CN102191234A - 鸡蛋清溶菌酶的分离纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鸡蛋清溶菌酶的分离纯化方法。步骤如下：1)前处理，新鲜鸡蛋蛋清加入一定比例缓冲液，均匀搅拌，4℃静置过夜，去除沉淀并调至上样pH。2)离子交换，采用CM型琼脂糖离子交换介质，上样后清洗未交换蛋白，最后用1M NaCl进行梯度洗脱，并收集洗脱峰。3)超滤脱盐，以膜截留分子量为3000～5000Da的超滤膜进行超滤，室温下脱盐并浓缩。4)冷冻干燥，将超滤脱盐并浓缩的溶液进行冷冻真空干燥，得到白色粉末，即为溶菌酶。本发明所开发的鸡蛋清溶菌酶的分离纯化方法，具有蛋清溶菌酶活性高，工艺简单，条件温和，投资较少，并可进行规模化生产，适用于食品、医药和生物技术行业。
Description
技术领域
本发明涉及一种鸡蛋清溶菌酶的分离纯化方法，属于天然活性成分工业化提取技术领域。
背景技术
溶菌酶(Lysozyme)又称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，广泛存在于动物组织和分泌物中，以鸡蛋清中最丰富，其含量约占蛋清蛋白总量的3.4％-3.5％。
溶菌酶的用途较广，它既是药品，又是保健品，还是生化药物中理想的药用酶。在食品工业中，溶菌酶一种天然、无毒、安全性高的食品添加剂，可以作为防腐和保鲜，广泛应用于乳制品、低度酒、饮料、水产品、肉类制品和糕点等的防腐保鲜；在医药上，溶菌酶作为一种存在于人体正常体液及组织中的非特异性免疫因素，具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤的功效，广泛应用于临床医学；在生物技术中，溶菌酶是基因工程、细胞工程、发酵工程中必不可少的工具酶。因此，对溶菌酶的研究及生产十分必要，特别是对禽蛋产品中溶菌酶的高效提取技术与产品开发技术研究更为重要。
溶菌酶的提取方法报道较多，有直接结晶法、超滤法、离子交换树脂吸附法、亲和层析法、反胶束萃取法、薄层层析法、沉淀法等等。各种方法优缺点不一，产品的质量和生产成本不能有效协调。目前，以离子交换树脂吸附法为主要手段的提取方法最具前景，但是树脂是一种人工合成的高分子聚合物，分离过程中容易使蛋白质变性，因此产品的酶活性受到了较大的影响。
本发明以生物相容性的琼脂糖基离子交换为分离主体，从鸡蛋清中分离纯化得到活力高、纯度高的蛋清溶菌酶，工艺简单，条件温和，投资较少，并可进行规模化生产，适用于食品、医药和生物技术行业。
发明内容
本发明的目的是提供一种鸡蛋清溶菌酶的分离纯化方法。该方法解决了现有离子交换树脂影响溶菌酶活性的缺点，工艺简单，条件温和，获得的溶菌酶活性高。
鸡蛋清溶菌酶的分离纯化方法，步骤如下：
1)前处理
取新鲜鸡蛋，收集蛋清，按1∶0.5～1∶2的比例加入50mM的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，均匀搅拌，4℃静置过夜，去除沉淀，用0.5M NaOH调至上样pH 6～7.5。柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液的pH为4.0～4.8。
2)离子交换
将CM型琼脂糖离子交换介质装柱，以0.1M HCl、0.1M NaOH分别过柱，最后交换成Na型，最后用pH 6～7.5的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液平衡。按照上样液和介质体积比2∶1～ 3∶1上柱。清洗未交换蛋白，最后用1M NaCl进行梯度洗脱，并收集洗脱峰。NaCl梯度洗脱的长度为3～6个柱体积。
3)超滤脱盐
以膜截留分子量为3000～5000Da的超滤膜进行超滤，室温下脱盐并浓缩。
4)冷冻干燥
将超滤脱盐并浓缩的溶液进行冷冻真空干燥，得到白色粉末，即为溶菌酶。
本发明在分离纯化工艺上采用等电点除蛋清杂蛋白，CM型琼脂糖离子交换分离纯化溶菌酶，超滤和冷冻干燥获得产品，得到白色无定形的粉末。所获得的溶菌酶比酶活为20000～25000U/mg，收率为每1kg蛋清3.3～4.2g溶菌酶。
附图说明
图1是本发明溶菌酶SDS-PAGE电泳图。其中，条带4：溶菌酶产品(根据实施例1)；条带6：溶菌酶产品(根据实施例2)；条带7：溶菌酶标样；条带8：蛋白质maker。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步的描述：
实施例1
用鸡蛋分离器获取新鲜鸡蛋蛋清100ml，加入80ml的pH450mM柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，均匀混合，4℃静置过夜。离心除去沉淀，用NaOH调至上样pH 6，即为待处理样品。将200ml CM型琼脂糖离子交换介质填充到2.6cm内径，40cm高的层析柱，依次用0.1M HCl、0.1M NaOH分别过柱2个柱体积，然后用20mM pH 6的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液平衡。将样品上柱，清洗，用1M NaCl进行梯度洗脱，梯度长度为4个柱体积。收集洗脱峰，以膜截留分子量为3000-5000Da的超滤膜在室温下进行超滤，达到脱盐和浓缩的目的。将超滤脱盐并浓缩的溶液进行冷冻真空干燥，得到白色粉末，即为溶菌酶。得到的溶菌酶酶活为20000U/mg。
实施例2
用鸡蛋分离器获取新鲜鸡蛋蛋清80ml，加入100ml的pH4.650mM柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，均匀混合，4℃静置过夜。离心除去沉淀，用NaOH调至上样pH 7.5，即为待处理样品。将200ml CM型琼脂糖离子交换介质填充到2.6cm内径，40cm高的层析柱，依次用0.1M HCl、0.1M NaOH分别过柱2个柱体积，然后用20mM pH 7.5的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液平衡。将样品上柱，清洗，用1M NaCl进行梯度洗脱，梯度长度为4个柱体积。收集洗脱峰，以膜截留分子量为3000-5000Da的超滤膜在室温下进行超滤，达到脱盐和浓缩的目的。将超滤脱盐并浓缩的溶液进行冷冻真空干燥，得到白色粉末，即为溶菌酶。得到的溶菌酶酶活为25000U/mg。
实施例3
用鸡蛋分离器获取新鲜鸡蛋蛋清100ml，加入150ml的pH4.650mM柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，均匀混合，4℃静置过夜。离心除去沉淀，用NaOH调至上样pH 6.5，即为待处理 样品。将200ml CM型琼脂糖离子交换介质填充到2.6cm内径，40cm高的层析柱，依次用0.1M HCl、0.1M NaOH分别过柱2个柱体积，然后用20mM pH 6.5的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液平衡。将样品上柱，清洗，用1M NaCl进行梯度洗脱，梯度长度为4个柱体积。收集洗脱峰，以膜截留分子量为3000-5000Da的超滤膜在室温下进行超滤，达到脱盐和浓缩的目的。将超滤脱盐并浓缩的溶液进行冷冻真空干燥，得到白色粉末，即为溶菌酶。得到的溶菌酶酶活为22000U/mg。
Claims (6)
1.一种鸡蛋清溶菌酶的分离纯化方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)取新鲜鸡蛋，收集蛋清，按一定比例加入50mM的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，均匀搅拌，4℃静置过夜。
(2)去除沉淀，用0.5MNaOH调至上样pH值。
(3)将CM型琼脂糖离子交换介质装柱，以0.1M HCl、0.1M NaOH分别过柱，交换成Na型，最后用上样pH的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液平衡。
(4)按照上样液和介质体积比上柱，清洗未交换蛋白，最后用1M NaCl进行梯度洗脱，并收集洗脱峰。
(5)用超滤仪在室温下进行超滤，进行脱盐并浓缩。
(6)将超滤脱盐并浓缩的溶液进行冷冻真空干燥，得到白色粉末，即为溶菌酶。
2.根据权利要求1所述的鸡蛋清溶菌酶的分离纯化方法，其特征在于加入蛋清中的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液pH为4.0～4.8，蛋清与缓冲液的比例为1∶0.5～1∶2。
3.根据权利要求1所述的鸡蛋清溶菌酶的分离纯化方法，其特征在于上样缓冲液和样品溶液pH为6～7.5。
4.根据权利要求1所述的鸡蛋清溶菌酶的分离纯化方法，其特征在于上样液和介质体积比2∶1～3∶1。
5.根据权利要求1所述的鸡蛋清溶菌酶的分离纯化方法，其特征在于NaCl梯度洗脱的长度为3～6个柱体积。
6.根据权利要求1所述的鸡蛋清溶菌酶的分离纯化方法，其特征在于超滤仪是膜截留分子量为3000～5000Da。
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