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CN105670964B - 萎缩芽孢杆菌BsR05菌株及其应用 - Google Patents

萎缩芽孢杆菌BsR05菌株及其应用 Download PDF

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CN105670964B CN201610056373.XA CN201610056373A CN105670964B CN 105670964 B CN105670964 B CN 105670964B CN 201610056373 A CN201610056373 A CN 201610056373A CN 105670964 B CN105670964 B CN 105670964B
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bsr05
bacillus
atrophicus
strain
microbial inoculum
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扈进冬
李纪顺
杨合同
陈凯
魏艳丽
王贻莲
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Ecology Institute Of Shandong Academy Of Sciences (the Sino-Japanese Friendship Biotechnology Research Center Shandong Academy Of Sciences)
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Biology Institute of Shandong Academy of Sciences
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    • A01N63/00Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
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Abstract

本发明公开了萎缩芽孢杆菌BsR05菌株及其应用。萎缩芽孢杆菌BsR05菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号:CGMCCNO.11665。采用本发明菌株制备的萎缩芽孢杆菌BsR05的液体悬浮剂对黄瓜灰霉病具有特异的防治作用,防效高平均防效在70%以上。

Description

萎缩芽孢杆菌BsR05菌株及其应用
技术领域
本发明涉及农业微生物防治技术领域,特别是涉及萎缩芽孢杆菌BsR05菌株及其应用。
背景技术
黄瓜灰霉病是由真菌半知菌亚门灰葡萄孢(Botrytis cinerea Pers.ex Fr.)侵染引起的世界范围内流行性病害,是黄瓜保护地栽培常年发生的一种病害,近年来发生呈逐年趋重。由于果实常常受到侵扰而引起腐烂,菜农常常称之烂果病,霉烂病。目前黄瓜的灰霉病病害发生日趋严重,造成大量烂瓜,发病严重的温室大棚,一般可减产2~3成,甚至提前拉秧,严重影响黄瓜的产量和质量。造成黄瓜灰霉病大发生的重要因素之一是药物组配不合理及黄瓜对所用药剂产生抗药性。
采用生防微生物防治植物病害无毒、无害、无污染、不产生抗药性、高效、不仅符合人们对绿色食品的需求,而且为农业的可持续发展提供了保障。因此植物病害的生防微生物研究越来越受到重视。生防微生物其作用方式独特多样,是解决诸如黄瓜灰霉病这类难防植物病害重要有效措施。
萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)非致病菌,枯草芽孢杆菌的一类变种,在含有碳水化合物的培养基上可形成可溶的黑色菌落,主要从土壤中分离得到。在农业、工业、科研、医疗和卫生等领域都有广泛的应用。在美国、英国、日本、欧盟等国家和地区常将该菌株作为质量控制标准检测菌株及杀菌效果评价试验指标菌。应用该菌用于防治植物病害方面研究较少,鹿秀云等公开了一种用于防治棉铃疫病的萎缩芽孢杆菌及其菌种(发明专利201210028087.4),辛海峰等发现一株萎缩芽孢杆菌用于防治赤霉病(辛海峰等,生态学杂志,2013,32(6));韩松等报道了一种内生菌对尖孢镰刀菌具有拮抗作用,经鉴定为萎缩芽孢杆菌(韩松,西北植物学报,2011(5))。现有的防治灰霉病的有益微生物大多为直接使用菌株或菌剂防治病害,如木霉等但由于活菌制剂不易保存,其货架期难以保证。
发明内容
本发明的目的就是针对上述存在的缺陷而提供萎缩芽孢杆菌BsR05菌株及其应用。该菌株对灰霉病具有较强的抑制,能够作于制备防治黄瓜灰霉病的生防药物。本发明的萎缩芽孢杆菌BsR05制备的微生物菌剂有效成分以芽孢为主,可以较长时间的保存而活性不易丧失,所以可以可以有效的提高和稳定病害生物防治的效果,更好地用于农业生产。
本发明的萎缩芽孢杆菌BsR05菌株及其应用技术方案为,萎缩芽孢杆菌BsR05菌株,萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)BsR05菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,邮编:100101,保藏号:CGMCCNO.11665,保藏日期为2015年11月16日。
萎缩芽孢杆菌BsR05在酪氨酸培养基上37℃培养24h菌落颜色均较淡,无明显黑色素产生,菌落湿润,边缘整齐,不透明,凸起;37℃培养48h,开始产生黑色素,37℃培养96h,菌落呈黑色,黑色素积聚。
萎缩芽孢杆菌BsR05能利用甘油,接触酶反应阳性,能将硝酸盐还原成亚硝酸盐,能液化明胶,可利用甘露糖发酵,不利用阿拉伯糖、苦杏仁苷和甘露醇发酵,能在含7% NaCl胰胨水中生长,能水解淀粉。
所述的萎缩芽孢杆菌BsR05菌株在防治黄瓜灰霉病方面的应用。
所述的萎缩芽孢杆菌BsR05菌株制备的微生物菌剂,将萎缩芽孢杆菌BsR05进行发酵,在萎缩芽孢杆菌BsR05发酵液中添加按重量百分比的添加5%硫酸铵,0.15%苯甲酸钠,0.1%脂肪醇聚氧乙烯醚,0.20%黄原胶制得微生物菌剂。
该微生物菌剂制备过程中各种成分添加次序为:首先要将硫酸铵缓慢且不停搅动地加入萎缩芽孢杆菌BsR05发酵液中,待硫酸铵全部溶解后,再缓慢依次加入苯甲酸钠,脂肪醇聚氧乙烯醚,黄原胶,获得萎缩芽孢杆菌BsR05微生物菌剂悬浮剂。
萎缩芽孢杆菌BsR05发酵液通过以下步骤制得:
(1)斜面菌种:采用固体LB培养基,将萎缩芽孢杆菌BsR05接种在试管培养基中,30℃恒温条件下培养24小时得斜面菌种;
(2)摇瓶菌种:采用液体LB培养基,将斜面菌种的单菌落接种在液体LB培养基中置摇床上30℃恒温条件下培养18小时得种子液;
(3)液体发酵:调节培养基pH 7.0-7.5,121℃ 灭菌20分钟,将步骤(2)获得的种子液按接种量2%接种于10升发酵罐内,30℃培养,每分钟通气量与发酵罐容积比为1.2-1.5:1,搅拌速度为250r/min,培养时间为28-36小时,在芽孢脱落70%(芽孢率(%)=成熟芽孢数/(成熟芽孢数+营养菌体数)×100)时终止发酵得到萎缩芽孢杆菌BsR05发酵液。
步骤(3)中,培养基按重量百分比为:2%玉米粉、6%豆粕粉、0.2%(NH42SO4、0.2%KH2PO4·2H2O、0.4%K2HPO4·2H2O、0.05%FeSO4·5H2O、0.3%CaCO3
本发明的萎缩芽孢杆菌BsR05菌株及其应用有益效果为:本发明的萎缩芽孢杆菌BsR05对黄瓜灰霉病的抑制率达83.24%,本发明还提供了利用上述萎缩芽孢杆菌发酵制备防治黄瓜灰霉病的微生物菌剂,该微生物菌剂能够有效防治黄瓜灰霉病,同时具有促进植物生长的优点。本发明的萎缩芽孢杆菌BsR05制备的微生物菌剂有效成分以芽孢为主,可以较长时间的保存而活性不易丧失,所以可以可以有效的提高和稳定病害生物防治的效果,更好地用于农业生产。
附图说明:
图1所示为萎缩芽孢杆菌BsR05在酪氨酸培养基上37℃培养96h图。
具体实施方式:
为了更好地理解本发明,下面用具体实例来详细说明本发明的技术方案,但是本发明并不局限于此。
实施例1:
萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)的鉴定
采用16SrDNA序列比对结合生理生化特征测定的方法将BsR05鉴定为萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)。具体步骤如下:
(1)16SrDNA序列分析
提取BsR05菌体的基因组DNA,用细菌16SrDNA通用引物(16s F: 5'AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3';16s R: 5' TACGGCTACCTTGTTACGACT 3')进行PCR扩增,然后用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收。将回收后纯化的PCR产物送到上海生工生物技术公司测序得SEQ ID NO1:
CTGGAATCGC TAGTAATCGC GGATCAGCAT GCCGCGGTGA ATACGTTCCC GGGCCTTGTA 60
CACACCGCCC GTCACACCAC GAGAGTTTGT AACACCCGAA GTCGGTGGGG TAACCTTTTT 120
GGAGCCAGCC GCCTAAGGTG GGACAGATGA TTGGGGTGAA GTCGTAACAA GGTAGCCGTA 180
TCGGAAGGTG CGGCTGGATC ACTATTGGAG AGTTTGATCC TGGCTCAGGA TGAACGCTGG 240
CGGCGTGCCT AATACATGCA AGTCGAGCGA ATGGATTAAG AGCTTGCTCT TATGAAGTTA 300
GCGGCGGACG GGTGAGTAAC ACGTGGGTAA CCTGCCCATA AGACTGGGAT AACTCCGGGA 360
AACCGGGGCT AATACCGGAT AACATTTTGA ACTGCATGGT TCGAAATTGA AAGGCGGCTT 420
CGGCTGTCAC TTATGGATGG ACCCGCGTCG CATTAGCTAG TTGGTGAGGT AACGGCTCAC 480
CAAGGCAACG ATGCGTAGCC GACCTGAGAG GGTGATCGGC CACACTGGGA CTGAGACACG 540
GCCCAGACTC CTACGGGAGG CAGCAGTAGG GAATCTTCCG CAATGGACGA AAGTCTGACG 600
GAGCAACGCC GCGTGAGTGA TGAAGGCTTT CGGGTCGTAA AACTCTGTTG TTAGGGAAGA 660
ACAAGTGCTA GTTGAATAAG CTGGCACCTT GACGGTACCT AACCAGAAAG CCACGGCTAA 720
CTACGTGCCA GCAGCCGCGG TAATACGTAG GTGGCAAGCG TTATCCGGAA TTATTGGGCG 780
TAAAGCGCGC GCAGGTGGTT TCTTAAGTCT GATGTGAAAG CCCACGGCTC AACCGTGGAG 840
GGTCATTGGA AACTGGGAGA CTTGAGTGCA GAAGAGGAAA GTGGAATTCC ATGTGTAGCG 900
GTGAAATGCG TAGAGATATG GAGGAACACC AGTGGCGAAG GCGACTTTCT GGTCTGTAAC 960
TGACACTGAG GCGCGAAAGC GTGGGGAGCA AACAGGATTA GATACCCTGG TAGTCCACGC 1020
CGTAAACGAT GAGTGCTAAG TGTTAGAGGG TTTCCGCCCT TTAGTGCTGA AGTTAACGCA 1080
TTAAGCACTC CGCCTGGGGA GTACGGCCGC AAGGCTGAAA CTCAAAGGAA TTGACGGGGG 1140
CCCGCACAAG CGGTGGAGCA TGTGGTTTAA TTCGAAGCAA CGCGAAGAAC CTTACCAGGT 1200
CTTGACATCC TCTGAAAACC CTAGAGATAG GGCTTCTCCT TCGGGAGCAG AGTGACAGGT 1260
GGTGCATGGT TGTCGTCAGC TCGTGTCGTG AGATGTTGGG TTAAGTCCCG CAACGAGCGC 1320
AACCCTTGAT CTTAGTTGCC ATCATTAAGT TGGGCACTCT AAGGTGACTG CCGGTGACAA 1380
ACCGGAGGAA GGTGGGGATG ACGTCAAATC ATCATGCCCC TTATGACCTG GGCTACACAC 1440
GTGCTACAAT GGACGGTACA AAGAGCTGCA AGACCGCGAG GTGGAGCTAA TCTCATAAAA 1500
CCGTTCTCAG TTCGGATTGT AGGCTGCAAC TCGCCTACAT GAAG 1544
使用NCBI网站对BsR05菌的16SrDNA序列与数据库中各种菌的16S rDNA序列进行相似性比较分析,结果表明BsR05 16SrDNA序列与萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)的16SrDNA序列同源性非常高,达99%。
(2)生理生化特征
萎缩芽孢杆菌原始菌株能在含酪氨酸培养基上产生黑色素,根据这一特性将又将萎缩芽孢杆菌称之为枯草芽孢杆菌黑色变种以区别于枯草芽孢杆菌。菌株BsR05在酪氨酸培养基上37℃培养24h菌落颜色均较淡,无明显黑色素产生,菌落湿润,边缘整齐,不透明,凸起。37℃培养48h,开始产生黑色素,37℃培养96h,菌落呈黑色,黑色素积聚,如说明书附图图1所示。
此外,BsR05能利用甘油,接触酶反应阳性,能将硝酸盐还原成亚硝酸盐,能液化明胶,可利用甘露糖发酵,不利用阿拉伯糖、苦杏仁苷和甘露醇发酵,能在含7% NaCl胰胨水中生长,能水解淀粉,而枯草芽孢杆菌可以利用甘露醇,故鉴定BsR05为萎缩芽孢杆菌。
实施例2:萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus) BsR05菌剂的制备,步骤如下:
(1)斜面菌种:采用固体LB培养基,将萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)BsR05试管菌种接种在试管培养基中,30℃恒温条件下培养24小时得斜面菌种。
(2)摇瓶菌种:采用液体LB培养基,将斜面菌种的单菌落接种在液体LB培养基中置摇床上30℃恒温条件下培养18小时得种子液。
(3)液体发酵:培养基按重量百分比为:2%玉米粉、6%豆粕粉、0.2%(NH42SO4、0.2%KH2PO4·2H2O、0.4%K2HPO4·2H2O、0.05%FeSO4·5H2O、0.3%CaCO3,pH 7.0-7.5,121℃ 灭菌20分钟,将步骤(2)的种子液接种于10升发酵罐内(接种量为2%),30℃培养,每分钟通气量与发酵罐容积比为1.2-1.5:1,搅拌速度为250r/min,培养时间为28-36小时,在芽孢脱落70%(芽孢率(%)=成熟芽孢数/(成熟芽孢数+营养菌体数)×100)时终止发酵。
(4)微生物菌剂悬浮剂的制备:在液体发酵完成后的发酵液中添加5%硫酸铵,0.15%苯甲酸钠,0.1%脂肪醇聚氧乙烯醚,0.20%黄原胶。注意在悬浮剂配置的各种成分添加次序为:首先要将硫酸铵缓慢且不停搅动地加入发酵液中,待硫酸铵全部溶解后,再缓慢依次加入苯甲酸钠,脂肪醇聚氧乙烯醚,黄原胶。最终制备获得萎缩芽孢杆菌BsR05微生物菌剂悬浮剂。
实施例3:萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus) BsR05对黄瓜灰霉病的拮抗作用
供试病原菌:灰葡萄孢(Botrytis cinerea Pers.ex Fr.)本山东省科学院生物研究所保藏,采用对峙培养法,首先将灰葡萄孢在PDA平板上活化,培养5天后在菌落边缘区域用打孔器打孔制成5mm的病原菌菌饼,将病原菌菌饼转接至PDA平板中央,在距菌饼2.0cm处点接种萎缩芽孢杆菌BsR05,以只接种病原菌菌饼的平皿为对照,每个处理设3次重复。25℃温箱培养,待空白对照长满整个培养皿时,测量对照菌落半径和接种BsR05后的抑制生长半径,用拮抗作用抑制率(抑菌率(%)=(对照生长量-处理生长量)/对照生长量×100)表示。
结果见表1,萎缩芽孢杆菌BsR05对黄瓜灰霉病的抑制率达83.24%,透明的抑菌带宽11.5毫米。说明萎缩芽孢杆菌BsR05对黄瓜灰霉病具有明显的抑制作用,具有防治灰霉病的生防潜能。
表1萎缩芽孢杆菌BsR05对黄瓜灰霉病的拮抗作用
Figure DEST_PATH_IMAGE001
实施例4:萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)微生物菌剂对黄瓜灰霉病防效的温室试验
黄瓜灰霉病:选发育整齐的黄瓜幼苗,试验前调查发病情况。萎缩芽孢杆菌BsR05微生物菌剂悬浮液稀释100倍后均匀喷雾至叶子两面,每处理10株,4个重复,24 h后同法接种灰霉病菌,7d后进行病害调查,对照药剂为40% 嘧霉胺悬浮剂(北京富力特农业科技有限责任公司生产),用水稀释1000使用。试验地点:山东省科学院生物研究所人工气候室。
病情调查与分级标准:
0级:叶片无病斑;1级:单叶片有病斑3个;3级:单叶片有病斑4~6个;5级:单叶片有病斑7~10个;7级:单叶片有病斑11~20个;9级:单叶片有病斑密集占叶面积1/4以上。
病情指数(%)=100×∑(各病级×各级株数)/(最高病级×总调查株数)
病指增加率(%)=100×(药后病情指数-药前病情指数)/药前病情指数
防治效果(%)=100×(对照病指增加率-处理病指增加率)/对照病指增加率
结果见表2,萎缩芽孢杆菌BsR05微生物菌剂处理的黄瓜灰霉病病情指数显著低于空白对照,并略低于化学药剂处理的病情指数;说明萎缩芽孢杆菌BsR05微生物菌剂对黄瓜灰霉病具有良好的防治效果。
表2 萎缩芽孢杆菌BsR05微生物菌剂悬浮剂防治黄瓜灰霉病室内试验结果
Figure DEST_PATH_IMAGE002
实施例4:萎缩芽孢杆菌BsR05微生物菌剂悬浮剂对黄瓜灰霉病防效的田间试验
(1)供试药剂:萎缩芽孢杆菌BsR05微生物菌剂,对照药剂:40%嘧霉胺悬浮剂(北京富力特农业科技有限责任公司生产)。
(2)试验设计与方法
试验地点在山东诸城贾悦镇王家杨柳村黄瓜(果期)大棚完成。试验设2个处理,萎缩芽孢杆菌BsR05微生物菌剂悬浮液稀释100倍使用,40% 嘧霉胺悬浮剂稀释1000倍使用,每亩喷施60L,空白对照(CK)。田间小区试验采用随机排列,重复4次,小区面积30 m2。
施药方法:用电动喷雾器进行整株喷洒,一般在上午10:00以前,下午16:00点以后或阴天喷施。
试验调查及防效计算:调查方法为每个处理固定10株,每株上中下调查10张叶片,喷药前调查病叶病情,每次喷药后7 d调查一次,记录病叶病情。计算病情指数和防治效果,用新复极差法进行显著性分析。
分级标准:0级——无病;1级——病斑面积占整个叶片面积的5%以下;3级——病斑面积占整个叶片面积的6%~15%;5级——病斑面积占整个叶片面积的16%~25%;7级——病斑面积占整个叶片面积的26%~50%;9级——病斑面积占整个叶片面积的50%以上。
Figure DEST_PATH_IMAGE003
式中,CK0为空白对照区施药前病情指数;CK1为空白对照区施药后病情指数;PT0为药剂处理区施药前病情指数;PTl为药剂处理区施药后病情指数。
表3 萎缩芽孢杆菌BsR05微生物菌剂悬浮剂防治黄瓜灰霉病田间试验结果
Figure DEST_PATH_IMAGE004
SEQUENCE LISTING
<110> 山东省科学院生物研究所
<120> 萎缩芽孢杆菌BsR05菌株及其应用
<130>
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成
<400> 1
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 合成
<400> 2
tacggctacc ttgttacgac t 21
<210> 3
<211> 1544
<212> DNA
<213> Bacillus atrophaeus
<400> 3
ctggaatcgc tagtaatcgc ggatcagcat gccgcggtga atacgttccc gggccttgta 60
cacaccgccc gtcacaccac gagagtttgt aacacccgaa gtcggtgggg taaccttttt 120
ggagccagcc gcctaaggtg ggacagatga ttggggtgaa gtcgtaacaa ggtagccgta 180
tcggaaggtg cggctggatc actattggag agtttgatcc tggctcagga tgaacgctgg 240
cggcgtgcct aatacatgca agtcgagcga atggattaag agcttgctct tatgaagtta 300
gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa cctgcccata agactgggat aactccggga 360
aaccggggct aataccggat aacattttga actgcatggt tcgaaattga aaggcggctt 420
cggctgtcac ttatggatgg acccgcgtcg cattagctag ttggtgaggt aacggctcac 480
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gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg gaatcttccg caatggacga aagtctgacg 600
gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggcttt cgggtcgtaa aactctgttg ttagggaaga 660
acaagtgcta gttgaataag ctggcacctt gacggtacct aaccagaaag ccacggctaa 720
ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg ttatccggaa ttattgggcg 780
taaagcgcgc gcaggtggtt tcttaagtct gatgtgaaag cccacggctc aaccgtggag 840
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gtgaaatgcg tagagatatg gaggaacacc agtggcgaag gcgactttct ggtctgtaac 960
tgacactgag gcgcgaaagc gtggggagca aacaggatta gataccctgg tagtccacgc 1020
cgtaaacgat gagtgctaag tgttagaggg tttccgccct ttagtgctga agttaacgca 1080
ttaagcactc cgcctgggga gtacggccgc aaggctgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg 1140
cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggt 1200
cttgacatcc tctgaaaacc ctagagatag ggcttctcct tcgggagcag agtgacaggt 1260
ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc 1320
aacccttgat cttagttgcc atcattaagt tgggcactct aaggtgactg ccggtgacaa 1380
accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac 1440
gtgctacaat ggacggtaca aagagctgca agaccgcgag gtggagctaa tctcataaaa 1500
ccgttctcag ttcggattgt aggctgcaac tcgcctacat gaag 1544
Figure IDA0000916215710000011
Figure IDA0000916215710000021
Figure IDA0000916215710000031
Figure IDA0000916215710000041
Figure IDA0000916215710000051
Figure IDA0000916215710000061

Claims (5)

1.萎缩芽孢杆菌BsR05菌株在防治黄瓜灰霉病方面的应用,其特征在于,萎缩芽孢杆菌Bacillus atrophaeus BsR05菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号:CGMCCNO.11665,保藏日期为2015年11月16日;
萎缩芽孢杆菌BsR05在酪氨酸培养基上37℃培养24h菌落颜色均较淡,无明显黑色素产生,菌落湿润,边缘整齐,不透明,凸起;37℃培养48h,开始产生黑色素,37℃培养96h,菌落呈黑色,黑色素积聚;
萎缩芽孢杆菌BsR05能利用甘油,接触酶反应阳性,能将硝酸盐还原成亚硝酸盐,能液化明胶,可利用甘露糖发酵,不利用阿拉伯糖、苦杏仁苷和甘露醇发酵,能在含7%NaCl胰胨水中生长,能水解淀粉。
2.一种采用萎缩芽孢杆菌BsR05菌株制备的微生物菌剂,其特征在于,将萎缩芽孢杆菌BsR05进行发酵,在萎缩芽孢杆菌BsR05发酵液中添加按重量百分比的添加5%硫酸铵,0.15%苯甲酸钠,0.1%脂肪醇聚氧乙烯醚,0.20%黄原胶制得微生物菌剂,所述的萎缩芽孢杆菌BsR05菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号:CGMCCNO.11665,保藏日期为2015年11月16日。
3.根据权利要求2所述的微生物菌剂,其特征在于,该微生物菌剂制备过程中各种成分添加次序为:首先要将硫酸铵缓慢且不停搅动地加入萎缩芽孢杆菌BsR05发酵液中,待硫酸铵全部溶解后,再缓慢依次加入苯甲酸钠,脂肪醇聚氧乙烯醚,黄原胶,获得萎缩芽孢杆菌BsR05微生物菌剂悬浮剂。
4.根据权利要求2所述的微生物菌剂,其特征在于,萎缩芽孢杆菌BsR05发酵液通过以下步骤制得:
(1)斜面菌种:采用固体LB培养基,将萎缩芽孢杆菌BsR05接种在试管培养基中,30℃恒温条件下培养24小时得斜面菌种;
(2)摇瓶菌种:采用液体LB培养基,将斜面菌种的单菌落接种在液体LB培养基中置摇床上30℃恒温条件下培养18小时得种子液;
(3)液体发酵:调节培养基pH 7.0-7.5,121℃灭菌20分钟,将步骤(2)获得的种子液按接种量2%接种于10升发酵罐内,30℃培养,每分钟通气量与发酵罐容积比为1.2-1.5:1,搅拌速度为250r/min,培养时间为28-36小时,在芽孢脱落70%时终止发酵得到萎缩芽孢杆菌BsR05发酵液。
5.根据权利要求4所述的微生物菌剂,其特征在于,步骤(3)中,培养基按重量百分比为:2%玉米粉、6%豆粕粉、0.2%(NH4)2SO4、0.2%KH2PO4·2H2O、0.4%K2HPO4·2H2O、0.05%FeSO4·5H2O、0.3%CaCO3
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