或消耗物的工序。此处关于该定量法使用的接触包含为了本发明的阿马多里酶能够催化α－果糖基肽的氧化反应而该阿马多里酶与试样物理性存在于一起的所有方式，例如不仅包括在溶液中混合游离的酶和α－果糖基肽的情形，也包括向担载于固相载体的本发明的阿马多里酶添加或滴加含有α－果糖基肽的溶液试样的方式。该定量法还可以包括利用适当的蛋白酶处理HbA1c而制造α－果糖基肽的工序。蛋白酶可以是切断特异性高的蛋白酶，此外，也可以是切断特异性低的蛋白酶。
本发明的HbA1c测定方法使用的试样可以是有可能含有糖化血红蛋白的所有的生物学试样，例如可以是来自血液、体液、淋巴液等的试样。试样可适当进行加工处理。
将使用的阿马多里酶突变体的酶量和反应时间(作用时间)设置为一定而改变HbA1c的量时，通过研究伴随HbA1c的量减少，被检测的发光底物的吸光度也成比例减少的HbA1c浓度范围，能够确定使用该阿马多里酶时的能够检测的最低HbA1c浓度。该浓度在本说明书中有时称为检测限浓度。本发明的HbA1c定量法中，优选按照HbA1c的检测限比测定试样中的αF6P等α－果糖基肽浓度或血中糖化血红蛋白浓度低的方式设定酶量和反应时间。
本发明的HbA1c定量的测定中，可预先根据含有浓度已知的HbA1c或αF6P等α－果糖基肽的对照的吸光度等测定值通过进行最小二乘法等回归分析而制作校正曲线。通过相对于制作的校正曲线将HbA1c或αF6P等α－果糖基肽浓度未知的试样的测定值进行绘图，能够将该试样中的HbA1c或αF6P等α－果糖基肽浓度进行定量。
本发明人等发现来自锥毛壳属的阿马多里酶突变体，例如本发明的阿马多里酶25(CFP-T7-H35)不仅与αFV和αFVH，而且也会与αF3P、αF4P、αF5P、αF6P、αF8P和αF16P反应。基于这样的见解，认为对αF6P具有良好活性的其他本发明的阿马多里酶突变体同样不仅与αFV和αFVH，而且与各种链长的α－果糖基肽(αFV～αF16P)也具有活性。利用对这样的α－果糖基肽(αFV～αF16P)具有活性的阿马多里酶，切断特异性低的蛋白酶也能够用于HbA1c定量测定。此外，本领域技术人员能够适当设定用于这样的定量测定的酶量(酶浓度)、反应时间等条件。
目前为止为了HbA1c定量测定，开发了首先利用蛋白酶将HbA1c切断，生成αFVH，接下来使用与αFVH反应的阿马多里酶的方法(专利文献1～7)。但是由于利用蛋白酶的水解反应的反应速度依赖于底物浓度，因此HbA1c的大部分被水解时，蛋白酶的反应速度降低。因此，在以往的HbA1c的测定中存在未被水解为αFVH的糖基化肽也残存的可能性。由于本发明的阿马多里酶对αF6P等α－果糖基肽具有活性，因此使用该酶时不仅能够定量来自HbA1cβ链的αFV和αFVH，而且同时能够定量未被水解为αFVH等而残存的各种链长的α－果糖基肽(αF3P～αF32P，例如αF3P～αF16P)，并能够减少蛋白酶处方量，能够使利用阿马多里酶的HbA1c测定高灵敏度化。
在一实施方式中，本发明的HbA1c定量测定中，被测定的试样中的来自HbA1c的α－果糖基肽的主成分是αFVH，但是由于没有利用蛋白酶完全分解为αFVH，所以αF3P～αF32P，例如αF3P～αF16P等各种链长的α－果糖基肽也可以少量存在。由于本发明的阿马多里酶也与这类各种链长的α－果糖基肽作用，因此，能够进行HbA1c定量测定。此处，主成分是αFVH是指在各种链长的α－果糖基肽中，αFVH占50％以上，例如60％以上，70％以上，80％以上或90％以上。
在另一实施方式中，本发明的HbA1c定量测定中，被测定的试样中的α－果糖基肽的主成分是αF3P～αF32P，例如αF3P～αF16P。即使是这类试样，在切断HbA1c的各种蛋白酶中，通过将从HbA1c的β链N末端特异生成的αF3P、αF4P、αF5P、αF8P、或αF16P的酶与本发明的阿马多里酶组合能够定量HbA1c。这是因为本发明的阿马多里酶也与α－果糖基肽(αF3P～αF32P)作用。因此，本发明扩大了能够用于HbA1c定量的试样的范围，并扩大了能够用于HbA1c定量的蛋白酶的范围。
(筛选方法)
在一实施方式中，可使用上述测定方法，确定某一阿马多里酶是否与α－果糖基肽(例如αF1P～αF32P，进一步为αF1P～αF64P、αF1P～αF128P、αF1P～αF145P等)反应。作为成为候选的阿马多里酶，可举出各种天然阿马多里酶或它们的修饰体，例如具有αFV活性的阿马多里酶、具有αFVH活性的阿马多里酶、具有αF6P活性的阿马多里酶、对α－果糖基肽具有活性的阿马多里酶或它们的修饰体，例如上述(阿马多里酶的修饰体)记载的物质。筛选可使用96孔板等将多数候选一同处理以高通量迅速进行。能够进行候选阿马多里酶作用于适当链长的α－果糖基肽(例如αF1P～αF32P)的筛选。此外对于候选阿马多里酶，可以首先进行一次选拔是否具有αFV活性、αFVH活性、αF6P活性等，接下来对于具有该活性的酶，可以二次选拔是否与αF8P～αF32P作用。筛选可以对由生物试样制备的粗酶提取液或其精制物进行。此外，通过惯用方法取得具有对α－果糖基肽的活性的阿马多里酶的基因，使用基因重组技术制造酶，可以将其用于选拔。惯用方法可举出精制对α－果糖基肽具有活性的阿马多里酶，确定其氨基酸序列，以该序列信息为基础设计PCR用引物来取得基因的方法，以公知的阿马多里酶的序列信息为基础设计PCR用引物从某一生物的基因组文库、cDNA文库取得基因的方法，但不局限于此。也请参照上述(编码阿马多里酶的基因的取得)。可对取得的阿马多里酶基因使用惯用的基因重组技术导入适当的突变，研究得到的突变体是否与目的α－果糖基肽(例如αF1P～αF32P，进一步为αF1P～αF64P、αF1P～αF128P、αF1P～αF145P等)作用。此外，对取得的阿马多里酶基因使用基因重组技术导入适当的突变来制作对链长长的α－果糖基肽例如αF6P具有活性的修饰体，接下来也能研究其是否作用于更长的链长的α－果糖基肽(例如αF1P～αF32P，进一步为αF1P～αF64P、αF3P～αF128P、αF3P～αF145P等)。在制作这样的修饰体时，可以参考将与序列号1的氨基酸序列的(a)62位对应的位置的氨基酸取代为丙氨酸、天冬酰胺或天冬氨酸，(b)将与63位对应的位置的氨基酸取代为组氨酸或丙氨酸，(c)将与102位对应的位置的氨基酸取代为赖氨酸，(d)将与106位对应的位置的氨基酸取代为丙氨酸、赖氨酸或精氨酸，(e)将与110位对应的位置的氨基酸取代为亮氨酸或酪氨酸，(f)将与113位对应的位置的氨基酸取代为赖氨酸或精氨酸，(g)将与355位对应的位置的氨基酸取代为丝氨酸和/或(h)将与419位对应的位置的氨基酸取代为赖氨酸，但是导入的突变不局限于此，也能够使用在此基础上进一步导入突变或导入随机突变的方法。重复多次突变导入和活性的确认，也能够取得对α－果糖基肽(例如αF1P～αF32P，进一步为αF1P～αF64P、αF1P～αF128P、αF1P～αF145P等)的活性更高的突变体。也请参照上述(阿马多里酶基因的突变处理)。
本发明的HbA1c测定用试剂盒中，除了上述α－果糖基肽测定用试剂外，还可以含有切出用蛋白酶或肽酶，进一步根据需要可以含有其他公知的稳定化剂、夹杂物质消除系统等。可以将以利用酶法测定HbA1c作为目的的各种试剂或试剂盒所使用的技术适当用于本发明的HbA1c测定用试剂盒。
以下，通过实施例，对本发明做更具体说明。但是，本发明的技术范围，不受到这些例子的任何限制。
[实施例1]
(1)重组质粒pKK223－3－CFP－T7DNA的制备
将具有来自锥毛壳属的阿马多里酶基因(序列号2)的重组质粒的大肠杆菌JM109(pKK223－3－CFP－T7)株(参照国际公开第2007/125779号)接种于3ml的LB－amp培养基[1％(w/v)细菌用胰蛋白胨、0.5％(w/v)蛋白胨、0.5％(w/v)NaCl、50μg/ml氨苄西林]，37℃下振荡培养16小时，得到培养物。
将该培养物通过以10000×g离心分离1分钟收集细菌得到菌体。从该菌体，使用GenElutePlasmidMiniprepKit(Sigma-Aldrich公司制)提取并精制重组质粒pKK223－3－CFP－T7，得到2.5μg重组质粒pKK223－3－CFP－T7DNA。
(2)重组质粒pKK223－3－CFP－T7DNA的部位特异性修饰操作
将得到的重组质粒pKK223－3－CFP－T7DNA作为模板，使用序列号3、4的合成寡核苷酸、KOD－Plus－(东洋纺织公司制)在以下条件下进行PCR反应。
即，添加5μl的10×KOD－Plus－缓冲液、5μl的以dNTP成为各2mM的方式制备的dNTPs混合溶液、2μl的25mM的MgSO4溶液、50ng的成为模板的pKK223－3－CFP－T7DNA、各自15pmol的上述合成寡核苷酸、1Unit的KOD－Plus－，利用灭菌水将全量设定为50μl。使用热循环仪(Eppendorf公司制)将制备的反应液在94℃孵育2分钟，接下来，重复30次“94℃，15秒”－“50℃，30秒”－“68℃，6分”的循环。
将反应液的一部分利用1.0％琼脂糖凝胶进行电泳，确认约6000bp的DNA被特异性扩增。将这样得到的DNA利用限制性内切酶DpnI(NEWENGLANDBioLabs公司制)处理，将残存的模板DNA切断后，转化大肠杆菌JM109，在LB－amp琼脂培养基中展开。将生长的集落接种于LB－amp培养基进行振荡培养，利用与上述(1)同样的方法分离质粒DNA。使用多毛细管DNA解析系统AppliedBiosystems3130xl基因分析仪(LifeTechnologies公司制)确定该质粒中的编码阿马多里酶的DNA碱基序列，得到编码序列号1记载的氨基酸序列的62位的精氨酸被取代为丙氨酸的修饰型阿马多里酶的重组质粒(pKK223－3－CFP－T7－H1)。
(3)各种修饰型阿马多里酶的生产
将转导有pKK223－3－CFP－T7－H1的大肠杆菌JM109(pKK223－3－CFP－T7－H1)株在以终浓度为0.1mM的方式添加IPTG的LB－amp培养基3ml中在25℃培养16小时。将得到的各培养菌体利用10mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)清洗后，在相同的缓冲液中悬浮进行超声破碎处理，以20000×g离心分离10分钟，制备含有修饰型阿马多里酶(CFP－T7－H1)的粗酶液0.6ml。
(4)αF6P/αFVH和αF6P/αFV的测定
使用上述含有CFP－T7－H1的酶液，通过上述B：活性测定方法记载的方法，测定对αFV、αFVH、αF6P的氧化活性。此外，为了比较，使用含有由大肠杆菌JM109(pKK223－3－CFP－T7)株生产的CFP－T7的酶液进行同样的测定。对于各个阿马多里酶，将αFVH氧化活性作为100时的、对αFV、αFVH和αF6P的氧化活性、以及αF6P/αFVH和αF6P/αFV示于表1。
表1
如表1所示，CFP－T7具有αFV氧化活性和αFVH氧化活性，但不具有αF6P氧化活性。由此可知，CFP－T7对于α－果糖基二肽的特异性非常高，不与α－果糖基六肽作用。
另一方面，突变体CFP－T7－H1，除了αFV、αFVH氧化活性之外，也具有αF6P氧化活性。
即，表明通过对CFP－T7导入R62A的氨基酸取代，能够对CFP－T7新赋予αF6P氧化活性，对αF6P的反应性(底物特异性)提高。
接下来，将重组质粒pKK223－3－CFP－T7－H1DNA作为模板，使用序列号5～8的寡核苷酸和KOD－Plus－，在与上述(2)同样的条件下进行PCR反应、大肠杆菌JM109的转化和生长集落保持的质粒DNA中的编码阿马多里酶的DNA的碱基序列确定。最终得到编码序列号1记载的氨基酸序列的62位的精氨酸被取代为丙氨酸且110位的谷氨酰胺被取代为亮氨酸或苯丙氨酸或酪氨酸的修饰型阿马多里酶的重组质粒(pKK223－3－CFP－T7－H2、pKK223－3－CFP－T7－H3、pKK223－3－CFP－T7－H4)。
将转导有pKK223－3－CFP－T7－H2或pKK223－3－CFP－T7－H3或pKK223－3－CFP－T7－H4的大肠杆菌JM109株利用上述(3)记载的方法培养，制备含有各种修饰型阿马多里酶(CFP－T7－H2、CFP－T7－H3、CFP－T7－H4)的粗酶液0.6ml。
使用这样制备的粗酶液，通过上述B.活性测定方法记载的方法，测定对αFV、αFVH、αF6P的氧化活性。此外，为了比较，使用含有由大肠杆菌JM109(pKK223－3－CFP－T7－H1)株生产的CFP－T7－H1的酶液进行同样的测定。对于各个阿马多里酶，将αFVH氧化活性作为100时的、对αFV、αFVH和αF6P的氧化活性、以及αF6P/αFVH和αF6P/αFV示于表2。
表2
即，表明CFP－T7－H2和CFP－T7－H4与CFP－T7－H1相比，对αF6P的反应性(底物特异性)进一步增大。
接下来，将重组质粒pKK223－3－CFP－T7－H2DNA作为模板，使用序列号4、序列号9～12的寡核苷酸和KOD－Plus－，在与上述(2)同样的条件下进行PCR反应、大肠杆菌JM109的转化和生长集落保持的质粒DNA中的编码阿马多里酶的DNA的碱基序列确定。最终得到编码序列号1记载的氨基酸序列的110位的谷氨酰胺被取代为亮氨酸且62位的精氨酸被取代为天冬酰胺或天冬氨酸或谷氨酰胺或谷氨酸的修饰型阿马多里酶的重组质粒(pKK223－3－CFP－T7－H2－62N、pKK223－3－CFP－T7－H6、pKK223－3－CFP－T7－H2－62Q、pKK223－3－CFP－T7－H2－62E)。
将转导有pKK223－3－CFP－T7－H2－62N或pKK223－3－CFP－T7－H6或pKK223－3－CFP－T7－H2－62Q或pKK223－3－CFP－T7－H2－62E的大肠杆菌JM109株利用上述(3)记载的方法进行培养，制备含有各种修饰型阿马多里酶(CFP－T7－H2－62N、CFP－T7－H6、CFP－T7－H2－62Q、CFP－T7－H2－62E)的粗酶液0.6ml。
使用这样制备的粗酶液，通过上述B.活性测定方法记载的方法测定对αF6P的氧化活性。此外，为了比较，使用含有由大肠杆菌JM109(pKK223－3－CFP－T7－H2)株生产的CFP－T7－H2的酶液进行同样的测定。将含有CFP－T7－H2的粗酶液的αF6P氧化活性作为100时的、含有各个阿马多里酶的粗酶液的αF6P氧化活性比率如表3所示。
表3
即，表明CFP－T7－H2－62N和CFP－T7－H6与CFP－T7－H2相比αF6P氧化活性提高。
使用含有CFP－T7－H2或CFP－T7－H6的粗酶液，通过上述B.活性测定方法记载的方法测定对αFV、αFVH、αF6P的氧化活性。对于各个阿马多里酶，将αFVH氧化活性作为100时的、对各底物的氧化活性以及αF6P/αFVH和αF6P/FV如表4所示。
表4
即，表明CFP－T7－H6与CFP－T7－H2相比αF6P氧化活性大幅提高，与αF6P的反应性(底物特异性)提高。
接下来，将重组质粒pKK223－3－CFP－T7－H6DNA作为模板，使用序列号13～24的寡核苷酸和KOD－Plus－，在与上述(2)同样的条件下进行PCR反应、大肠杆菌JM109的转化和生长集落保持的质粒DNA中的编码阿马多里酶的DNA的碱基序列确定。最终，得到编码序列号1记载的氨基酸序列的62位的精氨酸被取代为天冬氨酸且110位的谷氨酰胺被取代为亮氨酸、进一步64位的精氨酸被取代为丙氨酸或谷氨酸或组氨酸的修饰型阿马多里酶的重组质粒(pKK223－3－CFP－T7－H7、pKK223－3－CFP－T7－H8、pKK223－3－CFP－T7－H9)，以及编码序列号1记载的氨基酸序列的62位的精氨酸被取代为天冬氨酸且110位的谷氨酰胺被取代为亮氨酸、进一步106位的天冬氨酸被取代为丙氨酸或赖氨酸或精氨酸的修饰型阿马多里酶的重组质粒(pKK223－3－CFP－T7－H10、pKK223－3－CFP－T7－H11、pKK223－3－CFP－T7－H12)，以及编码序列号1记载的氨基酸序列的62位的精氨酸被取代为天冬氨酸且110位的谷氨酰胺被取代为亮氨酸、进一步113位的丙氨酸被取代为赖氨酸或精氨酸的修饰型阿马多里酶的重组质粒(pKK223－3－CFP－T7－H13、pKK223－3－CFP－T7－H14)。
将转导有pKK223－3－CFP－T7－H7或pKK223－3－CFP－T7－H8或pKK223－3－CFP－T7－H9或pKK223－3－CFP－T7－H10或pKK223－3－CFP－T7－H11或pKK223－3－CFP－T7－H12或pKK223－3－CFP－T7－H13或pKK223－3－CFP－T7－H14的大肠杆菌JM109株，利用上述(3)记载的方法培养，制备含有各种修饰型阿马多里酶(CFP－T7－H7、CFP－T7－H8、CFP－T7－H9、CFP－T7－H10、CFP－T7－H11、CFP－T7－H12、CFP－T7－H13、CFP－T7－H14)的粗酶液0.6ml。
使用这样制备的粗酶液，通过上述B.活性测定方法记载的方法测定对αF6P的氧化活性。此外，为了比较，使用含有由大肠杆菌JM109(pKK223－3－CFP－T7－H6)株生产的CFP－T7－H6的酶液进行同样的测定。将含有CFP－T7－H6的粗酶液的αF6P氧化活性作为100时的、含有各个阿马多里酶的粗酶液的αF6P氧化活性如表5所示。
表5
即，CFP－T7－H10、CFP－T7－H11、CFP－T7－H12、CFP－T7－H13和CFP－T7－H14与CFP－T7－H6相比αF6P氧化活性比率全部大幅提高，一部分中飞跃性提高。
使用含有CFP－T7－H6、CFP－T7－H11、CFP－T7－H12、CFP－T7－H13、CFP－T7－H14的粗酶液，通过上述B.活性测定方法记载的方法测定对αFV、αFVH、αF6P的氧化活性。对于各个阿马多里酶，将αFVH氧化活性作为100时的、对各底物的氧化活性以及αF6P/αFVH和αF6P/FV如表6所示。
表6
即，如表6所示，表明CFP－T7－H11、CFP－T7－H12、CFP－T7－H13和CFP－T7－H14与CFP－T7－H6相比与αF6P的反应性(底物特异性)大幅提高。
接下来，将重组质粒pKK223－3－CFP－T7－H11DNA作为模板，使用序列号21～24的寡核苷酸和KOD－Plus－，在与上述(2)同样的条件下进行PCR反应、大肠杆菌JM109的转化和生长集落保持的质粒DNA中的编码阿马多里酶的DNA的碱基序列确定。最终，得到编码序列号1记载的氨基酸序列的62位的精氨酸被取代为天冬氨酸且106位的天冬氨酸被取代为赖氨酸且110位的谷氨酰胺被取代为亮氨酸，进一步113位的丙氨酸被取代为赖氨酸或精氨酸的修饰型阿马多里酶的重组质粒(pKK223－3－CFP－T7－H20、pKK223－3－CFP－T7－H21)。
将转导有pKK223－3－CFP－T7－H20或pKK223－3－CFP－T7－H21的大肠杆菌JM109株利用上述(3)记载的方法培养，制备含有各种修饰型阿马多里酶(CFP－T7－H20、CFP－T7－H21)的粗酶液0.6ml。
使用含有CFP－T7－H11、CFP－T7－H20、CFP－T7－H21的粗酶液，通过上述B.活性测定方法记载的方法测定对αFV、αFVH、αF6P的氧化活性。对于各个阿马多里酶，将αFVH氧化活性作为100时的、对各底物的氧化活性以及αF6P/αFVH和αF6P/FV如表7所示。
表7
即，表明CFP－T7－H20和CFP－T7－H21与CFP－T7－H11相比对αF6P的反应性(底物特异性)提高。
接下来，将重组质粒pKK223－3－CFP－T7－H20DNA作为模板，使用序列号25～29的寡核苷酸和KOD－Plus－，在与上述(2)同样的条件下进行PCR反应、大肠杆菌JM109的转化和生长集落保持的质粒DNA中的编码阿马多里酶的DNA的碱基序列确定。最终，得到编码序列号1记载的氨基酸序列的62位的精氨酸被取代为天冬氨酸且106位的天冬氨酸被取代为赖氨酸且110位的谷氨酰胺被取代为亮氨酸且113位的丙氨酸被取代为赖氨酸，进一步63位的亮氨酸被取代为丙氨酸或天冬氨酸或组氨酸或赖氨酸的修饰型阿马多里酶的重组质粒(pKK223－3－CFP－T7－H24、pKK223－3－CFP－T7－H25、pKK223－3－CFP－T7－H26、pKK223－3－CFP－T7－H27)。
将转导有pKK223－3－CFP－T7－H24或pKK223－3－CFP－T7－H25、或pKK223－3－CFP－T7－H26或pKK223－3－CFP－T7－H27的大肠杆菌JM109株利用上述(3)记载的方法培养，制备含有各种修饰型阿马多里酶(CFP－T7－H24、CFP－T7－H25、CFP－T7－H26、CFP－T7－H27)的粗酶液0.6ml。
使用这样制备的粗酶液，通过上述B.活性测定方法记载的方法测定对αF6P的氧化活性。此外，为了比较，使用含有由大肠杆菌JM109(pKK223－3－CFP－T7－H20)株生产的CFP－T7－H20的酶液进行同样的测定。将含有CFP－T7－H20的粗酶液的αF6P氧化活性作为100时的、含有各个阿马多里酶的粗酶液的αF6P氧化活性如表8所示。
表8
即，如表8所示，可知CFP－T7－H24和CFP－T7－H26与CFP－T7－H20相比αF6P氧化活性提高。
使用含有CFP－T7－H20或CFP－T7－H24或CFP－T7－H26的粗酶液，通过上述B.活性测定方法记载的方法测定对αFV、αFVH、αF6P的氧化活性。对于各个阿马多里酶，将αFVH氧化活性作为100时的、对各底物的氧化活性以及αF6P/αFVH和αF6P/αFV如表9所示。
表9
即，如表9所示，可知CFP－T7－H24和CFP－T7－H26与CFP－T7－H20相比对αF6P的反应性(底物特异性)提高。
接下来，将重组质粒pKK223－3－CFP－T7－H26DNA作为模板，使用序列号30～33的寡核苷酸和KOD－Plus－，在与上述(2)同样的条件下进行PCR反应、大肠杆菌JM109的转化和生长集落保持的质粒DNA中的编码阿马多里酶的DNA的碱基序列确定。最终，得到编码序列号1记载的氨基酸序列的62位的精氨酸被取代为天冬氨酸且63位的亮氨酸被取代为组氨酸且106位的天冬氨酸被取代为赖氨酸且110位的谷氨酰胺被取代为亮氨酸且113位的丙氨酸被取代为赖氨酸，进一步102位的谷氨酸被取代为赖氨酸的修饰型阿马多里酶的重组质粒(pKK223－3－CFP－T7－H28)，以及编码序列号1记载的氨基酸序列的62位的精氨酸被取代为天冬氨酸且63位的亮氨酸被取代为组氨酸且106位的天冬氨酸被取代为赖氨酸且110位的谷氨酰胺被取代为亮氨酸且113位的丙氨酸被取代为赖氨酸，进一步419位的丙氨酸被取代为赖氨酸的修饰型阿马多里酶的重组质粒(pKK223－3－CFP－T7－H29)。
将转导有pKK223－3－CFP－T7－H26或pKK223－3－CFP－T7－H28或pKK223－3－CFP－T7－H29的大肠杆菌JM109株利用上述(3)记载的方法培养，制备含有各种修饰型阿马多里酶(CFP－T7－H26、CFP－T7－H28、CFP－T7－H29)的粗酶液0.6ml。
使用这样制备的粗酶液，通过上述B.活性测定方法记载的方法测定对αF6P的氧化活性。此外，为了比较，使用含有由大肠杆菌JM109(pKK223－3－CFP－T7－H26)株生产的CFP－T7－H26的酶液进行同样的测定。将含有CFP－T7－H26的粗酶液的αF6P氧化活性作为100时的、含有各个阿马多里酶的粗酶液的αF6P氧化活性如表10所示。
表10
即，如表10所示，可知CFP－T7－H28和CFP－T7－H29与CFP－T7－H26相比αF6P氧化活性提高。
使用含有CFP－T7－H26或CFP－T7－H28或CFP－T7－H29的粗酶液，通过上述B.活性测定方法记载的方法测定对αFV、αFVH、αF6P的氧化活性。对于各个阿马多里酶，将αFVH氧化活性作为100时的、对各底物的氧化活性以及αF6P/αFVH和αF6P/αFV如表11所示。
表11
即，如表11所示，可知CFP－T7－H28和CFP－T7－H29与CFP－T7－H26相比对αF6P的反应性(底物特异性)提高。
接下来，将重组质粒pKK223－3－CFP－T7－H28DNA作为模板，使用序列号34～35的寡核苷酸和KOD－Plus－，在与上述(2)同样的条件下进行PCR反应、大肠杆菌JM109的转化和生长集落保持的质粒DNA中的编码阿马多里酶的DNA的碱基序列确定。最终，得到编码序列号1记载的氨基酸序列的62位的精氨酸被取代为天冬氨酸且63位的亮氨酸被取代为组氨酸且102位的谷氨酸被取代为赖氨酸且106位的天冬氨酸被取代为赖氨酸且110位的谷氨酰胺被取代为亮氨酸且113位的丙氨酸被取代为赖氨酸，进一步355位的丙氨酸被取代为丝氨酸的修饰型阿马多里酶的重组质粒(pKK223－3－CFP－T7－H35)。
将转导有pKK223－3－CFP－T7－H35的大肠杆菌JM109株利用上述(3)记载的方法培养，制备含有作为修饰型阿马多里酶的CFP－T7－H35的粗酶液0.6ml。
使用这样制备的粗酶液，通过上述B.活性测定方法记载的方法测定对αF6P的氧化活性。此外，为了比较，使用含有由大肠杆菌JM109(pKK223－3－CFP－T7－H28)株生产的CFP－T7－H20的酶液进行同样的测定。将含有CFP－T7－H26的粗酶液的αF6P氧化活性作为100时的、含有各个阿马多里酶的粗酶液的αF6P氧化活性如表12所示。
表12
即，如表12所示，可知CFP－T7－H35与CFP－T7－H28相比αF6P氧化活性提高。
接下来，将重组质粒pKK223－3－CFP－T7DNA作为模板，使用序列号4、10的寡核苷酸和KOD－Plus－，在与上述(2)同样的条件下进行PCR反应、大肠杆菌JM109的转化和生长集落保持的质粒DNA中的编码阿马多里酶的DNA的碱基序列确定。最终，得到编码序列号1记载的氨基酸序列的62位的精氨酸被取代为天冬氨酸的修饰型阿马多里酶的重组质粒(pKK223－3－CFP－T7－62D)。接下来，制作转导有pKK223－3－CFP－T7－62D的大肠杆菌JM109株。
[实施例2]
(各种阿马多里酶的生产和精制)
(来自锥毛壳属的修饰型阿马多里酶的生产和精制)
将生产来自锥毛壳属的野生型阿马多里酶和如上述得到的修饰型阿马多里酶的大肠杆菌JM109(pKK223－3－CFP－T7)、大肠杆菌JM109(pKK223－3－CFP－T7－62D)、大肠杆菌JM109(pKK223－3－CFP－T7－H20)、和大肠杆菌JM109(pKK223－3－CFP－T7－H21)、和大肠杆菌JM109(pKK223－3－CFP－T7－H35)，在以终浓度为0.1mM的方式添加IPTG的LB－amp培养基120ml中植菌，25℃下培养16小时。将得到的各培养菌体利用10mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)清洗后，在相同缓冲液中将菌体悬浮进行超声破碎处理，以20000×g离心分离10分钟，制备粗酶液24ml。
使制备的粗酶液吸附于利用含有1.35M(NH4)2SO4的10mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)平衡化的12ml的ButylToyopearl650C树脂(TOSOH公司制)，接下来利用120ml相同的缓冲液清洗树脂，接下来利用84ml含有1.05M(NH4)2SO4的10mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)将吸附于树脂的阿马多里酶洗脱回收。
将得到的含有阿马多里酶的粗酶液转移至透析管(Spectra/PorMWCO:12000-14000)，重复三次在10倍量的5mM磷酸钾缓冲液(pH7.5)中进行透析的操作，从含有阿马多里酶的粗酶液完全除去(NH4)2SO4。接下来，向利用10mM磷酸钾缓冲液(pH7.5)平衡化的HiScreenCaptoQImpRes(GEHealthcare公司制)供给含有阿马多里酶的粗酶液，使阿马多里酶与阴离子交换树脂结合。然后，通过使10mM磷酸钾缓冲液(pH7.5)所含有的NaCl浓度从0mM至160mM线性增加，将与树脂结合的蛋白质洗脱，回收具有阿马多里酶活性的部分。得到的具有阿马多里酶活性的部分通过利用SDS－PAGE的分析，确认被精制到不含有其他夹杂蛋白质的纯度，作为CFP－T7、CFP－T7－62D、CFP－T7－H20、CFP－T7－H21和pKK223－3－CFP－T7－H35的精制标准品。
(来自米曲霉(Aspergillusoryzae)RIB40的果糖基氨基酸氧化酶的生产和精制)
序列号36是来自米曲霉RIB40的果糖基氨基酸氧化酶(以后称为FAOAo2)的氨基酸序列，通过将插入有编码序列号36的氨基酸序列的基因(序列号37)的重组质粒(以后称为pUC19－FAOAo2)在大肠杆菌DH5α表达，生产FAOAo2，表明FAOAo2与果糖基六肽作用(参照国际公开第2008/108385号公报)。
将上述具有FAOAo2生产能力的大肠杆菌DH5α(pUC19－FAOAo2)在以终浓度为0.1mM的方式添加IPTG的LB－amp培养基中植菌，25℃下培养16小时。将得到的各培养菌体利用10mMTris－HCl缓冲液(pH8.5)清洗后，在相同的缓冲液中将菌体悬浮进行超声破碎处理，以20000×g离心分离10分钟，制备粗酶液。
使制备的粗酶液吸附于利用10mMTris－HCl缓冲液(pH8.5)平衡化的QSepharoseFastFlow树脂(GEHealthcare公司制)，接下来利用含有50mMNaCl的10mMTris－HCl缓冲液(pH8.5)清洗树脂，接下来利用含有100mMNaCl的10mMTris－HCl缓冲液(pH8.5)将吸附于树脂的FAOAo2洗脱回收。
将得到的FAOAo2粗酶液供给至利用含有150mMNaCl的20mMMES－NaOH缓冲液(pH7.0)平衡化的HiLoad26/600Superdex200柱，利用相同缓冲液将FAOAo2洗脱，回收具有阿马多里酶活性的部分。将得到的部分通过SDS－PAGE进行分析，确认被精制到不含有其他夹杂蛋白质的纯度，作为FAOAo2的精制标准品。
(来自颖枯壳针孢的果糖基肽氧化酶的生产株的制作)
序列号38是来自颖枯壳针孢的果糖基肽氧化酶(以后称为PnFX)的氨基酸序列(参照BiotechnologyandBioengineering,106,358－366,2010)。通过利用作为常规方法的基因片段的PCR进行的全合成而全合成cDNA从而取得编码序列号38的氨基酸序列的基因(序列号39)。此时，在序列号39的5′末端、3′末端分别添加NdeI位点和BamHI位点。此外，确认了由克隆的基因序列预想到的氨基酸序列全长与图1的PnFX的序列一致。
接下来，为了使取得的序列号39的基因在大肠杆菌中表达，进行以下顺序。首先，通过利用NdeI位点和BamHI(TAKARABIO公司制)这2种限制性内切酶处理上述全合成的基因，插入到pET－22b(+)Vector(Novagen公司制)的NdeI－BamHI位点，取得重组质粒pET22b－PnFX，在与上述同样的条件下转化大肠杆菌BL21(DE3)株，得到大肠杆菌BL21(DE3)(pET22b－PnFX)株。
(来自颖枯壳针孢的果糖基肽氧化酶的生产和精制)
将上述得到的具有PnFX生产能力的大肠杆菌BL21(DE3)(pET22b－PnFX)株在以终浓度为0.1mM的方式添加IPTG的LB－amp培养基中植菌，25℃下培养16小时。将得到的各培养菌体利用10mM磷酸钾缓冲液(pH8.0)清洗后，在相同缓冲液中将菌体悬浮进行超声破碎处理，以20000×g离心分离10分钟，制备粗酶液。
制备的PnFX的粗酶液按照上述的非专利文献(BiotechnologyandBioengineering,106,358－366,2010)记载的方法精制。即，利用硫酸铵分离粗酶液，利用10mM磷酸钾缓冲液(pH8.0)进行透析，通过阴离子交换色谱(本实施例中使用QSepharoseFastFlow)精制，通过凝胶过滤色谱(本实施例中使用HiLoad26/600Sueprdex200)精制。将得到的部分通过SDS－PAGE进行分析，确认被精制到不含有其他夹杂蛋白质的纯度，作为PnFX的精制标准品。
使用得到的CFP－T7、CFP－T7－62D、CFP－T7－H20、CFP－T7－H21、CFP－T7－H35、和FAOAo2、和PnFX的精制标准品，测定将αFV、αFVH、αF6P作为底物时的相对活性。结果示于表13。应予说明，相对活性的计算中使用的蛋白质浓度是通过利用了280nm的吸光度的紫外吸收法测定的(参照ProteinSci.4，2411－23，1995)。
表13
精制的CFP－T7如预想的那样没有对αF6P反应。与此相对，CFP－T7－62D、CFP－T7－H20、CFP－T7－H21、CFP－T7－H35对αF6P的相对活性分别为0.018U/mg、0.850U/mg、0.795U/mg、4.27U/mg，在排除来自作为宿主的大肠杆菌的蛋白酶/肽酶的影响的测定方法中，也显示出对αF6P具有充分高的反应性。
此外，作为已报告的对αF6P具有反应性的阿马多里酶的FAOAo2(参照国际公开第2008/108385号)和PnFX(参照国际公开第2011/15326号，该当文献中记载为P.nFPOX)对αF6P的相对活性，分别为0.0022U/mg、0.0091U/mg。按照本说明书记载的顺序制作的来自锥毛壳属的阿马多里酶的修饰体具有这些已报告的对αF6P具有反应性的阿马多里酶的2倍(阿马多里酶26/比较例3)至1940倍多(阿马多里酶25/比较例2)的相对活性。即，按照本说明书记载的顺序能够得到对αF6P具有高的反应性的阿马多里酶。
应予说明，CFP－T7－H20、CFP－T7－H21具有的αF6P/αFVH的值，在使用粗酶液测定的情形和使用精制酶测定的情形之间，没有发现大的背离。
使用得到的CFP－T7、CFP－T7－H35的精制标准品，测定将αFV、αFVH、αF3P、αF4P、αF5P、αF6P、αF8P和αF16P作为底物时的相对活性。结果示于表1。应予说明，相对活性的计算中使用的蛋白质浓度是通过利用了280nm的吸光度的紫外吸收法而测定的(参照ProteinSci.4，2411－23，1995)。
表14
精制的CFP－T7具有氧化αFV、αFVH的活性，但是不具有氧化肽链长度为3以上的糖基化肽的活性。与此相对，CFP－T7－H35不仅具有氧化αFV、αFVH的活性而且具有氧化肽链长度从3至16的糖基化肽的活性。CFP－T7－H35对αFV和αF6P具有特别高的相对活性，对于中间链长的αFVH～αF5P也具有充分的相对活性。由于这一结果以及CFP－T7－H35对αF6P、αF8P和αF16P也具有活性，因此CFP－T7－H35对于中间链长的αF7P、αF9P～αF15P同样也具有活性的可能性高。此外，由于CFP－T7－H35对αF16P也具有活性，因此认为对于链长更长的底物，例如αF17P～αF32P等也具有活性。
以上结果表明，CFP－T7－H35也将在野生型酶(CFP－T7)中不能够作为底物的肽链长度长的各种各样的糖基化肽作为底物。如果使用这类阿马多里酶，能够提供以少的蛋白酶的处方量迅速、简便且精度良好地将HbA1c定量的测定方法、测定试剂盒，或迅速、简便、高精度且高灵敏度地将HbA1c定量的测定方法、测定试剂盒。
[实施例3]
(向各种阿马多里酶导入点突变)
通过导入上述突变，来自锥毛壳属的阿马多里酶对αF6P的反应性上升，对αF3P、αF4P、αF5P、αF6P、αF8P和αF16P的反应性上升。因此，将利用基于序列同源性的公知的整列处理得到的信息作为参考，通过在来自其他生物种的阿马多里酶的氨基酸序列的对应位置导入同样的突变，同样能够期待对αF6P、αF3P、αF4P、αF5P、αF6P、αF8P和αF16P的反应性上升。因此，实际上对于来自锥毛壳属的阿马多里酶以外的多个阿马多里酶，也在对应的位置导入突变。
1.对来自土正青霉的果糖基肽氧化酶基因导入点突变
序列号40是来自土正青霉的果糖基肽氧化酶(以后称为EFP－T5)的氨基酸序列，通过保有插入编码序列号40的氨基酸序列的基因(序列号41)的重组质粒pUTE100K’－EFP－T5的大肠杆菌能够生产，并确认EFP－T5具有αFV和αFVH氧化活性(参照国际公开第2007/125779号公报和国际公开第2008/018094号公报)。
为了在EFP－T5中导入底物特异性改善型突变，将重组质粒pUTE100K’－EFP－T5作为模板，使用序列号42、43的合成寡核苷酸、KOD－Plus－(东洋纺织公司制)，在与实施例1同样的条件下进行PCR反应、大肠杆菌JM109的转化和生长集落保持的质粒DNA中的编码EFP－T5突变体的DNA的碱基序列确定。最终，得到编码序列号40记载的氨基酸序列的62位的精氨酸被取代为天冬氨酸的EFP－T5基因的重组质粒(pUTE100K’－EFP－T5－62D)。
接下来，与上述同样，将pUTE100K’－EFP－T5－62D作为模板，使用序列号44、45的合成寡核苷酸，得到编码序列号40记载的氨基酸序列的62位的精氨酸被取代为天冬氨酸、106位的天冬酰胺被取代为赖氨酸的EFP－T5基因的重组质粒(pUTE100K’－EFP－T5－62D/106K)。
接下来，与上述同样，将pUTE100K’－EFP－T5－62D/106K作为模板，使用序列号46、47的合成寡核苷酸，得到编码序列号40记载的氨基酸序列的62位的精氨酸被取代为天冬氨酸、106位的天冬酰胺被取代为赖氨酸、110位的赖氨酸被取代为亮氨酸的EFP－T5基因的重组质粒(pUTE100K’－EFP－T5－62D/106K/110L)。
接下来，与上述同样，将pUTE100K’－EFP－T5－62D/106K/110L作为模板，使用序列号48、49的合成寡核苷酸，得到编码序列号40记载的氨基酸序列的62位的精氨酸被取代为天冬氨酸、106位的天冬酰胺被取代为赖氨酸、110位的赖氨酸被取代为亮氨酸、113位的苏氨酸被取代为赖氨酸的EFP－T5基因的重组质粒(pUTE100K’－EFP－T5－62D/106K/110L/113K)。
接下来，与上述同样，将pUTE100K’－EFP－T5－62D/106K/110L/113K作为模板，使用序列号50、51的合成寡核苷酸，得到编码序列号40记载的氨基酸序列的62位的精氨酸被取代为天冬氨酸、106位的天冬酰胺被取代为赖氨酸、110位的赖氨酸被取代为亮氨酸、113位的苏氨酸被取代为赖氨酸、355位的丙氨酸被取代为丝氨酸的EFP－T5基因的重组质粒(pUTE100K’－EFP－T5－62D/106K/110L/113K/355S)。
进一步，与上述同样，将pUTE100K’－EFP－T5－62D/106K/110L/113K/355S作为模板，使用序列号52、53的合成寡核苷酸，得到编码序列号40记载的氨基酸序列的62位的精氨酸被取代为天冬氨酸、63位的亮氨酸被取代为组氨酸、106位的天冬酰胺被取代为赖氨酸，110位的赖氨酸被取代为亮氨酸、113位的苏氨酸被取代为赖氨酸，355位的丙氨酸被取代为丝氨酸的EFP－T5基因的重组质粒(pUTE100K’－EFP－T5－62D/63H/106K/110L/113K/355S)。
2.对来自侵管新赤壳菌的酮胺氧化酶基因导入点突变
序列号54是来自侵管新赤壳菌的酮胺氧化酶(以后称为NvFX)的氨基酸序列，通过保有插入了编码序列号54的氨基酸序列的基因(序列号55)的重组质粒pET22b－NvFX的大肠杆菌能够生产，并确认NvFX具有αFV和αFVH氧化活性(参照国际公开第2012/018094号公报)。
为了在NvFX中导入底物特异性改善型突变，将重组质粒pET22b－NvFX作为模板，使用序列号56、57的合成寡核苷酸、KOD－Plus－(东洋纺织公司制)，在与实施例1同样的条件下进行PCR反应、大肠杆菌JM109的转化和生长集落保持的质粒DNA中的编码NvFX突变体的DNA的碱基序列确定。最终，得到编码序列号54记载的氨基酸序列的62位的精氨酸被取代为天冬氨酸的NvFX基因的重组质粒(pET22b－NvFX－62D)。
接下来，与上述同样，将pET22b－NvFX－62D作为模板，使用序列号58、59的合成寡核苷酸，得到编码序列号54记载的氨基酸序列的62位的精氨酸被取代为天冬氨酸、106位的甘氨酸被取代为赖氨酸的NvFX基因的重组质粒(pET22b－NvFX－62D/106K)。
进一步，与上述同样，将pET22b－NvFX－62D/106K作为模板，使用序列号60、61的合成寡核苷酸，得到编码序列号54记载的氨基酸序列的62位的精氨酸被取代为天冬氨酸、106位的精氨酸被取代为赖氨酸、110位的谷氨酸被取代为亮氨酸的NvFX基因的重组质粒(pET22b－NvFX－62D/106K/110L)。
而且，在与实施例1同样的条件下转化大肠杆菌BL21(DE3)株，得到大肠杆菌BL21(DE3)(pET22b－NvFX－62D/106K/110L)株。
3.对来自构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶基因导入点突变
序列号62是为了赋予果糖基肽氧化酶活性而将59位的丝氨酸取代为甘氨酸的来自构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶(以后称为AnFX)的氨基酸序列，通过保有插入了编码序列号62的氨基酸序列的基因(序列号63)的重组质粒pET22b－AnFX的大肠杆菌能够生产，确认AnFX具有αFV和αFVH氧化活性(参照国际公开第2012/018094号公报)。
为了在AnFX中导入底物特异性改善型突变，将重组质粒pET22b－AnFX作为模板，使用序列号64、65的合成寡核苷酸、KOD－Plus－(东洋纺织公司制)，在与实施例1同样的条件下进行PCR反应、大肠杆菌JM109的转化和生长集落保持的质粒DNA中的编码AnFX突变体的DNA的碱基序列确定。最终，得到编码序列号62记载的氨基酸序列的61位的精氨酸被取代为天冬氨酸的AnFX基因的重组质粒(pET22b－AnFX－61D)。
接下来，与上述同样，将pET22b－AnFX－61D作为模板，使用序列号66、67的合成寡核苷酸，得到编码序列号62记载的氨基酸序列的61位的精氨酸被取代为天冬氨酸、105位的甘氨酸被取代为赖氨酸的AnFX基因的重组质粒(pET22b－AnFX－61D/105K)。
接下来，与上述同样，将pET22b－AnFX－61D/105K作为模板，使用序列号68、69的合成寡核苷酸，得到编码序列号62记载的氨基酸序列的61位的精氨酸被取代为天冬氨酸、105位的甘氨酸被取代为赖氨酸、109位的赖氨酸被取代为亮氨酸的AnFX基因的重组质粒(pET22b－AnFX－61D/105K/109L)。
而且，在与实施例1同样的条件下转化大肠杆菌BL21(DE3)株，得到大肠杆菌BL21(DE3)(pET22b－AnFX－61D/105K/109L)株。
接下来，与上述同样，将pET22b－AnFX－61D/105K/109L作为模板，使用序列号112、70的合成寡核苷酸，得到编码序列号62记载的氨基酸序列的61位的精氨酸被取代为天冬氨酸、105位的甘氨酸被取代为赖氨酸、109位的赖氨酸被取代为亮氨酸、112位的丝氨酸被取代为赖氨酸的AnFX基因的重组质粒(pET22b－AnFX－61D/105K/109L/112K)。
接下来，与上述同样，将pET22b－AnFX－61D/105K/109L/112K作为模板，使用序列号71、72的合成寡核苷酸，得到编码序列号62记载的氨基酸序列的61位的精氨酸被取代为天冬氨酸、105位的甘氨酸被取代为赖氨酸、109位的赖氨酸被取代为亮氨酸、112位的丝氨酸被取代为赖氨酸、355位的丙氨酸被取代为丝氨酸的AnFX基因的重组质粒(pET22b－AnFX－61D/105K/109L/112K/355S)。
接下来，与上述同样，将pET22b－AnFX－61D/105K/109L/112K/355S作为模板，使用序列号73、74的合成寡核苷酸，得到编码序列号62记载的氨基酸序列的61位的精氨酸被取代为天冬氨酸、62位的亮氨酸被取代为组氨酸、105位的甘氨酸被取代为赖氨酸、109位的赖氨酸被取代为亮氨酸、112位的丝氨酸被取代为赖氨酸、355位的丙氨酸被取代为丝氨酸的AnFX基因的重组质粒(pET22b－AnFX－61D/62H/105K/109L/112K/355S)。
接下来，与上述同样，将pET22b－AnFX－61D/62H/105K/109L/112K/355S作为模板，使用序列号75、76的合成寡核苷酸，得到编码序列号62记载的氨基酸序列的61位的精氨酸被取代为天冬氨酸、62位的亮氨酸被取代为组氨酸、101位的谷氨酸被取代为赖氨酸、105位的甘氨酸被取代为赖氨酸、109位的赖氨酸被取代为亮氨酸、112位的丝氨酸被取代为赖氨酸、355位的丙氨酸被取代为丝氨酸的AnFX基因的重组质粒(pET22b－AnFX－61D/62H/101K/105K/109L/112K/355S)。
而且，在与实施例1同样的条件下转化大肠杆菌BL21(DE3)株，得到大肠杆菌BL21(DE3)(pET22b－AnFX－61D/62H/101K/105K/109L/112K/355S)株。
4.对来自颖枯壳针孢的果糖基肽氧化酶基因导入点突变
为了在PnFX中导入底物特异性改善型突变，将如上述所示制备的重组质粒pET22b－PnFX作为模板，使用序列号77、78的合成寡核苷酸、KOD－Plus－(东洋纺织公司制)，在与实施例1同样的条件下进行PCR反应、大肠杆菌JM109的转化和生长集落保持的质粒DNA中的编码PnFX突变体的DNA的碱基序列确定。最终，得到编码序列号38记载的氨基酸序列的62位的丝氨酸被取代为天冬氨酸的PnFX基因的重组质粒(pET22b－PnFX－62D)。
接下来，与上述同样，将pET22b－PnFX－62D作为模板，使用序列号79、80的合成寡核苷酸，得到编码序列号38记载的氨基酸序列的62位的丝氨酸被取代为天冬氨酸、106位的天冬氨酸被取代为赖氨酸的PnFX基因的重组质粒(pET22b－PnFX－62D/106K)。
接下来，与上述同样，将pET22b－PnFX－62D/106K作为模板，使用序列号81、82的合成寡核苷酸，得到编码序列号38记载的氨基酸序列的62位的丝氨酸被取代为天冬氨酸、106位的天冬氨酸被取代为赖氨酸、110位的甘氨酸被取代为亮氨酸的PnFX基因的重组质粒(pET22b－PnFX－62D/106K/110L)。
进一步，与上述同样，将pET22b－PnFX－62D/106K/110L作为模板，使用序列号83、84的合成寡核苷酸，得到编码序列号38记载的氨基酸序列的62位的丝氨酸被取代为天冬氨酸、106位的天冬氨酸被取代为赖氨酸、110位的甘氨酸被取代为亮氨酸、113位的丙氨酸被取代为赖氨酸的PnFX基因的重组质粒(pET22b－PnFX－62D/106K/110L/113K)。
而且，在与实施例1同样的条件下转化大肠杆菌BL21(DE3)株，得到大肠杆菌BL21(DE3)(pET22b－PnFX－62D/106K/110L/113K)株。
进一步，与上述同样，将pET22b－PnFX－62D/106K/110L/113K作为模板，使用序列号85、86的合成寡核苷酸，得到编码序列号38记载的氨基酸序列的62位的丝氨酸被取代为天冬氨酸、106位的天冬氨酸被取代为赖氨酸、110位的甘氨酸被取代为亮氨酸、113位的丙氨酸被取代为赖氨酸、351位的丙氨酸被取代为丝氨酸的PnFX基因的重组质粒(pET22b－PnFX－62D/106K/110L/113K/351S)。
进一步，与上述同样，将pET22b－PnFX－62D/106K/110L/113K/351S作为模板，使用序列号87、88的合成寡核苷酸，得到编码序列号38记载的氨基酸序列的62位的丝氨酸被取代为天冬氨酸、63位的亮氨酸被取代为组氨酸、106位的天冬氨酸被取代为赖氨酸、110位的甘氨酸被取代为亮氨酸、113位的丙氨酸被取代为赖氨酸、351位的丙氨酸被取代为丝氨酸的PnFX基因的重组质粒(pET22b－PnFX－62D/63H/106K/110L/113K/351S)。
而且，在与实施例1同样的条件下转化大肠杆菌BL21(DE3)株，得到大肠杆菌BL21(DE3)(pET22b－PnFX－62D/63H/106K/110L/113K/351S)株。
5.对来自新型隐球菌的果糖基肽氧化酶基因导入点突变
序列号89是来自新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶(以后称为CnFX)的氨基酸序列，通过保有插入了编码序列号89的氨基酸序列的基因(序列号90)的重组质粒pET22b－CnFX的大肠杆菌能够生产，确认CnFX具有αFV和αFVH氧化活性(参照国际公开第2012/018094号公报)。
为了在CnFX中导入底物特异性改善型突变，将如上述所示制备的重组质粒pET22b－CnFX作为模板，使用序列号91、92的合成寡核苷酸、KOD－Plus－(东洋纺织公司制)，在与实施例1同样的条件下进行PCR反应、大肠杆菌JM109的转化和生长集落保持的质粒DNA中的编码CnFX突变体的DNA的碱基序列确定。最终，得到编码序列号89记载的氨基酸序列的62位的精氨酸被取代为天冬氨酸的CnFX基因的重组质粒(pET22b－CnFX－62D)。
接下来，与上述同样，将pET22b－CnFX－62D作为模板，使用序列号93、94的合成寡核苷酸，得到编码序列号89记载的氨基酸序列的62位的精氨酸被取代为天冬氨酸、106位的丝氨酸被取代为赖氨酸的CnFX基因的重组质粒(pET22b－CnFX－62D/106K)。
接下来，与上述同样，将pET22b－CnFX－62D/106K作为模板，使用序列号95、96的合成寡核苷酸，得到编码序列号89记载的氨基酸序列的62位的精氨酸被取代为天冬氨酸、106位的丝氨酸被取代为赖氨酸、110位的丝氨酸被取代为亮氨酸的CnFX基因的重组质粒(pET22b－CnFX－62D/106K/110L)。
接下来，与上述同样，将pET22b－PnFX－62D/106K/110L作为模板，使用序列号97、98的合成寡核苷酸，得到编码序列号89记载的氨基酸序列的62位的精氨酸被取代为天冬氨酸、106位的丝氨酸被取代为赖氨酸、110位的丝氨酸被取代为亮氨酸、113位的丙氨酸被取代为赖氨酸的CnFX基因的重组质粒(pET22b－CnFX－62D/106K/110L/113K)。
而且，在与实施例1同样的条件下转化大肠杆菌BL21(DE3)株，得到大肠杆菌BL21(DE3)(pET22b－CnFX－62D/106K/110L/113K)株。
6.对与来自棒弯孢的酮胺氧化酶具有95％的序列同源性的阿马多里酶基因导入点突变
(与来自棒弯孢的酮胺氧化酶具有95％的序列同源性的阿马多里酶的生产株的制作)
序列号99是具有与来自棒弯孢的酮胺氧化酶具有95％的序列同源性的氨基酸序列的阿马多里酶(以后称为Cc95FX)。通过利用了作为常规方法的基因片段PCR的全合成而全合成cDNA从而取得编码序列号99的氨基酸序列的基因(序列号100)。此时，在序列号100的5′末端、3′末端分别添加NdeI位点和BamHI位点。
接下来，为了使取得的序列号100的基因在大肠杆菌中表达，进行以下顺序。首先，通过利用NdeI位点和BamHI(TAKARABIO公司制)2种限制性内切酶处理上述全合成的基因，插入到pET－22b(+)Vector(Novagen公司制)的NdeI－BamHI位点，取得重组质粒pET22b－Cc95FX，在与上述同样的条件下转化大肠杆菌BL21(DE3)株，得到大肠杆菌BL21(DE3)(pET22b－Cc95FX)株。
(对与来自棒弯孢的酮胺氧化酶具有95％的序列同源性的阿马多里酶基因导入点突变)
为了在Cc95FX中导入底物特异性改善型突变，将如上述所示制备的重组质粒pET22b－Cc95FX作为模板，使用序列号101、102的合成寡核苷酸、KOD－Plus－(东洋纺织公司制)，在与实施例1同样的条件下进行PCR反应、大肠杆菌JM109的转化和生长集落保持的质粒DNA中的编码Cc95FX突变体的DNA的碱基序列确定。最终，得到编码序列号99记载的氨基酸序列的62位的精氨酸被取代为天冬氨酸的Cc95FX基因的重组质粒(pET22b－Cc95FX－62D)。
接下来，与上述同样，将pET22b－Cc95FX－62D作为模板，使用序列号103、104的合成寡核苷酸，得到编码序列号99记载的氨基酸序列的62位的精氨酸被取代为天冬氨酸、106位的天冬氨酸被取代为赖氨酸的Cc95FX基因的重组质粒(pET22b－Cc95FX－62D/106K)。
接下来，与上述同样，将pET22b－Cc95FX－62D/106K作为模板，使用序列号105、106的合成寡核苷酸，得到编码序列号99记载的氨基酸序列的62位的精氨酸被取代为天冬氨酸、106位的天冬氨酸被取代为赖氨酸、110位的丙氨酸被取代为亮氨酸的Cc95FX基因的重组质粒(pET22b－Cc95FX－62D/106K/110L)。
接下来，与上述同样，将pET22b－Cc95FX－62D/106K/110L作为模板，使用序列号107、108的合成寡核苷酸，得到编码序列号99记载的氨基酸序列的62位的精氨酸被取代为天冬氨酸、106位的天冬氨酸被取代为赖氨酸、110位的丙氨酸被取代为亮氨酸、113位的丙氨酸被取代为赖氨酸的Cc95FX基因的重组质粒(pET22b－Cc95FX－62D/106K/110L/113K)。
接下来，与上述同样，将pET22b－Cc95FX－62D/106K/110L/113K作为模板，使用序列号109、110的合成寡核苷酸，得到编码序列号99记载的氨基酸序列的62位的精氨酸被取代为天冬氨酸、106位的天冬氨酸被取代为赖氨酸、110位的丙氨酸被取代为亮氨酸、113位的丙氨酸被取代为赖氨酸、353位的丙氨酸被取代为丝氨酸的Cc95FX基因的重组质粒(pET22b－Cc95FX－62D/106K/110L/113K/353S)。
接下来，与上述同样，将pET22b－Cc95FX－62D/106K/110L/113K/353S作为模板，使用序列号111、102的合成寡核苷酸，得到编码序列号99记载的氨基酸序列的62位的精氨酸被取代为天冬氨酸、63位的亮氨酸被取代为组氨酸、106位的天冬氨酸被取代为赖氨酸、110位的丙氨酸被取代为亮氨酸、113位的丙氨酸被取代为赖氨酸、353位的丙氨酸被取代为丝氨酸的Cc95FX基因的重组质粒(pET22b－Cc95FX－62D/63H/106K/110L/113K/353S)。
而且，在与实施例1同样的条件下转化大肠杆菌BL21(DE3)株，得到大肠杆菌BL21(DE3)(pET22b－Cc95FX－62D/63H/106K/110L/113K/353S)株。
[实施例4]
(各种阿马多里酶的生产和精制)
(来自土正青霉的果糖基肽氧化酶的生产和精制)
将生产野生型EFP－T5和如上述所示得到的修饰型EFP－T5的大肠杆菌JM109(pUTE100K’－EFP－T5)、大肠杆菌JM109(pUTE100K’－EFP－T5－62D)、大肠杆菌JM109(pUTE100K’－EFP－T5－62D/63H/106K/110L/113K/355S)在以终浓度为0.1mM的方式添加IPTG的LB－amp培养基中植菌，25℃下培养16小时。将得到的各培养菌体利用10mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)清洗后，在相同缓冲液中将菌体悬浮进行超声破碎处理，以20000×g离心分离10分钟，制备粗酶液。
制备的野生型或修饰型EFP－T5的粗酶液中以35％饱和浓度的方式添加硫酸铵并搅拌，以20000×g离心分离10分钟回收上清。接下来，向得到的上清中以70％饱和浓度的方式追加添加硫酸铵并搅拌，以20000×g离心分离10分钟废弃上清，将沉淀物溶解于10mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)。
将得到的野生型或修饰型EFP－T5的粗酶液利用10mM磷酸钾缓冲液(pH6.5)透析后，提供于利用相同缓冲液平衡化的4ml的QSepharoseFastFlow树脂(GEHealthcare公司制)，利用相同缓冲液将未吸附于树脂的蛋白质洗脱。接下来，将得到的野生型或修饰型EFP－T5M的粗酶液利用10mM磷酸钾缓冲液(pH8.0)透析后，使其吸附于利用相同缓冲液平衡化的HiLoad26/10QSepharoseHP柱(GEHealthcare公司制)，接下来利用相同缓冲液清洗树脂，接下来边使相同缓冲液中的NaCl的浓度从0mM至100mM线性增加，边将吸附于树脂的野生型或修饰型EFP－T5洗脱回收。
将得到的含有野生型或修饰型EFP－T5的粗酶液供给至利用含有150mMNaCl的10mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)平衡化的HiLoad26/600Superdex200柱，利用相同缓冲液将野生型或修饰型EFP－T5洗脱，回收具有果糖基氨基酸氧化酶活性(阿马多里酶活性)的部分。将得到的部分通过SDS－PAGE进行分析，确认被精制到不含有其他夹杂蛋白质的纯度，作为野生型或修饰型EFP－T5的精制标准品。
(来自侵管新赤壳菌的酮胺氧化酶的生产和精制)
将生产野生型的NvFX和如上述所示得到的修饰型NvFX的大肠杆菌BL21(DE3)(pET22b－NvFX)、大肠杆菌BL21(DE3)(pET22b－NvFX－62D/106K/110L)在以终浓度为0.1mM的方式添加IPTG的LB－amp培养基中植菌，25℃下培养16小时。将得到的各培养菌体利用10mM磷酸钾缓冲液(pH8.0)清洗后，在相同缓冲液中将菌体悬浮进行超声破碎处理，以20000×g离心分离10分钟，制备粗酶液。
使制备的粗酶液吸附于利用10mM磷酸钾缓冲液(pH8.0)平衡化的QSepharoseFastFlow树脂(GEHealthcare公司制)，接下来，利用含有20mMNaCl的10mM磷酸钾缓冲液(pH8.0)清洗树脂，接下来利用含有300mMNaCl的10mM磷酸钾缓冲液(pH8.0)洗脱回收吸附于树脂的野生型或修饰型NvFX。
将得到的含有野生型NvFX或修饰型NvFX的粗酶液供给至利用含有150mMNaCl的20mMMES－NaOH缓冲液(pH7.0)平衡化的HiLoad26/600Superdex200柱，利用相同缓冲液洗脱野生型NvFX或修饰型NvFX，回收具有果糖基氨基酸氧化酶活性(阿马多里酶活性)的部分。将得到的部分通过SDS－PAGE进行分析，确认被精制到不含有其他夹杂蛋白质的纯度，作为野生型或修饰型NvFX的精制标准品。
(来自构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶的生产和精制)
将生产野生型AnFX和如上述所示得到的修饰型AnFX的大肠杆菌BL21(DE3)(pET22b－AnFX－61D/105K/109L)和大肠杆菌BL21(DE3)(pET22b－AnFX－61D/62H/101K/105K/109L/112K/355S)在以终浓度为0.1mM的方式添加IPTG的LB－amp培养基中植菌，25℃下培养16小时。将得到的各培养菌体利用10mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)清洗后，在相同缓冲液中将菌体悬浮进行超声破碎处理，以20000×g离心分离10分钟，制备粗酶液。
使制备的粗酶液吸附于利用10mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)平衡化的SPSepharoseFastFlow树脂(GEHealthcare公司制)，接下来利用含有20mMNaCl的10mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)清洗树脂，接下来利用含有100mMNaCl的10mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)洗脱回收吸附于树脂的修饰型AnFX。
将得到的含有修饰型AnFX的粗酶液供给于利用含有150mMNaCl的20mMMES－NaOH缓冲液(pH7.0)平衡化的HiLoad26/600Superdex200柱，利用相同缓冲液洗脱修饰型AnFX，回收具有果糖基氨基酸氧化酶活性(阿马多里酶活性)的部分。将得到的部分通过SDS－PAGE进行分析，确认被精制到不含有其他夹杂蛋白质的纯度，作为修饰型AnFX的精制标准品。
(来自颖枯壳针孢的果糖基肽氧化酶的生产和精制)
将生产如上述所示得到的修饰型AnFX的大肠杆菌BL21(DE3)(pET22b－PnFX－62D/106K/110L/113K)和大肠杆菌BL21(DE3)(pET22b－PnFX－62D/63H/106K/110L/113K/351S)按照上述的野生型PnFX的精制方法精制。利用HiLoad26/600Superdex200柱的精制结束后，通过SDS－PAGE分析纯度，确认被精制到不含有其他夹杂蛋白质的纯度，作为修饰型PnFX的精制标准品。
(来自新型隐球菌的酮胺氧化酶的生产和精制)
将生产野生型CnFX和如上述所示得到的修饰型CnFX的大肠杆菌BL21(DE3)(pET22b－CnFX)、大肠杆菌BL21(DE3)(pET22b－CnFX－62D/106K/110L/113K)在以终浓度为0.1mM的方式添加IPTG的LB－amp培养基中植菌，25℃下培养16小时。将得到的各培养菌体利用10mM磷酸钾缓冲液(pH8.0)清洗后，在相同缓冲液中将菌体悬浮进行超声破碎处理，以20000×g离心分离10分钟，制备粗酶液。
使制备的粗酶液吸附于利用10mM磷酸钾缓冲液(pH8.0)平衡化的QSepharoseFastFlow树脂(GEHealthcare公司制)，接下来利用含有20mMNaCl的10mM磷酸钾缓冲液(pH8.0)清洗树脂，接下来利用含有300mMNaCl的10mM磷酸钾缓冲液(pH8.0)洗脱回收吸附于树脂的野生型或修饰型CnFX。
将得到的含有野生型CnFX或修饰型CnFX的粗酶液供给于利用含有150mMNaCl的20mMMES－NaOH缓冲液(pH7.0)平衡化的HiLoad26/600Superdex200柱，利用相同缓冲液洗脱野生型CnFX或修饰型CnFX，回收具有果糖基氨基酸氧化酶活性(阿马多里酶活性)的部分。将得到的部分通过SDS－PAGE进行分析，确认被精制到不含有其他夹杂蛋白质的纯度，作为野生型或修饰型CnFX的精制标准品。
(与来自棒弯孢的酮胺氧化酶具有95％的序列同源性的阿马多里酶的生产)
将生产野生型Cc95FX和如上述所示得到的修饰型Cc95FX的大肠杆菌JM109(pET22b－Cc95FX)和大肠杆菌JM109(pET22b－Cc95FX－62D/63H/106K/110L/113K/355S)在以终浓度为0.1mM方式添加IPTG的LB－amp培养基中植菌，25℃下培养16小时。将得到的各培养菌体利用10mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)清洗后，在相同缓冲液中将菌体悬浮进行超声破碎处理，以20000×g离心分离10分钟，制备粗酶液。
使用得到的各种阿马多里酶的野生型酶和修饰型酶的精制标准品，测定将αF6P作为底物时的相对活性。结果示于表15。应予说明，相对活性的计算中使用的蛋白质浓度是通过利用了280nm的吸光度的紫外吸收法而测定的(参照ProteinSci.4，2411－23，1995)。
此外，使用含有Cc95FX或Cc95FX－62D/63H/106K/110L/113K/355S的粗酶液，通过上述B.活性测定方法记载的方法测定对αFV、αFVH、αF6P的氧化活性。对于各个阿马多里酶，将αFVH氧化活性作为100时的、对各底物的氧化活性以及αF6P/αFVH和αF6P/αFV如表16所示。
表15
表16
将按照本说明书记载的顺序制作的、与来自锥毛壳的阿马多里酶(CFP－T7；比较例1)相比赋予或增强对αF6P的反应性的氨基酸取代导入各种阿马多里酶，最终，如预想的那样，对EFP－T5、NvFX、AnFX、CnFX新赋予了对αF6P的反应性。此外，PnFX以往略微具有对αF6P的反应，但通过本说明书记载的氨基酸取代的导入，对αF6P的相对活性提高了13.7倍。
此外，将按照本说明书记载的顺序制作的、与来自锥毛壳的阿马多里酶(CFP－T7；比较例1)相比赋予或增强对αF6P的反应性的氨基酸取代导入按照本说明书记载的顺序制作的、与来自棒弯孢的酮胺氧化酶具有95％的序列同源性的阿马多里酶(Cc95FX；比较例8)，最终如预想的那样，对Cc95FX新赋予了对αF6P的反应性，Cc95FX－62D/63H/106K/110L/113K/355S中，αF6P氧化活性高于αFVH氧化活性。
即，针对本说明书记载的来自锥毛壳的阿马多里酶赋予或增强了对αF6P的反应性的氨基酸取代的效果，并非仅仅局限于针对来自锥毛壳的阿马多里酶，如果是图1和图2所示的与来自锥毛壳的阿马多里酶具有74％以上的序列同源性的阿马多里酶，则普遍同样地赋予或增强了对αF6P的反应性。
以下的表中示出比较例和本发明的突变体的62位、63位、102位、106位、110位、113位、355位和419位的氨基酸以及有取代时取代后的氨基酸的关系。
表17
表18
表19
表20
表21
表22
如上述所示，CFP－T7－H35，不仅将αFV、αFVH作为底物，而且也将野生型酶(CFP－T7)中无法作为底物的肽链长度长的糖基化肽(αF3P、αF4P、αF5P、αF6P、αF8P和αF16P)作为底物。
基于上述见解，按照上述顺序制作在与序列号1的氨基酸序列的位置对应的位置具有同样突变的修饰体后，这样的修饰体对αF6P也具有活性。因此认为这些修饰体与CFP－T7－H35同样，不仅对αFV、αFVH和αF6P具有活性，而且对αF3P、αF4P、αF5P、αF8P和αF16P也具有活性。此外，由于CFP－T7－H35将αFV、αFVH、αF3P、αF4P、αF5P、αF6P、αF8P和αF16P作为底物，因此，认为其同样将含有αF7P、αF9P～αF15P的α－果糖基肽(αF1P～αF16P)，进一步将含有αFV～αF32P的α－果糖基肽作为底物。这样的阿马多里酶修饰体能够用于HbA1c定量测定。由此，即使从HbA1c切出α－果糖基肽的蛋白酶，是切断效率高但切断特异性低的蛋白酶而没有完全分解为αFVH，通过阿马多里酶不仅与αFVH而且与各种长度的α－果糖基肽作用，无论切断的各种α－果糖基肽的长度和各自在整体中占有的比例，都能以高精度进行HbA1c定量。此外，从HbA1c切出α－果糖基肽的蛋白酶，不局限于切断特异性高的切出αF6P的蛋白酶，容易获得的其他切断特异性低的蛋白酶也能够用于HbA1c定量测定。
[实施例5]
(各α－果糖基肽的定量)
制备由以下组成构成的测定用试剂，利用BioMajestyJCA－BM1650(日本电子)如下述所示实施α3P、α4P、α5P、α6P、α8P、α16P的测定。
试样1：各α－果糖基肽溶液(终浓度0.50～4.0μM)
以4.0μM、8.0μM、16μM、24μM和32μM各浓度制备的α3P、α4P、α5P、α6P、α8P、α16P的溶液。
作为浓度0μM的α－果糖基肽溶液，使用离子交换水。
试剂4：无色染料、过氧化酶溶液
120mMMES－NaOH缓冲液pH6.5
0.16mMN－(羧甲基氨基羰基)－4，4′－双(二甲基氨基)二苯胺钠(DA－64、和光纯药工业制)
16U/ml过氧化酶(KIKKOMAN制)
试剂5：CFP－T7－H35溶液
120mMMES－NaOH缓冲液pH6.5
100U/ml(23.4mg/ml)CFP－T7－H35(本发明25)
其中，U/ml表示对1mM的αF6P的活性。
在125μl的试剂4中添加25μl试样1，37℃下孵育5分钟后，测定波长751nm的光的吸光度(A0)，接下来添加50μl的试剂5，37℃下进行5分钟由各α－果糖基肽的氧化生成的过氧化氢的定量反应后，再次测定波长751nm的光的吸光度(A5)。将来自试样1的各α－果糖基肽的终浓度为横轴，过氧化氢的定量反应前后的吸光度差ΔA(由A5－A0计算)为纵轴制作的图示于图3。应予说明，图中的吸光度差ΔA表示减去空白测定(作为试样1使用离子交换水)的ΔA的值。
在各α－果糖基肽终浓度为0.50μM～4.0μM的范围，ΔA与各α－果糖基肽浓度之间具有良好的相关关系(图3－1～图3－6)。因此，可知通过配合本发明的阿马多里酶(CFP－T7－H35)，能够迅速(5分钟)且高灵敏度(到0.5μM)地进行各α－果糖基肽的定量。
本实施例中使用本发明的阿马多里酶(CFP－T7－H35)，能够将底物αF3P、αF4P、αF5P、αF8P和αF16P定量。使用本发明的阿马多里酶时，认为对于底物αF7P、αF9P～αF15P同样也能够定量。
[实施例6]
(含有各α－果糖基肽的α－果糖基缬氨酰基组氨酸试样的定量)
制备由以下组成构成的测定用试剂，利用BioMajestyJCA－BM1650(日本电子)，如下述所示实施含有各α－果糖基肽的α－果糖基缬氨酰基组氨酸(αF2P)试样的测定。
试样2：含有各α－果糖基肽的α－果糖基缬氨酰基组氨酸溶液
制备下述9种试样(2A－2I)。
2A：离子交换水
2B：20μMα－果糖基缬氨酰基组氨酸(αF2P)
2C：16μMαF2P
2D：16μMαF2P+4μMαF3P
2E：16μMαF2P+4μMαF4P
2F：16μMαF2P+4μMαF5P
2G：16μMαF2P+4μMαF6P
2H：16μMαF2P+4μMαF8P
2I：16μMαF2P+4μMαF16P
试样2D～2I是利用其他α－果糖基肽补充试样2B和2C之间的αF2P的浓度差(4μM，终浓度相当于0.5μM)的试样。
试剂4：无色染料，过氧化酶溶液
120mMMES－NaOH缓冲液pH6.5
0.16mMN－(羧甲基氨基羰基)－4，4′－双(二甲基氨基)二苯胺钠(DA－64，和光纯药工业制)
16U/ml过氧化酶(KIKKOMAN制)
试剂6：CFP－T7－H35溶液
120mMMES－NaOH缓冲液pH6.5
50U/ml(11.7mg/ml)CFP－T7－H35(本发明25)
其中，U/ml表示对1mM的αF6P的活性。
试剂7：CFP－T7溶液
120mMMES－NaOH缓冲液pH6.5
11.7mg/mlCFP－T7(比较例1)
在125μl试剂4中添加25μl试样2，37℃下孵育5分钟后，测定波长751nm的光的吸光度(A0)，接下来添加50μl试剂6或试剂7，37℃下进行5分钟利用各α－果糖基肽的氧化生成的过氧化氢的定量反应后，再次测定波长751nm的光的吸光度(A5)。计算每个试样的过氧化氢的定量反应前后的吸光度差ΔA(由A5－A0计算)，接下来，从试样2B～2I的ΔA值减去作为空白测定进行的试样2A的ΔA，利用试剂6进行测定时的结果示于表23，利用试剂7进行测定时的结果示于表24。相对值是将测定试样2B时的吸光度差ΔA作为100％进行计算的。
表23
| 试样 | 2B | 2C | 2D | 2E | 2F | 2G | 2H | 2I |
| ΔA | 0.082 | 0.064 | 0.081 | 0.080 | 0.085 | 0.083 | 0.084 | 0.078 |
| 相对值(％) | 100 | 79 | 99 | 98 | 104 | 101 | 103 | 95 |
表24
| 试样 | 2B | 2C | 2D | 2E | 2F | 2G | 2H | 2I |
| ΔA | 0.109 | 0.087 | 0.089 | 0.087 | 0.089 | 0.090 | 0.089 | 0.089 |
| 相对值(％) | 100 | 79 | 82 | 80 | 81 | 82 | 81 | 82 |
表23中，试样2D～2I的ΔA的相对值显示试样2B的±5％以内的值。这一结果表明，如果使用本发明的阿马多里酶，在蛋白酶的作用下从HbA1c切取αF2P时，即使未被分解成αF2P的α－果糖基肽残存，也能够正确将HbA1c定量。
与此相对，表24中，试样2D～2I的ΔA的相对值显示试样2C的±2％以内的值。这一结果表明，如果使用以往的阿马多里酶，在蛋白酶的作用下从HbA1c切取αF2P时，依赖于未被分解为αF2P的α－果糖基肽的残存量，吸光度差(ΔA)变为低值，不能正确将HbA1c定量。
在利用以往的阿马多里酶的HbA1c的测定方法中，需要通过蛋白酶的作用将HbA1c完全分解成αF2P。但是，没有验证HbA1c是否被完全分解成αF2P。根据表24的结果可知，使用以往的阿马多里酶，未被分解为αF2P的α－果糖基肽存在时，依赖于其残存量，吸光度差(ΔA)变为低值，不能正确将HbA1c定量。但是，如果使用本发明的阿马多里酶，即使是各种α－果糖基肽混合存在的试样，也能够全部反映于HbA1c值。因此，由于不考虑蛋白酶所致的HbA1c分解反应的进度而能够正确测定HbA1c，所以在产业利用上非常有利。
此外，将蛋白酶和酶(阿马多里酶、过氧化酶)同时配合时，由于蛋白酶，阿马多里酶、过氧化酶也被分解，失去酶活性。在目前为止的测定方法中，只能选择能够将HbA1c分解成αF2P的蛋白酶，没有其他选择余地。但是，如果使用本发明的阿马多里酶，即使是各种α－果糖基肽混合存在的试样，也能够全部反映于HbA1c值，因此，能够优先选择不易与阿马多里酶、过氧化酶作用的蛋白酶来组合至测定试剂。这在产业利用上非常有利。
此外，进行糖尿病诊断中，需要判断作为糖尿病的临界值的HbA1c6.5％(NGSP值)。NGSP值6.5％相当于IFCC值47mmol/mol，当血中血红蛋白浓度为13g/dl、NGSP值为6.5％时，氨基末端被糖化的血红蛋白β链的血中浓度大约为190μM。即，如果不能在至少190μM以下的浓度范围将糖基化肽定量，那么用于糖尿病诊断的实用化困难，难以克服产业利用上的课题。这一点，如果使用本发明的阿马多里酶，即使将上述的血液稀释47.5～380倍(换言之即使测定溶液中的终浓度是0.5μM～4μM)也能够检测来自HbA1cβ链氨基末端的各α－果糖基肽，在产业利用上非常有利。
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序列表自由文本
序列号1锥毛壳属NISL9330阿马多里酶的氨基酸序列
序列号2序列号1的阿马多里酶的碱基序列
序列号3－33PCR引物
序列号34PCR引物
序列号35PCR引物
序列号36米曲霉RIB40(FAOAo2)氨基酸序列
序列号37：FAOAo2碱基序列
序列号38颖枯壳针孢(PnFX)氨基酸序列
序列号39PnFX碱基序列
序列号40土正青霉(EFP-T5)氨基酸序列
序列号41EFP-T5碱基序列
序列号42－53PCR引物
序列号54侵管新赤壳菌(NvFX)氨基酸序列
序列号55NvFX碱基序列
序列号56－61PCR引物
序列号62S59G取代构巢曲霉(AnFX)氨基酸序列
序列号63AnFX碱基序列
序列号64－88PCR引物
序列号89新型隐球菌(CnFX)氨基酸序列
序列号90CnFX碱基序列
序列号91－98PCR引物
序列号99与棒弯孢酮胺氧化酶具有95％的序列同源性的阿马多里酶(Cc95FX)氨基酸序列
序列号100Cc95FX碱基序列
序列号101－112PCR引物
序列号113棘壳孢菌属(Py)阿马多里酶的氨基酸序列
序列号114棘壳孢菌属(Py)阿马多里酶的碱基序列
序列号115节菱孢菌属(Ar)阿马多里酶的氨基酸序列
序列号116节菱孢菌属(Ar)阿马多里酶的碱基序列
序列号117棒弯孢(Cc)阿马多里酶的氨基酸序列
序列号118棒弯孢(Cc)阿马多里酶的碱基序列
序列号119构巢裸胞壳(En)阿马多里酶的氨基酸序列
序列号120构巢裸胞壳(En)阿马多里酶的碱基序列
序列号121细基格孢属(Ul)阿马多里酶的氨基酸序列
序列号122细基格孢属(Ul)阿马多里酶的碱基序列
序列号123微紫青霉菌(Pj)阿马多里酶的氨基酸序列
序列号124微紫青霉菌(Pj)阿马多里酶的碱基序列
序列号125烟曲霉阿马多里酶I的氨基酸序列
序列号126阿马多里酶I碱基序列
序列号127米曲霉FAOAo1氨基酸序列
序列号128FAOAo1碱基序列
序列号129烟曲霉阿马多里酶II氨基酸序列
序列号130阿马多里酶II碱基序列
序列号131土曲霉FAOD-A氨基酸序列
序列号132FAOD-A碱基序列
序列号133CFP-T7-H20(R62D、D106K、Q110L、A113K)锥毛壳属氨基酸序列
序列号134CFP-T7-H20碱基序列
序列号135PnFPOX(S62D、D106K、G110L、A113K)颖枯壳针孢氨基酸序列
序列号136编码序列号135的氨基酸序列的碱基序列
序列号137(阿马多里酶29)NvFX-62D/106K/110L(R62D、G106K、E110L)侵管新赤壳菌氨基酸序列
序列号138编码序列号137的氨基酸序列的碱基序列
序列号139(阿马多里酶30)AnFX-61D/105K/109L(S59G、R61D、G105K、K1091L)构巢曲霉氨基酸序列
序列号140编码序列号13的氨基酸序列的碱基序列
序列号141(阿马多里酶25)CFP-T7-H35(R62D、L63H、E102K、D106K、Q110L、A113K、A355S)锥毛壳属氨基酸序列
序列号142CFP-T7-H35碱基序列
序列号143EFP-T5-62D/63H/106K/110L/113K/355S土正青霉氨基酸序列
序列号144编码序列号143的氨基酸序列的碱基序列
序列号145土正青霉野生型阿马多里酶的氨基酸序列
序列号146土正青霉野生型阿马多里酶的碱基序列
序列号147AnFX野生型阿马多里酶的氨基酸序列
序列号148AnFX野生型阿马多里酶的碱基序列
序列号149CnFX野生型阿马多里酶的氨基酸序列
序列号150CnFX野生型阿马多里酶的碱基序列
序列号151(阿马多里酶1)CFP-T7-H1(R62A)锥毛壳属氨基酸序列
序列号152CFP-T7-H1碱基序列
序列号153(阿马多里酶26)CFP-T7-62D(R62D)锥毛壳属氨基酸序列
序列号154CFP-T7-62D碱基序列
序列号155(阿马多里酶27)EFP-T5-R62D(R62D)土正青霉氨基酸序列
序列号156EFP-T5-R62D碱基序列
序列号157(阿马多里酶2)CFP-T7-H2(R62A、Q110L)锥毛壳属氨基酸序列
序列号158CFP-T7-H2碱基序列
序列号159(阿马多里酶4)CFP-T7-H4(R62A、Q110Y)锥毛壳属氨基酸序列
序列号160CFP-T7-H4碱基序列
序列号161(阿马多里酶5)CFP-T7-H2-62N(R62N、Q110L)锥毛壳属氨基酸序列
序列号162CFP-T7-H2-62N碱基序列
序列号163(阿马多里酶6)CFP-T7-H6(R62D、Q110L)锥毛壳属氨基酸序列
序列号164CFP-T7-H6碱基序列
序列号165(阿马多里酶12)CFP-T7-H10(R62D、D106A、Q110L)锥毛壳属氨基酸序列
序列号166CFP-T7-H10碱基序列
序列号167(阿马多里酶13)CFP-T7-H11(R62D、D106K、Q110L)锥毛壳属氨基酸序列
序列号168CFP-T7-H11碱基序列
序列号169(阿马多里酶14)CFP-T7-H12(R62D、D106R、Q110L)锥毛壳属氨基酸序列
序列号170CFP-T7-H12碱基序列
序列号171(阿马多里酶15)CFP-T7-H13(R62D、Q110L、A113K)锥毛壳属氨基酸序列
序列号172CFP-T7-H13碱基序列
序列号173(阿马多里酶16)CFP-T7-H14(R62D、Q110L、A113R)锥毛壳属氨基酸序列
序列号174CFP-T7-H14碱基序列
序列号175(阿马多里酶18)CFP-T7-H21(R62D、D106K、Q110L、A113R)锥毛壳属氨基酸序列
序列号176CFP-T7-H21碱基序列
序列号177(阿马多里酶19)CFP-T7-H24(R62D、L63A、D106K、Q110L、A113K)锥毛壳属氨基酸序列
序列号178CFP-T7-H24碱基序列
序列号179(阿马多里酶21)CFP-T7-H26(R62D、L63H、D106K、Q110L、A113K)锥毛壳属氨基酸序列
序列号180CFP-T7-H26碱基序列
序列号181(阿马多里酶23)CFP-T7-H28(R62D、L63H、E102K、D106K、Q110L、A113K)锥毛壳属氨基酸序列
序列号182CFP-T7-H28碱基序列
序列号183(阿马多里酶24)CFP-T7-H29(R62D、L63H、D106K、Q110L、A113K、A419K)锥毛壳属氨基酸序列
序列号184CFP-T7-H29碱基序列
序列号185(阿马多里酶31)(AnFX-61D/62H/101K/105K/109L/112K/355S)构巢曲霉氨基酸序列
序列号186编码序列号185的氨基酸序列的碱基序列
序列号187(阿马多里酶33)(PnFX-62D/63H/106K/110L/113K/351S)颖枯壳针孢氨基酸序列
序列号188编码序列号187的氨基酸序列的碱基序列
序列号189(阿马多里酶34)(CnFX-62D/106K/110L/113K)新型隐球菌氨基酸序列
序列号190编码序列号189的氨基酸序列的碱基序列
序列号191(阿马多里酶35)(Cc95FX-62D/63H/106K/110L/113K/353S)棒弯孢氨基酸序列
序列号192编码序列号191的氨基酸序列的碱基序列
序列号193血红蛋白β链的氨基酸序列
Claims (19)
1.一种试样中的α－果糖基低聚肽的测定方法，其特征在于，使阿马多里酶与含有以下αF3P～αF16P中任1个以上的试样作用，测定通过该作用产生的过氧化氢或被消耗的氧，其中，所述阿马多里酶作用于αF3P～αF16P中任1个以上的α－果糖基低聚肽，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酸，即αF3P，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酸，即αF4P，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酸，即αF5P，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酸，即αF6P，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酸，即αF7P，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酸，即αF8P，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酸，即αF9P，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酸，即αF10P，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酸，即αF11P，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酸，即αF12P，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酸，即αF13P，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酰基亮氨酸，即αF14P，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酰基亮氨酰基色氨酸，即αF15P，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酰基亮氨酰基色氨酰基甘氨酸，即αF16P。
2.一种试样中的α－果糖基肽的测定方法，其特征在于，使阿马多里酶与含有(a)～(f)中任1个以上的试样作用，测定通过该作用生成的过氧化氢或被消耗的氧，其中，所述阿马多里酶作用于(a)～(f)中任1个以上的α－果糖基肽，
(a)α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酸，即αF3P，
(b)α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酸，即αF4P，
(c)α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酸，即αF5P，
(d)α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酸，即αF6P，
(e)α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酸，即αF8P，
(f)α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酰基亮氨酰基色氨酰基甘氨酸，即αF16P。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，试样进一步含有α－果糖基缬氨酸即αF1P或α－果糖基缬氨酰基组氨酸即αF2P，阿马多里酶进一步作用于α－果糖基缬氨酸即αF1P或α－果糖基缬氨酰基组氨酸即αF2P，也测定通过该作用生成的过氧化氢或被消耗的氧。
4.一种试样中的血红蛋白A1c的测定方法，其特征在于，利用蛋白酶处理试样，使含有以下αF3P～αF16P中任1个以上的α－果糖基低聚肽游离，使阿马多里酶与其作用，测定通过该作用生成的过氧化氢或被消耗的氧，其中，所述阿马多里酶将游离的α－果糖基低聚肽中的任1个以上氧化，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酸，即αF3P，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酸，即αF4P，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酸，即αF5P，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酸，即αF6P，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酸，即αF7P，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酸，即αF8P，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酸，即αF9P，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酸，即αF10P，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酸，即αF11P，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酸，即αF12P，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酸，即αF13P，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酰基亮氨酸，即αF14P，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酰基亮氨酰基色氨酸，即αF15P，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酰基亮氨酰基色氨酰基甘氨酸，即αF16P。
5.一种试样中的血红蛋白A1c的测定方法，其特征在于，利用蛋白酶处理试样，使含有(a)～(f)中任1个以上的糖基化肽游离，使阿马多里酶作用，测定通过该作用生成的过氧化氢或被消耗的氧，其中，所述阿马多里酶将游离的含有(a)～(f)中任1个以上的糖基化肽氧化，
(a)α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酸，即αF3P，
(b)α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酸，即αF4P，
(c)α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酸，即αF5P，
(d)α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酸，即αF6P，
(e)α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酸，即αF8P，
(f)α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酰基亮氨酰基色氨酰基甘氨酸，即αF16P。
6.权利要求4或5所述的方法，其特征在于，通过利用蛋白酶处理试样进一步使α－果糖基缬氨酸即αF1P或α－果糖基缬氨酰基组氨酸即αF2P游离，阿马多里酶进一步作用于α－果糖基缬氨酸即αF1P或α－果糖基缬氨酰基组氨酸即αF2P，也测定通过该作用生成的过氧化氢或被消耗的氧。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的测定方法，其中，阿马多里酶来自锥毛壳(Coniochaeta)属、正青霉(Eupenicillium)属、棘壳孢菌(Pyrenochaeta)属、节菱孢菌(Arthrinium)属、弯孢菌(Curvularia)属、新赤壳菌(Neocosmospora)属、隐球菌(Cryptococcus)属、暗球腔菌(Phaeosphaeria)属、曲霉(Aspergillus)属、翘孢霉(Emericella)属、细基格孢(Ulocladium)属或青霉(Penicillium)属。
8.根据权利要求1～6中任一项所述的测定方法，其中，阿马多里酶来自锥毛壳属(Coniochaetasp.)、土正青霉(Eupenicilliumterrenum)、棘壳孢菌属(Pyrenochaetasp.)、节菱孢菌属(Arthriniumsp.)、棒弯孢(Curvulariaclavata)、侵管新赤壳菌(Neocosmosporavasinfecta)、新型隐球菌(Cryptococcusneoformans)、颖枯壳针孢(Phaeosphaerianodorum)、构巢曲霉(Aspergillusnidulans)、构巢裸胞壳(Emericellanidulans)属、细基格孢属(Ulocladiumsp.)或微紫青霉菌(Penicilliumjanthinellum)。
9.根据权利要求1～6中任一项所述的测定方法，其中，阿马多里酶是选自以下的阿马多里酶，
(i)具有在序列号141表示的氨基酸序列中进行1个或多个氨基酸的取代、缺失或添加而成的氨基酸序列的阿马多里酶，
(ii)所述(i)的阿马多里酶中，该阿马多里酶的全长氨基酸序列与序列号141的氨基酸序列具有70％以上的序列同源性，且由序列号141的第10位～32位、36～41位、49～52位、54～58位、73～75位、84～86位、88～90位、120～122位、145～150位、156～162位、164～170位、180～182位、202～205位、207～211位、214～224位、227～230位、236～241位、243～248位、258～261位、266～268位、270～273位、275～287位、295～297位、306～308位、310～316位、324～329位、332～334位、341～344位、346～355位、357～363位、370～383位、385～387位、389～394位、405～410位和423～431位的氨基酸序列构成的相同性区域的氨基酸序列和该阿马多里酶的对应位置的相同性区域的氨基酸序列具有90％以上的序列同源性的阿马多里酶。
10.根据权利要求1、2、4、5和7～9中任一项所述的方法，其中，进一步使用将α－果糖基缬氨酸或α－果糖基缬氨酰基组氨酸氧化的阿马多里酶。
11.一种试样中的α－果糖基肽测定用试剂盒，其特征在于，含有以下的成分(1)和(2)，
(1)阿马多里酶，具有将以下αF3P～αF16P中任1个以上氧化而生成过氧化氢的作用，和
(2)用于测定过氧化氢的试剂；
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酸，即αF3P，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酸，即αF4P，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酸，即αF5P，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酸，即αF6P，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酸，即αF7P，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酸，即αF8P，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酸，即αF9P，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酸，即αF10P，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酸，即αF11P，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酸，即αF12P，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酸，即αF13P，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酰基亮氨酸，即αF14P，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酰基亮氨酰基色氨酸，即αF15P，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酰基亮氨酰基色氨酰基甘氨酸，即αF16P。
12.一种试样中的α－果糖基肽测定用试剂盒，其特征在于，含有以下成分(1)和(2)，
(1)阿马多里酶，具有将含有(a)～(f)中任1个以上的糖基化肽氧化而生成过氧化氢的作用，和
(2)用于测定过氧化氢的试剂；
(a)α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酸，即αF3P，
(b)α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酸，即αF4P，
(c)α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酸，即αF5P，
(d)α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酸，即αF6P，
(e)α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酸，即αF8P，
(f)α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酰基亮氨酰基色氨酰基甘氨酸，即αF16P。
13.根据权利要求11或12所述的试剂盒，其中，阿马多里酶进一步具有将α－果糖基缬氨酸基αF1P或α－果糖基缬氨酰基组氨酸即αF2P氧化而生成过氧化氢的作用。
14.一种试样中的血红蛋白A1c的测定用试剂盒，其特征在于，含有以下的(1)～(3)的成分，
(1)蛋白酶，水解HbA1c的β链，使含有以下αF3P～αF16P中任1个以上的糖基化肽游离，
(2)阿马多里酶，具有将以下αF3P～αF16P中任1个以上氧化而生成过氧化氢的作用，和
(3)用于测定过氧化氢的试剂；
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酸，即αF3P，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酸，即αF4P，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酸，即αF5P，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酸，即αF6P，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酸，即αF7P，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酸，即αF8P，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酸，即αF9P，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酸，即αF10P，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酸，即αF11P，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酸，即αF12P，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酸，即αF13P，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酰基亮氨酸，即αF14P，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酰基亮氨酰基色氨酸，即αF15P，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酰基亮氨酰基色氨酰基甘氨酸，即αF16P。
15.一种试样中的血红蛋白A1c的测定用试剂盒，其特征在于，含有以下的(1)～(3)的成分，
(1)蛋白酶，水解HbA1c的β链，使含有(a)～(f)中任1个以上的糖基化肽游离，
(2)阿马多里酶，具有将含有(a)～(f)中任1个以上的糖基化肽氧化而生成过氧化氢的作用，和
(3)用于测定过氧化氢的试剂；
(a)α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酸，即αF3P，
(b)α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酸，即αF4P，
(c)α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酸，即αF5P，
(d)α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酸，即αF6P，
(e)α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酸，即αF8P，
(f)α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酰基亮氨酰基色氨酰基甘氨酸，即αF16P。
16.根据权利要求14或15所述的试剂盒，其中，(1)蛋白酶进一步水解HbA1c的β链而使α－果糖基缬氨酸即αF1P或α－果糖基缬氨酰基组氨酸即αF2P游离，(2)阿马多里酶进一步具有将α－果糖基缬氨酸即αF1P或α－果糖基缬氨酰基组氨酸即αF2P氧化而生成过氧化氢的作用。
17.根据权利要求11～16中任一项所述的试剂盒，其中，阿马多里酶来自锥毛壳(Coniochaeta)属、正青霉(Eupenicillium)属、棘壳孢菌(Pyrenochaeta)属、节菱孢菌(Arthrinium)属、弯孢菌(Curvularia)属、新赤壳菌(Neocosmospora)属、隐球菌(Cryptococcus)属、暗球腔菌(Phaeosphaeria)属、曲霉(Aspergillus)属、翘孢霉(Emericella)属、细基格孢(Ulocladium)属或青霉(Penicillium)属。
18.根据权利要求11～16中任一项所述的试剂盒，其中，阿马多里酶是选自以下的阿马多里酶，
(i)具有在序列号141表示的氨基酸序列进行1个或多个氨基酸的取代、缺失或添加而成的氨基酸序列的阿马多里酶，
(ii)所述(i)的阿马多里酶中，该阿马多里酶的全长氨基酸序列与序列号141的氨基酸序列具有70％以上的序列同源性，且由序列号141的第10位～32位、36～41位、49～52位、54～58位、73～75位、84～86位、88～90位、120～122位、145～150位、156～162位、164～170位、180～182位、202～205位、207～211位、214～224位、227～230位、236～241位、243～248位、258～261位、266～268位、270～273位、275～287位、295～297位、306～308位、310～316位、324～329位、332～334位、341～344位、346～355位、357～363位、370～383位、385～387位、389～394位、405～410位和423～431位的氨基酸序列构成的相同性区域的氨基酸序列和该阿马多里酶的对应位置的相同性区域的氨基酸序列具有90％以上的序列同源性的阿马多里酶。
19.一种试样中的α－果糖基低聚肽的测定方法，其特征在于，使阿马多里酶与含有以下αF1P～αF32P中任1个以上的试样作用，测定通过该作用生成的过氧化氢或被消耗的氧，其中，所述阿马多里酶作用于αF1P～αF32P中任1个以上的α－果糖基低聚肽，
α－果糖基缬氨酸，即αF1P，
α－果糖基缬氨酰基组氨酸，即αF2P，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酸，即αF3P，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酸，即αF4P，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酸，即αF5P，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酸，即αF6P，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酸，即αF7P，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酸，即αF8P，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酸，即αF9P，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酸，即αF10P，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酸，即αF11P，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酸，αF12P，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酸，即αF13P，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酰基亮氨酸，即αF14P，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酰基亮氨酰基色氨酸，即αF15P，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酰基亮氨酰基色氨酰基甘氨酸，即αF16P，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酰基亮氨酰基色氨酰基甘氨酰基赖氨酸，即αF17P，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酰基亮氨酰基色氨酰基甘氨酰基赖氨酰基缬氨酸，即αF18P，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酰基亮氨酰基色氨酰基甘氨酰基赖氨酰基缬氨酰基天冬酰胺，即αF19P，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酰基亮氨酰基色氨酰基甘氨酰基赖氨酰基缬氨酰基天冬酰胺酰基缬氨酸，即αF20P，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酰基亮氨酰基色氨酰基甘氨酰基赖氨酰基缬氨酰基天冬酰胺酰基缬氨酰基天冬氨酸，即αF21P，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酰基亮氨酰基色氨酰基甘氨酰基赖氨酰基缬氨酰基天冬酰胺酰基缬氨酰基天冬氨酰基谷氨酸，即αF22P，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酰基亮氨酰基色氨酰基甘氨酰基赖氨酰基缬氨酰基天冬酰胺酰基缬氨酰基天冬氨酰基谷氨酰基缬氨酸，αF23P，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酰基亮氨酰基色氨酰基甘氨酰基赖氨酰基缬氨酰基天冬酰胺酰基缬氨酰基天冬氨酰基谷氨酰基缬氨酰基甘氨酸，即αF24P，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酰基亮氨酰基色氨酰基甘氨酰基赖氨酰基缬氨酰基天冬酰胺酰基缬氨酰基天冬氨酰基谷氨酰基缬氨酰基甘氨酰基甘氨酸，即αF25P，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酰基亮氨酰基色氨酰基甘氨酰基赖氨酰基缬氨酰基天冬酰胺酰基缬氨酰基天冬氨酰基谷氨酰基缬氨酰基甘氨酰基甘氨酰基谷氨酸，即αF26P，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酰基亮氨酰基色氨酰基甘氨酰基赖氨酰基缬氨酰基天冬酰胺酰基缬氨酰基天冬氨酰基谷氨酰基缬氨酰基甘氨酰基甘氨酰基谷氨酰基丙氨酸，即αF27P，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酰基亮氨酰基色氨酰基甘氨酰基赖氨酰基缬氨酰基天冬酰胺酰基缬氨酰基天冬氨酰基谷氨酰基缬氨酰基甘氨酰基甘氨酰基谷氨酰基丙氨酰基亮氨酸，即αF28P，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酰基亮氨酰基色氨酰基甘氨酰基赖氨酰基缬氨酰基天冬酰胺酰基缬氨酰基天冬氨酰基谷氨酰基缬氨酰基甘氨酰基甘氨酰基谷氨酰基丙氨酰基亮氨酰基甘氨酸，即αF29P，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酰基亮氨酰基色氨酰基甘氨酰基赖氨酰基缬氨酰基天冬酰胺酰基缬氨酰基天冬氨酰基谷氨酰基缬氨酰基甘氨酰基甘氨酰基谷氨酰基丙氨酰基亮氨酰基甘氨酰基精氨酸，即αF30P，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酰基亮氨酰基色氨酰基甘氨酰基赖氨酰基缬氨酰基天冬酰胺酰基缬氨酰基天冬氨酰基谷氨酰基缬氨酰基甘氨酰基甘氨酰基谷氨酰基丙氨酰基亮氨酰基甘氨酰基精氨酰基亮氨酸，即αF31P，
α－果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酰基谷氨酰基赖氨酰基丝氨酰基丙氨酰基缬氨酰基苏氨酰基丙氨酰基亮氨酰基色氨酰基甘氨酰基赖氨酰基缬氨酰基天冬酰胺酰基缬氨酰基天冬氨酰基谷氨酰基缬氨酰基甘氨酰基甘氨酰基谷氨酰基丙氨酰基亮氨酰基甘氨酰基精氨酰基亮氨酰基亮氨酸，即αF32P。
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