CN105671073A - 供植物中基因靶向用的工程化降落场 - Google Patents

Abstract

本发明涉及供植物中基因靶向用的工程化降落场，具体地涉及一种用于生成转基因植物的方法包括提供包含与植物细胞的基因组DNA缺乏序列同源性的至少两个核酸序列区和至少两个锌指核酸酶识别位点的核酸分子，其中与植物细胞的基因组DNA缺乏序列同源性的至少两个核酸序列区在至少两个锌指核酸酶识别位点侧翼。转化具有稳定整合入植物细胞的基因组中的核酸分子的植物细胞或组织。自植物细胞再生植物。通过所述方法生成转基因植物。通过转基因植物生成种子。

Description

供植物中基因靶向用的工程化降落场

本发明申请是基于申请日为2011年1月21日，申请号为201180015548.8(国际申请号为PCT/US2011/022145)，名称为“供植物中基因靶向用的工程化降落场”的发明专利申请的分案申请。

优先权要求

本申请要求2010年1月22日提交的美国临时专利申请流水号61/297,641关于“ENGINEEREDLANDINGPADSFORGENETARGETINGINPLANTS”的提交日的权益。

发明领域

一般地，本发明涉及用于生成转基因生物体，例如植物的组合物和方法。在某些实施方案中，本发明的方法容许将工程化降落场(engineeredlandingpad,ELP)掺入基因组位点中，由此便于将其它感兴趣的核酸分子导入含有一个或多个ELP的限定基因组位点中。在一些实施方案中，ELP可以包含含有在锌指核酸酶(ZFN)结合位点侧翼的基本上随机的序列的核苷酸序列区。

发明背景

许多植物用来自其它物种的基因遗传转化以导入期望的性状，诸如以经由例如改善营养价值质量、提高产量、赋予有害物或疾病抗性、提高干旱和应激耐受性、改善园艺质量诸如色素沉着和生长、和/或赋予除草剂抗性；实现自植物生成工业上有用的化合物和/或材料；和/或实现药物的生成来改善农业价值。克隆基因对植物细胞的导入和稳定的能育转基因植物的回收可以用于进行植物的此类修饰，并且已经容许植物的遗传工程(例如用于作物改良)。在这些方法中，通常将外来DNA随机导入真核植物细胞的核或质体DNA中，接着分离含有整合入细胞的DNA中的外来DNA的细胞，以生成经稳定转化的植物细胞。

第一代转基因植物通常通过土壤杆菌属(Agrobacterium)介导的转化技术生成。用这些技术获得的成功激励开发将感兴趣的核酸分子导入植物基因组中的其它方法，诸如原生质体中PEG介导的DNA摄取、微粒轰击、和硅须晶(whisker)介导的转化。

然而，在所有这些植物转化方法中，掺入植物基因组中的转基因以随机方式且以不可预测的拷贝数整合。通常，转基因可以以整个转基因或其部分的重复形式整合。此类复杂的整合样式可以影响转基因的表达水平(例如，通过经由转录后基因沉默机制破坏转录的RNA，或者通过诱导对导入DNA的甲基化实现)，由此下调转基因的转录。还有，整合位点本身可以影响转基因的表达水平。这些因素的组合导致感兴趣的转基因或外来DNA在不同转基因植物细胞和植物系间的表达水平的广泛变化。此外，感兴趣的外来DNA的整合可以对基因组中发生整合的区域具有破坏性影响，而且可以影响或扰乱所述靶区域的正常功能，由此经常导致不想要的副作用。

以上需要无论何时调查将特定外来DNA导入植物中的影响，生成并分析大量转基因植物系以获得显著的结果。同样地，在转基因作物植物的世代中，在植物中导入感兴趣的特定DNA以提供具有期望表型的转基因植物的情况中，创建独立创建的转基因植物系的大群体以容许选择具有最佳转基因表达，且对转基因植物的总体表型具有最小或无副作用的那些植物系。特别在此领域中，例如鉴于繁琐的管理要求和与消除不想要的转基因事件需要的重复田间试验有关的高成本，更定向的转基因方法是期望的。此外，会清楚的是，靶向性DNA插入的可能性在转基因叠加过程中也会是有益的。

已开发出几种方法以控制植物中的转基因插入。见例如Kumar和Fladung(2001)TrendsPlantSci.6:155-9。这些方法依赖于基于同源重组的转基因整合。此策略已经在原核生物和低等真核生物中成功应用。Paszkowski等(1988)EMBOJ.7:4021-6。然而，对于植物，直到最近，转基因整合的主要机制基于非常规重组，其牵涉重组DNA链间很少的同源性。因此，此领域中的主要挑战是检测罕见的同源重组事件，其被经由非常规重组有效得多地整合导入的外来DNA掩盖。

定制设计的锌指核酸酶(ZFN)是为了提供DNA中靶定位点特异性双链断裂，随后重组切割末端设计的蛋白质。ZFN组合限制性内切核酸酶，诸如例如FokI的非特异性切割域与锌指DNA结合蛋白。见例如Huang等(1996)J.ProteinChem.15:481-9；Kim等(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:3616-20；Kim等(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:1156-60；Kim等(1994)ProcNatl.Acad.Sci.USA91:883-7；Kim等(1997b)Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:12875-9；Kim等(1997c)Gene203:43-9；Kim等(1998)Biol.Chem.379:489-95；Nahon和Raveh(1998)NucleicAcidsRes.26:1233-9；Smith等(1999)NucleicAcidsRes.27:674-81。各个锌指基序可以设计为靶向并结合大范围的DNA位点。规范的Cys₂His₂及非规范的Cys₃His锌指蛋白通过将α-螺旋插入双螺旋的大沟中结合DNA。锌指对DNA的识别是模块的：每个指主要接触靶物中的三个连续的碱基对，并且蛋白质中的几个关键残基介导识别。已经显示了FokI限制性内切核酸酶必须经由核酸酶域二聚化以切割DNA，诱导双链断裂。类似地，ZFN也需要核酸酶域的二聚化以切割DNA。Mani等(2005)Biochem.Biophys.Res.Commun.334:1191-7；Smith等(2000)NucleicAcidsRes.28:3361-9。ZFN的二聚化由两个相邻的、相反取向的结合位点促进。同上文。

发明概述

本文中公开了将核酸分子导入展现出低同源重组率的宿主生物体，例如，植物或动物物种的基因组中的方法。在具体的例子中，使用“工程化降落场”(ELP)，其中ELP可以包含如下的核苷酸序列区，其包含在DNA结合域(例如，锌指蛋白(ZFP)、大范围核酸酶、或亮氨酸拉链)的结合位点侧翼的与宿主生物体的基因组基本上缺乏同源性的核苷酸序列(例如，随机生成的序列)。靶向ELP的结合位点的DNA结合域可以天然地包含DNA切割功能域或者可以是融合蛋白中进一步包含功能域，例如内切核酸酶切割域或切割半域(例如，ZFN、重组酶、转座酶、或归巢内切核酸酶，包括具有经修饰的DNA结合域的归巢内切核酸酶)的部分。此类DNA结合和切割蛋白在本文中统称为“靶向性内切核酸酶”。在具体的例子中，也可以使用来自与宿主生物体不同的生物来源的非随机化核苷酸序列；与靶生物体的基因组的非同源性是合适的。如此，在一些例子中，核苷酸序列可以设计为确保与任何测序的靶植物基因组的区域基本上没有同源性。

在一些例子中，ELP可以提供同源性区和靶向性内切核酸酶(例如，ZFN)的高活性的结合位点以进行同源性指导的基因靶向。因此，ELP可以降低或消除对在核酸插入物中使用外部或内部的其它核苷酸序列的需要。ELP可以设计为缺乏任何假的可读框，而且如优选的，含有或缺乏限制酶位点以构建载体或分析用感兴趣的核酸分子转化的植物。在一些例子中，ELP侧翼可以有不同限制性位点，其在限制酶消化后生成相容的末端，但是杂合的连接位点是任一种限制酶不可切割的。在这些和其它例子中，这容许将ELP串联成更大的排列(array)，它们各具有独特的同源性区和靶向性内切核酸酶结合位点(例如，ZFN结合位点)。

在一些例子中，ELP可以随机掺入靶基因组中，或者靶向至已经显示容纳转基因插入物的基因组位点，而对所得的转基因植物没有任何，或者具有可接受的有害影响。基因组靶位点中的同源性区可以与靶定的供体核酸分子中的同源性区相同，由此便于靶向性内切核酸酶(例如，ZFN)的双链切割后同源性指导的重组。

因而，公开了设计并生成ELP的方法以及使用ELP用感兴趣的核酸分子转化植物的方法。还公开了可用于本发明的核酸分子，和通过依照本发明的方法生成的经遗传修饰的植物。

具体地，本发明涉及如下各项：

1.一种用于生成转基因植物或植物组织的方法，该方法包括：

提供核酸分子，该核酸分子包含与植物细胞的基因组DNA基本上缺乏序列同源性的至少两个核酸序列区和至少一个靶向性内切核酸酶识别位点，其中与所述植物细胞的基因组DNA缺乏基本的性序列同源性的所述至少两个核酸序列区在所述至少一个靶向性内切核酸酶识别位点侧翼；

用所述核酸分子转化所述植物细胞或包含所述植物细胞的植物组织，其中所述核酸分子稳定整合入所述植物细胞的基因组中；并

自用所述核酸分子转化的所述植物细胞生成植物组织或再生植物。

2.项1的方法，其中所述核酸分子进一步包含不同限制性位点。

3.项2的方法，其中所述不同限制性位点包含相容的单链末端，其容许多个ELP的连环化。

4.项1的方法，其中与所述植物细胞的基因组DNA缺乏序列同源性的所述至少两个核酸序列区不包含可读框。

5.项1的方法，其中与所述植物细胞的基因组DNA缺乏序列同源性的所述至少一个核酸序列区不包含可读框。

6.项1的方法，其中与所述植物细胞的基因组DNA缺乏序列同源性的所述至少两个核酸序列区是约50bp至约3kb。

7.项1的方法，其中与所述植物细胞的基因组DNA缺乏序列同源性的所述至少两个核酸序列区选自下组中的一种或多种：序列IDNO1到10。

8.项1的方法，其中与所述植物细胞的基因组DNA缺乏序列同源性的所述至少两个核酸序列区和靶向性内切核酸酶包含序列ID15和16。

9.项1的方法，其中与所述植物细胞的基因组DNA缺乏序列同源性的所述至少两个核酸序列区和靶向性内切核酸酶包含并入用于转化单子叶植物、双子叶植物，包括芸苔的植物转化载体pDAB104137、pDAB104139、pDAB104141、或pDAB104143中的序列ID15和16。

10.依照项1的方法，其中所述靶向性内切核酸酶是锌指核酸酶。

11.项1的方法，其中所述核酸分子在所述植物细胞的基因组中稳定地随机整合。

12.项1的方法，其中所述核酸分子在所述植物细胞的基因组中在一个或多个已知靶位点处稳定整合。

13.项1的方法，其中所述核酸分子稳定整合入染色体或微型染色体的扩增区中。

14.通过项1的方法生成的转基因植物组织或植物。

15.由项14的转基因植物生成的种子。

16.一种用于生成转基因植物的方法，该方法包括：

提供自项8的转基因植物组织或植物分离的细胞或组织；

提供至少一种靶向性内切核酸酶或包含编码所述至少一种靶向性内切核酸酶的核酸序列的第一核酸分子，其中所述至少一种靶向性内切核酸酶识别导入所述转基因植物的基因组中的至少一个靶向性内切核酸酶识别位点；

提供第二核酸分子，其包含感兴趣的核酸序列和在所述感兴趣的核酸序列侧翼的两个额外的核酸序列，其中所述两个额外的核酸序列各与同基因组DNA缺乏序列同源性的两个核酸序列区之一同源；

将(i)所述至少一种靶向性内切核酸酶或所述第一核酸分子；和(ii)所述第二核酸分子导入所述植物细胞或组织中，其中所述感兴趣的核酸序列稳定整合入所述植物细胞的基因组中；并

自用所述第一和第二核酸分子转化的植物细胞或组织再生植物。

17.通过项16的方法生成的转基因植物。

18.由项17的转基因植物生成的种子。

19.项1的方法，其中所述核酸分子在每个末端侧翼有一个或多个额外的靶向性内切核酸酶识别位点。

20.项19的方法，其进一步包括将识别所述一个或多个额外的靶向性内切核酸酶识别位点的一种或多种靶向性内切核酸酶导入所述植物组织或植物中，其中自所述植物组织或植物的基因组切除所述核酸分子。

21.依照项16的方法，其中所述靶向性内切核酸酶是锌指核酸酶。

从参照附图进行的几个实施方案的以下详细描述看，上述和其它特征会变得更加显而易见。

附图简述

图1包括包含ELP的代表性载体pDAB100610的描绘。

图2包括包含ELP的代表性载体pDAB100611的描绘。

图3包括包含ELP的代表性载体pDAB100640的描绘。

图4包括包含ELP的代表性载体pDAB100641的描绘。

图5包括包含要整合入ELP中的供体片段的代表性载体pDAB105955的描绘。

图6包括包含要整合入ELP中的供体片段的代表性载体pDAB105956的描绘。

图7包括包含要整合入ELP中的供体片段的代表性载体pDAB105979的描绘。

图8包括包含要整合入ELP中的供体片段的代表性载体pDAB105980的描绘。

图9是a)玉米中的ELP1；b)用于ELP1再靶向的供体构建体；c)再靶定的ELP1基因座的示意图。

图10包括代表性载体pDAB104132的描绘。

图11包括侧翼有工程化锌指结合位点和缓冲序列(buffersequence)的多克隆位点的代表性DNA片段的描绘。

图12包括代表性载体pDAB104126的描绘。

图13包括代表性载体pDAB104136的描绘。

图14包括代表性载体pDAB104138的描绘。

图15包括代表性载体pDAB104140的描绘。

图16包括代表性载体pDAB104142的描绘。

图17包括代表性载体pDAB104133的描绘。

图18包括代表性载体pDAB104134的描绘。

图19包括代表性载体pDAB104135的描绘。

图20包括代表性载体pDAB104137的描绘。

图21包括代表性载体pDAB104139的描绘。

图22包括代表性载体pDAB104141的描绘。

图23包括代表性载体pDAB104143的描绘。

发明详述

I.几个实施方案的概述

在一些实施方案中，提供了用于将包含“工程化降落场”(ELP)的核酸分子导入宿主生物体中，从而便于其它感兴趣的核酸分子整合入宿主生物体中的方法。在实施方案中，ELP可以包含在靶向性内切核酸酶识别位点(例如，ZFN识别位点)侧翼的与宿主生物体的天然序列不同源的核酸序列区(例如，基本上随机生成的核酸序列，然后，其可以基于某些期望的标准为了插入而选择，如本文中公开的)。供整合ELP用的位点可以是随机的，可以通过例如鉴定宿主基因组内具有要在ELP的位点处导入的感兴趣核酸分子期望的水平表达的结构基因确定，或者可以通过鉴定宿主基因组内在所述位点处引入ELP时不对经转化的宿主生物体赋予代谢、功能、农艺学(若植物的话)或其它罚分(penalty)的位置确定。可以将ELP串联导入基因组中，使得例如ELP在依照本发明的方法生成的生物体中以多联体存在。

在一些实施方案中，在ELP位点处实施感兴趣的核酸分子的整合。在实施方案中，要在ELP位点处引入的感兴趣的核酸分子与以多肽提供的或自导入的RNA或DNA表达的一种或多种靶向性内切核酸酶联合。另外，导入的核酸分子可以包含与已经掺入宿主基因组中的ELP不同的ELP。本领域技术人员会领会在野生型生物体中表达天然核酸序列的位点处导入宿主基因组中的核酸序列预期会以与天然核酸序列相似的方式表达。例如，若在调节元件控制下在野生型生物体中表达天然核酸序列(例如，使得例如，核酸序列以组织特异性或发育特异性方式表达)，则预期导入的核酸序列会经历相同或相似的调节控制。如此，ELP可以便于在ELP位点处导入的感兴趣的核酸分子期望的时间和/或空间表达。

II.缩写

ELISA酶联免疫吸附测定法

ELP工程化降落场

ZFN锌指核酸酶

III.术语

基因表达：将核酸转录单元(包括例如，基因组DNA)的编码信息转化成细胞的操作的、非操作的、或结构的部分的过程，经常包括蛋白质的合成。基因表达可以受到外部信号影响；例如，将细胞、组织、或生物体暴露于提高或降低基因表达的媒介物。基因表达也可以在从DNA至RNA至蛋白质的途径中的任何地方受到调节。例如经由对转录、翻译、RNA转运和加工、对中间分子诸如mRNA的降解起作用的控制，或者经由特定蛋白质分子在它们生成后的活化、灭活、区室化(compartmentalization)、或降解，或者通过其组合发生基因表达的调节。基因表达可以通过本领域中已知的任何方法在RNA水平或蛋白质水平测量基因表达，包括但不限于Northern印迹、RT-PCR、Western印迹、或体外、原位、或体内蛋白质活性测定法。

杂交：寡核苷酸及其类似物通过互补碱基间的氢键合(其包括沃森-克里克(WatsonCrick)、Hoogsteen或反Hoogsteen氢键合)杂交。一般地，核酸分子由作为嘧啶(胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U)和胸腺嘧啶(T))或嘌呤(腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G))的含氮碱基组成。这些含氮碱基在嘧啶和嘌呤间形成氢键，并且嘧啶与嘌呤的键合称为“碱基配对”。更具体地，A或与T或U氢键合，而G会与C键合。“互补的”指两种独特的核酸序列或相同核酸序列的两个独特区间发生的碱基配对。

“可特异性杂交的”和“特异性互补的”是指足够的互补性程度，使得在寡核苷酸和DNA或RNA靶物间发生稳定的且特异性的结合的术语。寡核苷酸与要可特异性杂交的其靶序列不需要是100％互补的。在寡核苷酸对靶DNA或RNA分子的结合干扰靶DNA或RNA的正常功能，并且有足够的互补性程度以避免寡核苷酸在期望特异性结合的条件下，例如，在体内测定法或系统的情况中在生理学条件下与非靶序列的非特异性结合时，寡核苷酸是可特异性杂交的。此类结合称为特异性杂交。

导致特定严格性程度的杂交条件会随选择的杂交方法的性质和杂交核酸序列的组成和程度而有所变化。一般地，杂交温度和杂交缓冲液的离子强度(尤其是Na⁺和/或Mg²⁺浓度)会促成杂交的严格性，尽管清洗次数也影响严格性。关于获得特定的严格性程度需要的杂交条件的计算在Sambrook等(编),MolecularCloning:ALaboratoryManual,第2版,第1-3卷,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork,1989,第9章和第11章中讨论。

出于本公开内容的目的，“严格条件”涵盖若杂交分子与靶序列间存在有小于25％错配会发生杂交的条件。“严格条件”可以进一步限定成特定的严格性水平。如此，如本文中所使用的，“中等严格性”条件是具有超过25％错配的分子不会杂交的条件。“中间严格性”条件是具有超过15％错配的分子不会杂交的条件，而“高严格性”条件是具有超过10％错配的序列不会杂交的条件。“极高严格性”条件是具有超过6％错配的序列不会杂交的条件。

在具体的实施方案中，严格条件可以包括于65℃杂交，接着于65℃用0.1xSSC/0.1％SDS连续清洗40分钟。

分离的：“分离的”生物组分(诸如核酸或蛋白质)已经与该组分天然存在的生物体细胞中的其它生物组分，即，其它染色体和染色体外DNA和RNA及蛋白质基本上分开、离开其生成、远离其纯化。已经“分离的”核酸分子和蛋白质包括通过标准纯化方法纯化的核酸分子和蛋白质。该术语还包括通过宿主细胞中的重组表达制备的核酸和蛋白质以及化学合成的核酸分子、蛋白质和肽。

核酸分子：核苷酸的聚合形式，其可以包括RNA、cDNA、基因组DNA的有义和反义链两者，和上述物质的合成形式和混合聚合物。核苷酸指核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、或任一类核苷酸的修饰形式。如本文中使用的，“核酸分子”与“核酸”和“多核苷酸”是同义的。该术语包括单和双链形式的DNA。核酸分子可以包括通过天然存在的和/或非天然存在的核苷酸联接连接在一起的天然存在的和经修饰的核苷酸中的任一种或两种。

核酸分子可以是经化学或生物化学修饰的，或者可以含有非天然的或衍生化的核苷酸碱基，如本领域技术人员会容易领会的。此类修饰包括例如，标记、甲基化、和用类似物替代一种或多种天然存在的核苷酸。其它修饰包括核苷酸间修饰，诸如不带电荷的连接(例如，膦酸甲酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)、带电荷的连接(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)、悬垂的模块(例如，肽)、插入剂(例如，吖啶、补骨脂素(psoralen)等)、螯合剂、烷化剂、和经修饰的连接(例如，α异头核酸等)。术语“核酸分子”还包括任何拓扑构象，包括单链、双链、部分双链体的、三链体的、发夹的、环状、和挂锁的构象。

可操作连接的：在第一核酸序列在与第二核酸序列的功能性关系中时，第一核酸序列与第二核酸序列可存在连接。例如，在启动子影响编码序列的转录或表达时，启动子与编码序列可操作连接。在重组生成时，可操作连接的核酸序列一般是连续的，且在必需连接两个蛋白质编码区的情况中，处于相同阅读框中。然而，元件不需要为了是可操作连接的而是连续的。

启动子：转录需要的一般位于上游(朝向基因的5’区)的DNA区。启动子容许其控制的基因的正确活化或阻抑。启动子含有转录因子识别的特定序列。这些因子结合启动子DNA序列，并且导致RNA聚合酶，即自基因的编码区合成RNA的酶的募集。在一些实施方案中，使用组织特异性启动子。组织特异性启动子是在相对于生物体的其它组织而言启动子是特异性的组织中指导关联基因的较高水平转录的DNA序列。组织特异性启动子的例子包括绒毡层特异性启动子；花药特异性启动子；花粉特异性启动子(见例如美国专利No.7,141,424和国际PCT公开文本No.WO99/042587)；胚珠特异性启动子(见例如美国专利申请No.2001/047525A1)；果实特异性启动子(见例如美国专利No.4,943,674和5,753,475)；和种子特异性启动子(见例如，美国专利No.5,420,034和5,608,152)。在一些实施方案中，也使用发育阶段特异性启动子，例如，在较晚的发育阶段有活性的启动子。

转化的：在病毒或载体将核酸分子转移入细胞中时其“转化”或“转导”细胞。在核酸分子通过将核酸分子整合入细胞基因组中，或者通过附加体复制被细胞稳定复制时，细胞被转导入细胞中的核酸分子“转化”。如本文中使用的，术语“转化”涵盖可以将核酸分子导入此类细胞中的所有技术。例子包括但不限于用病毒载体转染、用质粒载体转化、电穿孔(Fromm等(1986)Nature319:791-3)、脂转染(Felgner等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:7413-7)、微注射(Mueller等(1978)Cell15:579-85)、土壤杆菌属介导的转移(Fraley等(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:4803-7)、直接的DNA摄取、和微粒轰击(Klein等(1987)Nature327:70)。

转基因：外源核酸序列。在一个例子中，转基因是基因序列(例如，除草剂抗性基因)、编码工业或药学上有用的化合物的基因、或编码期望的农业性状的基因。在又一个实施方案中，转基因是反义核酸序列，其中反义核酸序列的表达展现出靶核酸序列的表达。转基因可以含有与转基因可操作连接的调节序列(例如，启动子)。在一些实施方案中，要通过ELP靶向性重组引入的感兴趣的核酸分子是转基因。然而，在其它实施方案中，感兴趣的核酸分子是内源核酸序列，其中内源核酸序列的额外的基因组拷贝是期望的，或相对于宿主生物体中的靶核酸分子处于反义取向的核酸分子。

载体：如导入细胞中，由此生成经转化的细胞的核酸分子。载体可以包括容许其在宿主细胞中复制的核酸序列，诸如复制起点。例子包括但不限于质粒、粘粒、噬菌体、或将外源DNA携带到细胞中的病毒。载体还可以包含一种或多种基因、反义分子、和/或选择标志基因和本领域中已知的其它遗传元件。载体可以转导、转化、或感染细胞，由此引起细胞表达由载体编码的核酸分子和/或蛋白质。任选地，载体可以包含帮助实现核酸分子进入细胞中的材料(例如，脂质体、蛋白质编码等)。

IV.供植物中基因靶向用的工程化降落场

A.概述

在一些实施方案中，将ELP导入植物中，例如以便于引入一种或多种其它感兴趣的核酸分子。其它感兴趣的核酸分子可以包含例如编码要在宿主生物体中表达的蛋白质的任何核酸序列。在其它实施方案中，使用ELP以便于引入未知功能的核酸分子，从而基于异位基因表达辨别其功能。在ELP侧翼的区域与宿主植物的基因组核酸序列可以是同源的，使得ELP以位点特异性方式整合入宿主植物基因组中。可以使用ELP以掺入各种长度的核酸分子。

在一些实施方案中，靶向至转基因ELP靶物的核酸分子可以含有第二ELP以容许靶位点处的继续基因添加。可以在此过程中序贯或同时使用一种或多种靶向性内切核酸酶(例如，ZFN)。若想要的话，可以另外在与宿主植物的基因组核酸序列同源的ELP区内部整合超过一个靶向性内切核酸酶结合位点(例如，ZFN结合位点)。在一些实施方案中，可以添加靶向性内切核酸酶结合位点，使得它们在ELP侧翼。在此后一种和其它实施方案中，在植物中在添加的结合位点处切割的靶向性内切核酸酶(例如，ZFN)的表达导致切除ELP。

在一些实施方案中，也可以与其它侧翼DNA组合使用与宿主植物的基因组核酸序列同源的区域以容许插入与在ELP靶物处引入的感兴趣的核酸分子相邻的核酸分子，诸如例如基因表达元件或感兴趣的基因。可以使用DNA切割以增强此位点处的同源重组。在一些实施方案中，也可以使用ELP中与基因组核酸序列同源的同源性区以靶向性插入核酸分子，其由切割DNA的酶，诸如ZFN、大范围核酸酶或其它靶向性内切核酸酶促进。

在一些实施方案中，ELP可以掺入经修饰的染色体区中，诸如可以通过DNA扩增过程或在微型染色体中生成。在一些实施方案中，使用同源性区和适当放置的靶向性内切核酸酶(例如，ZFN)以便于修饰在与宿主植物的基因组核酸序列同源的侧翼区内部的序列。

B.ELP的设计

在一些实施方案中，ELP可以设计为便于植物染色体位置中的同源重组。ELP对周围的基因或DNA序列可以具有中性的影响。ELP可以代表植物基因组内独特的、可靶向的序列。在某些实施方案中，期望的染色体位置的每个5’和3’同源性区的大小(例如，1kb)选择为满足认为对于便于同源性指导的重组期望的最小大小。在具体的实施方案中，每个5’和3’同源性区的大小是约50bp；100bp；200bp；400bp；600bp；700bp；750bp；800bp；1kb；1.2kb；1.4kb；1.6kb；1.8kb；2kb；或3kb。5’和3’同源性区在具体的实施方案中不需要是相同大小的。例如，可以使用用于随机数目生成的计算机程序生成ELP序列。然后，基于期望的特征，包括但不限于与靶生物体的天然基因组序列基本上或完全缺乏同源性的序列，可以选择例如通过随机序列生成所生成的ELP序列以用作ELP。也可以修饰选择的ELP，如下文进一步详述的。

在一些实施方案中，用于设计ELP和/或修饰选定的ELP的标准可以包括下列一项或多项：除去常规用于克隆的限制性位点；潜在甲基化位点(例如，CG和CNG)数目的减少；和缺乏大于300bp的任何可读框。另外，在ELP设计期间，可以除去核酸序列中的其它位点，包括例如：外显子:内含子连接(5’或3’)；多聚A添加信号；RNA聚合酶终止信号；和高度稳定的链内二级结构。也可以分析并修饰序列以降低TA或CG双联体的频率。也可以在ELP设计期间自序列除去具有超过约6个连续的[G+C]或[A+T]残基的序列区组。

在实施方案中，ELP可以包含例如式X1-Y-X2的核苷酸序列，其中Y是至少一个靶向性内切核酸酶结合位点(例如，ZFN结合位点)，其中X1是与宿主生物体的基因组缺乏同源性的选定核苷酸序列，并且位于Y的5’，且其中X2是同与X1不同的宿主生物体基因组缺乏同源性的选定核苷酸序列。

例示性的X1和X2核苷酸序列可以独立选自下列序列：SEQIDNO:1；SEQIDNO:2；SEQIDNO:3；SEQIDNO:4；SEQIDNO:5；SEQIDNO:6；SEQIDNO:7；SEQIDNO:8；SEQIDNO:9；和SEQIDNO:10。可以在一些实施方案中进行对这些序列的其它修饰、删除、或添加(例如，除去或添加限制性位点)以提供添加的或不同的功能性。例如，在某些实施方案中：可以修饰SEQIDNO:1以生成SEQIDNO:11；可以修饰SEQIDNO:3以生成SEQIDNO:12；可以修饰SEQIDNO:2以生成SEQIDNO:13；可以修饰SEQIDNO:4以生成SEQIDNO:14；可以修饰SEQIDNO:5以生成SEQIDNO:17；并且可以修饰SEQIDNO:6以生成SEQIDNO:18。

在具体的实施方案中，例示性的ELP包括但不限于下列序列：SEQIDNO:15；SEQIDNO:16；和SEQIDNO:19。

可以在ELP侧翼引入限制酶位点(例如，FseI限制酶位点)以实现ELP对合适的载体的克隆。也可以在ELP侧翼引入在限制酶消化后生成相容末端的限制酶位点(例如，BglII和BamHI位点)，以容许将ELP在宿主植物基因组中例如以多联体链接在一起。也可以引入限制酶位点以容许在宿主植物中分析随后通过重组靶向至ELP的感兴趣的核酸序列。可以在单个ELP侧翼引入两个或更多个限制酶位点。例如，BglII和BamHI位点可以包含在FseI位点内部。也可以引入限制酶位点以容许在宿主植物中分析通过重组靶向至插入的ELP的感兴趣的核酸序列。例如，可以引入PmeI位点以在插入位点侧翼。

C.将核酸分子投递入含有ELP的植物细胞中

为了经由靶向性整合实现感兴趣的核酸分子(例如，ELP和/或靶向至先前整合的ELP的外源核酸分子)对植物基因组的靶向性内切核酸酶介导的整合，需要投递靶向性内切核酸酶或靶向性内切核酸酶编码核酸分子，接着在植物细胞中表达功能性靶向性内切核酸酶蛋白。感兴趣的核酸分子还应当与其中投递或表达靶向性内切核酸酶同时存在于植物细胞中，使得功能性靶向性内切核酸酶蛋白可以在靶位点处诱导双链断裂，然后，其经由感兴趣的核酸分子对靶基因座的同源性驱动的整合来修复。本领域技术人员可以设想可以通过几种方法，包括但不限于靶向性内切核酸酶编码构建体的基因转移，或靶向性内切核酸酶编码构建体的瞬时表达实现功能性靶向性内切核酸酶蛋白的表达。在这两种情况中，植物细胞中功能性靶向性内切核酸酶蛋白的表达和供体DNA的投递可以同时实现以驱动靶向性整合。

如此，在具体的实施方案中，自经转化植物中的核酸分子表达靶向性内切核酸酶(例如，ZFN)以在经转化的植物的基因组中，例如在先前引入植物的一个或多个ELP中引入双链断裂。可以使用靶向性内切核酸酶，其靶向设计为存在于ELP中的一个或多个识别序列。因此，可以通过确定一种或多种特定的核酸序列开始用于构建本发明的ELP的设计和选择方法，所述一种或多种特定的核酸序列由随后要用于在ELP处引入感兴趣的核酸分子的靶向性内切核酸酶识别。ZFN系统的柔性和特异性提供先前通过已知的重组酶介导的基因切除策略不可实现的控制水平。

作为一个例子，可以容易地工程化改造ZFN，例如以识别特定的核酸序列(例如，ELP)。Wu等(2007)Cell.Mol.LifeSci.64:2933-44。锌指识别残基的密码子的随机化容许选择对任意选择的DNA序列具有高亲和力的新指。此外，锌指是天然的DNA结合分子，并且已经显示了工程化锌指对活细胞中其设计的靶物起作用。如此，基于锌指的核酸酶可靶向特定的但任意的识别位点。

对嵌合锌指核酸酶的切割域的二聚化的需要赋予高水平的序列特异性。因为三个指的每组结合9个连续的碱基对，所以若每个锌指域具有完全的特异性，则两个嵌合核酸酶有效要求18bp靶物。此长度的任何给定序列预测为在单一基因组内是独特的(假设约109bp)。Bibikova等(2001)Mol.Cell.Biol.21(1):289-97；Wu等(2007),见上文。此外，其它指提供增强的特异性，Beerli等(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:14628-33；Kim和Pabo(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:2812-7；Liu等(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:5525-30，因此可以增加每个DNA结合域中的锌指数目以提供甚至进一步的特异性。例如，可以通过使用识别24bp序列的一对4指ZFN来进一步提高特异性。Urnov等(2005)Nature435:646-51。如此，可以使用ZFN，使得导入宿主植物基因组中的ELP中的识别序列在基因组内是独特的。

通过ELP处的靶向性重组引入的感兴趣的核酸分子可以以足够的量与驱动基因表达的一种或多种植物启动子可操作连接以赋予期望的性状或表型。适合于这种和其它用途的启动子是本领域中公知的。描述此类启动子的非限制性例子包括美国专利No.6,437,217(玉米RS81启动子)；5,641,876(稻肌动蛋白启动子)；6,426,446(玉米RS324启动子)；6,429,362(玉米PR-1启动子)；6,232,526(玉米A3启动子)；6,177,611(组成性玉米启动子)；5,322,938、5,352,605、5,359,142、和5,530,196(35S启动子)；6,433,252(玉米L3油质蛋白启动子)；6,429,357(稻肌动蛋白2启动子和稻肌动蛋白2内含子)；5,837,848(根特异性启动子)；6,294,714(光诱导型启动子)；6,140,078(盐诱导型启动子)；6,252,138(病原性诱导型启动子)；6,175,060(磷缺乏诱导型启动子)；6,388,170(双向启动子)；6,635,806(gamma-薏苡辛(coixin)启动子)；和美国专利申请流水号09/757,089(玉米叶绿体醛缩酶启动子)。其它启动子包括胭脂氨酸合成酶(NOS)启动子(Ebert等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84(16):5745-9)；章鱼碱合酶(OCS)启动子(其在根癌土壤杆菌的肿瘤诱导质粒上携带)；花椰菜花叶病毒(caulimovirus)启动子，诸如花椰菜花叶病毒(CaMV)19S启动子(Lawton等(1987)PlantMol.Biol.9:315-24)；CaMV35S启动子(Odell等(1985)Nature313:810-2；玄参花叶病毒35S启动子(Walker等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84(19):6624-8)；蔗糖合酶启动子(Yang和Russell(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:4144-8)；R基因复合物启动子(Chandler等(1989)PlantCell1:1175-83)；叶绿素a/b结合蛋白基因启动子；CaMV35S(美国专利No.5,322,938,5,352,605,5,359,142和5,530,196)；FMV35S(美国专利No.6,051,753和5,378,619)；PC1SV启动子(美国专利No.5,850,019)；SCP1启动子(美国专利No.6,677,503)；和AGRtu.nos启动子(GenBank登录号V00087；Depicker等(1982)J.Mol.Appl.Genet.1:56173；Bevan等(1983)Nature304:184-7)等。

可以任选地与感兴趣的核酸分子可操作连接的其它遗传元件包括编码转运肽的序列。例如，已经显示了合适的叶绿体转运肽，诸如拟南芥(A.thaliana)EPSPSCTP(Klee等(1987)Mol.Gen.Genet.210:437-42)和矮牵牛(Petuniahybrida)EPSPSCTP(dellaCioppa等(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA83:6873-7)的掺入将异源EPSPS蛋白序列靶向至转基因植物中的叶绿体。也可以将麦草畏单加氧酶(Dicambamonooxygenase,DMO)靶向至叶绿体，如记载于国际PCT公开文本No.WO2008/105890的。

可以任选地与感兴趣的核酸分子可操作连接的其它遗传元件还包括位于启动子序列和功能为翻译前导序列的编码序列间的5’UTR。翻译前导序列存在于在翻译起始序列上游的完全加工的mRNA中。翻译前导序列可以影响前转录物(primarytranscript)加工成mRNA、mRNA稳定、和/或翻译效率。翻译前导序列的例子包括玉米和矮牵牛热休克蛋白前导物(美国专利No.5,362,865)、植物病毒壳体蛋白前导物、植物rubisco前导物等。见例如Turner和Foster(1995)MolecularBiotech.3(3):225-36。5’UTR的非限制性例子包括GmHsp(美国专利No.5,659,122)；PhDnaK(美国专利No.5,362,865)；AtAnt1；TEV(Carrington和Freed(1990)J.Virol.64:1590-7)；和AGRtunos(GenBank登录号V00087；和Bevan等(1983)Nature304:184-7)。

可以任选地与感兴趣的核酸分子可操作连接的其它遗传元件还包括3’非翻译序列、3’转录终止区、或多腺苷酸化区。这些是位于多核苷酸分子下游的遗传元件，并且包括提供多腺苷酸化信号的多核苷酸、和/或能够影响转录、mRNA加工、或基因表达的其它调节信号。多腺苷酸化信号在植物中发挥功能以引起多腺苷酸化核苷酸添加至mRNA前体的3’端。多腺苷酸化序列可以源自天然基因、多种植物基因、或T-DNA基因。3’转录终止区的非限制性例子是胭脂氨酸合成酶3’区(nos3’；Fraley等(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:4803-7)。在Ingelbrecht等,(1989)植物细胞1:671-80中提供使用不同3’非翻译区的例子。多腺苷酸化信号的非限制性例子包括来自豌豆(Pisumsativum)RbcS2基因(Ps.RbcS2E9；Coruzzi等(1984)EMBOJ.3:1671-9)和AGRtu.nos(GenBank登录号E01312)的。

D.用核酸分子转化宿主细胞

可以使用用于将核酸分子导入植物中的本领域中已知的任何技术来生成依照本发明的转化植物，例如以将一个或多个ELP引入宿主植物基因组中，和/或以进行引入感兴趣的核酸分子。认为适合于转化植物的方法实质上包括可以将DNA导入细胞中的任何方法，诸如：通过电穿孔，如美国专利No.5,384,253中例示的；通过微粒轰击，如美国专利No.5,015,580、5,550,318、5,538,880、6,160,208、6,399,861和6,403,865中例示的；通过土壤杆菌属介导的转化，如美国专利No.5,635,055,5,824,877,5,591,616；5,981,840和6,384,301中例示的；及通过原生质体转化，如美国专利No.5,508,184中列出的，等等。经由应用诸如这些技术，可以将实际上任何植物物种的细胞稳定转化，并且可以通过本领域技术人员已知的技术将这些细胞开发成转基因植物。例如，可以在棉转化背景中特别有用的技术披露于美国专利No.5,846,797,5,159,135,5,004,863和6,624,344；特别地，用于转化芸苔属(Brassica)植物的技术披露于例如美国专利No.5,750,871；用于转化大豆的技术披露于例如美国专利No.6,384,301；并且用于转化玉米的技术披露于例如美国专利No.7,060,876、美国专利No.5,591,616和国际PCT公开文本WO95/06722。

在实现外源DNA对接受细胞的投递后，一般地，鉴定经转化的细胞以进一步培养和植物再生。为了改善鉴定转化体的能力，可以期望与用于生成转化体的转化载体一起采用选择或筛选标志基因。在此情况中，可以通过将细胞暴露于一种或多种选择剂来测定潜在转化细胞群体，或者可以对细胞筛选期望的标志基因性状。

可将幸免于对选择剂暴露的细胞，或在筛选测定法中得分为正的细胞在支持植物再生的培养基中培养。在一些实施方案中，可通过包含其它物质，诸如生长调节物修饰任何合适的植物组织培养基(例如，MS和N6培养基)。可将组织在具有生长调节物的基础培养基上维持，直至足够的组织可用于开始植物再生努力，或者在手工选择的重复轮次后，直至组织的形态学适合于再生(例如，至少2周)，然后转移至进行枝条形成的培养基。周期性转移培养物，直至已经发生足够的枝条形成。一旦形成枝条，便将它们转移至进行根形成的培养基。一旦形成足够的根，可将植物转移至土壤以进一步生长和成熟。

为了确认感兴趣的核酸分子在再生植物中的存在，可以实施多种测定法。此类测定法包括例如：分子生物学测定法，诸如Southern和Northern印迹和PCR；生物化学测定法，诸如检测蛋白质产物的存在，例如，通过免疫学手段(ELISA和/或Western印迹)或者通过酶功能；植物部分测定法，诸如叶或根测定法；和分析再生的全植物的表型。

例如，可以使用例如对感兴趣的核酸分子特异性的寡核苷酸引物通过PCR扩增筛选靶向性整合事件。PCR基因型分型理解为包括但不限于源自分离的宿主植物愈伤组织(callustissue)的基因组DNA的聚合酶链式反应(PCR)扩增，接着进行PCR扩增产物的标准克隆和序列分析，所述宿主植物愈伤组织预测为含有整合入基因组中的感兴趣核酸分子。PCR基因型分型的方法已经充分描述(例如，Rios,G.等(2002)PlantJ.32:243-53)，并且可以应用于源自任何植物物种或组织类型，包括细胞培养物的基因组DNA。可以在PCR扩增反应中序贯使用或多重化(multiplex)结合靶序列和引入序列两者的寡核苷酸引物的组合。设计为与靶位点、引入的核酸序列、和/或两种的组合退火的寡核苷酸引物是可行的。如此，PCR基因型分型策略可以包括(但不限于)扩增植物基因组中的特异性序列、扩增植物基因组中的多个特异性序列、扩增植物基因组中的非特异性序列、或其组合。本领域技术人员可以设计引物和扩增反应的其它组合以询问基因组。例如，一组正向和反向寡核苷酸引物可以设计为与对在引入的核酸序列边界外部的靶物特异性的核酸序列退火。

正向和反向寡核苷酸引物可以设计为与引入的感兴趣核酸分子(例如，在与感兴趣的核酸分子内的编码区对应的序列处)或感兴趣的核酸分子的其它部分特异性退火。可以与上文所描述的引物联合使用这些引物。寡核苷酸引物可以依照期望的序列合成，并且是商品化的(例如，来自IntegratedDNATechnologies,Inc.,Coralville,IA)。扩增可以继之以克隆和测序，或者对扩增产物的直接序列分析。本领域技术人员可以设想用于分析PCR基因型分型期间生成的扩增产物的备选方法。在一个实施方案中，在PCR扩增中采用对基因靶物特异性的寡核苷酸引物。

E.转基因植物的培养和使用

包含一个或多个ELP和/或通过在依照本发明的ELP位点处的靶向性重组插入的感兴趣的核酸分子的转基因植物可以具有一种或多种期望的性状。此类性状可以包括例如：对昆虫、其它有害物和引起疾病的媒介物的抗性；对除草剂的耐受性；增强的稳定性、产量、或货架期；环境耐受性；药物生成；工业产品生成；和营养增强。期望的性状可以由在展现出期望性状的植物中表达的通过ELP位点处的靶向性重组插入的一种或多种核酸分子赋予。如此，在一些实施方案中，期望的性状可以是由于植物中存在转基因所致，所述转基因在ELP位点处导入植物基因组中。在又一个实施方案中，可以经由常规育种获得期望的性状，该性状可以由通过ELP位点处的靶向性重组插入的一种或多种核酸分子赋予。

依照本发明的转基因植物可以是能够用本发明的核酸分子转化的任何植物。因而，植物可以是双子叶植物或单子叶植物。在本方法中可用的双子叶植物的非限制性例子包括苜蓿、豆、花茎甘蓝(broccoli)、甘蓝(cabbage)、胡萝卜、花椰菜、芹菜、白菜(Chinesecabbage)、棉、黄瓜、茄子、莴苣、甜瓜(melon)、豌豆、胡椒、花生、马铃薯、南瓜、萝卜、油菜籽、菠菜、大豆、南瓜、甜菜、向日葵、烟草、番茄和西瓜。本方法中可用的单子叶植物的非限制性例子包括玉米、洋葱、稻、高粱、小麦、黑麦、黍(millet)、甘蔗、燕麦、黑小麦、柳枝稷和草地草(turfgrass)。

可以以任何方式使用或栽培依照本发明的转基因植物，其中ELP和/或感兴趣的核酸分子是想要的。因而，可以通过本领域技术人员已知的任何方法工程化改造为具有一种或多种期望的性状等(通过用依照本发明的核酸分子转化)，种植并栽培。

实施例

包括以下实施例以例示本发明的实施方案。本领域技术人员应当领会，实施例中公开的技术代表发明人发现的在实施本发明中运行良好的技术。然而，根据本公开内容，本领域技术人员应当领会可以在不偏离本发明范围的前提下对公开的具体实施方案做出许多变化，并且仍获得相似或类似的结果。更具体地，会显而易见的是，可以用化学和生理学相关的某些药剂替换本文中描述的药剂，同时会实现相同或类似的结果。本领域技术人员显而易见的所有此类相似替代和修改视为在本发明的范围内，如所附权利要求书限定的。

实施例1：载体构建

合成两种不同ELP，其由1kbp5’同源性区(pDAB100610/pDAB100640中的“工程化降落场区1”(SEQIDNO:11)和pDAB100611/pDAB100641中的“工程化合成同源性区3”(SEQIDNO:12))和1kbp3’同源性区(pDAB100610中的“工程化降落场区2”(SEQIDNO:13)和pDAB100611/pDAB100641中的“工程化合成同源性区4”(SEQIDNO:14))组成。这些同源性区以两种不同EXZACT锌指核酸酶(eZFN)结合位点分开。

使用LR克隆酶反应(Invitrogen,Carlsbad,CA)将分别用于pDAB100610和pDAB100611的两种ELP(称作ELP1(SEQIDNO:15)和ELP2(SEQIDNO:16))转移到pDAB100704，即一种源自pSB11的目的超二元载体(destinationsuperbinaryvector)(WO94/00977和WO95/06722)中。pDAB100704含有ZmUbi1启动子(源自玉蜀黍(Zeamays)泛素1启动子的启动子、5’非翻译区(UTR)和内含子(Christensen等,(1992)PlantMolecularBiology,18(4)；675-89))、AAD-1选择标志基因(即一种来自Sphingobiumherbicidovorans(700291)的芳氧基链烷酸酯(aryloxyalkanoate)加双氧酶基因的合成的经植物优化的型式，所述芳氧基链烷酸酯加双氧酶基因编码具有赋予对芳氧基苯氧基丙酸酯除草剂的抗性的alpha酮戊二酸依赖性加双氧酶活性的酶(WO2005/107437、WO2008/141154A2和US2009/0093366，通过述及将每篇并入本文)、和ZmLip3’UTR(包含玉蜀黍LIP基因的转录终止子和多腺苷酸化位点的3’非翻译区(UTR)；GenBank登录号L35913)。

使用LR克隆酶反应(Invitrogen,Carlsbad,CA)将分别用于pDAB100640和pDAB100641的两种ELP(分别称作ELP1(SEQIDNO:15)和ELP2(SEQIDNO:16))转移到pDAB101849，即一种二元载体中。pDAB101849含有OsAct1启动子(源自稻肌动蛋白启动子的启动子和内含子(美国专利No.5641876))、pat选择标志基因(草胺膦(phosphinothricin)乙酰基转移酶基因；Wohlleben等,(1988)Gene70:25-37)、和ZmLip3’UTR(包含玉蜀黍LIP基因的转录终止子和多腺苷酸化位点的3’非翻译区(UTR)；GenBank登录号L35913)。

将所得的克隆pDAB100610(图1)、pDAB100611(图2)、pDAB100640(图3)和pDAB100641(图4)进行序列证实。将pDAB100610和pDAB100611载体转移到含有pSB1二元载体的根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株LBA4404中，并经由同源重组将T链区整合入pSB1中。将pDAB100640和pDAB100641载体转移到根癌土壤杆菌菌株LBA4404中。通过限制酶消化确认每种质粒的结构。

通过在ELP1和ELP2的5’和3’同源性区的截短型式(称为型式2(v2))间插入YFP表达盒和PAT或AAD-1表达盒装配含有感兴趣的核酸分子(供体DNA)的载体。PAT表达盒含有用于表达pat基因(草胺膦乙酰基转移酶基因；Wohlleben等,(1988)Gene70:25-37)的OsAct1启动子(稻肌动蛋白1启动子；McElroy等,(1990)PlantCell2:163-171)及其侧翼的ZmLip3’非翻译区。AAD-1表达盒含有驱动aad-1基因的ZmUbi1启动子和ZmPer53’UTR(美国专利No.US6384207)。YFP表达盒由用于驱动PhiYFP基因(黄色荧光蛋白(美国专利申请US2007/0298412))表达的ZmUbi1启动子及其侧翼的ZmPer53’UTR(美国专利No.US6384207)组成。

将PAT和YFP表达盒在ELP1中的“工程化降落场区1”和“工程化降落场区2”的截短型式间克隆(pDAB105955，图5)。或者，将PAT和YFP表达盒在ELP2中的“工程化同源区3”和“工程化同源区4”的截短型式间克隆(pDAB105956,图6)。同样地，将AAD-1和YFP表达盒在ELP1中在“工程化降落场区1”的截短型式和“工程化降落场区2”的截短型式间克隆(pDAB105979,图7)。或者，将AAD-1和YFP表达盒在ELP2中在“工程化同源区3”的截短型式和“工程化同源区4”的截短型式间克隆(pDAB105980,图8)。将供体DNA构建体克隆入二元载体中以进行生物射弹、晶须(WHISKERS)或土壤杆菌属(Agrobacterium)介导的转化。另外，可以将DNA构建体克隆入高拷贝数质粒(例如携带ColE1复制起点的pBR322衍生物)中以生成用于直接DNA投递转化的质粒DNA。

实施例2：晶须介导的DNA投递

生成玉米的胚胎发生Hi-II细胞培养物，如记载于美国专利No.7,179,902的，并用作例示靶向性整合的活植物细胞的来源。

使用含有AAD-1植物选择标志盒和分别来自pDAB100610和pDAB100611的ELP1和ELP2的片段和含有PAT植物选择标志盒和分别来自pDAB100640和pDAB100641的ELP1和ELP2的片段来生成转基因事件。分离并表征转基因事件。然后，使用同源性指导的同源重组靶向这些事件，其中感兴趣的核酸分子可以在工程化降落场内整合。

将加上28mL条件化培养基的12mL压紧细胞体积(packedcellvolume,PCV)的来自先前冷冻保存的细胞系传代培养入500mL锥形瓶中的80mLGN6液体培养基(N6培养基(Chu等,(1975)SciSin.18:659-668)、2.0mg/L2,4-D、30g/L蔗糖，pH5.8)中，并在摇动器上于28℃以125rpm放置。使用相同细胞系将此步骤重复两次，使得将总共36mLPCV在三个烧瓶间分配。在24小时后，将GN6液体培养基除去，并用72mLGN6S/M渗透培养基(N6培养基、2.0mg/L2,4-D、30g/L蔗糖、45.5g/L山梨糖醇、45.5g/L甘露醇、100mg/L肌肉肌醇，pH6.0)替换。将烧瓶在黑暗中于28℃以中等搅动(125rpm)的情况中温育30-35分钟。在温育期期间，通过将8.1mLGN6S/M液体培养基添加至405mg无菌碳化硅晶须来制备50mg/mL碳化硅晶须(AdvancedCompositeMaterials,LLC,Greer,SC)悬浮液。

在GN6S/M渗透培养基中温育后，将每个烧瓶的内容物合并入250mL离心瓶中。在烧瓶中的所有细胞沉积至底部后，将超过约14mL的内容物体积的GN6S/M液体抽取，并在无菌1-L烧瓶中收集，供未来使用。将晶须的预先湿润的悬浮液在涡旋上以最大速度混合60秒，然后添加至离心管。

将170μg来自pDAB100610或pDAB100611质粒DNA的纯化片段添加至每瓶。一旦添加DNA，立即将瓶在改良的RedDevil5400商业涂料混合机(RedDevilEquipmentCo.,Plymouth,MN)中放置，并搅动10秒。在搅动后，将细胞、培养基、晶须和DNA的混合物与125mL新鲜的GN6液体培养基一起添加至1-L烧瓶内容物以减少渗压剂(osmoticant)。容许细胞在设置于125rpm的摇动器上恢复2小时。使用与房屋真空线连接的玻璃细胞收集器单元将6毫升分散的悬浮液过滤到Whatman#4滤纸(5.5cm)上，使得每瓶获得60升。将滤纸放到GN6固体培养基(与GN6液体培养基相同，除了具有2.5g/LGelrite胶凝剂)的60x20mm板上，并于28℃在黑暗条件下培养1周。

实施例3：推定的转基因事件的鉴定和分离

DNA投递后一周，将滤纸转移到含有合适的选择剂的GN6(1H)选择培养基(N6培养基、2.0mg/L2,4-D、30g/L蔗糖、100mg/L肌肉肌醇、2.5g/LGelrite，pH5.8)的60x20mm板。将这些选择板于28℃在黑暗中温育1周。在黑暗中选择1周后，通过将1/2的细胞从每块板刮到含有于37-38℃保持的3.0mLGN6琼脂糖培养基(N6培养基、2.0mg/L2,4-D、30g/L蔗糖、100mg/L肌肉肌醇、7g/L琼脂糖，pH5.8，于121℃高压灭菌10分钟)的管中将组织包埋到新鲜培养基上。

用刮刀打碎琼脂糖/组织混合物，随后，将3mL琼脂糖/组织培养物均匀地倒入含有GN6(1H)培养基的100x15mm培养皿的表面上。对每块板的两半都重复此过程。一旦将所有组织包埋，将板单独用或M密封，并于28℃在黑暗条件下培养多至10周。将在这些选择条件下生长的推定的转化隔离群自包埋板取出，并转移到60x20mm板中的新鲜选择培养基。若持续生长在约2周后是明显的，则将事件视为对应用的除草剂(选择剂)有抗性，并且随后收获细胞的等分试样以进行基因型分析。

实施例4：事件的分子表征

基因组DNA提取。

将基因组DNA(gDNA)自分离的玉米细胞分离，并作为模板用于PCR基因型分型实验。自约100-300μl压紧细胞体积(PCV)的依照96植物试剂盒(QIAGENInc.,Valencia,CA)中详述的制造商的方案分离的Hi-II愈伤组织提取gDNA。将基因组DNA在100μl试剂盒供应的稀释缓冲液中稀释，产生20-200ng/μL的终浓度，随后经由基于PCR的基因型分型方法分析。

拷贝数的分子分析。

使用系统(RocheAppliedScience,Indianapolis,IN)通过实时PCR实施通过与测定法类似的水解探针测定法的转基因拷贝数测定。使用探针设计软件2.0对AAD-1和PAT基因和内部参照基因设计测定法。对于扩增，将480探针Master混合物(RocheAppliedScience,Indianapolis,IN)以1x终浓度在含有0.4μM每种引物和0.2μM每种探针的10μL体积多重反应中制备。在荧光采集的情况中实施两步扩增反应，其中于58℃延伸38秒。将所有样品一式三份运行，并使用平均循环阈值(Ct)数值来分析每份样品。使用软件第1.5版使用相对定量模块实施对实时PCR数据的分析，并且其基于ΔΔCt方法。对于这点，来自单拷贝校准物和已知的2个拷贝检验(check)的基因组DNA的样品包含在每次运行(与用于上述测定法的那些运行相同)中。然后，通过此数据，对每份样品评估表观AAD-1或PAT拷贝数。

用于PCR基因型分型的引物设计。

将寡核苷酸引物在标准脱氧条件下合成(例如，IntegratedDNATechnologies,Inc.(Coralville,IA))，并用水稀释至100μM的浓度。将寡核苷酸引物设计为与DNA插入物的末端区退火。在存在自非转基因生物体分离的DNA的情况中使用质粒DNA的稀释液测试引物。使用引物自推定事件的基因组DNAPCR扩增pDAB100610、pDAB100611、pDAB100640和pDAB100641的插入物。将所得的片段克隆入质粒载体中，并测序以确认工程化降落场在转化期间完全整合入植物基因组中。

Southern印迹分析。

实施Southern分析以确认转基因拷贝数。对于此分析，将基因组DNA用合适的限制酶消化并探查。

将通过基因座特异性PCR鉴定为含有推定的ELP的玉米组织进行Sothern印迹分析。对于Southern分析，将组织样品在2mleppendorf管中收集，并冻干2天。用Kleco组织粉碎机和钨珠(Kleco,Visalia,CA)实施组织浸渍。在组织浸渍后，使用DNeasy植物迷你试剂盒(Qiagen,Germantown,MD)依照制造商提示的方案分离基因组DNA。

通过Quant-ITPicoGreenDNA测定试剂盒(MolecularProbes,Invitrogen,Carlsbad,CA)量化基因组DNA。将量化的DNA调节至4μg以进行Southern印迹分析，并使用合适的限制酶于37℃消化过夜。使用Quick-Precip(EdgeBioSystem,Gaithersburg,MD)依照制造商提示的方案纯化经消化的DNA。将沉淀的DNA在10X染料中重悬，并在0.8％SeaKemLE琼脂糖凝胶(Lonza,Rockland,ME)上以40伏特进行电泳达17小时。将DNA过夜转移到尼龙带电荷膜(Millipore,Bedford,MA)，并使用UVStrata连接仪(linker)1800(Stratagene,LaJolla,CA)与膜交联。将印迹与20mLPerfectHybPlus(Sigma,St.Louis,MO)预杂交，并用合适的放射性标记的探针探查过夜。将印迹清洗，并在磷光体图像屏(phosphorimagescreen)上放置24小时，然后使用STORMTM860扫描仪(MolecularDynamics)分析。

实施例5：选择具有插入DNA的转基因事件

如上文所描述，通过水解探针测定法和PCR对事件筛选含有AAD-1或PAT基因盒的完整植物转录单元(PTU)和完整ELP。用AAD-1和PAT基因和ELP探针使用标准方法通过Southern分析进一步确认拷贝数。维持来自含有来自pDAB100610和pDAB100611的单拷贝、完整插入物的选定转基因事件的愈伤组织，随后测试AAD-1基因的表达。使用AAD-1qRT-PCR法和ELISA(下文)的筛选鉴定出表达AAD-1的事件。

对AAD-1表达事件的qRT-PCR分析。

使用定量实时PCR(qRT-PCR)量化AAD-1基因表达的mRNA表达。开发通过相对于来自内部参照基因的mRNA表达标准化这些水平来量化来自转基因Hi-II愈伤组织样品的相对AAD-1mRNA表达的测定法。相对于来自内部参照基因的mRNA标准化AAD-1mRNA容许比较不同样品间的AAD-1表达，并且可以用于鉴定表现为高度表达的事件。

使用Qiagen96试剂盒(Qiagen,Valencia,CA)自新鲜的愈伤组织制备总RNA。用无RNA酶的DNA酶依照试剂盒的用法说明书处理RNA以除去任何基因组DNA污染物。依照III逆转录酶(Invitrogen,Carlsbad,CA)制造商的用法说明书建立第一条链合成，并使用随机六聚体引发。将合成的cDNA链在水中以1:10和1:50的比率稀释(这提供足够的模板以PCR扩增多种靶物)。将每份等分试样于20℃无限期保存。为了扩增AAD-1cDNA如下设立qRT-PCR反应混合物：7.5μL2XLC480探针Master缓冲液(RocheDiagnostic,Indianapolis,IN)、0.3μL来自10μM储液的基因特异性正向引物、0.3μL来自10μM储液的基因特异性反向引物、来自480探针Master,RocheDiagnostic,Indianapolis,IN)的0.15μLUPL探针，1.5μL10％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮-40(PVP-40)和3.9μL水。UPL探针(RocheDiagnostics,Indianapolis,USA)是一种锁定核酸，并且因此比其它方式计算的Tm具有更高的Tm。在处理标准品和未知物前将所有组分放回冰箱中。将384孔微量板划界并标记，每孔添加13.5μLMaster混合物。将密封箔温和附着于微量板。将板以3,000rpm在Qiagen微量板离心机中离心1分钟。添加1.5μL融化的、稀释的合成的cDNA链。另外，将1.5μL质粒DNA拷贝数标准品以最低至最高浓度的稀释系列添加至不同孔，将这些标准品与AAD-1cDNA(自总mRNA合成)比较以定量拷贝数。通过将靶扩增子克隆入pCR2.1质粒(Invitrogen,Carlsbad,CA)中，并生成稀释系列以量化拷贝数来生成AAD-1DNA拷贝数标准品系列。将箔封条稳固地附于板并离心，如先前所描述的。实施PCR程序，并在实时PCR仪LC480(Roche,Indianapolis,IN)或等同物中扩增DNA。

实施例6：通过ELISA测定玉米组织中的AAD-1蛋白

开发使用酶联免疫吸附法(ELISA)技术定量测定玉米愈伤组织中的AAD-1蛋白的方法。可以使用本文中所描述的方法来检测AAD-1蛋白并分析来自转基因玉米愈伤组织的植物组织样品。

用基于含有0.05％Tween20(PBST)，并且可能含有牛血清清蛋白、蛋白酶抑制剂或抗坏血酸的磷酸盐缓冲盐水溶液的愈伤组织特异性缓冲液自玉米样品提取AAD-1蛋白。将提取物离心；将水性上清液收集、稀释并使用特异性AAD-1ELISA测定。在此测定法中应用同时三明治式ELISA形式。将稀释样品的等分试样和生物素化的抗AAD-1单克隆抗体(单抗473F185)在用固定化的抗AAD-1单克隆抗体(单抗473H274)包被的微量滴定板的孔中温育。这些抗体与孔中的玉米表达的AAD-1蛋白结合以与可溶的和固定化的抗体间结合的AAD-1蛋白形成“三明治”。然后，通过用PBST清洗自板除去未结合的样品和缀合物。将过量的链霉抗生物素蛋白-酶(碱性磷酸酶)缀合物添加至孔以进行温育。通过将酶缀合物与酶底物一起温育；生成有色产物检测AAD-1的存在。因为AAD-1在抗体三明治中结合，所以显色的水平与样品中的AAD-1浓度成比例(即，较低的蛋白质浓度导致较低的显色)。使用读板仪测量于405nm的吸光度。

将高表达AAD-1事件自选择的转基因事件鉴定并维持以进行随后用供体DNA的靶向。

实施例7：生物射弹介导的DNA对含有ELP的植物细胞的投递

再生具有靶DNA的转基因事件

再生来自确认为低拷贝且含有完整PTU的pDAB100160和pDAB100611的事件以生成未成熟的胚供体材料以进行靶向。首先将健康的生长组织转移至28+100吡氟氯禾灵(MS培养基(Murashige和Skoog(1962)PhysiolPlant15:473-497)、0.025mg/L2,-4D、5mg/LBAP、0.0362mg/L吡氟氯禾灵、30g/L蔗糖、2.5g/Lgelrite,pH5.7)，并在低光照(14μE/m2·秒16小时光周期)中温育7天，接着高光照(89μE/m2·秒16小时光周期)再温育7天。将变绿的结构转移至36+100吡氟氯禾灵(与28+100吡氟氯禾灵相同，减去BAP和2,4-D)，并在高光照(40μE/m2·秒16小时光周期)中温育，直至枝条结构形成足够的根以移植到温室。使用95％Metro-Mix和5％粘土/壤土的混合物在温室中将植物培养至成熟，并根据植物健康传粉。将有力生长的植物自交或同胞杂交(sib)(来自同一事件的植物)，并将不太有力的植物与Hi-II、A188或B104杂交以维持供体材料的胚胎发生能力。

实施例8：生物射弹介导的DNA对含有ELP的植物细胞的投递

自pDAB100610和pDAB100611生成的事件的靶向。

使用两种不同转化方案完成供体序列的靶向。对于含有AAD-1作为选择标志的转基因完整ELP事件(pDAB100610和pDAB100611事件)，经由生物射弹介导的DNA对愈伤组织形成前(pre-callused)未成熟胚的投递实施靶向。传粉后10-13天收获大小1.2-2.0mm的胚，并将其分配到N6E培养基(N6培养基、2.0mg/L2,4-D、2.8g/LL-脯氨酸、100mg/L酪蛋白水解产物、100mg/L肌肉肌醇、4.25mg/L硝酸银、30g/L蔗糖，pH5.8)上，并于28℃在黑暗中温育2-3天。将溶胀的胚转移到填充Whatman#4滤纸上2.5cm直径圆的N6OSM(与N6E相同，其中添加36.4g/l山梨糖醇、36.4g/L甘露醇和降低至0.7g/L的L-脯氨酸)。使用1,000μm屏，含有供爆破(blasting)用的胚，并将胚在黑暗中于28℃温育4小时，之后进行爆破。为了用DNA包被生物射弹颗粒，将3mg0.60微米直径金颗粒用100％乙醇清洗一次，用无菌蒸馏水清洗两次，并在50μl水中在硅化处理的微离心(microfuge)管中重悬。将总共5μg质粒DNA，编码锌指核酸酶和供体DNA片段的不同载体；pDAB105955或pDAB105956)、20μl亚精胺(0.1M)和50μl氯化钙(2.5M)分开添加至金悬浮液，并在旋涡上混合。将混合物于室温温育10分钟，以10,000rpm在台上(benchtop)微离心机中沉淀10秒，在60μl冷100％乙醇中重悬，并将8-9μl分配到每个巨载体(macrocarrier)上。

使用生物射弹PDS-1000/HE^TM系统(Bio-RadLaboratories,Hercules,CA)发生轰击。将含有胚的板在中间架上在650psi和27英寸Hg++真空的条件下放置，并遵照参照手册轰击一次。轰击后24小时，将胚直接转移(无滤纸)到N6E(与上文相同)以进行恢复，并于28℃在黑暗中温育13天。每2周将胚转移到选择培养基N6S(N6培养基、2.0mg/L2,4-D、100mg/L肌肉肌醇、0.85mg/L硝酸银、2mg/L双丙氨膦(bialaphos)、30g/L蔗糖、2.5g/Lgelrite，且pH5.8)，在选择培养基上转移3次，并于28℃在黑暗条件下温育多至10周。将在这些选择条件下生长的推定地转化的隔离群自包埋板取出，并转移到60x20mm板中的新鲜的选择培养基。若持续生长在约2周后是明显的，则事件被视为对应用的除草剂(选择剂)有抗性，并且随后收获细胞的等分试样以进行基因型分析(下文所描述的分析)。

自pDAB100640和pDAB100641生成的事件的靶向。

对于含有PAT作为选择标志的转基因完整ELP事件(pDAB100640和pDAB100641)，经由生物射弹介导的DNA对胚胎发生玉米愈伤组织的投递实施靶向。传代培养后6至8天，将胚胎发生玉米组织((约0.4mLPCV的细胞)在100x15mm培养皿上放置的Whatman#4滤纸上方的直径2.5cm的圆中薄层涂布，所述培养皿含有用2.5g/Lgelrite凝固的GN6S/M培养基(N6培养基、2.0mg/L2,4-D、30g/L蔗糖、45.5g/L山梨糖醇、45.5g/L甘露醇、100mg/L肌肉肌醇，pH5.8)。将细胞在黑暗条件下温育4小时。制备DNA以进行爆破，如先前所描述的，使用pDAB105979和pDAB105980进行靶向。

使用生物射弹PDS-1000/HE^TM系统(Bio-RadLaboratories,Hercules,CA)发生轰击。将含有细胞的板在中间架上在1,100psi和27英寸Hg++真空的条件下放置，并遵照参照手册轰击一次。轰击后24小时，将含有植物细胞的滤纸转移到用2.5g/LGelrite凝固的GN6固体培养基(N6培养基、2.0mg/L2,4-D、100mg/L肌肉肌醇、30g/L蔗糖，pH5.8)，并于28℃在黑暗条件下温育24小时。在24小时恢复期后，将含有植物细胞的滤纸转移到GN6+100吡氟氯禾灵(N6培养基、2.0mg/L2,4-D、100mg/L肌肉肌醇、30g/L蔗糖、0.0362mg/L吡氟氯禾灵、2.5g/LGelrite,pH5.8)，将细胞在滤纸上在薄层中涂开。每2周在选择培养基上继续转移，达3次转移。将组织温育多至12周，直至源自供体DNA整合的推定的转基因隔离群开始出现。将在这些选择条件下生长的推定地转化的隔离群自包埋板取出，并转移到60x20mm板中的新鲜的选择培养基。若持续生长在约2周后是明显的，则事件被视为对应用的除草剂(选择剂)有抗性，并且随后收获细胞的等分试样以进行基因型分析(下文所描述的分析)。

实施例9：经由PCR基因型分型筛选靶向性整合事件

通过使用1)基因座特异性PCR；2)供体特异性TaqMan，和；3)基因座特异性Southern印迹的组合分析供体分子(pDAB105979,pDAB105980,pDAB105955,pDAB105956)对转基因玉米中ELP的靶向以评估插入物精确性、完整性和拷贝数。预期阳性再靶向事件具有a)阳性输出-输出(out-out)PCR或重叠的输入-输出(in-out)PCR结果和2)供体存在诊断性Southern图像。

DNA提取

将来自再靶向转基因玉米的组织(愈伤组织或植物叶)在96孔收集板(Qiagen,Germantown,MD)中冻干至少2天。使用BioSprint96工作站(Qiagen,Germantown,MD)遵循制造商的用法说明书自冻干的组织提取DNA，并在200μl水中重悬。使用2-96A型Kleco组织粉碎机(GarciaManufacturing,VisaliaCA)进行组织破坏。

DNA量化：使用PicoGreenDNA测定试剂盒(MolecularProbes,Invitrogen.Carlsbad,CA)量化所得的基因组DNA。使用范围为20ng/μL至1.25ng/μL(连续稀释的)的5种预先量化的DNA标准品进行标准曲线生成。首先将未知的样品以1:10或1:20稀释度稀释至测定法的线性范围内。将5μL稀释的样品和标准品与100μL稀释的PicoGreen底物(1:200)混合，并在黑暗中温育10分钟。然后，使用Synergy2读板仪(Biotek)记录荧光。基因组DNA浓度自背景荧光校正后计算的标准曲线评估。随后，使用Biorobot-3000自动化液体处理器(Qiagen,Germantown,MD)相对于2ng/μL的浓度标准化DNA。使用标准化的DNA进行PCR和拷贝数分析。

PCR分析

实施这些类型的基因座特异性PCR(输出-输出、5’输出-输入(out-in)、3’输出-输入)以评估供体质粒是否靶向至ELP。实施PCR反应以调查供体DNA的完整拷贝的存在(out-outPCR)。其它PCR反应聚焦于靶物与供体间的5’边界和供体与靶物间的3’边界(输入-输出PCR)。图9中例示了具有用于分析的引物的位置的示意图。表1中概述了每种供体和ELP靶物的预期PCR产物。表2中显示了用于分析的引物的序列。

表1：用于靶向性供体整合分析的基因座特异性PCR的预期扩增子大小。

表2：用于靶向性整合分析的引物的序列

PCR扩增：

实施聚合酶链式反应(PCR)以评估并确认ELP的再靶向。在具有PhusionDNA聚合酶(NewEnglandBiolabs,Ipswich,MA)或AccuPrime(Invitrogen,Carlsbad,CA)的25μl体积中制备PCR反应物。对于PhusionPCR，每种反应物含有1XPhusionGC缓冲液、0.2mMdNTP、0.2μM正向和反向寡聚物、2.5个单位的PhusionDNA聚合酶和20ng基因组DNA。构建为模拟再靶向事件的10至20ng质粒DNA作为阳性对照运行。还运行非模板对照(水作为模板)。PCR条件如下：98℃1分钟，98℃10秒，65℃，20秒，72℃持续2.5分钟的35个循环，接着是72℃持续10分钟。

用AccuPrime(Invitrogen,Carlsbad,CA)实施的25微升PCR反应含有1X缓冲液II、0.2uM正向和反向寡聚物、2.5个单位的AccuPrimeTaq聚合酶、和20ng基因组DNA。运行阳性和阴性对照，如上文对Phusion描述的。AccuPrime的条件如下：98℃1分钟，98℃10秒，65℃20秒，68℃持续2.5分钟的35个循环，接着是68℃持续10分钟。

依照制造商的指导将扩增片段进行凝胶切割并纯化。随后，将纯化的片段克隆入质粒载体中，并转化到感受态大肠杆菌细胞中。

将各个菌落选出并确认为含有扩增的PCR片段。实施质粒克隆的双链测序反应以确认PCR扩增的基因组序列含有整合的供体。鉴定为含有供体片段的事件代表如下的靶物，其中已经发生ZFN介导的双链断裂的同源性驱动的修饰和供体DNA在特定基因靶物处的靶向性整合。

水解探针/TaqMan测定法

进行TaqMan分析以限定推定的再靶向事件中供体的拷贝数。使用480系统(RocheAppliedScience,Indianapolis,IN)通过实时PCR实施通过与测定法类似的水解探针测定法进行的拷贝测定。使用探针设计软件2.0对PAT和AAD1及内部参照基因GLP1和转化酶设计测定法。对于扩增，在含有0.4μM每种引物和0.2μM每种探针(表3)的10μL体积多重反应中以1x终浓度制备480探针Master混合物(RocheAppliedScience,Indianapolis,IN)。进行98℃1分钟、98℃10秒、65℃20秒、72℃2.5分钟的35个循环接着是72℃持续10分钟。在荧光采集的情况中实施两步扩增反应，其中于58℃延伸38秒(对于PAT/GLP1)和于60℃延伸40秒(对于AAD-1和转化酶Invertase)。将所有样品一式三份运行，并使用平均循环阈值(Ct)数值来分析每份样品。

使用软件第1.5版使用相对定量模块实施对实时PCR数据的分析，并且其基于ΔΔCt方法。对于这点，来自单拷贝校准物和已知的2个拷贝检验(check)的基因组DNA的样品包含在每次运行中。

表3：关于pat和内部参照(HMG)的水解探针测定法的引物和探针信息

Southern分析

实施Southern分析以确认供体DNA在ELP基因座处的靶向。对于此分析，用合适的限制酶消化基因组DNA，并用基因座特异性放射性标记片段(不存在于供体中)探查。

使用玉米愈伤组织(pDAB100640和pDAB100641靶实验)或T0玉米植物(pDAB100610和pDAB100611靶实验)。将组织样品在2ml微离心管中收集，并冻干2天。用Kleco组织粉碎机和钨珠实施组织浸渍，如上文。在组织浸渍后，使用DNeasy植物迷你试剂盒(Qiagen,Germantown,MD)依照制造商提示的方案分离基因组DNA。

通过Quant-ITPicoGreenDNA测定试剂盒(MolecularProbes,Invitrogen,Carlsbad,CA)量化基因组DNA。使用合适的限制酶将每种样品4微克DNA于37℃消化过夜。使用Quick-Precip(EdgeBioSystem,Gaithersburg,MD)依照制造商提示的方案纯化经消化的DNA。在0.8％SeaKemLE琼脂糖凝胶(Lonza,Rockland,ME)上电泳后，将DNA过夜转移到尼龙带电荷膜(Millipore,Bedford,MA)，并使用UVStrata连接仪(linker)1800(Stratagene,LaJolla,CA)与膜交联。将印迹与20mLPerfectHybPlus(Sigma,St.Louis,MO)预杂交，并用合适的放射性标记的探针探查过夜。将印迹清洗，并在磷光体图像屏上放置24小时，然后使用STORMTM860扫描仪(MolecularDynamics)分析。

实施例10：构建中间植物转化载体，其会接受ELP、选择标志，并且实现独立构建体元件的植物中(inplanta)切除

可以将工程化锌指核酸酶(eZFN)结合位点和ELP元件单独或一起掺入植物转化载体中，使得所得的经转化的植物细胞、组织或植物会具有下列特性：1)在初始转基因插入位点处在ELP内以精确的、靶向性方式用其它转基因再转化的能力和2)通过以可预测的且有效的方式除去转基因，特别是植物选择标志基因修饰转基因基因座的能力。构建一系列载体以转化一批植物物种。这通过使用“中间植物转化载体”(下文所述)，即一种影响在所有选择标志和ELP侧翼的eZFN掺入称为初级转化载体的基础载体中的载体来实现。

构建中间植物转化载体，其包含具有位于右侧和左侧T-DNA边界间的独特多克隆位点(MCS)的土壤杆菌属二元转化载体主链。此中间载体是pDAB104132(图10)。pDAB104132中使用的MCS含有AgeI,NotI,FseI,SwaI,XbaI,AseI,PacI,XhoI,SalI和NsiI的独特的限制酶位点。在此实施例中，使用这些位点以将关键的功能性元件掺入最终的初级转化载体中。可以使用独特的NotI位点来引入携带NotI片段的的GATEWAY^TM目的载体盒，然后随后可以使用Invitrogen的GATEWAY^TM系统将其用于将多种转基因叠加到转化载体中。可以使用独特的FseI位点来引入在其末端具有FseI位点的ELP。如先前在这些实施例中所描述的，在存在于转基因植物中时，可以使用ELP作为靶位点以使用eZFN插入其它基因。可以使用MCS中的其它位点来插入其它感兴趣的基因，包括选择标志基因。使用上文所描述的独特的限制性位点，可以使用中间植物转化载体诸如pDAB104132来将功能性元件，包括GATEWAY^TM目的载体盒、ELP、选择标志-ZFN模块、和eZFN切除可以或不可实现的任何其它转基因的任何和所有组合集合到单一植物转化载体中。

实施例11：使用锌指核酸酶模块构建切割使能的植物选择标志盒。

在此实施例中，使用eZFN结合位点实现自经转化的植物在植物中删除任何转基因，包括选择标志基因。见美国临时专利申请No._61/297,628，通过述及并入本文。此能力是通过使具有一个或多个eZFN结合位点的转基因在侧翼，并将这些可切除的基因模块掺入植物转化载体中，然后将其用于生成转基因植物细胞来实现。本领域技术人员可以使用标准分子生物学技术来实现此类模块和载体的构建。

携带ZFN结合位点模块的中间质粒是朝向构建可切割基因盒的有用的第一步。eZFN结合位点模块是DNA中含有在可以接受转基因克隆的一个或多个限制酶位点侧翼的至少两个eZFN结合位点的区段。一个例子是以SEQID:20和图11呈现的ZFN模块2:4-MCS-2:4。此模块含有由限制性位点AseI,HindIII,PacI,SbfI,SphI和SalI组成的多克隆位点(MCS)及其侧翼的eZFN2和eZFN4的结合位点对。由在eZFN结合位点侧翼的100bp随机序列组成的序列的两个相同拷贝也在此ZFN模块内。另外，限制酶位点对SpeI和XhoI在整个功能性模块侧翼，容许其克隆入植物转化载体中。图12中显示了pDAB104126，即一种携带ZFN模块2:4-MCS-2:4的质粒。

使用标准的分子克隆技术将4种不同植物选择标志基因单独插入pDAB104126中的ZFN模块2:4-MCS-2:4中。一种选择标志基因是设计为在双子叶植物中赋予草丁磷耐受性的功能性PAT基因。此PAT基因由PAT编码序列及其可操作连接的CsVMV启动子(源自木薯叶脉花叶病毒的启动子和5’非翻译区；Verdaguer等(1996)PlantMolecularBiology31(6):1129-1139)和AtuORF13’UTR构成。将PAT基因盒作为HindIII-SphI片段插入ZFN模块的HindIII-SphI位点中以生成质粒pDAB104136(图13)。

第二选择标志基因是设计为在单子叶植物中赋予草丁磷耐受性的PAT基因。此PAT基因由PAT编码序列及与其可操作连接的OsAct1启动子和ZmLip3’UTR构成。将此单子叶PAT基因作为PacI-SphI片段插入ZFN模块的PacI-SphI位点中以生成质粒pDAB104138(图14)。

第三选择标志基因包含设计为在单子叶植物中赋予吡氟氯禾灵或2,4-D耐受性的AAD-1基因。此AAD-1基因包含AAD-1编码序列及其可操作连接的ZmUbi1启动子和ZmLip3’UTR。将此单子叶AAD-1基因作为HindIII-SbfI片段插入ZFN模块的HindIII-SbfI位点中以生成质粒pDAB104140(图15)。

第四选择标志基因包含设计为在芸苔植物中赋予草丁磷耐受性的PAT基因。此PAT基因包含PAT编码序列及其可操作连接的CsVMV启动子和AtuORF13’UTR，并放置在破坏的异戊烯基转移酶(ipt)基因内。将PAT基因作为AseI-SalI片段插入ZFN模块的Ase-XhoI位点中以生成质粒pDAB104142(图16)。

如此，pDAB104136,pDAB104138,pDAB104140和pDAB104142是携带可以掺入植物转化载体中的不同ZFN切除使能选择标志基因的中间质粒。在通过转化最终掺入植物基因组中时，选择标志ZFN模块容许随后除去选择标志基因。这可以通过在植物细胞中生成eZFN2或eZFN4蛋白(通过其编码基因的瞬时表达或稳定表达进行)来实现。例如，可以通过eZFN自eZFN2或eZFN4基因的瞬时表达在先前经转化的植物细胞中表达eZFN2，或备选地eZFN4。eZFN酶会识别并结合特定的eZFN结合位点，并且引起在基因组中在这些位置处发生双链断裂。在模块内的选择标志基因两侧的双链断裂会导致选择标志基因自基因组DNA的切除。随后，会通过非同源末端连接或者通过包含在ZFN模块中的重复100bp序列间的同源单链修复来修复双链断裂。此过程会导致对于其初始基因组位置永久删除选择标志基因。

实施例12：初级植物转化载体的装配。

本领域技术人员可以逐步组合装配上文所描述的元件以生成初级转化载体以用于不同作物植物。将ELP1插入pDAB104132的FseI位点中以生成pDAB104133(图17)。接着，将GATEWAY^TM目的载体盒插入pDAB104133的NotI位点中以生成pDAB104134(图18)和pDAB104135(图19)，其相对于ELP位置仅在其Gateway盒取向上不同。然后，将上文所描述的4种选择标志ZFN模块克隆入pDAB104135中以生成四种新的植物转化载体(PTV)。本领域技术人员可以使用标准DNA克隆方法实现此装配，如下文所描述的。

使用SpeI自pDAB104136切除双子叶PATZFN模块，并克隆入pDAB104135的XbaI位点中以生成PTVpDAB104137(图20)。pDAB104137是一种携带ELP1和ZFN可切除双子叶PAT选择标志的二元植物转化载体，并且也是GATEWAY^TM目的载体，其容许其它转基因的GATEWAY^TM克隆。

使用SpeI自pDAB104138切除单子叶PATZFN模块，并克隆入pDAB104135的XbaI位点中以生成PTVpDAB104139(图21)。pDAB104139是携带ELP1和ZFN可切割单子叶PAT选择标志的二元植物转化载体，并且也是一种GATEWAY^TM目的载体。

使用SpeI自pDAB104140切除单子叶AAD1ZFN模块，并克隆入pDAB104135的XbaI位点中以生成PTVpDAB104141(图22)。pDAB104141是一种携带ELP1和ZFN可切割单子叶AAD1选择标志的二元植物转化载体，并且也是一种Gateway^TM目的载体。

使用XhoI自pDAB104142切出芸苔PATZFN模块，并克隆入pDAB104135的XhoI位点中以生成PTVpDAB104143(图23)。pDAB104143是一种携带ELP1和ZFN可切割芸苔PAT选择标志的二元植物转化载体，并且也是一种GATEWAY^TM目的载体。

可使用植物转化方法使用这些构建体转化作物植物。随后，可用其它新的转基因靶向所得的转基因事件。其中，经由同源重组将新的转基因靶向至ELP。另外，可将选择标志表达盒除去或切除。随后，可使用上文所描述的技术经由同源重组用新的转基因再靶向通过切除选择标志盒生成的所得ELP。

Claims (20)

1.一种工程化降落场(ELP)，其包含：

具有式X1-Y-X2的核苷酸分子，

其中Y包含至少一个靶向性内切核酸酶结合位点，

其中X1是与宿主生物体的基因组缺乏同源性的选定核苷酸序列，并且位于Y的5’，且

其中X2是与X1不同的与宿主生物体基因组缺乏同源性的选定核苷酸序列。

2.权利要求1的ELP，其中所述至少一个靶向性内切核酸酶结合位点包含锌指核酸酶(ZFN)结合位点。

3.权利要求1的ELP，其中所述核酸分子还包含不同限制性位点。

4.权利要求2的ELP，其中所述不同限制性位点包含相容的单链末端，其容许多个ELP的连环化。

5.权利要求1的ELP，其中所述与宿主生物体的基因组缺乏序列同源性的选定核苷酸序列是约50bp至约3kb。

6.权利要求1的ELP，其中所述ELP在每个末端侧翼有一个或多个靶向性内切核酸酶识别位点。

7.权利要求1的ELP，其中所述ELP在每个末端侧翼有一个或多个限制酶位点。

8.权利要求7的ELP，其中所述一个或多个限制酶位点包含FseI限制酶位点。

9.权利要求8的ELP，所述一个或多个限制酶位点包含在FseI限制酶位点内部的BglII和BamHI位点。

10.权利要求1的ELP，其中X1包含序列IDNO1到10的一个或多个核苷酸序列。

11.权利要求1的ELP，其中X2包含序列IDNO1到10的一个或多个核苷酸序列。

12.权利要求1的ELP，其中X1包含序列IDNO11到14、17和18的一个或多个核苷酸序列。

13.权利要求1的ELP，其中X2包含序列IDNO11到14、17和18的一个或多个核苷酸序列。

14.权利要求1的ELP，其中X1包含序列IDNO15、16和19的一个或多个核苷酸序列。

15.权利要求1的ELP，其中X2包含序列IDNO15、16和19的一个或多个核苷酸序列。

16.一种工程化降落场(ELP)，其包含：

具有式X1-Y-X2的核苷酸分子，

其中Y包含至少一个靶向性内切核酸酶结合位点，

其中X1包含序列IDNO1到19的一个或多个核苷酸序列，且

其中X2包含序列IDNO1到19的一个或多个核苷酸序列。

17.权利要求16的ELP，其中所述至少一个靶向性内切核酸酶结合位点包含锌指核酸酶(ZFN)结合位点。

18.权利要求16的ELP，其中所述核酸分子还包含不同限制性位点。

19.权利要求16的ELP，其中所述ELP在每个末端侧翼有一个或多个靶向性内切核酸酶识别位点。

20.权利要求16的ELP，其中所述ELP在每个末端侧翼有一个或多个限制酶位点。