CN105648008A

CN105648008A - 一种饲用蚕丝抗菌肽制剂及其制备方法

Info

Publication number: CN105648008A
Application number: CN201610000658.1A
Authority: CN
Inventors: 赵迎庆; 刘洋; 邹芳平; 孙标
Original assignee: Shandong Runmu Biological Technology Co Ltd
Current assignee: Shandong Runmu Biological Technology Co Ltd
Priority date: 2016-01-04
Filing date: 2016-01-04
Publication date: 2016-06-08

Abstract

本发明公布了一种饲用蚕丝抗菌肽制剂及其制备方法，该制备方法包括以下步骤：（1）废蚕丝脱胶及脱胶蚕丝的氯化钙溶解；（2）将步骤（1）制备的脱胶蚕丝溶液采用碱性蛋白酶（Alcalase2.4L）和复合风味蛋白酶（Flavorzyme）按照3:2比例混合，控制反应条pH8.5，温度55℃，反应时间5h，制成蚕丝多肽酶解液；（3）透析、脱盐、浓缩步骤（2）制备的蚕丝多肽酶解液；（4）DEAE-52、Sephadex？G-25葡聚糖凝胶分离纯化蚕丝抗菌肽；（5）真空冷冻干燥步骤（4）制备的蚕丝抗菌肽溶液，即得成品。本发明的目的在于提供一种绿色、替代饲料添加剂抗生素、回收废弃蚕丝、制备工艺简单、易清洗蚕丝多肽制备工艺。

Description

一种饲用蚕丝抗菌肽制剂及其制备方法

技术领域

本发明属于动物饲料添加剂技术领域，具体涉及一种饲用蚕丝抗菌肽制剂及其制备方法。

背景技术

新华网在2015年11月23日报道，最近在牲畜和人身上发现了一种能对抗强效抗生素的“超级细菌”基因，这意味着人类所用抗生素中的“最后一道防线”有被攻破的风险。研究人员分析猪肉、鸡肉以及人类患者身上采集的细菌样本发现，存在一种特殊基因MCR-1，携带该基因的细菌对多粘菌素表现出强耐药性，并且这种耐药性还能够快速转移至其他菌株。

中国由于滥用各种抗生素、激素和违禁药品饲喂畜禽，而导致食品安全事件频发，畜禽肉制品对外出口连年下降，我国猪肉、禽肉、禽蛋、肉类总产量均占世界首位，而出口总量仅占世界肉类出口总量3.6%，由于动物饲养方面仍然存在卫生安全问题，欧盟、美国、日本等发达国家至今未解除对我国动物源型食品进口限制。可见开发高效优质的生物饲料产品替代抗生素、激素，生产绿色无公害、有机肉、蛋、奶是国家和全民食品安全需要的民生问题。

近几年来，人们研究开发出了饲用酶制剂、饲用微生物制剂、酸化剂、抗菌肽、寡聚糖、大蒜素、中草药以及有机金属微量元素等抗生素替代品，这些绿色饲料添加剂得到了人们的青睐，都是基于抑制有害菌增殖、促进有益菌增殖、改善肠道微环境的基础上进行研究的，但总体来说，这些抗生素替代产品相对于抗生素而言，其作用效果仍有一定的差距。

各种动物及家禽自幼小个体发育开始，体内就建立起平衡的微生物菌群，并有其维持自身菌群稳态的机制，例如抗氧化因子、激素、蛋白、小肽等是维持机体微环境稳定的重要因子。

抗菌肽是1980年由瑞典科学家G.Boman等人在蚕丝中分离得到的一类具有抗菌活性的碱性多肽物质，分子量在2000~7000左右，由20~60个氨基酸残基组成。这类活性多肽多数具有强碱性、热稳定性以及广谱抗菌等特点。本发明以天然蚕丝为原料，通过先进的工艺设计保证了抗菌肽的活性及稳定性，项目最终获得具有抗细菌、抗霉菌、抗氧化等活性的绿色、健康、无耐药性、环境友好、可代替饲料用抗生素的产品，从而达到更好的预防和治疗畜禽疾病的目的。

发明内容

本发明的目的是提供一种简便的蚕丝抗菌肽的制备工艺，客服现有霉菌毒素吸附剂效果片面吸附霉菌毒素以及因使用抗生素带来的抗生素污染问题。

为了上述目的，本发明实施的技术方案如下：

所述可以产生抗菌效果的抗菌肽，是由从桑蚕养殖户收购的废蚕丝作为抗菌肽制备的原料。

所述抗菌肽制备工艺方法如下：

（1）废蚕丝的预处理，称取一定量废蚕丝，利用碳酸钠溶液对蚕丝进行脱胶处理，以碳酸钠溶液浓度、固液比和精炼时间作为废蚕丝预处理的影响因素，以脱胶率作为实验的考察指标。

所述步骤（1）碳酸钠溶液浓度为0.2%-0.6%，固液比为1:30-1:70（g/mL），脱胶时间30-60min。

所述步骤（1）脱胶率，计算方法以采用烘干称重法测定处理前后试样的质量，分别将未脱胶和已脱胶的丝素样品放入烘箱中，以(65±1)℃的温度将其烘至恒重，并放入干燥器中进行冷却，在室温下稳定12h后用电子天平分别称质量，即得脱胶蚕丝和未脱胶蚕丝的干重，分别以M₁和M₂表示。脱胶率公式如下：

式中：M₁表示脱胶蚕丝干重，M₂未脱胶蚕丝干重

（2）将步骤（1）所得到的脱胶蚕丝，采用氯化钙溶液溶解，溶解后的蚕丝采用超滤膜对其进行超滤脱盐处理。

所述步骤（2）中氯化钙溶液浓度为20%、30%、40%、50%，所使用的超滤膜为MWCO1000超滤膜。

（3）对步骤（2）分离得到的脱盐处理的脱胶蚕丝，采用碱性蛋白酶（Alcalase2.4L）和风味蛋白酶（Flavorzyme）进行水解。

所述步骤（3）中使用的复合蛋白酶配比为1:1-1:3，控制底物浓度3%-5%、加酶量1%-2.5%、pH8-9、反应温度45℃-65℃、酶解时间2.5h-6.5h。本发明采用半微量凯氏定氮法与甲醛法滴定氨基态氮联合测定蚕丝抗菌肽的得率。

（4）对步骤（3）经过酶水解得到的蚕丝抗菌肽溶液进行分离纯化，将蚕丝酶解液置于的透析袋中对纯水透析，主要是利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开，透析结束后，再用聚乙二醇6000浓缩至原体积的1/5，收集备用，即为蚕丝中的多肽物质。

（5）采用饱和的硫酸铵溶液沉淀步骤（4）制备的蚕丝多肽物质，得到蚕丝抗菌肽沉淀。

（6）采用氯化钙溶解蚕丝抗菌肽沉淀，采用超滤膜过滤脱盐浓缩蚕丝抗菌肽。

所述步骤（6）使用的超滤膜为MWCO1000膜。

（7）经浓缩过的蚕丝抗菌肽用离子交换层析和葡聚糖凝胶层析进行分离纯化，采用考马斯亮蓝比色法进行跟踪检测，收集洗脱液。

所述步骤（7）采用DEAE-52纤维素对蚕丝抗菌肽进行初步的分离纯化，采用Sephadex-G25凝胶柱层析进行进一步的纯化处理，

（8）合并步骤（7）收集的洗脱峰洗脱液，并按照洗脱峰的顺序依次编号，预冻处理后，采用真空冷冻干燥机干燥，即得蚕丝抗菌肽粉末。

所述步骤（8）洗脱液厚度液位高度控制在0.5-1cm，洗脱液预冻温度为（-15℃）-（-18℃），真空干燥机真空度为0.05MPa-0.08MPa，按照0℃-50℃程序降温，干燥时间12-24h。

（9）本发明提供了一种蚕丝抗菌肽制剂的分离制备方法，工艺采用酶法水解脱胶蚕丝，制备过程环境温和，分离过程绿色环保，减少了因是由有机试剂带来的环境污染和能源动力消耗，采用本工艺分离制备的蚕丝抗菌肽可以应用到饲料行业，因蚕丝抗菌肽具有抗菌性能，所以可以在作为抗菌成分替代饲料添加剂中抗生素成分，所以本发明提供的蚕丝抗菌肽产品的制备工艺将具有良好的发展前景。

附图说明

图1是本发明蚕丝抗菌肽制备工艺流程图。

图2是本发明DEAE-52离子交换层析柱层析梯度洗脱曲线图(柱子规格：20mm*65cm)

图3是本发明SAP-1组分SephadexG-25葡聚糖凝胶柱层析洗脱曲线图(柱子规格规格：16mm*100cm)

图4是本发明蚕丝抗菌肽SephadexG-25葡聚糖凝胶纯度鉴定图谱(柱子规格规格：16mm*100cm)

具体实施方式

以下通过实施形式对本发明上述说明内容进行进一步的说明，一种饲用蚕丝抗菌肽制剂及其制备方法，包括如下步骤：

（1）分析天平称取1000g废蚕丝，添加浓度0.5%的碳酸钠溶液300mL，提取40min，即得脱胶蚕丝，以未脱胶蚕丝作为对照试验。

（2）将步骤（1）得到的未脱胶和已脱胶的丝素样品放入烘箱中，以(65±1)℃的温度将其烘至恒重，并放入干燥器中进行冷却，在室温下稳定12h后用电子天平分别称质量，即得脱胶蚕丝和未脱胶蚕丝的干重，分别以M₁和M₂表示，计算脱胶率。

（3）利用40%的氯化钙溶液溶解步骤（2）得到的脱胶蚕丝，采用MWCO1000超滤膜对脱胶蚕丝进行浓缩脱盐处理。

（4）将碱性蛋白酶（Alcalase2.4L）和复合风味蛋白酶（Flavorzyme）按照3:2比例混合，添加2%的复合蛋白酶水解步骤（3）制备的脱胶蚕丝浓缩液，控制反应条pH8.5，温度55℃，反应时间5h，采用半微量凯氏定氮法与甲醛法滴定氨基态氮联合测定蚕丝抗菌肽的得率。

所述步骤（4）脱胶蚕丝缩液浓度为4%。

所述步骤（4）蚕丝抗菌肽得率计算方法如下：

脱胶蚕丝中蛋白质含量：

式中：T---样品中蛋白质质量（g）

V₂---样品消耗硫酸标准溶液体积（mL）

V₁---空白消耗硫酸标准溶液体积（mL）

C---硫酸标准溶液浓度（mol/L）

0.014---与1.0mL硫酸标准溶液相当的氮的质量（g）

6.25---氮换算为蛋白质的系数

W---样品质量（g）

V---试样分解液总体积（mL）

V'---试样分解液蒸馏用体积（mL)

氨基态氮含量：

式中：A---样品中总的游离氨基酸质量（g）

V1---空白试验加入甲醛后滴定至终点所消耗的氢氧化钠标准溶液的体积（mL）

V2---样品稀释在加入甲醛后滴定至终点pH9.2所消耗的氢氧化钠标准溶液的体积（mL）

C---氢氧化钠标准溶液浓度（mol/L）

0.014---氮的毫摩尔质量（g/mmol）

V---测定用样品溶液的体积（mL）

蚕丝抗菌肽的得率：

（5）取经过脱胶和复合蛋白酶水解处理过样品，置于截留分子量2000Da的透析袋（G-RC-18-2K）中对纯水透析48h，每隔8h换水一次透，透析结束后，再用聚乙二醇6000浓缩至原体积的1/5，收集备用，即为蚕丝多肽物质浓缩液。

（6）采用DEAE-52离子交换层析柱初步分离纯化步骤（5）制备的蚕丝多肽浓缩液。

步骤（6）所述DEAE-52离子交换层析柱规格为20mm*65cm。

步骤（6）所述DEAE-52离子交换层析柱平衡采用蒸馏水洗至中性。

步骤（6）所述DEAE-52离子交换层析柱上样，吸取步骤（5）制备的蚕丝多肽浓缩液5mL到事先用蒸馏水平衡过的柱子内，这时打开柱子出液口止水阀，使样品渗到层析介质内，采用蒸馏水、0.1mol/LNaCl、0.3mol/LNaCl、0.5mol/LNaCl各100mL进行梯度洗脱，流速控制在0.5mL/min，用考马斯亮蓝比色法进行跟踪检测，最后根据梯度洗脱曲线收集合并单一洗脱峰。

（7）将步骤（6）收集的洗脱液置于截留分子量2000Da的透析袋（G-RC-18-2K）中对纯水透析48h，每隔8h换水一次透，透析结束后，真空冷冻干燥，即得蚕丝抗菌肽初分离粉末。

（8）利用蒸馏水溶解步骤（7）制备的蚕丝抗菌肽初分离粉末，即得，蚕丝抗菌肽初分离溶液。

步骤（8）所述的蚕丝抗菌肽初分离溶液浓度为1g/mL。

（9）利用SephadexG-25葡聚糖凝胶柱进一步纯化步骤（8）制备的蚕丝抗菌肽初分离溶液。

步骤（9）所述SephadexG-25葡聚糖凝胶柱规格为16mm*100cm。

步骤（9）所述SephadexG-25葡聚糖凝胶柱，使用前柱子需要进行平衡处理，采用pH7.8的磷酸磷酸盐缓冲液平衡柱子，流速控制在0.5mL/min，当流出液的pH与平衡缓冲液pH一致时，层析柱达到平衡。

步骤（9）所述SephadexG-25葡聚糖凝胶柱上样方法，吸取步骤（8）制备的蚕丝抗菌肽初分离溶液5mL到事先用磷酸磷酸盐缓冲液平衡过的柱子内，这时打开柱子出液口止水阀，使样品渗到层析介质内。

步骤（9）所述SephadexG-25葡聚糖凝胶柱洗脱与收集方法，当样品凹液面接近柱床表面时用滴管缓慢滴加一定高度的蒸馏水，防止在洗脱的时候直接滴加洗脱液破坏柱床表面，用0.2mol/L的磷酸磷酸盐缓冲液进行洗脱，流速0.5mL/min，每管收集5mL，用考马斯亮蓝比色法进行跟踪检测，最后根据梯度洗脱曲线收集合并单一洗脱峰。

（10）合并步骤（9）收集的洗脱峰，在-16℃预冻洗脱液，在空载情况下，按照温度0℃、-10℃、-20℃、-30℃进行程序降温，时间1h，在真空度0.06MPa干燥24h，即得蚕丝多肽粉末。

Claims

1.一种饲用蚕丝抗菌肽制剂及其制备方法，包括如下步骤：

（1）将废蚕丝利用浓度为0.2%-0.6%的碳酸钠溶液进行脱胶处理；

（2）氯化钙溶解步骤（1）制备的胶脱胶蚕丝，利用蛋白酶进行酶解；

（3）透析、浓缩、沉淀步骤（2）制备的蚕丝多肽溶液；

（4）利用离子交换层析和葡聚糖凝胶层析分离纯化步骤（3）制备的蚕丝多肽溶液；

（5）将步骤（4）制备的蚕丝抗菌肽溶液进行冷冻干燥，得到蚕丝抗菌肽产品。

2.根据权利要求1所述的废蚕丝脱胶工艺，其特征在于碳酸钠溶液浓度0.2%-0.6%、固液比为1:30-1:70（g/mL），脱胶时间30-60min。

3.根据权利要求1所述的蛋白酶酶解工艺，其特征在于复合蛋白酶配比为1:1-1:3，控制底物浓度3%-5%、加酶量1%-2.5%、pH8-9、反应温度45℃-65℃、酶解时间2.5h-6.5h。

4.根据权利要求1所述的步骤（3），其特征在于透析袋截留分子量2000Da，采用饱和硫酸铵沉淀蚕丝多肽。

5.根据权利要求1所述的蚕丝多肽分离纯化工艺，其特征在于采用DEAE-52、SephadexG-25葡聚糖凝胶进行分离纯化，DEAE-52离子交换柱层析流动相采用蒸馏水、0.1mol/LNaCl、0.3mol/LNaCl、0.5mol/LNaCl，流速控制在0.5mL/min；SephadexG-25葡聚糖凝胶柱层析流动相采用pH7.8的磷酸磷酸盐缓冲液，流速控制在0.5mL/min。

6.根据权利要求1所述的蚕丝抗菌肽干燥工艺，其特征在于蚕丝抗菌肽溶液-16℃预冻，真空度0.06MPa，干燥24h。