CN105647842A

CN105647842A - 硫酯酶相关的方法和组合物

Info

Publication number: CN105647842A
Application number: CN201510993452.9A
Authority: CN
Inventors: 路易斯·侯姆; 纳·瑞恩; 穆尔塔扎·阿里比海
Original assignee: LS9 Inc
Current assignee: LS9 Inc
Priority date: 2008-12-23
Filing date: 2009-12-23
Publication date: 2016-06-08
Also published as: CN110129296A; AU2016225853C1; MX389888B; US20210371836A1; MX2011006785A; AU2009329970B2; MX368526B; CN102325864A; EP2382285A2; US20170292121A1; CA3055144C; AU2009329970A1; AU2016225853B2; AP2011005777A0; EP2382285B1; BRPI0923572A2; BR122019009204B1; CA2747516C; EP3564345A1; CA2747516A1

Abstract

本发明涉及新的突变硫酯酶及其天然存在的等同物、由所述酶制备的组合物以及硫酯酶的用途。具体而言，本发明提供了具有改变的性质的突变硫酯酶，例如，改变的底物特异性、改变的活性、改变的选择性和/或产物混合物中改变的收率比例。本发明还提供了编码所述突变硫酯酶的多核苷酸以及包含所述多核苷酸的载体和宿主细胞。本发明还提供了硫酯酶在生产各种脂肪酸衍生物中的新用途，所述各种脂肪酸衍生物可用作工业化学品和燃料或用作工业化学品和燃料的成分。

Description

硫酯酶相关的方法和组合物

本申请是申请日为2009年12月23日、申请号为200980157397.2、发明名称为“硫酯酶相关的方法和组合物”的发明专利申请的分案申请。

相关申请的交叉引用

本申请要求于2008年12月23日提交的美国临时申请第61/140,600号的优先权，通过引用将其全部内容并入本文。

发明领域

本发明涉及新的硫酯酶组合物、包含硫酯酶的新的重组宿主细胞、产生脂肪酸衍生物的新方法以及由此产生的脂肪酸衍生物及其用途。本发明的一特定方面涉及工业化学品和燃料的生产。

发明背景

随着技术的发展，与之相伴的是对石油化学品来源的燃料和工业化学品的依赖性的增加。这类燃料来源正变得日益有限和难以获得。随着化石燃料以空前的速度被消耗，世界对燃料和石油化学品来源的化学品的需求将很快超过目前的供给。

因此，现在致力于利用可再生能源，诸如日光、水、风和生物质。利用生物质产生非石油来源的新的燃料和化学品资源(例如生物燃料)已成为一种可供选择的方案。

生物燃料是一种由烷烃和/或酯类组成的可生物降解的、清洁燃烧的燃料。示例性的生物燃料是生物柴油。生物柴油可以以纯的形式(被称为“纯”生物柴油)，或者作为以任何浓度与常规的石化柴油或其它生物柴油的混合物用于大部分内燃柴油发动机中。

与石化柴油相比，生物柴油提供了许多有益性质，包括燃烧过程中排放(例如，一氧化碳、硫、芳香烃、烟灰颗粒等)下降。因生物柴油是基于可再生的生物材料，所以其还能维持平衡的二氧化碳循环。生物柴油通常是可完全生物降解的，而且因为燃点相对高、易燃性相对低而因此具有良好的安全性。此外，生物柴油提供良好的润滑性质，从而减少发动机的磨损和破坏。

目前生产生物柴油的方法涉及将来自植物油原料的三酰甘油进行酯交换，所述植物油原料例如来自欧洲的油菜籽、北美的大豆和东南亚的棕榈油。因此工业规模的生物柴油生产在地理和季节上局限于植物油原料的产地。酯交换过程产生可以作为生物柴油的脂肪酯混合物，但也会产生不希望的副产品甘油。要作为生物柴油使用，必须从上述异质产物中进一步纯化脂肪酯。这最终会增加生物柴油的产量，但也增加了脂肪酯生产的成本和所需能量。而且，植物油原料是低效能源，因为它们需要广大的种植面积。例如，因为只有菜籽油用于产生生物柴油而油菜籽生物质的其它部分不被使用，所以从油菜籽产生的生物柴油的产量仅有1300L/公顷。此外，诸如油菜籽和大豆的某些植物油原料的种植需要经常进行农作物轮种以防止土地养分耗尽。

PCT公开第WO2007/136762号公开了能从脂肪酸合成途径合成产物的重组微生物，所述产物尤其包括脂肪酸酯和脂肪醇。特别是，描述的某些脂肪酸衍生物具有限定的碳链长度、分支水平和饱和度。所述‘762公开描述了在脂肪酸衍生物产生中利用硫酯酶蛋白的内源过表达或异源表达的重组细胞。

PCT公开第WO2008/119082号公开了从脂肪酸生物合成途径产生产物的基因工程化的细胞和微生物，所述产物尤其包括脂肪酸酯和脂肪醇。所述‘082公开描述了利用酰基辅酶A合成酶的过表达来更有效地产生脂肪酸衍生物的重组细胞。

美国专利第5,955,329号公开了具有改变的底物特异性的基因工程化植物酰基ACP硫酯酶蛋白。具体而言，所述‘329专利公开了如何产生工程化的植物酰基ACP硫酯酶，其中与天然酰基ACP硫酯酶相比，所述工程化的植物酰基ACP硫酯酶表现出对于植物硫酯酶所水解的酰基ACP底物的改变的底物特异性。

尽管现有技术公开了与某些脂肪酸衍生物产生相关的某些有用的公开内容，但是本领域内需要更有效和更经济地产生这种脂肪酸衍生物的改善的方法和过程，并且还需要便于产生具有改变的产品规格的组合物的技术。作为具体的实例，需要产生对诸如燃料、去垢剂、润滑剂、工业前体分子的具体应用以及脂肪酸衍生物的其它有价值应用具有预先设计的或“特制的”规格和性质的脂肪酸组合物。

发明概述

本发明的目的是提供有用的突变硫酯酶和天然存在的硫酯酶、编码这些酶的多核苷酸、包含编码所述有用的硫酯酶的多核苷酸的载体、包含突变内源硫酯酶的重组宿主细胞、用所述载体转化的重组宿主细胞、编码有用的硫酯酶的多核苷酸被整合入染色体中的重组宿主细胞、由所述宿主细胞产生的硫酯酶、体外和/或体内产生的脂肪酸衍生物组合物(例如工业化学品和生物燃料)、在体外和/或体内产生脂肪酸衍生物组合物的方法以及利用产生的脂肪酸衍生物组合物的方法。

本发明的目的是提供通过微生物发酵产生脂肪酸衍生物组合物的方法，所述脂肪酸衍生物组合物在碳链长度和收率比例方面具有预定的产物谱。这些组合物非常适用于燃料和化学品工业中的应用，因为可以调整它们的性质使其适应预计的特定应用。例如，可以按本文所述方法调整脂肪酯产物，使其能用作汽车燃料，和/或可以设计组合物使其具有例如改善的燃料特性，如浊点、润滑性、十六烷值、运动粘性、酸值、沸点、氧化稳定性、冷滤点、杂质谱、硫酸盐粉水平和/或引火点。同样，按本文所述方法制备的工业化学品可以替代目前源自石油的化学品，并且可以调整它们使其适应特定的用途，例如，产生最适宜用作表面活性剂和/或去垢剂的脂肪醇。

本发明的目的是提供在不存在酯合酶的情况下制备脂肪酯的可选方法。该方法大大优于此前公开的通过微生物发酵过程制备脂肪酯组合物的方法，所述此前的方法至少同时需要一种硫酯酶和一种酯合酶。因而，本发明的新硫酯酶提供其它优势。

在本发明的一个实施方案中，提供了源自前体硫酯酶的突变硫酯酶(或其天然存在的等同物)，其中与所述前体硫酯酶的性质相比，每个突变体(或天然存在的等同物)在体外和/或体内具有至少一种改变的性质。所述改变的性质可以是例如生物物理性质，如热稳定性(熔点T_m)；溶剂、溶质和/或氧化稳定性；亲油性；亲水性；四级结构；偶极矩；和/或等电点。所述改变的性质也可以是例如生物化学性质，如pH最适度、温度最适度和/或离子强度最适度。所述改变的性质还可以是例如酶催化参数，如产物分布(包括，例如产物混合物中特定产物与其它产物相比的更高或更低的百分比或收率比例)、特异性活性、底物偏好性、底物亲和力、底物抑制、产物亲和力、周转率或催化速率、产物抑制、动力学机制、K_M、k_cat、k_cat/K_m和/或V_Max。所述改变的性质还可以是例如，对醇解与水解、酰基辅酶A与酰基-酰基载体蛋白底物、酯与硫酯底物、饱和与不饱和底物、直链与支链底物的活性的升高或降低或偏好性的改变；不饱和位置、十六烷值范围、或具体的碳链长度、支链底物、分支位置、羟酰基底物、酮脂酰基底物的改变；和/或产物具有改变范围的或特定的十六烷值、辛烷值、氧化稳定性、润滑性、引火点、粘性、沸点、熔点、倾点、浊点、冷滤点、冷流性、芳香度和/或碘值。改变的性质还可以包括例如，酯水解的活性降低或酯水解的减弱，使得所需产物分子的水解降低或消除。改变的性质还可以包括例如，与前体蛋白对细胞的毒性和/或细胞中的表达水平相比，蛋白对同一种细胞的毒性的减弱和/或同一种细胞中蛋白表达水平的改变。在示例性的实施方案中，改变的性质可以包括在体内或体外直接或间接催化脂酰基衍生物合成的能力的改变。在另一个示例性的实施方案中，改变的性质是特别需要的脂肪酸衍生物的体外和/或体内的收率或收率比例的提高或增加。

在本发明的一个实施方案中，突变硫酯酶(或其天然存在的等同物)来自前体硫酯酶。在本发明具体实施方案中，所述前体硫酯酶是天然存在的硫酯酶、事先修饰过的硫酯酶或合成的硫酯酶。

在本发明的一个实施方案中，突变硫酯酶(或其天然存在的等同物)来自前体硫酯酶，所述前体硫酯酶是天然存在的硫酯酶。天然存在的前体硫酯酶可以获自例如，植物、动物、细菌、真菌、酵母或其它微生物来源。突变硫酯酶(或其天然存在的等同物)所来自的前体硫酯酶可以来自于食酸菌属(Acidovorax)、不动杆菌属(Acinetobacter)、气单胞菌属(Aeromonas)、嗜烷菌属(Alcanivorax)、另类弧菌(Aliivibrio)、碱湖生菌属(Alkalilimnicola)、交替单胞菌目(Alteromonadales)、交替单胞菌属(Alteromonas)、橙单胞菌属(Aurantimonas)、固氮弧菌属(Azoarcus)、固氮根瘤菌属(Azorhizobium)、固氮菌属(Azotobacter)、贝氏硫菌属(Beggiatoa)、拜叶林克氏菌属(Beijerinckia)、博德特氏菌属(Bordetella)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)、伯克氏菌属(Burkholderia)、柄杆菌属(Caulobacter)、纤维弧菌属(Cellvibrio)、色素杆菌属(Chromobacterium)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、丛毛单胞菌属(Comamonas)、贪铜菌属(Cupriavidus)、脱氯单胞菌属(Dechloromonas)、代夫特菌属(Delftia)、脱硫弧菌属(Desulfovibrio)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、埃希氏菌属(Escherichia)、地杆菌属(Geobacter)、河氏菌属(Hahella)、嗜盐红螺菌属(Halorhodospira)、Herminiimonas、海源菌属(Idiomarina)、詹森菌属(Janthinobacterium)、克雷白杆菌属(Klebsiella)、钩端螺旋体属(Leptospira)、纤发菌属(Leptothrix)、硫氧化湖沉积杆菌(Limnobacter)、磁螺菌属(Magnetospirillum)、海杆菌属(Marinobacter)、海单胞菌属(Marinomonas)、methylibium、甲基菌属(methylobacillus)、甲基杆菌属(methylobacterium)、甲基细胞菌属(methylocella)、甲基球菌属(methylococcus)、摩替亚氏菌(Moritella)、硝化杆菌属(Nitrobacter)、硝化球菌属(Nitrococcus)、亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)、亚硝化螺菌属(Nitrosospira)、海洋螺菌属(Oceanospirillum)、寡养菌属(Oligotropha)、果胶杆菌属(Pectobacterium)、发光杆菌属(Photobacterium)、光杆状菌属(Photorhabdus)、极单胞菌属(Polaromonas)、变形杆菌属(Proteus)、普罗威登斯菌属(Providencia)、交替假单胞菌属(Pseudoalteromonas)、假单胞菌属(Pseudomonas)、冷单胞菌属(Psychromonas)、雷尔氏菌属(Ralstonia)、Reinekea、红细菌目(Rhodobacterales)、红育菌属(Rhodoferax)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、红螺菌(Rhodospirillum)、Saccharophagus、沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)、希瓦氏菌属(Shewanella)、志贺氏菌属(Shigella)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、链球菌属(Streptococcus)、索氏菌属(Thauera)、硫碱弧菌属(Thioalkalivibrio)、硫杆菌属(Thiobacillus)、弧菌属(Vibrio)、黄单胞菌属(Xanthomonas)或耶尔森氏菌属(Yersinia)。

在具体的实施方案中，本发明的前体硫酯酶可以来自以下的任何一个：燕麦嗜酸菌西瓜亚种(Acidovoraxavenaesubsp.Citrulli)AAC00-1、嗜酸菌(Acidovoraxsp.)JS42、鲍氏不动杆菌(Acinetobacterbaumannii)ACICU、鲍氏不动杆菌ATCC17978、嗜水气单胞菌嗜水亚种(Aeromonashydrophilasubsp.Hydrophila)ATCC7966、杀鲑气单胞菌杀鲑亚种(Aeromonassalmonicidasubsp.salmonicida)A449、博克岛食烷菌(Alcanivoraxborkumensis)SK2、食烷菌(Alcanivoraxsp.)DG881、杀鲑另类弧菌(Aliivibriosalmonicida)LFI1238、AlkalilimnicolaehrlicheiMLHE-1、α-变形细菌(alphaproteobacterium)HTCC2255、交替单胞菌(Alteromonadalesbacterium)TW-7、麦氏交替单细胞菌深海生态型(Alteromonasmacleodiideepecotype)、橙单胞菌(Aurantimonassp.)SI85-9A1、固氮弧菌(Azoarcussp.)BH72、茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobiumcaulinodans)ORS571、维氏固氮菌(Azotobactervinelandii)AvOP、贝氏硫菌(Beggiatoasp.)PS、印度拜叶林克氏菌印度亚种(Beijerinckiaindicasubsp.Indica)ATCC9039、鸟博德特氏菌属(Bordetellaavium)197N、支气管炎博德特氏菌(Bordetellabronchiseptica)RB50、副百日咳博德特氏菌(Bordetellaparapertussis)12822、百日咳博德特氏菌(Bordetellapertussis)TohamaI、彼得里博德特氏菌(Bordetellapetrii)DSM12804、慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumsp.)BTAi1、慢生根瘤菌ORS278、须芒草伯克氏菌(Burkholderiaambifaria)AMMD、须芒草伯克氏菌IOP40-10、须芒草伯克氏菌MC40-6、须芒草伯克氏菌MEX-5、石竹伯克氏菌(Burkholderiacenocepacia)AU1054、石竹伯克氏菌HI2424、石竹伯克氏菌J2315、石竹伯克氏菌MC0-3、石竹伯克氏菌PC184、洋葱伯克氏菌(Burkholderiadolosa)AUO158、荚壳伯克氏菌(Burkholderiagraminis)C4D1M、鼻疽伯克氏菌(Burkholderiamallei)ATCC23344、鼻疽伯克氏菌GB8马4、鼻疽伯克氏菌NCTC10229、多噬伯克氏菌(Burkholderiamultivorans)ATCC17616、BurkholderiaoklahomensisC6786、BurkholderiaoklahomensisEO147、吩嗪伯克氏菌(Burkholderiaphymatum)STM815、类鼻疽伯克氏菌(Burkholderiapseudomallei)1106a、类鼻疽伯克氏菌1106b、类鼻疽伯克氏菌14、类鼻疽伯克氏菌1655、类鼻疽伯克氏菌1710b、类鼻疽伯克氏菌305、类鼻疽伯克氏菌406e、类鼻疽伯克氏菌668、类鼻疽伯克氏菌7894、类鼻疽伯克氏菌K96243、类鼻疽伯克氏菌NCTC13177、伯克氏菌属(Burkholderiasp.)383、泰国伯克氏菌(Burkholderiathailandensis)Bt4、泰国伯克氏菌E264、泰国伯克氏菌MSMB43、泰国伯克氏菌TXDOH、新加坡伯克氏菌(Burkholderiaubonensis)Bu、越南伯克氏菌(Burkholderiavietnamiensis)G4、新月柄杆菌(Caulobactercrescentus)CB15、纤维弧菌(Cellvibriojaponicus)Ueda107、青紫色素杆菌(Chromobacteriumviolaceum)ATCC12472、需盐色盐杆菌(Chromohalobactersalexigens)DSM3043、克氏柠檬酸杆菌(Citrobacterkoseri)ATCCBAA-895、睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonastestosterone)KF-1、台湾贪铜菌(Cupriavidustaiwanensis)、DechloromonasaromaticaRCB、食酸代夫特菌(Delftiaacidovorans)SPH-1、脱硫脱硫脱硫弧菌亚种(Desulfovibriodesulfuricanssubsp.desulfuricans)G20菌株、脱硫链球菌属脱硫脱硫弧菌亚种G20、生癌肠杆菌(Enterobactercancerogenus)ATCC35316、阪崎肠杆菌(Enterobactersakazakii)ATCCBAA-894、肠杆菌(Enterobactersp.)638、塔斯曼尼亚欧文氏菌(Erwiniatasmaniensis)、艾伯替埃希氏菌(Escherichiaalbertii)TW07627、大肠杆菌(Escherichiacoli)O157:H7EDL933、大肠杆菌O157:H7EC4024菌株、大肠杆菌O157:H7链球菌EC4196、γ-变形细菌(gammaproteobacterium)HTCC5015、γ-变形细菌KT71、地杆菌(Geobactersp.)M21、哈赫拉菌(Hahellachejuensis)KCTC2396、嗜盐嗜盐红螺菌(Halorhodospirahalophila)SL1、Herminiimonasarsenicoxydans、波罗的海海源菌(Idiomarinabaltica)OS145、热液海源菌(Idiomarinaloihiensis)L2TR、Janthinobacteriumsp.Marseille、肺炎克雷白杆菌(Klebsiellapneumoniae)342、肺炎克雷伯菌肺炎亚种(Klebsiellapneumoniaesubsp.Pneumoniae)MGH78578、克雷白杆菌(Klebsiellasp.)ZD414、问号钩端螺旋体(Leptospirainterrogans)哥本哈根血清变种FiocruzL1-130菌株、赖型问号钩端螺旋体(LeptospirainterrogansserovarLai)56601菌株、克洛德氏纤发菌(Leptothrixcholodnii)SP-6、硫氧化湖沉积杆菌MED105、趋磁细菌(Magnetospirillummagneticum)AMB-1、海洋γ-变形细菌(marinegammaproteobacterium)HTCC2080、海洋γ-变形细菌HTCC2143、海洋γ-变形细菌HTCC2207、海洋宏基因组(marinemetagenome)、栖藻海杆菌(Marinobacteralgicola)DG893、水油海杆菌(Marinobacteraquaeolei)VT8、海杆菌(Marinobactersp.)ELB17、海单胞菌(Marinomonassp.)MWYL1、MethylibiumpetroleiphilumPM1、MethylobacillusflagellatusKT、MethylobacteriumchloromethanicumCM4、外链甲基杆菌(Methylobacteriumextorquens)PA1、MethylobacteriumpopuliBJ001、MethylocellasilvestrisBL2、荚膜甲基球菌Bath菌株(Methylococcuscapsulatusstr.Bath)、摩替亚氏菌(Moritellasp.)PE36、消化杆菌(Nitrobactersp.)Nb-311A、NitrobacterwinogradskyiNb-255、运动消化球菌(Nitrococcusmobilis)Nb-231、海洋亚硝化球菌(Nitrosococcusoceani)ATCC19707、海洋亚硝化球菌C-27、欧洲亚硝化单胞菌(Nitrosomonaseuropaea)ATCC19718、欧洲亚硝化单胞菌C91、多形亚硝化螺菌(Nitrosospiramultiformis)ATCC25196、海洋螺菌(Oceanospirillumsp.)MED92、食羧寡养菌(Oligotrophacarboxidovorans)OM5、黑腐果胶杆菌(Pectobacteriumatrosepticum)SCRI1043、深海发光杆菌(Photobacteriumprofundum)3TCK、深海发光杆菌SS9、发光杆菌(Photobacteriumsp.)SKA34、发光发光杆菌(Photorhabduslumescens)、发光杆菌laumondiiTTO1亚种、PolaromonasnaphthalenivoransCJ2、极单胞菌(Polaromonassp.)JS666、多核杆菌(Polynucleobactersp.)QLW-P1DMWA-1、ProteusmirabilisHI4320、斯氏普罗威登斯菌(Providenciastuartii)ATCC25827、大西洋假交替单胞菌(Pseudoalteromonasatlantica)T6c、游海假交替单胞菌(Pseudoalteromonashaloplanktis)TAC125、假交替单胞菌(Pseudoalteromonassp.)643A、PseudoalteromonastunicataD2、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)PA7、铜绿假单胞菌PACS2、铜绿假单胞菌PAO1、铜绿假单胞菌UCBPP-PA14、PseudomonasentomophilaL48、荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)Pf0-1、荧光假单胞菌Pf-5、门多萨假单胞菌(Pseudomonasmendocina)ymp、恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)F1、恶臭假单胞菌GB-1、恶臭假单胞菌KT2440、恶臭假单胞菌W619、施氏假单胞菌(Pseudomonasstutzeri)A1501、丁香假单胞菌菜豆致病变种(Pseudomonassyringaepv.Phaseolicola)1448A、丁香假单胞菌菜豆致病变种B728a、丁香假单胞菌番茄致病变种(Pseudomonassyringaepv.Tomato)DC3000菌株、Psychromonasingrahamii37、真养雷尔氏菌(Ralstoniaeutropha)H16、真养雷尔氏菌JMP134、RalstoniametalliduransCH34、皮氏雷尔氏菌(Ralstoniapickettii)12D、皮氏雷尔氏菌12J、茄科雷尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)GMI1000、茄科雷尔氏菌IPO1609、茄科雷尔氏菌MolK2、茄科雷尔氏菌UW551、Reinekeasp.MED297、RhodobacteralesbacteriumY4I、RhodoferaxferrireducensT118、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)BisA53、沼泽红假单胞菌BisB18、沼泽红假单胞菌BisB5、沼泽红假单胞菌CGA009、沼泽红假单胞菌HaA2、沼泽红假单胞菌TIE-1、RhodospirillumcentenumSW、Saccharophagusdegradans2-40、肠道沙门氏菌亚利桑那亚种(Salmonellaentericasubsp.serovararizonae)62:z4,z23:--,肠道沙门氏菌猪霍乱病毒沙门氏菌亚种(Salmonellaentericasubsp.entericaserovarCholeraesuis)SC-B67菌株、肠道沙门氏菌肠道allinarum亚种287/91、肠道沙门氏菌肠道哈达尔亚种(Salmonellaentericasubsp.entericaserovarHadar)RI_05P066菌株、肠道沙门氏菌肠道爪哇岛亚种(Salmonellaentericasubsp.entericaserovarJaviana)GA_MM04042433菌株、肠道沙门氏菌肠道Saintpaul亚种SARA23菌株、肠道沙门氏菌肠道Saintpaul亚种SARA29菌株、肠道沙门氏菌肠道伤寒亚种(Salmonellaentericasubsp.entericaserovarTyphi)CT18菌株、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)LT2、变形斑沙雷氏菌(Serratiaproteamaculans)568、ShewanellaamazonensisSB2B、波罗的海希瓦氏菌(Shewanellabaltica)OS155、波罗的海希瓦氏菌OS185、波罗的海希瓦氏菌OS195、波罗的海希瓦氏菌OS223、海底希瓦氏菌(Shewanellabenthica)KT99、反硝化希瓦氏菌(Shewanelladenitrificans)OS217、冷海希瓦氏菌(Shewanellafrigidimarina)NCIMB400、ShewanellahalifaxensisHAW-EB4、光伏希瓦氏菌(Shewanellaloihica)PV-4、奥柰达希瓦氏菌(Shewanellaoneidensis)MR-1、ShewanellapealeanaATCC700345、腐败希瓦氏菌(Shewanellaputrefaciens)200、ShewanellasediminisHAW-EB3、希瓦氏菌(Shewanellasp.)ANA-3、希瓦氏菌MR-4、希瓦氏菌MR-7、希瓦氏菌W3-18-1、武氏希瓦氏菌(Shewanellawoodyi)ATCC51908、鲍氏志贺氏菌(Shigellaboydii)Sb227、痢疾志贺氏菌(Shigelladysenteriae)Sd197、嗜麦芽糖寡养单胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)K279a、嗜麦芽糖寡养单胞菌R551-3、链球菌(Streptococcussp.)(N1)、合成的构建体、索氏菌(Thauerasp.)MZ1T、硫碱弧菌(Thioalkalivibriosp.)HL-EbGR7、脱氮硫杆菌(Thiobacillusdenitrificans)ATCC25259、ThiomicrospiracrunogenaXCL-2、溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)12G01、VibrioangustumS14、坎氏弧菌(Vibriocampbellii)AND4、霍乱弧菌(Vibriocholerae)2740-80、霍乱弧菌MZO-2、霍乱弧菌O1埃尔托变种N16961菌株、霍乱弧菌V51、费氏弧菌(Vibriofischeri)ES114、费氏弧菌MJ11、哈维氏弧菌(Vibrioharveyi)ATCCBAA-1116、拟态弧菌(Vibriomimicus)、弧菌细菌(Vibrionalesbacterium)SWAT-3、副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)AQ3810、副溶血弧菌RIMD2210633、VibrioshiloniiAK1、灿烂弧菌(Vibriosplendidus)12B01、弧菌(Vibriosp.)MED222、创伤弧菌(Vibriovulnificus)CMCP6、创伤弧菌YJ016、地毯草黄单胞菌柑橘致病变种(Xanthomonasaxonopodispv.Citri)306菌株、野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonascampestrispv.Campestris)ATCC33913菌株、野油菜黄单胞菌野油菜致病变种B100菌株、野油菜黄单胞菌辣椒斑点病致病变种(Xanthomonascampestrispv.Vesicatoria)85-10菌株、水稻黄单胞菌水稻致病变种(Xanthomonasoryzaepv.Oryzae)KACC10331、水稻黄单胞菌水稻致病变种PXO99A、水稻黄单胞菌栖稻致病变种(Xanthomonasoryzaepv.Oryzicola)BLS256、伯氏耶尔森氏菌(Yersiniabercovieri)ATCC43970、小肠结肠炎耶尔森氏菌小肠结肠炎亚种(Yersiniaenterocoliticasubsp.enterocolitica)8081、弗氏耶尔森氏菌(Yersiniafrederiksenii)ATCC33641、中间耶尔森氏菌(Yersiniaintermedia)ATCC29909、莫氏耶尔森氏菌(Yersiniamollaretii)ATCC43969、鼠疫耶尔森氏菌Angola、鼠疫耶尔森氏菌东方变种(YersiniapestisbiovarOrientalis)F1991016菌株、鼠疫耶尔森氏菌CO92、鼠疫耶尔森氏菌(Yersiniapestis)KIM或假结核耶尔森氏菌(Yersiniapseudotuberculosis)IP31758。

在本发明的一个实施方案中，前体硫酯酶是具有与‘TesA类似的序列的硫酯酶(例如没有信号肽的TesA酶)。在优选的实施方案中，前体硫酯酶与‘TesA具有至少约20％，例如，至少约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。在另一个实例中，前体硫酯酶与获自大肠杆菌(例如大肠杆菌K12)的‘TesA具有至少约20％，例如，至少约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。在另一个实例中，前体硫酯酶是具有与图58的SEQIDNO:31序列类似的序列，且与图58的SEQIDNO:31优选具有至少约20％，例如，至少约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的硫酯酶。所述类似序列可以来自天然存在的蛋白或可以来自事先修饰过的蛋白。

在本发明的一个实施方案中，前体硫酯酶是包含以下氨基酸系列的硫酯酶：

G–D-S-L-X(5)-M(SEQIDNO:28)，其中：

“X”是指任何氨基酸残基；如果存在其相邻括号中的数字，则该数字是指氨基酸残基区段中X残基的数量；

第3位的S残基是催化残基；

第2位的D残基可用N或T取代；

第4位的L残基可用C或Q取代；

第10位的M残基可用C、D、L、N、T或V取代；和/或

V-X(2)-G-X-N-D-X-L(SEQIDNO:29)，其中：

每个“X”是指任何氨基酸残基；如果存在其相邻括号中的数字，则该数字是指氨基酸残基区段中X残基的数量；

第6位的N残基位于氧离子洞中；

第1位的V残基可用L取代；

第6位的N残基可用V、L、C、A、G、H、I、T或W取代；

第7位的D残基可用E取代；

第9位的L残基可用I、W、F、T、M、A、E、N或V取代；

和/或

D-X(2)-H-P-X(7)-I(SEQIDNO:30)，其中：

每个“X”是指任何氨基酸残基；如果存在其相邻括号中的数字，则该数字是指各自氨基酸残基区段中X残基的数量；

分别在第1位和第4位的D和H残基是催化残基；

第5位的P残基可用G、A、F、L、S或V取代；

第13位的I残基可用L或V取代。

在本发明的一个实施方案中，前体硫酯酶是与获自大肠杆菌的‘TesA具有免疫交叉反应性的硫酯酶。在具体的实施方案中，前体硫酯酶与获自大肠杆菌K-12的‘TesA具有免疫交叉反应性。在具体的实施方案中，前体硫酯酶与包含图58所示的SEQIDNO:31氨基酸序列的硫酯酶具有免疫交叉反应性。在具体的实施方案中，前体硫酯酶与获自大肠杆菌或获自大肠杆菌K-12的任何硫酯酶的片段(或部分)和/或包含图58所示的SEQIDNO:31氨基酸序列的任何硫酯酶的片段(或部分)具有交叉反应性。与‘TesA具有免疫交叉反应性的前体酶可以是天然存在的蛋白、事先修饰过的蛋白或合成的蛋白。

在另一个具体的实例中，前体硫酯酶是来自大肠杆菌的‘TesA，或者是来自大肠杆菌的‘TesA的同源物、旁系同源物或直系同源物，所述来自大肠杆菌的‘TesA例如来自大肠杆菌K12的‘TesA。本发明的突变体所来源于的硫酯酶前体还可以是上述硫酯酶中任何一种的酶学活性部分或片段。

在本发明的一个实施方案中，当与前体硫酯酶比较时，提供的突变硫酯酶(或其天然存在的等同物)包含的氨基酸序列具有至少一个氨基酸取代，使得突变硫酯酶相对于前体硫酯酶具有至少一种改变的性质。在本发明的示例性的实施方案中，提供的突变硫酯酶的氨基酸序列具有单个取代突变，且当与突变体所来源于的前体硫酯酶比较时，表现出至少一种改变的性质。在本发明的示例性的实施方案中，提供的突变硫酯酶的氨基酸序列具有从其前体硫酯酶序列的两个或更多个取代突变，且当与前体硫酯酶比较时，所述突变硫酯酶表现出至少一种改变的性质。

在本发明的一个实施方案中，提供了突变硫酯酶(或其天然存在的等同物)，其是前体硫酯酶的变体，并且相对于这种前体硫酯酶在体外或体内具有至少一种改变的性质，其中所述前体硫酯酶是包含图58的SEQIDNO:31的类似序列并因此包含SEQIDNO:31对应的氨基酸残基1-182的硫酯酶，其中所述前体硫酯酶在一个或多个氨基酸位置处进行了修饰，所述一个或多个氨基酸位置选自对应于图58的SEQIDNO:31的残基1-182中的一个或多个位置。

在本发明的一个实施方案中，提供了突变硫酯酶(或其天然存在的等同物)，其是前体硫酯酶的变体，所述前体硫酯酶包含图58的SEQIDNO:31的类似序列，并因此包含SEQIDNO:31对应的氨基酸残基1-182，并且所述突变硫酯酶相对于这种前体硫酯酶在体外或体内具有至少一种改变的性质，其中所述前体硫酯酶在一个或多个位置处进行了突变，所述一个或多个位置对应于图58的SEQIDNO:31中选自以下的一个或多个氨基酸位置：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181和/或182。

在本发明的一个实施方案中，提供了突变硫酯酶(或天然存在的等同物)，其是前体硫酯酶的变体，所述前体硫酯酶包含图58的SEQIDNO:31的类似序列，并因此包含SEQIDNO:31对应的氨基酸残基1-182，并且所述突变硫酯酶相对于这种前体硫酯酶在体外或体内具有至少一种改变的性质，其中所述前体硫酯酶用选自以下的一个或多个取代进行了突变：A1C、A1F、A1L、A1Q、A1R、A1S、A1V、A1Y、D2E、D2H、D2K、D2L、D2M、D2P、D2R、D2W、T3E、T3G、T3K、T3L、T3R、T3W、L4A、L4G、L4M、L4N、L4S、L4V、L4Y、L5C、L5E、L5F、L5G、L5H、L5K、L5N、L5Q、L5S、L5W、L5Y、I6A、I6L、I6T、I6V、L7A、L7C、L7E、L7K、L7M、L7N、L7S、L7T、L7V、L7W、L7Y、G8A、G8K、G8S、D9N、D9T、S10C、L11A、L11C、L11I、L11M、L11Q、L11V、S12A、S12I、S12L、S12M、S12N、S12T、S12V、S12Y、A13C、A13D、A13G、A13H、A13I、A13L、A13N、A13S、A13T、A13V、A13W、A13Y、G14A、G14C、G14E、G14F、G14I、G14K、G14M、G14N、G14P、G14Q、G14R、G14S、G14T、G14V、Y15A、Y15C、Y15D、Y15E、Y15G、Y15I、Y15L、Y15M、Y15N、Y15Q、Y15R、Y15S、Y15V、R16A、R16D、R16E、R16G、R16H、R16I、R16L、R16M、R16N、R16P、R16Q、R16S、R16T、R16V、R16W、M17A、M17C、M17D、M17E、M17G、M17K、M17L、M17N、M17P、M17Q、M17R、M17S、M17T、M17V、S18E、S18M、S18N、S18T、A19C、A19E、A19L、A19V、S20A、S20C、S20D、S20G、S20L、S20T、S20W、A21G、A21I、A21L、A21P、A21Y、A22C、A22D、A22E、A22F、A22G、A22H、A22I、A22K、A22L、A22M、A22N、A22P、A22R、A22S、A22T、A22Y、W23A、W23H、W23N、W23P、W23Y、P24A、P24C、P24D、P24E、P24F、P24G、P24I、P24M、P24N、P24S、P24T、P24V、P24W、A25D、A25E、A25L、A25N、A25P、A25Q、A25R、A25S、A25V、L26C、L26D、L26E、L26F、L26G、L26H、L26I、L26K、L26N、L26P、L26Q、L26R、L26S、L26V、L26W、L26Y、L27A、L27C、L27F、L27H、L27M、L27R、L27S、L27T、L27V、L27W、L27Y、N28A、N28G、N28I、N28K、N28M、N28P、N28R、N28W、D29M、D29P、D29V、K30P、W31D、W31E、W31G、W31L、W31N、W31P、W31R、W31S、W31T、Q32V、Q32Y、S33F、S33G、S33I、S33M、S33R、K34A、K34H、K34M、K34R、T35F、T35G、T35K,T35L、T35M、T35Q、T35V、T35Y、S36A、S36F、S36H、S36I、S36L、S36W、V37A、V37F、V37G、V37H、V37L、V37N、V37S、V37Q、V37S、V37W、V37Y、V38D、V38E、V38F、V38G、V38K、V38L、V38P、V38R、V38S、N39A、N39C、N39E、N39F、N39G、N39K、N39M、N39P、N39Q、N39R、N39T、N39V、N39W、N39Y、A40D、A40G、A40H、A40L、A40M、A40P、A40T、A40V、A40Y、S41C、S41P、S41T、I42A、I42C、I42D、I42E、I42G、I42K、I42L、I42M、I42P、I42S、I42T、I42W、I42Y、S43A、S43C、S43D、S43E、S43F、S43G、S43H、S43L、S43M、S43N、S43P、S43R、S43T、S43V、S43W、G44A、G44C、G44E、G44F、G44H、G44K、G44L、G44M、G44N、G44Q、G44R、G44S、G44W、G44Y、D45A、D45C、D45E、D45F、D45G、D45H、D45I、D45K、D45L、D45M、D45P、D45Q、D45S、D45T、D45V、D45W、T46A、T46C、T46D、T46E、T46F、T46G、T46I、T46K、T46L、T46N、T46R、T46S、T46V、T46W、S47A、S47C、S47E、S47F、S47G、S47L、S47M、S47P、S47Q、S47R、S47T、S47V、S47W、S47Y、Q48C、Q48D、Q48E、Q48F、Q48G、Q48I、Q48M、Q48S、Q48T、Q48V、Q48W、Q48Y、Q49A、Q49C、Q49D、Q49E、Q49G、Q49H、Q49I、Q49K、Q49L、Q49M、Q49P、Q49R、Q49S、Q49V、Q49W、Q49Y、G50A、G50C、G50E、G50F、G50I、G50K、G50L、G50M、G50N、G50P、G50Q、G50R、G50S、G50T、G50W、G50Y、L51A、L51C、L51D、L51F、L51H、L51N、L51P、L51S、L51T、L51V、L51W、L51Y、A52C、A52D、A52H、A52I、A52L、A52M、A52P、A52R、A52V、A52W、A52Y、R53A、R53C、R53D、R53E、R53F、R53G、R53I、R53K、R53L、R53N、R53S、R53T、R53V、R53W、R53Y、L54A、L54C、L54E、L54F、L54G、L54M、L54N、L54S、L54T、L54W、L54Y、P55A、P55G、P55Y、A56P、A56R、A56W、A56Y、L57A、L57C、L57F、L57G、L57H、L57I、L57K、L57N、L57P、L57Q、L57R、L57S、L57T、L57V、L57W、L57Y、L58A、L58D、L58E、L58F、L58G、L58H、L58I、L58M、L58N、L58R、L58S、L58V、L58W、L58Y、K59E、K59R、K59V、Q60E、Q60M、Q60P、H61A、H61D、H61E、H61G、H61P、H61W、Q62G、Q62M、Q62P、Q62W、P63D、P63E、P63G、P63I、P63K、P63L、P63M、P63N、P63Q、P63R、P63S、P63T、P63V、P63W、R64D、R64E、R64F、R64L、R64M、R64P、R64Q、R64W、R64Y、W65A、W65E、W65G、W65K、W65L、W65M、W65N、W65P、W65R、W65V、V66C、V66G、V66I、V66M、V66N、V66Q,V66S、V66W、V66Y、L67A、L67C、L67E、L67G、L67M、L67Q、L67Q、L67S、L67T、L67W、V68A、V68E、V68G、V68L、V68M、V68N、V68P、V68Q、V68S、V68T、E69A、E69C、E69D、E69F、E69G、E69H、E69K、E69L、E69M、E69N、E69P、E69Q、E69S、E69V、E69W、E69Y、L70A、L70C、L70E、L70F、L70G、L70H、L70I、L70K、L70Q、L70S、L70T、L70V、L70W、G71A、G71C、G71S、G72A、G72C、G72M、G72P、G72S、N73A、N73C、N73G、N73H、N73I、N73L、N73P、N73R、N73S、N73T、N73V、N73W、D74A、D74C、D74E、D74F、D74G、D74Q、D74S、D74W、D74Y、G75A、G75C、G75D、G75E、G75F、G75I、G75K、G75L、G75M、G75N、G75P、G75R、G75T、G75V、G75W、G75Y、L76A、L76C、L76D、L76E、L76F、L76G、L76I、L76K、L76M、L76N、L76P、L76Q、L76R、L76T、L76V、L76W、R77A、R77C、R77D、R77E、R77F、R77G、R77H、R77K、R77L、R77N、R77Q、R77S、R77V、R77W、G78A、G78C、G78D、G78E、G78F、G78M、G78N、G78P、G78Q、G78R、G78S、G78T、G78V、G78Y、F79A、F79D、F79E、F79G、F79H、F79K、F79M、F79N、F79P、F79Q、F79S、F79V、F79W、F79Y、Q80A、Q80E、Q80G、Q80L、Q80M、Q80S、Q80W、Q80Y、P81A、P81E、P81K、P81L、P81M、P81N、P81T、P81W、P81Y、Q82A、Q82F、Q82I、Q82M、Q82N、Q82P、Q82R、Q82S、Q82T、Q82V、Q82W、Q82Y、Q83A、Q83C、Q83F、Q83G、Q83K、Q83L、Q83M、Q83N、Q83R、Q83S、Q83T、Q83V、Q83W、Q83Y、T84A、T84D、T84E、T84F、T84G、T84H、T84K、T84L、T84M、T84N、T84Q、T84R、T84S、T84V、T84W、T84Y、E85A、E85C、E85D、E85F、E85G、E85L、E85P、E85Q、E85R、E85S、E85T、E85V、E85W、E85Y、Q86A、Q86G、Q86H、Q86K、Q86P、Q86T、Q86V、Q86W、Q86Y、T87A、T87C、T87D、T87E、T87F、T87G、T87H、T87L、T87M、T87P、T87R、T87S、T87V、T87W、L88A、L88C、L88E、L88F、L88G、L88H、L88Q、L88S、L88W、L88Y、R89A、R89G、R89H、R89L、R89P、R89T、R89V、R89W、Q90E、Q90L、Q90N、Q90P、Q90W、Q90Y、I91E、I91G、I91L、I91M、I91N、I91Q、I91S、I91V、I91Y、L92A、L92C、L92E、L92G、L92H、L92N、L92Q、L92R、L92S、L92T、L92V、L92Y、Q93A、Q93E、Q93F、Q93G、Q93H、Q93I、Q93L、Q93M、Q93N、Q93P、Q93S、Q93V、Q93W、Q93Y、D94C、D94E、D94F、D94G、D94H、D94K、D94L、D94N、D94P、D94Q、D94R、D94S、D94V、V95A、V95C、V95D、V95E、V95F、V95G、V95I、V95L、V95M、V95N、V95P、V95Q、V95T、V95W、V95Y、K96A、K96C、K96L、K96N、K96P、K96Q、K96R、K96V、K96Y、A97C、A97E、A97F、A97K、A97N、A97P、A97R、A97V、A97W、A98E、A98G、A98K、A98L、A98P、A98V、A98W、A98Y、N99A、N99C、N99D、N99G、N99L、N99M、N99P、N99Q、N99R、N99S、N99W、N99Y、A100D、A100E、A100G、A100H、A100I、A10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、V178R、V178S、V178T、V178W、N179G、N179H、N179R、N179T、N179V、N179W、N179Y、H180A、H180E、H180G、H180L、H180P、H180R、H180S、H180V、H180W、D181A、D181C、D181E、D181G、D181H、D181I、D181L、D181P、D181Q、D181R、D181S、D181T、D181W、S182A、S182C、S182D、S182E、S182G、S182I、S182K、S182L、S182N、S182P、S182Q、S182R、S182T和/或S180V，其中取代突变命名中的数字是指SEQIDNO:31的氨基酸位置。

在本发明的一个实施方案中，提供了突变硫酯酶(或其天然存在的等同物)，其对C₁₀底物(即碳链长度为10个碳的底物)具有增加的底物特异性和/或活性(例如催化速率)，并且所述突变硫酯酶是包含图58的SEQIDNO:31的类似序列的前体硫酯酶的变体，其中所述前体硫酯酶在一个或多个氨基酸位置处进行了突变，所述一个或多个氨基酸位置对应于SEQIDNO:31的选自5-30、35-60、65-98、102-139和/或140-180的一个或多个残基。可以在体外和/或体内检测对C₁₀底物增加的底物特异性和/或活性。

在本发明的一个实施方案中，提供了突变硫酯酶(或其天然存在的等同物)，其对C₁₀底物具有增加的底物特异性和/或活性(例如催化速率)，并且所述突变硫酯酶是包含图58的SEQIDNO:31的类似序列的前体硫酯酶的变体，其中所述前体硫酯酶在一个或多个氨基酸位置处进行了突变，所述一个或多个氨基酸位置对应于SEQIDNO:31中选自以下的一个或多个残基：1、3、4、7、9、12、13、14、16、17、20、22、24、25、28、32、38、39、40、42、43、46、47、48、49、50、51、52、54、56、59、60、64、68、72、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、89、90、91、92、93、94、95、96、98、99、100、101、102、103、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、130、132、133、134、138、139、140、141、142、144、145、146、147、148、150、151、152、156、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、175、176、177、178、179、180、181和/或182。可以在体外和/或体内检测对C₁₀底物增加的底物特异性和/或活性。

在本发明的一个实施方案中，提供了突变硫酯酶(或天然存在的等同物)，其对C₁₀底物具有增加的底物特异性和/或活性(例如催化速率)，并且所述突变硫酯酶是包含图58的SEQIDNO:31的类似序列的前体硫酯酶的变体，其中所述前体硫酯酶用选自以下的一个或多个取代进行了突变：A1L、A1S、T3K、L4A、L7M、L7V、D9N、S12A、A13D、G14A、G14E、G14P、G14Q、G14R、G14S、G14V、R16G、R16L、R16M、R16N、R16P、R16Q、R16T、M17C、M17L、M17T、M17V、S20A、S20C、S20D、S20G、S20L、S20T、S20W、A22C、A22D、A22E、A22G、A22H、A22I、A22K、A22N、P24A、P24C、P24D、P24F、P24I、P24S、P24T、P24V、P24W、A25E、A25L、A25N、A25Q、A25V、N28A、N28R、Q32V、Q32Y、V38E、V38K、V38R、N39A、N39T、A40D、A40H、I42A、I42E、I42L、I42S、I42T、I42W、I42Y、S43A、S43C、S43D、S43E、S43L、S43N、S43P、T46E、T46F、T46I、T46L、T46V、S47A、S47C、S47F、S47G、S47L、S47M、S47T、S47V、Q48D、Q48E、Q48G、Q48S、Q48T、Q48V、Q48W、Q49A、Q49C、Q49D、Q49G、Q49H、Q49L、Q49M、Q49S、G50A、G50Q、L51A、L51F、L51H、L51Y、A52D、A52M、L54T、A56P、K59R、Q60M、R64D、R64E、R64Q、V68L、G72A、G72C、G72P、G72S、G75A、G75C、G75D、G75E、G75F、G75I、G75K、G75L、G75M、G75N、G75P、G75T、G75V、G75W、G75Y、L76A、L76D、L76G、L76I、L76K、L76M、L76N、L76P、L76Q、L76R、L76W、R77G、R77L、R77Q、G78A、G78C、G78E、G78F、G78M、G78N、G78Q、G78R、G78S、G78T、G78V、G78Y、F79A、F79D、F79E、F79G、F79H、F79N、F79Q、F79W、F79Y、Q80E、P81N、P81T、P81Y、Q82R、Q82S、Q82T、Q83A、Q83C、Q83F、Q83G、Q83K、Q83L、Q83M、Q83N、Q83R、Q83S、Q83T、Q83V、Q83W、Q83Y、T84A、T84F、T84L、T84M、T84N、T84Q、T84V、T84Y、E85A、E85C、E85L、E85Q、E85R、E85S、E85T、E85W、E85Y、Q86A、Q86G、Q86K、Q86T、T87D、T87P、R89A、R89G、Q90E、Q90Y、I91V、L92V、Q93A、Q93E、Q93G、Q93H、Q93I、Q93L、Q93S、Q93W、Q93Y、D94E、D94F、D94G、D94H、D94K、D94N、D94Q、D94R、D94S、D94V、V95L、V95T、K96V、K96Y、A98W、N99G、N99L、N99P、N99Q、N99R、N99Y、A100G、A100V、E101A、E101D、E101G、E101L、E101M、E101S、E101T、E101V、P102S、L103G、M105C、M105I、M105V、Q106A、Q106D、Q106H、Q106W、I107Y、R108A、R108D、R108E、R108F、R108G、R108H、R108I、R108L、R108M、R108S、R108W、R108Y、L109A、L109D、L109E、L109F、L109G、L109K、L109P、L109R、L109S、L109Y、P110C、P110D、P110E、P110F、P110G、P110H、P110K、P110L、P110M、P110N、P110R、P110S、P110V、P110W、A111C、A111E、A111L、A111M、A111P、A111Q、A111R、A111V、A111W、A111Y、N112A、N112F、N112G、N112K、N112R、N112W、Y113A、Y113C、Y113G、Y113I、Y113M、G114K、G114L、G114P、R115A、R115C、R115E、R115G、R115N、R115S、R115W、R115Y、R116D、R116E、R116W、Y117A、Y117C、Y117E、Y117I、Y117L、Y117N、Y117Q、Y117R、Y117S、Y117T、Y117V、N118C、N118G、N118I、N118K、N118S、N118T、N118V、N118W、E119C、E119F、E119G、E119K、E119M、E119R、E119W、E119Y、A120D、A120E、A120G、A120W、F121A、F121D、F121E、F121M、F121P、F121Q、F121R、F121S、F121Y、S122D、S122E、S122F、S122I、S122L、S122M、S122V、S122W、S122Y、A123H、A123L、A123V、I124T、Y125C、Y125F、Y125G、Y125P、Y125S、Y125V、Y125W、P126R、P126T、P126V、P126Y、K127S、L128C、L128T、L128V、K130E、K130I、K130V、F132D、F132E、F132N、F132T、D133K、D133R、D133S、D133T、D133V、D133Y、V134I、V134M、V134S、P138E、P138N、P138R、P138T、P138V、F139A、F139D、F139G、F139H、F139M、F139S、F139W、F140C、F140G、F140M、F140N、F140P、F140S、M141A、M141C、M141D、M141E、M141F、M141G、M141K、M141L、M141P、M141Q、M141R、M141T、M141V、M141W、M141Y、E142A、E142C、E142P、E142Q、E142W、E142Y、V144D、V144E、V144G、V144H、V144N、V144P、V144Q、V144R、V144S、V144W、V144Y、Y145A、Y145C、Y145D、Y145E、Y145G、Y145I、Y145L、Y145M、Y145N、Y145Q、Y145T、Y145W、L146A、L146C、L146D、L146E、L146G、L146H、L146S、L146W、K147G、K147P、K147W、P148D、P148E、W150C、W150D、W150E、W150G、W150L、W150Q、W150T、M151A、M151C、M151E、M151F、M151G、M151I、M151Q、M151S、M151T、M151V、M151W、Q152D、Q152F、Q152I、Q152L、Q152T、I156L、P158A、P158F、P158G、P158H、P158I、P158L、P158Q、P158T、P158V、N159C、N159E、N159G、N159I、N159K、N159L、N159M、N159R、N159T、N159V、R160A、R160C、R160D、R160E、R160G、R160H、R160N、R160Q、R160S、R160W、D161E、D161G、D161I、D161K、D161L、D161M、D161Q、D161R、D161W、A162I、A162L、A162T、A162V、A162Y、Q163G、Q163L、Q163M、Q163S、P164A、P164C、P164D、P164M、P164N、P164R、P164V、P164W、F165D、F165E、F165G、F165H、F165I、F165K、F165L、F165M、F165R、F165S、F165T、F165V、F165Y、I166F、I166L、I166M、I166V、A167C、A167M、A167R、A167T、D168G、D168P、D168R、W169E、W169K、W169Q、M170F、M170H、M170L、M170T、M170V、M170Y、A171E、A171F、A171V、A171W、K172A、K172M、Q173N、Q175I、P176H、P176K、P176N、P176W、L177M、L177T、V178T、V178W、N179G、N179H、N179R、N179T、N179V、N179Y、H180E、H180G、H180R、H180V、H180W、D181A、D181H、D181I、D181L、D181P、D181R、D181W、S182A、S182G、S182K、S182L、S182P和/或S182R，其中取代突变命名中的数字是指SEQIDNO:31的氨基酸位置。可以在体外和/或体内检测对C₁₀底物增加的底物特异性和/或活性。

在本发明的一个实施方案中，提供了突变硫酯酶(或其天然存在的等同物)，其对C₁₂底物(即碳链长度为12个碳的底物)具有增加的底物特异性和/或活性(例如催化速率)，并且所述突变硫酯酶是包含图58的SEQIDNO:31的类似序列的前体硫酯酶的变体，其中所述前体硫酯酶在一个或多个氨基酸位置处进行了突变，所述一个或多个氨基酸位置对应于SEQIDNO:31的残基10-25、35-85、90-103、110-143、146-180。可以在体外和/或体内检测对C₁₂底物增加的底物特异性和/或活性。

在本发明的一个实施方案中，提供了突变硫酯酶(或天然存在的等同物)，其对C₁₂底物具有增加的底物特异性和/或活性(例如催化速率)，并且所述突变硫酯酶是包含图58的SEQIDNO:31的类似序列的前体硫酯酶的变体，其中所述前体硫酯酶在一个或多个氨基酸位置处进行了突变，所述一个或多个氨基酸位置对应于SEQIDNO:31中选自以下的一个或多个残基：1、2、3、4、5、6、7、9、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、24、25、26、27、28、29、30、31、35、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、57、58、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、76、77、78、79、80、81、82、83、84、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、111、112、113、114、115、116、117、119、120、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、133、134、136、137、140、141、142、145、149、152、153、155、156、158、159、160、161、162、163、164、166、167、168、169、170、172、173、174、175、176、177、179、180、181和/或182。可以在体外和/或体内检测对C₁₂底物增加的底物特异性和/或活性。

在本发明的一个实施方案中，提供了突变硫酯酶(或其天然存在的等同物)，其对C₁₂底物具有增加的底物特异性和/或活性(例如催化速率)，并且所述突变硫酯酶是包含图58的SEQIDNO:31的类似序列的前体硫酯酶的变体，其中所述前体硫酯酶用选自以下的一个或多个取代进行了突变：A1Q、A1S、A1V、D2E、D2K、D2P、D2W、T3R、T3W、L4A、L4Y、L5F、L5G、L5S、L5Y、I6T、I6V、L7A、L7C、L7M、L7N、L7S、L7T、L7V、L7Y、D9N、L11M、S12A、S12I、S12V、A13C、A13G、A13H、A13I、A13L、A13N、A13T、A13W、G14F、G14I、G14K、G14M、G14V、Y15A、Y15C、Y15D、Y15E、Y15G、Y15I、Y15L、Y15M、Y15N、Y15Q、Y15R、Y15S、Y15V、R16D、R16E、R16G、R16H、R16I、R16L、R16N、R16P、R16S、R16T、R16V、R16W、M17A、M17C、M17G、M17K、M17N、M17P、M17Q、M17R、M17S、M17T、S18M、S18N、A19L、S20A、S20C、S20D、S20G、S20L、S20T、S20W、A21I、A21L、A21P、A21Y、A22F、A22L、A22M、A22N、A22R、A22Y、P24G、P24V、A25D、A25E、A25L、A25N、A25Q、A25R、A25V、L26D、L26E、L26F、L26G、L26H、L26I、L26K、L26N、L26R、L26S、L26W、L26Y、L27A、L27C、L27F、L27M、L27W、L27Y、N28R、N28W、D29P、K30P、W31E、W31N、T35L、T35Y、V37F、V37S、V37W、V38D、V38F、V38G、V38P、N39A、N39C、N39E、N39G、N39Q、N39W、A40D、A40L、A40M、A40P、A40V、A40Y、S41C、S41T、I42A、I42C、I42D、I42E、I42G、I42K、I42L、I42M、I42P、I42S、I42T、I42W、I42Y、S43A、S43D、S43E、S43F、S43G、S43H、S43L、S43M、S43N、S43R、S43T、S43V、G44C、G44E、G44H、G44K、G44L、G44N、G44Q、G44R、G44S、D45A、D45C、D45E、D45F、D45H、D45I、D45K、D45L、D45M、D45P、D45Q、D45S、D45T、D45V、D45W、T46A、T46C、T46D、T46G、T46K、T46N、T46R、T46S、S47P、S47Q、Q48E、Q48V、Q48W、Q48Y、Q49A、Q49C、Q49D、Q49E、Q49G、Q49H、Q49I、Q49K、Q49L、Q49M、Q49P、Q49R、Q49S、Q49V、Q49W、Q49Y、G50A、G50C、G50F、G50I、G50K、G50L、G50M、G50N、G50P、G50Q、G50R、G50S、G50T、G50Y、L51A、L51D、L51N、L51T、L51V、L51W、A52C、A52M、A52P、A52W、R53A、R53C、R53D、R53E、R53F、R53G、R53I、R53K、R53L、R53N、R53S、R53T、R53V、R53W、R53Y、L54A、L54C、L54E、L54F、L54G、L54M、L54N、L54S、L54W、L54Y、P55Y、L57A、L57C、L57F、L57K、L57P、L57Q、L57R、L57Y、L58A、L58D、L58E、L58G、L58H、L58N、L58R、L58S、L58W、L58Y、Q60P、H61D、H61G、H61P、Q62P、Q62W、P63I、P63L、P63N、P63S、P63T、P63V、P63W、R64F、R64P、R64W、R64Y、W65A、W65E、W65G、W65K、W65M、W65N、W65V、V66M、V66S、L67A、L67T、V68A、V68L、V68M、V68S、V68T、E69A、E69C、E69D、E69G、E69H、E69K、E69L、E69M、E69N、E69P、E69V、E69Y、L70A、L70C、L70E、L70F、L70H、L70I、L70K、L70Q、L70S、L70T、L70V、G71A、G72A、N73G、N73H、N73L、N73R、N73S、N73T、D74E、D74G、L76I、L76M、L76W、R77C、R77D、R77E、R77G、R77K、R77L、R77Q、R77S、R77V、R77W、G78D、F79P、Q80G、Q80M、Q80S、Q80Y、P81A、P81E、P81K、P81L、P81M、P81W、P81Y、Q82F、Q82V、Q82W、Q82Y、Q83A、T84E、T84R、T84W、Q86A、Q86T、T87E、T87G、T87L、L88C、R89L、R89P、Q90N、Q90P、Q90W、I91G、I91M、I91S、I91V、I91Y、L92A、L92C、L92G、L92H、L92N、L92S、L92T、L92V、L92Y、Q93A、Q93G、Q93H、Q93I、Q93P、Q93Y、D94P、V95F、V95G、V95L、V95N、V95Q、V95T、V95W、K96A、K96L、K96P、K96Y、A97K、A97P、A98L、A98P、A98V、A98W、A98Y、N99C、N99D、N99G、N99L、N99M、N99P、N99Q、N99R、N99W、N99Y、A100D、A100E、A100G、A100H、A100I、A100K、A100L、A100Q、A100R、A100V、A100W、A100Y、E101G、E101L、E101M、E101P、E101S、E101T、E101V、P102E、P102F、P102H、P102L、P102Q、P102R、P102S、P102W、P102Y、L103E、L103K、L103N、L103Q、L103R、L104C、L104P、L104S、L104W、M105C、M105E、M105G、M105V、Q106A、Q106C、Q106G、Q106K、Q106R、Q106S、Q106T、I107C、I107E、I107K、I107L、I107M、I107S、I107V、R108F、R108W、L109M、A111C、A111Q、A111W、N112A、N112G、N112W、Y113A、Y113D、Y113G、Y113I、G114K、G114L、G114M、G114Y、R115A、R115C、R115E、R115G、R115N、R115S、R115Y、R116H、R116W、Y117C、Y117H、Y117I、Y117L、Y117M、Y117N、Y117S、Y117T、Y117V、E119C、E119F、E119K、E119M、E119R、E119W、E119Y、A120D、A120G、A120I、A120T、A120W、S122F、S122I、S122L、S122M、S122V、S122W、S122Y、A123C、A123F、A123H、A123L、A123R、A123T、A123V、A123W、A123Y、I124G、I124H、I124K、I124L、I124R、I124S、I124Y、Y125F、Y125R、P126C、P126F、P126H、P126Y、K127I、K127P、L128A、L128S、L128T、A129H、A129I、A129K、A129N、A129W、A129Y、K130P、E131A、E131C、E131F、E131G、E131K、E131L、E131N、E131V、E131W、D133K、V134D、V134E、V134K、V134N、V134Q、V134R、V134W、V134Y、L136A、L136D、L136E、L136F、L136G、L136H、L136K、L136N、L136P、L136Q、L136R、L136S、L136T、L137E、L137G、L137H、L137P、L137Q、L137S、L137Y、F140M、M141A、M141C、M141L、M141P、E142C、Y145E、Q149L、Q152A、Q152D、Q152E、Q152H、Q152K、Q152R、Q152Y、D153K、G155F、G155W、G155Y、I156C、I156F、I156M、I156V、P158A、P158G、N159G、N159Q、N159T、N159V、R160A、R160D、R160E、R160G、R160H、R160N、R160Q、R160S、R160W、D161I、D161K、D161L、D161M、D161N、D161Q、D161W、A162G、Q163A、Q163C、Q163G、Q163L、Q163M、Q163S、Q163T、P164C、P164M、I166L、I166V、A167C、A167E、A167F、A167G、A167K、A167L、A167N、A167Q、A167R、A167T、A167V、A167Y、D168G、D168H、D168L、D168R、D168V、D168W、W169A、W169D、W169E、W169G、W169K、W169Q、W169S、M170F、M170G、M170N、M170Q、M170S、M170V、M170W、K172M、K172P、Q173N、L174A、L174F、L174G、L174T、L174W、Q175I、P176H、P176K、P176L、P176N、P176W、L177D、L177G、N179H、N179R、N179Y、H180A、H180G、D181H、D181I、D181L、D181R、D181W、S182K、S182L、S182P和/或S182R，其中取代突变命名中的数字是指SEQIDNO:31的氨基酸位置。可以在体外和/或体内检测对C₁₂底物增加的底物特异性和/或活性。

在本发明的一个实施方案中，提供了突变硫酯酶(或其天然存在的等同物)，其对C₁₄底物(即碳链长度为14个碳的底物)具有增加的底物特异性和/或活性(例如催化速率)，并且所述突变硫酯酶是包含图58的SEQIDNO:31的类似序列的前体硫酯酶的变体，其中所述前体硫酯酶在一个或多个氨基酸位置处进行了突变，所述一个或多个氨基酸位置对应于SEQIDNO:31的残基5-20、35-58、65-80、83-90、110-130、140-145、155-160、165-180。可以在体外和/或体内检测对C₁₄底物增加的底物特异性和/或活性。

在本发明的一个实施方案中，提供了突变硫酯酶(或其天然存在的等同物)，其对C₁₄底物具有增加的底物特异性和/或活性(例如催化速率)，并且所述突变硫酯酶是包含图58的SEQIDNO:31的类似序列的前体硫酯酶的变体，其中所述前体硫酯酶在一个或多个氨基酸位置处进行了突变，所述一个或多个氨基酸位置对应于SEQIDNO:31中选自以下的一个或多个残基：1、4、5、7、8、9、11、12、13、14、15、16、17、20、21、22、23、25、26、28、29、33、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、56、57、58、66、68、69、70、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、89、91、92、93、95、96、97、98、99、100、101、102、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、131、133、134、136、137、138、139、140、141、142、143、147、148、151、152、153、155、156、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、173、174、175、176、178、179、180、181和/或182。可以在体外和/或体内检测对C₁₄底物增加的底物特异性和/或活性。

在本发明的一个实施方案中，提供了突变硫酯酶(或其天然存在的等同物)，其对C₁₄底物具有增加的底物特异性和/或活性(例如催化速率)，并且所述突变硫酯酶是包含图58的SEQIDNO:31的类似序列的前体硫酯酶的变体，其中所述前体硫酯酶用选自以下的一个或多个取代进行了突变：A1S、L4S、L4Y、L5H、L5Y、L7C、L7M、L7N、L7S、L7T、L7Y、G8S、D9N、D9T、L11C、L11I、L11M、L11Q、L11V、S12I、S12L、S12M、S12T、S12V、A13H、A13I、A13L、A13T、A13V、G14F、G14I、G14R、G14T、G14V、Y15A、Y15C、Y15D、Y15E、Y15G、Y15I、Y15L、Y15M、Y15N、Y15Q、Y15R、Y15S、Y15V、R16G、R16N、R16P、R16W、M17C、M17D、M17G、M17K、M17N、M17P、M17R、M17S、M17T、S20A、S20D、S20G、S20L、S20T、S20W、A21G、A22L、A22N、A22Y、W23Y、A25E、A25N、A25Q、A25V、L26C、L26F、L26H、L26Q、L26V、L26Y、N28K、N28P、D29V、S33F、S36H、V37H、V37Q、V38F、N39F、N39M、N39Q、N39V、N39W、N39Y、A40G、A40P、A40T、A40V、S41P、S41T、I42A、I42D、I42E、I42G、I42L、I42M、I42P、I42S、I42T、I42W、I42Y、S43A、S43D、S43E、S43F、S43G、S43H、S43L、S43M、S43N、S43T、S43V、S43W、G44A、G44C、G44E、G44F、G44H、G44K、G44L、G44M、G44N、G44Q、G44R、G44S、G44W、G44Y、D45A、D45C、D45E、D45F、D45G、D45H、D45M、D45P、D45Q、D45S、D45T、D45V、D45W、T46A、T46C、T46D、T46G、T46K、T46N、T46S、T46W、S47E、S47P、S47Q、S47W、S47Y、Q48C、Q48F、Q48I、Q48M、Q48V、Q48W、Q48Y、Q49A、Q49C、Q49D、Q49E、Q49G、Q49H、Q49I、Q49K、Q49L、Q49M、Q49P、Q49R、Q49S、Q49V、Q49W、Q49Y、G50A、G50C、G50E、G50F、G50I、G50K、G50L、G50M、G50N、G50P、G50Q、G50R、G50S、G50T、G50W、G50Y、L51A、L51C、L51D、L51S、L51V、A52H、A52I、A52L、A52M、A52P、A52R、A52V、A52W、A52Y、R53A、R53C、R53D、R53E、R53F、R53G、R53I、R53K、R53L、R53N、R53S、R53T、R53V、R53W、R53Y、L54W、L54Y、A56R、A56W、A56Y、L57F、L58F、L58I、L58Y、V66I、V68L、E69A、E69C、E69D、E69F、E69G、E69H、E69K、E69L、E69M、E69N、E69Q、E69S、E69V、E69Y、L70A、L70C、L70E、L70F、L70H、L70Q、L70S、L70T、L70V、L70W、G72A、G72C、G72P、G72S、N73A、N73C、N73G、N73H、N73I、N73L、N73P、N73R、N73S、N73T、N73V、N73W、D74E、D74G、G75A、G75C、G75D、G75E、G75F、G75I、G75K、G75L、G75M、G75N、G75P、G75T、G75W、G75Y、L76A、L76C、L76D、L76E、L76F、L76G、L76I、L76K、L76M、L76N、L76P、L76Q、L76R、L76T、L76V、L76W、R77A、R77C、R77D、R77E、R77F、R77G、R77H、R77K、R77L、R77N、R77Q、R77S、R77V、R77W、G78P、F79M、F79P、F79V、Q80A、Q80G、Q80L、Q80M、Q80S、Q80W、Q80Y、P81A、P81E、P81K、P81L、P81M、P81W、P81Y、Q82F、Q82I、Q82N、Q82P、Q82V、Q82W、Q82Y、Q83A、T84S、E85D、Q86A、Q86T、Q86V、Q86W、T87A、T87C、T87E、T87F、T87G、T87H、T87L、T87M、T87S、T87V、T87W、R89H、R89T、R89V、R89W、I91L、I91V、I91Y、L92V、Q93A、Q93G、Q93H、Q93I、Q93P、Q93Y、V95L、V95M、V95T、V95W、K96A、K96L、K96P、K96Y、A97W、A98K、A98L、A98W、N99G、N99L、N99P、N99Q、N99R、N99Y、A100G、A100H、A100I、A100K、A100L、A100M、A100R、A100T、A100V、A100Y、E101G、E101L、E101M、E101S、E101T、E101V、P102S、M105A、M105C、M105E、M105G、M105I、M105L、M105V、Q106A、Q106C、Q106D、Q106G、Q106H、Q106K、Q106L、Q106M、Q106R、Q106S、Q106T、Q106V、Q106W、Q106Y、I107C、I107E、I107G、I107L、I107M、I107Q、I107V、R108A、R108C、R108D、R108F、R108I、R108L、R108S、R108V、R108W、R108Y、L109C、L109M、L109Q、L109T、L109V、L109Y、P110A、P110E、P110H、P110N、P110R、P110V、A111C、A111L、A111Q、A111R、A111V、A111W、N112A、N112F、N112G、N112I、N112L、N112P、N112V、N112W、N112Y、Y113A、Y113D、Y113G、Y113I、Y113M、Y113W、G114F、G114K、G114L、G114M、G114W、G114Y、R115A、R115C、R115E、R115G、R115I、R115N、R115P、R115Q、R115S、R115V、R115W、R115Y、R116C、R116H、R116T、R116V、R116W、Y117C、Y117H、Y117I、Y117L、Y117M、Y117N、Y117S、Y117W、N118A、N118C、N118E、N118G、N118H、N118I、N118L、N118M、N118P、N118Q、N118T、N118V、N118W、E119C、E119D、E119F、E119K、E119M、E119P、E119R、E119T、E119W、E119Y、A120D、A120G、A120I、A120L、A120T、A120W、F121A、F121C、F121D、F121E、F121K、F121L、F121M、F121P、F121Q、F121R、F121S、F121V、F121Y、S122A、S122C、S122D、S122E、S122F、S122G、S122I、S122L、S122M、S122P、S122V、S122W、S122Y、A123C、A123E、A123F、A123H、A123L、A123T、A123V、A123W、A123Y、I124A、I124C、I124G、I124L、I124Y、Y125C、Y125F、Y125G、Y125I、Y125L、Y125P、Y125Q、Y125R、Y125S、Y125T、Y125V、P126C、P126H、P126Y、E131I、E131L、D133K、D133Y、V134S、L136C、L136M、L136Q、L136S、L137P、P138E、P138R、P138T、F139M、F140M、M141A、M141C、M141L、M141P、E142A、E142C、E142L、E142M、E142N、E142P、E142Q、E142S、E142Y、E143I、E143P、K147R、P148W、M151I、M151Q、M151V、Q152A、Q152K、Q152S、D153I、D153K、D153M、D153W、G155F、G155H、G155W、G155Y、I156C、I156F、I156M、I156Q、I156R、I156S、I156V、P158A、P158G、P158S、N159G、N159T、R160A、R160G、R160H、R160N、R160W、D161G、D161I、D161K、D161L、D161M、D161N、D161Q、D161R、D161S、D161V、D161W、A162G、Q163G、Q163L、Q163M、Q163S、P164A、P164C、P164K、P164L、P164M、P164N、P164R、P164T、P164W、F165G、F165H、F165S、F165W、F165Y、I166L、I166V、A167T、D168A、D168G、D168H、D168P、D168R、D168T、W169A、W169E、W169K、W169M、W169Q、W169R、W169S、W169T、W169V、M170A、M170F、M170V、A171I、Q173N、Q173W、Q173Y、L174Q、L174W、Q175I、Q175Y、P176H、P176K、P176L、P176R、P176W、P176Y、V178A、V178T、V178W、N179H、N179R、N179T、N179V、N179Y、H180G、H180R、H180S、H180W、D181A、D181H、D181I、D181L、D181Q、D181R、D181S、D181W、S182A、S182E、S182G、S182I、S182K、S182L、S182P、S182Q、S182R和/或S182T，其中取代突变命名中的数字是指SEQIDNO:31的氨基酸位置。可以在体外和/或体内检测对C₁₄底物增加的底物特异性和/或活性。

在本发明的一个实施方案中，提供了突变硫酯酶(或其天然存在的等同物)，其具有对酯底物(例如酰基PNP)超过对硫酯底物(例如酰基辅酶A)的偏好性，并且所述突变硫酯酶是包含图58的SEQIDNO:31的类似序列的前体硫酯酶的变体，其中所述前体硫酯酶在一个或多个氨基酸位置处进行了突变，所述一个或多个氨基酸位置对应于选自SEQIDNO:31中95、96、97、98、99、100、101、102、104、105、106、107、108、109和/或110的残基。可以在体外和/或体内检测对酯底物超过对硫酯底物的偏好性。

在本发明的一个实施方案中，提供了突变硫酯酶(或其天然存在的等同物)，其具有对酯底物(例如酰基PNP)超过对硫酯底物(例如酰基辅酶A)的偏好性，并且所述突变硫酯酶是包含图58的SEQIDNO:31的类似序列的前体硫酯酶的变体，其中所述前体硫酯酶用选自以下的一个或多个取代进行了突变：V95L、V95M、V95T、K96A、K96L、K96W、K96Y、A97F、A97K、A97S、A97T、A97W、A98E、A98F、A98K、A98L、A98Q、A98W、N99Y、A100K、A100V、E101L、P102S、L104C、M105F、Q106A、Q106C、Q106T、Q106Y、I107A、I107C、I107G、I107L、I107M、I107Q、I107V、R108A、R108C、R108D、R108F、R108I、R108L、R108S、R108V、R108W、R108Y、L109M、L109V、P110A、P110F、P110H、P110N、P110V和/或P110W，其中取代突变命名中的数字是指SEQIDNO:31的氨基酸位置。可以在体外和/或体内检测对酯底物超过对硫酯底物的偏好性。

在本发明的一个实施方案中，提供了突变硫酯酶(或其天然存在的等同物)，其具有对硫酯底物(例如酰基辅酶A)超过对酯底物(例如酰基PNP)的偏好性，并且所述突变硫酯酶是包含图58的SEQIDNO:31的类似序列的前体硫酯酶的变体，其中所述前体硫酯酶在一个或多个氨基酸位置处进行了突变，所述一个或多个氨基酸位置对应于选自SEQIDNO:31的95、96、97、101、102、103、104、105、107、109和/或110的残基。可以在体外和/或体内检测对硫酯底物超过对酯底物的偏好性。

在本发明的一个实施方案中，提供了突变硫酯酶(或其天然存在的等同物)，其具有对硫酯底物(例如酰基辅酶A)超过对酯底物(例如酰基PNP)的偏好性，并且所述突变硫酯酶是包含图58的SEQIDNO:31的类似序列的前体硫酯酶的变体，其中所述前体硫酯酶用选自以下的一个或多个取代进行了突变：V95E、V95I、V95W、V95Y、K96P、A97E、A97M、E101P、P102D、P102K、P102Y、L103E、L103K、L103N、L104A、L104D、L104E、L104N、L104Q、L104W、L104Y、M105W、I107E、I107K、I107P、L109A、L109C,L109D、L109E、L109G、L109K、L109N、L109P、L109Q、L109S、L109T、L109Y和/或P110R，其中取代突变命名中的数字是指SEQIDNO:31的氨基酸位置。可以在体外和/或体内检测对硫酯底物超过对酯底物的偏好性。

在本发明的一个实施方案中，提供了突变硫酯酶(或其天然存在的等同物)，其产生的脂肪酯与其它非脂肪酯产物(例如脂肪酯之外的游离脂肪酸和/或脂肪酸衍生物)相比的收率比例或收率百分比增加，所述突变硫酯酶是包含图58的SEQIDNO:31的类似序列的前体硫酯酶的变体，其中所述前体硫酯酶在一个或多个氨基酸位置处进行了突变，所述一个或多个氨基酸位置对应于选自SEQIDNO:31的1-14、22-29、33-58、65-100、103-109、114-117、119-121、127-136、139-144、150-151、155-170和/或173-174的残基。可以在体外和/或体内观察或测定脂肪酯与其它产物(例如脂肪酯之外的脂肪酸衍生物)相比的收率比例或收率百分比的增加。优选体内测定脂肪酯与其它产物相比的收率比例或收率百分比的增加。

在本发明的一个实施方案中，提供了突变硫酯酶(或其天然存在的等同物)，其产生的脂肪酯与其它产物(例如脂肪酯之外的游离脂肪酸和/或脂肪酸衍生物)相比的收率比例或收率百分比增加，所述突变硫酯酶是包含图58的SEQIDNO:31的类似序列的前体硫酯酶的变体，其中所述前体硫酯酶在一个或多个氨基酸位置处进行了突变，所述一个或多个氨基酸位置对应于SEQIDNO:31中选自以下的残基：1、2、4、5、6、7、8、12、13、14、22、23、24、25、26、28、29、33、34、35、36、37、38、39、40、41、44、45、46、47、49、50、53、58、65、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、79、81、84、86、87、88、89、90、91、92、93、95、96、99、100、103、104、105、106、107、108、109、114、115、117、119、120、121、127、128、129、131、132、134、135、136、139、141、142、143、144、150、151、155、156、158、159、160、161、162、163、164、165、166、169、170、173和/或174。可以在体外和/或体内观察或测定脂肪酯与其它产物(例如脂肪酯之外的脂肪酸衍生物)相比的收率比例或收率百分比的增加。优选体内测定脂肪酯与其它产物(例如脂肪酯之外的脂肪酸衍生物)相比的收率比例或收率百分比的增加。

在本发明的一个实施方案中，提供了突变硫酯酶(或其天然存在的等同物)，其产生的脂肪酯与其它产物(例如脂肪酯之外的游离脂肪酸和/或脂肪酸衍生物)相比的收率比例或收率百分比增加，所述突变硫酯酶是包含图58的SEQIDNO:31的类似序列的前体硫酯酶的变体，其中所述前体硫酯酶用选自以下的一个或多个取代进行了突变：A1R、D2H、D2R、L4G、L4M、L5Q、I6A、I6L、L7E、G8A、S12N、A13I、A13L、A13S、A13T、A13W、A13Y、G14K、G14R、G14S、G14T、A22D、A22E、A22H、A22Y、W23Y、P24C、P24G、P24T、A25P、L26C、L26D、L26E、L26G、L26N、N28A、N28M、D29V、S33G、S33M、K34A、K34H、K34M、T35G、T35M、S36A、V37A、V37G、V37H、V37S、V38D、V38G、V38P、N39E、N39Q、N39R、A40M、A40P、S41T、G44F、G44Y、D45P、D45Q、T46W、S47F、Q49I、G50A、G50K、G50M、G50S、R53S、L58D、L58M、L58R、W65L、L67G、V68G、V68M、V68N、E69P、E69Q、L70A、L70E、L70H、G71C、G72A、N73C、N73G、N73L、N73R、N73T、N73V、D74C、D74S、D74W、G75A、G75K、G75L、G75M、L76A、L76F、L76G、L76I、L76M、L76N、L76T、L76W、R77G、F79A、F79M、F79P、P81E、P81W、T84F、T84H、T84Y、Q86P、Q86W、T87M、T87S、T87W、L88C、L88F、L88G、L88H、L88Y、R89G、Q90P、Q90W、I91M、I91S、L92C、L92G、Q93F、Q93P、V95A、V95D、V95E、V95L、V95M、K96P、N99L、N99M、N99S、A100D、A100K、A100L、A100M、A100V、A100Y、L103A、L104A、L104C、L104P、L104Q、L104W、M105A、Q106A、Q106C、Q106T、Q106W、I107C、I107M、R108E、L109F、L109M、G114F、R115W、Y117P、E119D、E119P、A120P、F121A、F121C、F121W、K127P、L128F、A129L、A129Y、E131A、F132P、V134P、P135A、L136A、F139M、M141A、M141P、E142A、E143P、V144A、W150D、W150E、M151S、G155V、I156K、I156M、P158A、P158G、P158Q、P158S、N159E、N159I、R160H、R160I、R160K、D161G、A162T、A162Y、Q163A、Q163C、Q163E、Q163G、Q163I、Q163M、Q163S、Q163T、Q163V、P164C、F165D、F165S、I166A、I166L、W169M、M170E、M170G、M170N、M170S、Q173P和/或L174A，其中取代突变命名中的数字是指SEQIDNO:31的氨基酸位置。可以在体外和/或体内观察或测定脂肪酯与其它产物(例如脂肪酯之外的脂肪酸衍生物)相比的收率比例或收率百分比的增加。优选体内测定脂肪酯与其它产物(例如脂肪酯之外的脂肪酸衍生物)相比的收率比例或收率百分比的增加。

在本发明的一个实施方案中，提供了突变硫酯酶(或其天然存在的等同物)，当不需要产生脂肪酯时，所述突变硫酯酶产生的脂肪酯与其它非脂肪酯产物(例如脂肪酯之外的游离脂肪酸和/或脂肪酸衍生物)相比的收率比例或收率百分比降低，所述突变硫酯酶是包含图58的SEQIDNO:31的类似序列的前体硫酯酶的变体，其中所述前体硫酯酶在一个或多个氨基酸位置处进行了突变，所述一个或多个氨基酸位置对应于SEQIDNO:31中选自以下的残基：3、5、15-18、27-42、46、57-68、77-78、95-106、121-123、152-154、167和/或175-182。可以在体外和/或体内观察或测定脂肪酯与其它产物(例如脂肪酯之外的脂肪酸衍生物)相比的收率比例或收率百分比的降低。优选体内测定脂肪酯与其它产物(例如脂肪酯之外的脂肪酸衍生物)相比的收率比例或收率百分比的降低。

在本发明的一个实施方案中，提供了突变硫酯酶(或其天然存在的等同物)，当不需要产生脂肪酯时，所述突变硫酯酶产生的脂肪酯与其它产物(例如脂肪酯之外的游离脂肪酸和/或脂肪酸衍生物)相比的收率比例或收率百分比降低，所述突变硫酯酶是包含图58的SEQIDNO:31的类似序列的前体硫酯酶的变体，其中所述前体硫酯酶在一个或多个氨基酸位置处进行了突变，所述一个或多个氨基酸位置对应于SEQIDNO:31中选自以下的残基：3、5、15、16、18、27、28、33、34、35、36、37、38、40、42、46、57、59、60、62、65、68、77、78、95、96、97、98、99、100、102、103、105、106、121、123、152、153、154、167、175、176、178、179、180、181和/或182。可以在体外和/或体内观察或测定脂肪酯与其它产物(例如脂肪酯之外的脂肪酸衍生物)相比的收率比例或收率百分比的降低。优选体内测定脂肪酯与其它产物(例如脂肪酯之外的脂肪酸衍生物)相比的收率比例或收率百分比的降低。

在本发明的一个实施方案中，提供了突变硫酯酶(或其天然存在的等同物)，当不需要产生脂肪酯时，所述突变硫酯酶产生的脂肪酯与其它产物(例如脂肪酯之外的游离脂肪酸和/或脂肪酸衍生物)相比的收率比例或收率百分比降低，所述突变硫酯酶是包含图58的SEQIDNO:31的类似序列的前体硫酯酶的变体，其中所述前体硫酯酶用选自以下的一个或多个取代进行了突变：T3E、T3G、T3K、T3L、L5C、L5G、Y15A、Y15L、Y15Q、Y15R、Y15V、R16D、R16E、R16G、R16I、R16V、S18E、L27V、N28G、N28I、S33I、S33R、K34R、T35F、T35K、T35L、T35Q、T35V、S36F、S36I、S36L、S36W、V37L、V38E、V38F、V38K、V38L、A40D、A40G、I42T、T46L、L57A、L57F、L57G、L57H、L57K、L57N、L57P、L57R、L57S、L57T、L57V、L57W、L57Y、K59V、Q60E、Q60P、Q62G、W65V、V68L、R77L、G78M、V95F、V95N、K96C、K96L、K96N、K96Q、K96R、K96Y、A97E、A97F、A97R、A97W、A98E、N99A、N99D、A100S、P102I、L103Q、L103W、M105L、Q106G、Q106H、Q106K、Q106S、Q106V、F121P、A123E、Q152D、Q152E、Q152F、Q152H、Q152I、Q152K、Q152L、Q152S、Q152T、Q152Y、D153P、D153V、D154E、A167V、Q175L、P176D、V178K、N179H、N179W、H180E、H180L、H180P、H180R、D181C、D181E、S182K、S182L、S182N、S182R、S182T和/或S182V，其中取代突变命名中的数字是指SEQIDNO:31的氨基酸位置。可以在体外和/或体内观察或测定脂肪酯与其它产物(例如脂肪酯之外的脂肪酸衍生物)相比的收率比例或收率百分比的降低。优选体内测定脂肪酯与其它产物(例如脂肪酯之外的脂肪酸衍生物)相比的收率比例或收率百分比的降低。

在本发明的一个实施方案中，提供了突变硫酯酶(或其天然存在的等同物)，其能增加和/或提高一种或多种脂肪酸衍生物的收率，所述突变硫酯酶是包含图58的SEQIDNO:31的类似序列的前体硫酯酶的变体，其中所述前体硫酯酶在一个或多个氨基酸位置处进行了突变，所述一个或多个氨基酸位置对应于SEQIDNO:31中选自以下的残基：2、4、11-22、25-31、37-45、49-58、63-80、84-130、136-146和/或150-174。由此产生的示例性的脂肪酸衍生物是游离脂肪酸。可以在体外和/或体内检测脂肪酸衍生物增加和/或提高的收率。优选在体内检测脂肪酸衍生物增加和/或提高的收率。

在本发明的一个实施方案中，提供了突变硫酯酶(或其天然存在的等同物)，其能增加和/或提高一种或多种脂肪酸衍生物的收率，所述突变硫酯酶是包含图58的SEQIDNO:31的类似序列的前体硫酯酶的变体，其中所述前体硫酯酶在一个或多个氨基酸位置处进行了突变，所述一个或多个氨基酸位置对应于SEQIDNO:31中选自以下的残基：2、4、11、12、13、14、15、16、17、19、21、22、25、26、27、28、29、30、31、37、39、41、42、43、44、45、49、50、51、53、54、58、63、65、66、67、68、69、70、71、73、74、75、76、77、78、79、80、84、87、88、90、91、92、93、94、95、96、97、98、100、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、115、117、118、119、120、121、122、124、127、128、129、130、136、137、138、139、140、141、143、144、145、146、150、151、152、154、155、156、158、162、163、166、167、169、170、173和/或174。由此产生的示例性的脂肪酸衍生物是游离脂肪酸。可以在体外和/或体内检测脂肪酸衍生物增加和/或提高的收率。优选在体内检测脂肪酸衍生物增加和/或提高的收率。

在本发明的一个实施方案中，提供了突变硫酯酶(或其天然存在的等同物)，其能增加和/或提高一种或多种脂肪酸衍生物的收率，所述突变硫酯酶是包含图58的SEQIDNO:31的类似序列的前体硫酯酶的变体，其中所述前体硫酯酶用选自以下的一个或多个取代进行了突变：D2L、D2P、D2R、L5G、L11I、S12N、S12T、A13N、G14C、G14P、G14S、G14T、G14V、Y15C、Y15I、Y15V、R16T、M17D、M17E、M17N、M17R、M17S、M17V、A19C、A21G、A22L、A22R、A22T、A25P、L26D、L26G、L26W、L27C、L27F、L27W、L27Y、N28I、N28P、D29P、K30P、W31D、W31G、W31N、W31P、W31R、W31S、W31T、V37Y、N39P、S41C、I42D、I42G、S43E、G44K、G44R、G44W、D45G、Q49E、G50A、G50K、G50M、G50Q、L51D、L51T、R53A、R53G、R53L、R53N、R53S、R53V、L54E、L54F、L54G、L54N、L54S、L54W、L58R、P63G、P63M、P63N、P63T、P63W、W65E、W65G、V66G、V66S、L67T、V68S、E69F、E69V、L70C、L70F、L70Q、L70S、L70T、L70V、G71A、N73G、N73L、D74A、D74C、G75A、G75C、G75F、G75R、G75W、L76I、R77A、R77C、R77D、R77F、R77G、R77H、R77K、R77L、R77N、R77Q、R77S、R77W、G78D、G78E、F79K、Q80G、T84H、T84N、T84Q、T87A、T87F、T87H、T87W、L88A、L88C、L88H、Q90N、Q90W、I91G、I91L、I91M、I91S、L92G、L92N、L92Q、L92S、L92T、L92Y、Q93P、D94P、V95F、V95N、V95Q、K96P、A97C、A97P、A98P、A98V、A100D、A100E、A100Q、A100Y、P102L、P102Q、P102R、L103E、L103K、L104A、L104Q、L104W、L104Y、M105C、M105E、M105F、M105L、Q106D、Q106G、Q106L、Q106V、Q106W、Q106Y、I107A、I107C、I107E、I107G、I107K、I107L、I107Q、I107S、I107T、R108G、L109F、L109V、L109Y、P110A、P110E、P110F、P110G、P110H、P110N、P110S、P110V、A111Y、N112F、N112P、Y113D、Y113E、Y113P、R115W、Y117A、Y117D、Y117E、Y117G、Y117P、Y117Q、N118F、E119P、A120P、F121C、F121L、F121M、F121N、F121Q、F121R、F121V、F121W、F121Y、S122D、S122F、S122L、S122P、S122W、S122Y、I124A、I124G、I124H、I124K、I124R、K127P、L128S、A129I、A129W、A129Y、K130P、L136A、L136D、L136E、L136G、L136K、L136N、L136P、L136Q、L136S、L136T、L137A、L137C、L137H、L137K、L137Q、L137S、L137Y、P138F、F139L、F139M、F140C、F140I、F140L、F140M、F140V、M141T、E143P、V144H、Y145I、L146G、L146P、W150G、W150I、W150V、M151F、M151L、M151R、M151S、M151T、M151W、Q152N、Q152V、Q152Y、D154C、D154E、G155I、I156C、I156K、I156T、I156V、P158G、P158T、A162T、Q163A、Q163C、Q163E、Q163I、Q163S、Q163T、Q163V、I166C、A167E、A167F、A167L、A167N、A167R、A167V、A167Y、W169K、M170N、M170S、Q173D、L174A、L174T和/或L174W，其中取代突变命名中的数字是指SEQIDNO:31的氨基酸位置。由此产生的示例性的脂肪酸衍生物是游离脂肪酸。可以在体外和/或体内检测脂肪酸衍生物增加和/或提高的收率。优选在体内检测脂肪酸衍生物增加和/或提高的收率。

在一个实施方案中，提供了突变硫酯酶(或其天然存在的等同物)，其产生的短链(例如C₈、C₉、C₁₀、C₁₁、C₁₂、C₁₃、C₁₄)脂肪酸衍生物(例如短链脂肪酸、短链脂肪酯、短链脂肪醇等)其它产物(例如非短链脂肪酸衍生物，包括例如，长链(例如C₁₅、C₁₆、C₁₇、C₁₈、C₁₉、C₂₀)脂肪酸、长链脂肪酯、长链脂肪醇等)相比的收率比例或收率百分比增加，所述突变硫酯酶是包含图58的SEQIDNO:31的类似序列的前体硫酯酶的变体，其中所述前体硫酯酶在一个或多个氨基酸位置处进行了突变，所述一个或多个氨基酸位置对应于SEQIDNO:31中选自以下的残基：13、16-17、25-38、55-67、78-98、105-119、122、126、132-145、153和/或161-182。示例性的短链脂肪酸衍生物是C₁₂脂肪酸衍生物。可选的短链脂肪酸衍生物是C₁₄脂肪酸衍生物。在某些情况下，短链脂肪酸衍生物收率比例或收率百分比的增加可与长链脂肪酸衍生物收率比例的降低有关。可以在体外或体内检测短链脂肪酸衍生物收率比例或收率百分比的增加和/或长链脂肪酸衍生物收率比例或收率百分比的相应降低。优选在体内检测短链脂肪酸衍生物收率比例的增加或长链脂肪酸衍生物收率比例或收率百分比的相应降低。

在一个实施方案中，提供了突变硫酯酶(或其天然存在的等同物)，其产生的短链(例如C₈、C₉、C₁₀、C₁₁、C₁₂、C₁₃、C₁₄)脂肪酸衍生物(例如短链脂肪酸、短链脂肪酯、短链脂肪醇等)与其它产物(例如非短链脂肪酸衍生物，包括例如，长链(例如C₁₅、C₁₆、C₁₇、C₁₈、C₁₉、C₂₀)脂肪酸、长链脂肪酯、长链脂肪醇等)相比的收率比例或收率百分比增加，所述突变硫酯酶是包含图58的SEQIDNO:31的类似序列的前体硫酯酶的变体，其中所述前体硫酯酶在一个或多个氨基酸位置处进行了突变，所述一个或多个氨基酸位置对应于SEQIDNO:31中选自以下的一个或多个残基：13、16、17、25、29、31、35、36、38、55、57、58、59、61、62、63、64、65、66、67、78、79、82、83、84、85、86、87、89、90、93、94、95、96、97、98、105、106、108、111、113、114、117、119、122、126、132、135、136、139、142、144、145、153、161、162、165、168、173、175、176、178、179、180、181和/或182。示例性的短链脂肪酸衍生物是C₁₂脂肪酸衍生物。可选的短链脂肪酸衍生物是C₁₄脂肪酸衍生物。在某些情况下，短链脂肪酸衍生物收率比例或收率百分比的增加可与长链脂肪酸衍生物收率比例的降低有关。可以在体外或体内检测短链脂肪酸衍生物收率比例或收率百分比的增加和/或长链脂肪酸衍生物收率比例或收率百分比的相应降低。优选在体内检测短链脂肪酸衍生物收率比例的增加或长链脂肪酸衍生物收率比例的相应降低。

在一个实施方案中，提供了突变硫酯酶(或其天然存在的等同物)，其产生的短链(例如C₈、C₉、C₁₀、C₁₁、C₁₂、C₁₃、C₁₄)脂肪酸衍生物(例如短链脂肪酸、短链脂肪酯、短链脂肪醇等)与其它产物(例如非短链脂肪酸衍生物，包括例如，长链(例如C₁₅、C₁₆、C₁₇、C₁₈、C₁₉、C₂₀)脂肪酸、长链脂肪酯、长链脂肪醇等)相比的收率比例或收率百分比增加，所述突变硫酯酶是包含图58的SEQIDNO:31的类似序列的前体硫酯酶的变体，其中所述前体硫酯酶用选自以下的一个或多个取代进行了突变：A13V、R16A、M17T、A25S、D29M、W31L、T35Y、S36W、V38S、P55A、P55G、L57I、L58M、L58V、K59E、H61W、Q62M、P63V、R64M、W65L、V66C、L67C、L67M、G78F、G78M、G78R、G78T、G78V、F79K、F79Y、Q82A、Q82M、Q82R、Q83G、Q83K、T84M、T84V、E85A、E85C、E85G、E85Q、E85S、E85T、E85V、E85W、E85Y、Q86H、Q86Y、T87R、R89V、Q90L、Q93M、Q93N、Q93V、D94C、D94L、V95G、K96C、A97N、A97V、A98G、A98Y、M105I、Q106K、Q106R、R108W、A111E、A111N、A111S、A111W、A111Y、Y113A、Y113S、Y113V、G114K、G114Y、Y117R、E119M、E119Q、E119R、S122F、S122I、S122M、S122R、P126K、F132C、F132D、F132K、F132L、F132N、F132V、P135A、P135E、P135K、P135Q、L136H、F139L、E142W、V144Y、Y145A、Y145C、Y145D、Y145E、Y145G、Y145I、Y145L、Y145M、Y145N、Y145R、Y145S、Y145T、D153K、D153Q、D161K、A162I、F165K、D168W、Q173I、Q175M、P176Q、P176R、P176V、V178F、V178G、V178L、V178R、V178S、V178T、N179H、H180E、H180P、H180R、H180S,H180V、H180W、D181R、D181T、S182C,S182D、S182G和/或S182R，其中取代突变命名中的数字是指SEQIDNO:31的氨基酸位置。示例性的短链脂肪酸衍生物是C₁₂脂肪酸衍生物。可选的短链脂肪酸衍生物是C₁₄脂肪酸衍生物。在某些情况下，短链脂肪酸衍生物收率比例或收率百分比的增加可与长链脂肪酸衍生物收率比例的降低有关。可以在体外或体内检测短链脂肪酸衍生物收率比例或收率百分比的增加和/或长链脂肪酸衍生物收率比例的相应降低。优选在体内检测短链脂肪酸衍生物收率比例的增加或长链脂肪酸衍生物收率比例的相应降低。

在一个实施方案中，提供了突变硫酯酶(或其天然存在的等同物)，其产生的短链(例如C₈、C₉、C₁₀、C₁₁、C₁₂、C₁₃、C₁₄)脂肪酸衍生物(例如短链脂肪酸、短链脂肪酯、短链脂肪醇等)与其它产物(例如非短链脂肪酸衍生物，包括例如，长链(例如C₁₅、C₁₆、C₁₇、C₁₈、C₁₉、C₂₀)脂肪酸、长链脂肪酯、长链脂肪醇等)相比的收率比例或收率百分比降低，所述突变硫酯酶是包含图58的SEQIDNO:31的类似序列的前体硫酯酶的变体，其中所述前体硫酯酶在一个或多个氨基酸位置处进行了突变，所述一个或多个氨基酸位置对应于SEQIDNO:31中选自以下的一个或多个残基：1-31、36-81、84-159、162-177和/或181。示例性的短链脂肪酸衍生物是C₁₂脂肪酸衍生物。可选的短链脂肪酸衍生物是C₁₄脂肪酸衍生物。在某些情况下，短链脂肪酸衍生物收率比例或收率百分比的降低可与长链脂肪酸衍生物收率比例的增加有关。可以在体外或体内检测短链脂肪酸衍生物收率比例或收率百分比的降低和/或长链脂肪酸衍生物收率比例的相应增加。优选在体内检测短链脂肪酸衍生物收率比例的降低或长链脂肪酸衍生物收率比例的相应增加。

在一个实施方案中，提供了突变硫酯酶(或其天然存在的等同物)，其产生的短链(例如C₈、C₉、C₁₀、C₁₁、C₁₂、C₁₃、C₁₄)脂肪酸衍生物(例如短链脂肪酸、短链脂肪酯、短链脂肪醇等)与其它产物(例如非短链脂肪酸衍生物，包括例如，长链脂肪酸、长链脂肪酯、长链脂肪醇等)相比的收率比例或收率百分比降低，所述突变硫酯酶是包含图58的SEQIDNO:31的类似序列的前体硫酯酶的变体，其中所述前体硫酯酶在一个或多个氨基酸位置处进行了突变，所述一个或多个氨基酸位置对应于SEQIDNO:31中选自以下的一个或多个残基：1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、17、18、19、21、22、23、24、26、27、30、31、36、37、38、42、44、45、46、47、48、50、51、52、53、54、55、57、61、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、81、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、99、100、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、117、118、119、120、121、122、124、125、127、128、129、130、131、132、133、134、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、162、163、165、166、167、168、170、171、173、174、175、176、177和/或181。示例性的短链脂肪酸衍生物是C₁₂脂肪酸衍生物。可选的短链脂肪酸衍生物是C₁₄脂肪酸衍生物。在某些情况下，短链脂肪酸衍生物收率比例或收率百分比的降低可与长链脂肪酸衍生物收率比例的增加有关。可以在体外或体内检测短链脂肪酸衍生物收率比例或收率百分比的降低和/或长链脂肪酸衍生物收率比例的相应增加。优选在体内检测短链脂肪酸衍生物收率比例的降低或长链脂肪酸衍生物收率比例的相应增加。

在一个实施方案中，提供了突变硫酯酶(或其天然存在的等同物)，其产生的短链(例如C₈、C₉、C₁₀、C₁₁、C₁₂、C₁₃、C₁₄)脂肪酸衍生物(例如短链脂肪酸、短链脂肪酯、短链脂肪醇等)与其它产物(例如非短链脂肪酸衍生物，包括例如，长链脂肪酸、长链脂肪酯、长链脂肪醇等相比的收率比例或收率百分比降低，所述突变硫酯酶是包含图58的SEQIDNO:31的类似序列的前体硫酯酶的变体，其中所述前体硫酯酶用选自以下的一个或多个取代进行了突变：A1C、A1F、A1L、A1Y、D2L、D2M、D2P、D2W、T3R、L4A、L4M、L4N、L4S、L4V、L4Y、L5E、L5F、L5G、L5K、L5N、L5S、L5W、I6T、L7A、L7E、L7K、L7M、L7W、G8K、D9N、D9T、L11A、L11C、L11I、L11M、L11Q、L11V、S12I、S12L、S12M、S12N、S12T、S12V、S12Y、A13C、G14C、G14E、G14I、G14M、G14N、G14P、G14S、G14T、G14V、Y15C、Y15E、Y15G、Y15I、Y15N、Y15V、R16T、M17D、M17E、M17G、M17L、M17N、M17P、M17R、M17S、M17V、S18M、S18N、S18T、A19E、A19L、A19V、A21P、A22D、A22E、A22F、A22H、A22I、A22K、A22L、A22P、A22R、A22S、A22T、A22Y、W23A、W23H、W23N、W23P、P24A、P24C、P24D、P24E、P24F、P24G、P24I、P24M、P24N、P24S、P24T、P24V、P24W、L26P、L27A、L27C、L27F、L27H、L27R、L27S、L27T、L27W、L27Y、K30P、W31D、W31P、W31R、S36F、S36L、V37G、V37H、V37N、V37Q、V37W、V37Y、V38P、N39E、N39G、N39K、N39M、N39P、N39Q、N39Y、I42D、I42G、I42P、G44A、G44E、G44K、G44M、G44N、G44R、G44S、G44W、G44Y、D45G、D45M、T46D、S47E、S47P、S47Q、S47R、S47Y、Q48Y、G50C、G50E、G50F、G50I、G50K、G50L、G50M、G50N、G50P、G50Q、G50R、G50S、G50T、G50W、G50Y、L51D、L51P、L51T、A52P、R53A、R53C、R53D、R53E、R53F、R53G、R53I、R53K、R53L、R53N、R53S、R53T、R53V、R53W、R53Y、L54C、L54E、L54G、L54N、L54Y、P55Y、L57P、H61A、H61D、H61E、P63D、P63E、P63G、P63K、P63M、P63N、P63Q、P63R、R64L、W65G、W65P、W65R、V66N、V66Q、V66S、V66W、V66Y、L67E、L67G、L67Q、L67R、L67S、L67W、V68E、V68G、V68N、V68P、V68Q、E69A、E69C、E69D、E69F、E69G、E69H、E69K、E69L、E69M、E69N、E69P、E69Q、E69S、E69V、E69W、E69Y、L70A、L70C、L70E、L70F、L70G、L70H、L70K、L70Q、L70S、L70T、L70W、G71C、G71S、G72A、G72M、G72P、N73A、N73G、N73H、N73I、N73L、N73P、N73R、N73S、N73T、N73W、D74A、D74C、D74F、D74G、D74Q、D74S、D74W、D74Y、G75A、G75C、G75D、G75E、G75F、G75I、G75K、G75L、G75M、G75N、G75P、G75R、G75T、G75V、G75W、G75Y、L76A、L76C、L76D、L76E、L76F、L76G、L76I、L76K、L76M、L76N、L76P、L76Q、L76R、L76T、L76V、L76W、R77A、R77C、R77D、R77E、R77F、R77G、R77H、R77N、R77S、R77V、R77W、G78A、G78C、G78D、G78E、G78N、G78P、G78Q、G78Y、F79P、F79Q、F79S、F79V、P81E、P81W、T84D、T84E、T84G、T84H、T84K、T84L、T84N、T84Q、T84R、T84W、T84Y、E85F、E85P、Q86A、T87F、L88A、L88E、L88G、L88H、L88Q、L88S、L88W、L88Y、R89P、Q90P、Q90W、I91E、I91L、I91M、I91N、I91Q、I91S、I91Y、L92C、L92E、L92G、L92H、L92N、L92Q、L92R、L92S、L92Y、Q93P、D94P、D94V、V95A、V95C、V95D、V95E、V95F、V95I、V95P、V95Q、V95W、V95Y、K96P、A97C、A97P、N99D、A100Q、A100Y、P102E、P102G、P102H、P102L、P102R、P102V、P102W、L103C、L103E、L103I、L103K、L103N、L103R、L103S、L103T、L103V、L104A、L104C、L104E、L104G、L104I、L104N、L104P、L104Q、L104S、L104W、L104Y、M105A、M105C、M105E、M105F、M105G、M105K、M105L、M105P、M105T、M105W、Q106D、Q106G、Q106H、Q106L、Q106W、I107A、I107E、I107F、I107G、I107K、I107L、I107Q、I107S、I107T、I107Y、R108A、R108C、R108D、R108E、R108F、R108G、R108H、R108I、R108L、R108M、R108S、R108V、R108Y、L109C、L109F、L109G、L109K、L109Q、L109R、L109T、L109V、L109Y、P110A、P110C、P110D、P110E、P110F、P110G、P110H、P110K、P110L、P110M、P110N、P110R、P110S、P110V、P110W、A111C、A111L、A111P、A111Q、A111R、A111V、N112I、N112L、N112P、N112Y、Y113D、Y113E、Y113Q、G114A、R115W、Y117D、Y117G、Y117P、N118F、E119C、E119L、A120P、F121A、F121C、F121D、F121E、F121G、F121K、F121L、F121N、F121P、F121Q、F121R、F121S、F121V、F121W、F121Y、S122D、S122E、S122L、S122P、I124D、I124E、I124G、I124H、I124K、I124R、I124W、I124Y、Y125C、Y125G、Y125H、Y125I、Y125L、Y125P、Y125Q、Y125R、Y125S、Y125T、Y125V、K127A、L128E、L128F、L128G、L128K、L128Q、L128R、L128S、L128W、A129D、A129F、A129L、A129W、A129Y、K130P、K130V、E131A、E131C、E131D、E131P、E131V、F132P、D133C、V134C、V134D、V134N、V134P、V134W、L136A、L136D、L136E、L136G、L136N、L136P、L136T、L137D、L137E、L137G、L137H、L137K、L137P、L137Q、L137R、L137S、P138G、P138N、P138V、F139A、F139C、F139D、F139E、F139G、F139H、F139M、F139N、F139S、F139T、F139V、F139W、F140A、F140C、F140G、F140I、F140L、F140M、F140N、F140P、F140S、F140T、F140V、F140W、M141C、M141D、M141E、M141F、M141G、M141K、M141L、M141P、M141Q、M141R、M141T、M141W、M141Y、E142A、E142C、E142G、E142I、E142L、E142M、E142P、E142Q、E142R、E142T、E142V、E143A、E143D、E143F、E143G、E143I、E143M、E143P、E143W、V144A、V144D、V144E、V144G、V144H、V144N、V144P、V144Q、V144R、V144S、Y145Q、Y145W、L146C、L146P、W150P、W150R、M151A、M151C、M151D、M151E、M151F、M151G、M151I、M151L、M151Q、M151R、M151S、M151T、M151V、M151W、Q152P、D153A、D153E、D153F、D154A、D154C、D154E、D154F、D154G、D154H、D154I、D154K、D154L、D154M、D154N、D154P、D154R、D154S、D154T、D154V、D154W、G155A、G155P、G155V、I156A、I156C、I156E、I156F、I156G、I156K、I156M、I156Q、I156R、I156S、I156T、I156Y、H157C、H157E、P158F、P158H、P158I、P158L、P158Q、P158V、P158W、N159P、N159W、A162K、A162L、A162N、A162R、A162Y、Q163A、Q163D、Q163E、Q163F、Q163I、Q163V、Q163W、Q163Y、F165L、I166A、I166F、I166M、I166S、I166Y、A167C、A167D、A167E、A167F、A167L、A167N、A167R、A167V、A167W、A167Y、D168M、D168R、M170E、M170F、M170G、M170N、M170S、M170T、A171S、Q173D、Q173P、L174A、L174G、L174S、L174T、L174W、L174Y、Q175F、P176L、P176Y、L177F、L177M、L177S、D181C、D181E和/或D181G，其中取代突变命名中的数字是指SEQIDNO:31的氨基酸位置。示例性的短链脂肪酸衍生物是C₁₂脂肪酸衍生物。可选的短链脂肪酸衍生物是C₁₄脂肪酸衍生物。在某些情况下，短链脂肪酸衍生物收率比例或收率百分比的降低可与长链脂肪酸衍生物收率比例的增加有关。可以在体外或体内检测短链脂肪酸衍生物收率比例或收率百分比的降低和/或长链脂肪酸衍生物收率比例的相应增加。优选在体内检测短链脂肪酸衍生物收率比例的降低或长链脂肪酸衍生物收率比例的相应增加。

在本发明的一个实施方案中，提供了编码本发明突变硫酯酶(或其天然存在的等同物)的多核苷酸(或基因)。在本发明的另一个实施方案中，提供了包含本发明多核苷酸(或基因)的载体。

在本发明的一个实施方案中，编码前体硫酯酶的基因可与‘tesA或其直系同源物、旁系同源物或同源物的多核苷酸序列选择性地杂交。图56列出了与‘TesA具有至少40％的氨基酸序列同一性的‘TesA蛋白同源物的GenBank登录号。前体硫酯酶可以由在中等严紧性、高严紧性或最大严紧性条件下进行选择性地杂交的多核苷酸编码。

在本发明的一个实施方案中，提供了编码前体硫酯酶的多核苷酸，其中所述前体硫酯酶包含‘TesA的氨基酸序列、其直系同源物、旁系同源物或同源物。例如，前体硫酯酶包含获自大肠杆菌(例如大肠杆菌K12)的‘TesA的氨基酸序列。在具体的实施方案中，提供了编码前体硫酯酶的多核苷酸，其中所述前体硫酯酶包含图58的SEQIDNO:31的氨基酸序列、变体或片段。在具体的实施方案中，编码前体硫酯酶的基因包含图59的SEQIDNO:32的多核苷酸序列或其片段。

在本发明的一个实施方案中，提供了编码前体硫酯酶的多核苷酸，其中所述前体硫酯酶包含与图58的SEQIDNO:31序列具有至少约20％，例如，至少约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的蛋白。在一个实施方案中，提供了编码前体硫酯酶的多核苷酸，其中所述前体硫酯酶包含与大肠杆菌K12‘TesA的序列具有至少约20％，例如，至少约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的蛋白。在本发明的一个实施方案中，提供了多核苷酸，所述多核苷酸包含与图59的SEQIDNO:32具有至少约20％，例如，至少约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的序列。

在本发明的一个实施方案中，提供了包含编码突变硫酯酶或其天然存在的等同物的基因(或多核苷酸)的载体。可以将本发明的载体转化入合适的宿主细胞从而产生重组宿主细胞。

在本发明的一个实施方案中，提供了包含长度为约4-约150个核苷酸的多核苷酸的探针，其与图59的SEQIDNO:32的对应片段基本相同，其中所述探针用于检测和/或鉴定编码具有硫酯酶活性的酶的多核苷酸序列。本发明的探针可用于从不了解是否产生前体硫酯酶的来源检测和分离潜在的前体硫酯酶或检测和分离氨基酸或核酸序列未知的潜在的前体硫酯酶。

在本发明的某些实施方案中，提供了重组宿主细胞，其包含编码突变硫酯酶或其天然存在的等同物的多核苷酸。在一个实施方案中，已知的基因组改变或修饰技术可以用于改变或修饰宿主细胞的内源硫酯酶，实现一个或多个上述突变，使得至少一种突变内源硫酯酶具有至少一种改变的性质。在另一个实施方案中，将重组宿主细胞进行工程化使其包含质粒，所述质粒含有编码突变硫酯酶或其天然存在的等同物的多核苷酸。在另一个实施方案中，在将编码硫酯酶的多核苷酸整合进宿主细胞的染色体中之后，重组宿主细胞表达硫酯酶。

在本发明的一个实施方案中，本发明的重组宿主细胞可以选自能表达重组基因构建体的任何细胞，并且可以选自微生物、植物或动物细胞。在具体的实施方案中，宿主细胞是细菌、蓝细菌、真菌、酵母、藻类、人或哺乳动物来源。在具体的实施方案中，宿主细胞选自任何革兰氏阳性细菌，例如放线菌属(Actinomycetes)；芽孢杆菌科(Bacillaceae)，包括嗜碱芽孢杆菌(Bacillusalkalophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、迟缓枯草芽孢杆菌(Bacilluslentus)、短芽孢杆菌(Bacillusbrevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、凝固芽孢杆菌(BacillusCoagulans)、环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)、灿烂芽孢杆菌(Bacilluslautus)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)；短杆菌(Brevibacteriasp.)，包括黄色短杆菌(Brevibacteriumflavum)、乳发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentum)、产氨短杆菌(Brevibacteriumammoniagenes)、Brevibacteriumbutanicum、叉开短杆菌(Brevibacteriumdivaricatum)、希氏短杆菌(Brevibacteriumhealii)、酮戊二酸短杆菌(Brevibacteriumketoglutamicum)、降酮短杆菌(Brevibacteriumketosoreductum)、乳发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentum)、扩展短杆菌(Brevibacteriumlinens)、(Brevibacteriumparaffinolyticum)；棒杆菌(Corynebacteriumspp.)，例如谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)和栖糖蜜棒杆菌(C.melassecola)、力士棒杆菌(Corynebacteriumherculis)、百合花棒杆菌(Corynebacteriumlilium)、嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebactertiumacetoacidophilum)、醋谷棒杆菌(Corynebacteriumacetoglutamicum)、嗜乙酰棒杆菌(Corynebacteriumacetophilum)、产氨棒杆菌(Corynebacteriumammoniagenes)、Corynebacteriumfujiokense、Corynebacteriumnitrilophilus；或者乳酸菌包括诸如乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)的乳球菌(Lactococcusspp.)；乳杆菌(Lactobacillusspp.)包括路氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)；明串珠菌(Leuconostocspp.)；片球菌(Pediococcusspp.)；沙雷氏菌(Serratiaspp.)，例如粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)；链霉菌(Streptomyces)，例如浅青紫链霉菌(Streptomyceslividans)、鼠灰链霉菌(Streptomycesmurinus)、天蓝色链霉菌(S.coelicolor)和链球菌(Streptococcusspp.)。可选地，属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的革兰氏阴性细菌菌株包括大肠杆菌、纤维单胞菌；或者属于假单胞菌科(Pseudomonadaceae)的革兰氏阴性细菌菌株包括铜绿假单胞菌、产碱假单胞菌(Pseudomonasalcaligenes)、荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌、丁香假单胞菌和洋葱伯克氏菌Burkholderiacepacia、沙门氏菌(Salmonellasp.)、寡养单胞菌(Stenotrophomonasspp.)和嗜麦芽糖寡养单胞菌。也可以使用产油微生物，诸如混浊红球菌(Rhodococcusopacus)的红球菌(Rhodococcusspp)、雷尔氏菌(Ralstoniaspp.)和(Acetinobacterspp.)。此外，酵母和和丝状真菌菌株可以是可用的宿主细胞，包括犁头霉菌(Absidiaspp.)；支顶孢(Acremoniumspp.)；落叶松蕈(Agaricusspp.)；厌氧真菌(Anaeromycesspp.)；曲霉菌(Aspergillusspp.)，包括棘孢曲霉(A.aculeatus)、泡盛曲霉(A.awamori)、黄曲霉(A.flavus)、臭曲霉(A.foetidus)、丁稀二酸青霉(A.fumaricus)、烟曲霉(A.fumigatus)、构巢曲霉(A.nidulans)、黑曲霉(A.niger)、米曲霉(A.oryzae)、土曲霉(A.terreus)；塔宾曲霉(A.tubingensis)和杂色曲霉(A.versicolor)；Aeurobasidiumspp.；顶孢头孢霉(Cephalosporumspp.)；毛壳霉(Chaetomiumspp.)；鬼伞菌(Coprinusspp.)；Dactyllumspp.；镰刀菌(Fusariumspp.)，包括(F.conglomerans)、多隔镰刀菌(F.decemcellulare)、爪哇镰刀菌(F.javanicum)、亚麻镰刀菌(F.lini)、尖孢镰刀菌(F.oxysporum)和茄病镰刀菌(F.solani)；粘帚霉Gliocladiumspp.)；克鲁维酵母菌(Kluyveromycessp.)；汉逊酵母(Hansenulasp.)；腐质霉(Humicolaspp.)，包括特异腐质霉(H.insolens)和绵毛状腐质菌(H.lanuginose)；肉座菌(Hypocreaspp.)；毛霉菌(Mucorspp.)；脉胞菌(Neurosporaspp.)，包括粗糙脉孢菌(N.crassa)和好食脉孢菌(N.sitophila)；Neocallimastixspp.；瘤胃真菌(Orpinomycesspp.)；青霉菌(Penicilliumspp.)；平革菌(Phanerochaetespp.)；Phlebiaspp.；毕赤酵母(Pichiasp.)；Piromycesspp.；根霉菌(Rhizopusspp.)；根毛菌(Rhizomucor)例如米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)；裂褶菌(Schizophyllumspp.)；裂殖酵母(Schizosaccharomyces)例如粟酒裂殖酵母(S.pombe)；chytalidiumsp.、Sulpholobussp.、热源体(Thermoplasmasp.)、高温霉(Thermomycessp.)；栓菌(Trametesspp.)；木霉(Trichodermaspp.)，包括里氏木霉(T.reesei)、长枝木霉(longibrachiatum)和绿色木霉(T.viride)；Yarrowiniasp.和接霉(Zygorhynchusspp.)，并且特别包括产油酵母如法夫酵母(Phafiaspp.)、圆红冬孢酵母菌(Rhorosporidiumtoruloides)Y4、粘红酵母(RhodotorulaGlutinis)和假丝酵母(Candida)107。

在本发明的一个实施方案中，提供了重组宿主细胞，其表达或过表达编码突变硫酯酶(或其天然存在的等同物)的基因，并且其还表达(或过表达)编码一种或多种酶的一种或多种基因，所述一种或多种酶利用突变硫酯酶的反应产物(例如脂肪酸、脂酰辅酶A、脂酰磷酸酯、脂肪醛、脂肪酯或脂肪醇)或新陈代谢途径的部分中的一种或多种其它酶的反应产物作为底物，包括利用突变硫酯酶的反应产物(例如脂肪酸)作为前体和/或底物。

在本发明的一个实施方案中，提供了重组宿主细胞，其表达或过表达编码突变硫酯酶(或其天然存在的等同物)的基因，并且其还表达(或过表达)编码一种或多种酶的一种或多种基因，所述一种或多种酶与在脂肪酸生物合成途径中必需作为反应前体的底物发生反应。在具体的实施方案中，重组宿主细胞包含编码硫酯酶的基因和编码与在脂肪酸生物合成途径中必需作为反应前体的底物发生反应的酶的基因，包括选自pdh、panK、aceEF、fabH、fabD、fabG、acpP和/或fabF的基因的过表达或修饰。

在本发明的一个实施方案中，重组宿主细胞包含编码突变硫酯酶(或其天然存在的等同物)的基因(或多核苷酸)，并且还包含降低碳流通的基因的减弱或缺失、或与脂肪酸生物合成途径中的底物、辅助因子或能量需求竞争的基因。在具体的实施方案中，减弱的基因包括fadE、gpsA、ldhA、pflB、adhE、pta、poxB、ackA、ackB、plsB和/或sfa中的至少一个。

在本发明的一个实施方案中，重组宿主细胞包含编码突变硫酯酶(或其天然存在的等同物)的基因(或多核苷酸)和编码至少一种脂肪酸衍生物酶的异源引入的外源基因。在某些实施方案中，外源基因或多核苷酸编码例如酰基辅酶A合酶、酯合酶、醇酰基转移酶、醇脱氢酶、酰基辅酶A还原酶、脂肪醇形成酰基辅酶A还原酶、羧酸还原酶、脱羧酶、醛还原酶、脂肪醇乙酰转移酶、酰基缩合酶、氨基转移酶或脱羰基酶。

在本发明的一个实施方案中，重组宿主细胞包含编码突变硫酯酶(或其天然存在的等同物)的基因和至少两种编码脂肪酸衍生物酶的异源引入的外源基因。在某些实施方案中，外源基因或多核苷酸编码例如酰基辅酶A合酶、酯合酶、醇酰基转移酶、醇脱氢酶、脂酰辅酶A还原酶、脂肪醇形成酰基辅酶A还原酶、羧酸还原酶、脱羧酶、醛还原酶、脂肪醇乙酰转移酶、酰基缩合酶、氨基转移酶或脱羰基酶。

在本发明优选的实施方案中，过表达了编码突变硫酯酶(或其天然存在的等同物)和/或脂肪酸衍生物酶的基因，所述脂肪酸衍生物酶例如酰基辅酶A合酶、酯合酶、醇酰基转移酶、醇脱氢酶、脂酰辅酶A还原酶、脂肪醇形成酰基辅酶A还原酶、羧酸还原酶、脱羧酶、醛还原酶、脂肪醇乙酰转移酶、酰基缩合酶、醇酰基转移酶、氨基转移酶、其它硫酯酶或脱羰基酶。

在本发明的一个实施方案中，将重组宿主细胞中编码突变硫酯酶(或其天然存在的等同物)的基因、编码脂肪酸衍生物酶的基因和/或其它重组表达的基因进行修饰，从而优化重组宿主细胞中至少一种密码子的表达。

在本发明的一个实施方案中，重组宿主细胞包含至少一种编码突变硫酯酶(或其天然存在的等同物)的基因和编码酰基辅酶A合酶的基因。酰基辅酶A合酶可以是fadD、fadK、BH3103、yhfL、Pfl-4354、EAV15023、fadD1、fadD2、RPC_4074、fadDD35、fadDD22、faa3p或编码蛋白ZP_01644857的基因中的任何一个。酰基辅酶A合酶基因的其它实例包括来自结核分枝杆菌(M.tuberculosis)HR7Rv的fadDD35[NP_217021]、来自枯草芽孢杆菌(B.subtilis)的yhfL[NP_388908]、来自铜绿假单胞杆菌(P.aeruginosa)PAO1的fadD1[NP_251989]、编码来自嗜麦芽糖寡养单胞菌R551-3的蛋白ZP_01644857的基因或来自酿酒酵母的faa3p[NP_012257]。

在本发明的一个实施方案中，提供了重组宿主细胞，其包含至少一种编码突变硫酯酶(或其天然存在的等同物)的基因或多核苷酸和编码酯合酶的基因或多核苷酸，所述编码酯合酶的基因或多核苷酸例如获自不动杆菌(Acinetobacterspp.)、博克岛食烷菌(Alcanivoraxborkumensis)、拟南芥(Arabidopsisthaliana)、酿酒酵母、智人(Homosapiens)、加州希蒙得木(Simmondsiachinensis)、高山被孢霉(Mortierellaalpine)、弯曲隐球菌(Cryptococcuscurvatus)、Alcanivoraxjadensis、博克岛食烷菌、不动杆菌HOl-N或混浊红球菌(Rhodococcusopacus)的酯合酶基因。酯合酶基因的实例包括wax/dgat，其编码来自加州希蒙得木、不动杆菌菌株ADP1、博克岛食烷菌、铜绿假单胞菌、Fundibacterjadensis、拟南芥或真养产碱杆菌(Alkaligeneseutrophus)的双功能酯合酶/酰基辅酶A:二酰甘油酰基转移酶。在优选的实施方案中，将编码酯合酶的基因过表达。

在本发明的一个实施方案中，重组宿主细胞包含至少一种编码脂肪醛生物合成酶的基因。脂肪醛生物合成基因可以是，例如具有图32和33中列出的多核苷酸序列和/或多肽基序的羧酸还原酶基因(例如car基因)或其变体。在某些情况下，脂肪醛生物合成基因编码图33所示氨基酸基序中的一种或多种。

在本发明的一个实施方案中，重组宿主细胞包含至少一种脂肪醇产生基因。脂肪醇产生基因包括例如acr1。脂肪醇生成基因在例如PCT公开第2008/119082号和第2007/136762号中描述，通过引用将上述公开并入本文。

在本发明的一个实施方案中，重组宿主细胞包含编码突变硫酯酶(或其天然存在的等同物)的基因和编码至少一种烯烃产生基因的基因。所述基因可以是端烯烃产生基因或内烯烃产生基因。作为端烯烃产生基因的实例，在PCT公开第2009/085278号中描述的那些基因(包括orf880)是合适的。作为内烯烃产生基因的实例，在PCT公开第2008/147781A2号中描述的那些基因是合适的。通过引用将PCT公开第2009/085278号和第2008/147781A2号的公开内容并入本文。

在本发明的一个实施方案中，提供了重组宿主细胞，其包含至少一种编码突变硫酯酶(或其天然存在的等同物)的基因或多核苷酸，以及下述中的至少一种：(a)减弱的编码脂肪酸衍生物酶的基因或多核苷酸和(b)减弱的编码酰基辅酶A脱氢酶的基因或多核苷酸。优选地，减弱的或缺失的编码脂肪酸衍生物酶的基因对宿主细胞是内源性的，例如，编码酰基辅酶A合酶、酯合酶、醇酰基转移酶、醇脱氢酶、脂酰辅酶A还原酶、羧酸还原酶、脱羰基酶、脂肪醇乙酰转移酶、脂肪酸脱羧酶或脂肪醇形成酰基辅酶A还原酶。在一个实施方案中，减弱的基因编码酰基辅酶A合酶或酯合酶。

在本发明的一个实施方案中，提供了重组宿主细胞，其在一定条件下表达或优选过表达硫酯酶，使得能通过该硫酯酶从酰基ACP或酰基辅酶A直接合成脂肪酯，例如脂肪酸甲酯(FAME)和脂肪酸乙酯(FAEE)。在该实施方案中，硫酯酶将酰基ACP或酰基辅酶A直接转化为脂肪酯，而无需表达脂酰辅酶A合酶或酯合酶来产生脂肪酯。然而，尽管不必要表达或过表达脂酰辅酶A合酶或酯合酶，但是这些酶可用于增加产物收率。在该实施方案中，硫酯酶可以是任何的内源硫酯酶、异源表达的硫酯酶、突变硫酯酶或其天然存在的等同物。

在本发明的一个实施方案中，重组宿主细胞具有缺失的或减弱的编码酰基辅酶A脱氢酶的内源基因。

在本发明的一个实施方案中，提供了在允许一种或多种硫酯酶表达或过表达的条件下培养本发明的重组宿主细胞的方法，所述一种或多种硫酯酶可以选自内源硫酯酶、异源表达的硫酯酶、突变硫酯酶(或其天然存在的等同物)或这些硫酯酶的组合。在具体的实施方案中，在收获和/或裂解宿主细胞之后，可以回收表达或过表达的硫酯酶，且更优选地所述硫酯酶是基本上纯化的。

在本发明的一个实施方案中，提供了在允许产生脂肪酸衍生物的条件下培养本发明的重组宿主细胞的方法。在优选的实施方案中，可以回收脂肪酸衍生物，且更优选地脂肪酸衍生物是基本上纯化的。在特别优选的实施方案中，通过离心将脂肪酸衍生物组合物从培养过程中产生的其它组分中基本上纯化出来。

在本发明的一方面中，提供了产生脂肪酸衍生物的方法，所述方法包括在适于确保突变硫酯酶(或其天然存在的等同物)的表达或过表达的条件下培养本发明的重组宿主细胞并回收产生的脂肪酸衍生物。

在一个实施方案中，提供了在细胞外产生脂肪酸衍生物的体外方法，所述方法包括在适于硫酯酶(包括例如，内源硫酯酶、异源表达的硫酯酶、突变硫酯酶或其天然存在的等同物)的表达或过表达的条件下培养重组宿主细胞、收获细胞以及裂解细胞，以便可以回收产生的硫酯酶并将其用于体外产生脂肪酸衍生物。在示例性的实施方案中，硫酯酶是基本上纯化的。在另一个示例性的实施方案中，没有从细胞裂解物中纯化硫酯酶。然后，在允许脂肪酸衍生物的细胞外产生的条件下将纯化的硫酯酶或包含这种酶的细胞裂解物置于合适的硫酯酶底物。将底物引向酶的技术是本领域内公知的。非限制性实例是将溶液形式的底物加至酶溶液或细胞裂解物，并允许混合物进行孵育。另一个非限制性实例涉及通过以下方式孵育底物和酶溶液或细胞裂解物：将底物或酶附着于固体介质(例如珠、树脂、板等)，并以允许底物和酶充分接触的速度分别使酶溶液/裂解物或底物通过所述固体介质。

在本发明的另一个实施方案中，提供了产生脂肪酸衍生物的方法，所述方法包括在适于确保硫酯酶(包括例如，内源硫酯酶、异源表达的硫酯酶、突变硫酯酶或其天然存在的等同物)的表达的条件下培养重组宿主细胞，并回收分泌的或释放到细胞外的脂肪酸衍生物。因此，例如从培养宿主细胞的发酵液的上清液中回收脂肪酸衍生物产物。

在本发明的一个实施方案中，提供了细胞外获得脂肪酸衍生物组合物的方法，所述方法是通过在允许产生脂肪酸衍生物的条件下，培养已用编码硫酯酶(包括例如，内源硫酯酶、异源硫酯酶、突变硫酯酶或其天然存在的等同物)的多核苷酸转化的重组宿主细胞，所述脂肪酸衍生物的大部分或少部分被分泌出或释放到细胞外，以及回收产生的脂肪酸衍生物。在示例性的实施方案中，脂肪酸衍生物是在细胞内产生的，但是其一部分被宿主细胞释放出来。因此，所述方法还包括收获细胞、裂解细胞和回收脂肪酸衍生物。

在本发明的一个实施方案中，提供了产生脂肪酸衍生物的方法，其中重组宿主细胞在允许通过硫酯酶从酰基ACP或酰基辅酶A合成脂肪酯的条件下表达或优选过表达硫酯酶，在允许这种脂肪酯直接产生的条件下培养所述重组宿主细胞。

在本发明的一个实施方案中，提供了产生脂肪酸衍生物的方法，所述方法包括：利用合适的基因组改变技术来修饰宿主细胞的一种或多种内源硫酯酶，使得所述内源硫酯酶与内源硫酯酶前体相比包含一个或多个突变并具有一种或多种改变的性质；在适于所述宿主细胞表达或过表达所述突变硫酯酶的条件下培养所述宿主细胞；以及回收脂肪酸衍生物。在示例性的实施方案中，产生的脂肪酸衍生物可以分泌到或释放到细胞外，以便可从例如培养宿主细胞的发酵液的上清液中回收脂肪酸衍生物。

在本发明的一个实施方案中，提供了产生脂肪酸衍生物的方法，所述方法包括：用编码突变硫酯酶(或其天然存在的等同物)的多核苷酸序列转化宿主细胞，使得所述宿主细胞中脂肪酸衍生物的产生相对于未用突变硫酯酶基因(或其天然存在的等同物)转化的细胞发生了改变。

在本发明的一个实施方案中，提供了产生脂肪酸衍生物的方法，所述方法包括：提供包含编码突变硫酯酶(或其天然存在的等同物)的基因的多核苷酸序列；在允许所述多核苷酸序列被合并入所述细胞的染色体中并允许所述基因在所述宿主细胞中表达的条件下，用所述多核苷酸序列转化合适的宿主细胞；在适于所述宿主细胞表达所述基因并产生突变硫酯酶蛋白(或其天然存在的等同物)的条件下，培养所述转化的宿主细胞；以及回收脂肪酸衍生物。

在任何上述实施方案中，与不存在突变硫酯酶(或其天然存在的等同物)时同一宿主细胞中某碳链长度的脂肪酸衍生物的收率相比，可以回收到更高的收率比例的该碳链长度的衍生物。在具体的实施方案中，以升高的或降低的收率回收的脂肪酸衍生物包括主链长度为C₆、C₇、C₈、C₉、C₁₀、C₁₁、C₁₂、C₁₃、C₁₄、C₁₅、C₁₆、C₁₇、C₁₈、C₁₉、C₂₀、C₂₁、C₂₂、C₂₃、C₂₄、C₂₅、C₂₆、C₂₈、C₂₉、C₃₀、C₃₁、C₃₂、C₃₃、C₃₄、C₃₅、C₃₆、C₃₇、C₃₈或C₃₉的脂酰链。以组合物中升高的或降低的收率回收的脂肪酸衍生物可以选自所有类型的脂肪酸衍生物，包括例如，烃、脂肪酸、脂肪酯、脂肪醛、脂肪醇端烯烃、内烯烃、烷、二醇、脂肪胺、二羧酸或酮或以上的组合。

可选地，在任何上述实施方案中，与不存在突变硫酯酶(或其天然存在的等同物)时同一宿主细胞中特定脂肪酸衍生物的收率比例或收率百分比相比，所产生的这种特定脂肪酸衍生物相对于其它脂肪酸衍生物的收率比例或收率百分比可以升高或降低。在具体的实施方案中，以升高的收率比例或收率百分比产生的脂肪酸衍生物是脂肪酯。在另一个实施方案中，以降低的收率比例或收率百分比产生的脂肪酸衍生物是脂肪酯。

可选地，在任何上述实施方案中，产生的脂肪酸衍生物中短链(例如C₈、C₉、C₁₀、C₁₁、C₁₂、C₁₃或C₁₄)产物的收率或收率比例可以提高。相反，在任何上述实施方案中，产生的脂肪酸衍生物中短链(例如C₈、C₉、C₁₀、C₁₁、C₁₂、C₁₃或C₁₄)产物的收率或收率比例可以降低。

在本发明的一个实施方案中，提供了产生脂肪酸衍生物的方法，其中由本发明方法产生的脂肪酸衍生物的收率为每克碳源至少约0.001g脂肪酸衍生物产物，例如，每克碳源至少约0.01g脂肪酸衍生物产物、每克碳源约0.1g脂肪酸衍生物产物、每克碳源约0.2g脂肪酸衍生物产物、每克碳源约约0.3g脂肪酸衍生物产物、每克碳源约0.4g脂肪酸衍生物产物或每克碳源约0.45g脂肪酸衍生物产物。

在本发明的一个实施方案中，提供了产生脂肪酸衍生物的方法，其中所述方法产生的滴度为至少约0.5g/L，例如，至少约1g/L、2g/L、5g/L、10g/L、20g/L、30g/L、40g/L、50g/L、75g/L、100g/L、150g/L或200g/L。

在本发明的一个实施方案中，提供了产生脂肪酸衍生物的方法，其中所述方法的生产率是至少约0.1g/L.h，例如，至少约0.5g/L.h、1g/L.h、2g/L.h、3g/L.h、4g/L.h、5g/L.h、6g/L.h、7g/L.h或8g/L.h。

在本发明的一个实施方案中，提供了由本发明的宿主细胞产生的脂肪酸衍生物组合物。这类组合物可以包括烃、酯、醇、酮、醛、脂肪酸、二羧酸、内烯烃、端烯烃和/或以上的组合。这类组合物可用于化工产业中，例如用于生产表面活性剂和去垢剂，或用作生物燃料和用作石油、民用燃料油、煤油、柴油、喷气燃料(jetfuel)或汽油的替代品。

在本发明的一个实施方案中，提供的脂肪酸衍生物组合物包含：小于或等于约50ppm的砷，约30ppm、约25ppm或约10-约50ppm的砷；小于或等于约200ppm的钙，约150ppm的钙、约119ppm的钙或约50-约200ppm的钙；小于或等于约200ppm的氯，约150ppm的氯、约119ppm的氯或约50-约200ppm的氯；小于或等于约50ppm的铜，约30ppm的铜、约23ppm的铜或约10-约50ppm的铜；小于或等于约300ppm的铁，约200ppm的铁、约136ppm的铁或约50-约250ppm的铁；小于或等于约50ppm的铅，约30ppm的铅、约25ppm的铅或约10-约50ppm的铅；小于或等于约50ppm的锰，约30ppm的锰、约23ppm的锰或约10-约50ppm的锰；小于或等于约50ppm的镁，约30ppm的镁、约23ppm的镁或约10-约50ppm的镁；小于或等于约0.5ppm的汞，约0.1ppm的汞、约0.06ppm的汞或约0.01-约0.2ppm的汞；小于或等于约50ppm的钼，约30ppm的钼、约23ppm的钼或约10-约50ppm的钼；小于或等于约2％的氮，约1％的氮、约0.5％的氮或约0.1-1％的氮；小于或等于约200ppm的钾，约150ppm的钾、约103ppm的钾或约50-约200ppm的钾；小于或等于约300ppm的钠，200ppm的钠、约140ppm的钠或约50-约300ppm的钠；小于或等于约1ppm的硫、小于或等于约1％的硫、约0.14％的硫或约0.05-约0.3％的硫；小于或等于约50ppm的锌，约30ppm的锌、约23ppm的锌或约10-约50ppm的锌；或小于或等于约700ppm的磷，约500ppm的磷、约350ppm的磷或约100-约700ppm的磷。

在本发明的一个实施方案中，提供了现代碳分数(fractionofmoderncarbon)为约1.003到约1.5的脂肪酸衍生物。

在本发明的一个实施方案中，提供了脂肪酸衍生物组合物，其中所述组合物包括包含酰基基团的组分，所述酰基基团在碳链中从其还原末端的7位处(碳链上第7号碳和碳链上第8号碳之间)具有双键。

在具体的实施方案中，脂肪酸衍生物组合物包括C₅-C₂₅(即5-25个碳的碳链长度)脂肪酯、C₅-C₂₅脂肪酸、C₅-C₂₅脂肪醛、C₅-C₂₅脂肪醇；或C₁₀-C₂₀(即10-20个碳的碳链长度)脂肪酯、C₁₀-C₂₀脂肪酸、C₁₀-C₂₀脂肪醛、C₁₀-C₂₀脂肪醇；或C₁₂-C₁₈(即12-18个碳的碳链长度)脂肪酯、C₁₂-C₁₈脂肪酸、C₁₂-C₁₈脂肪醛、C₁₂-C₁₈脂肪醇。

在具体的实施方案中，本发明的脂肪酸衍生物包括直链脂肪酸衍生物、支链脂肪酸衍生物和/或环状部分。在具体的实施方案中，脂肪酸衍生物是不饱和的(例如单不饱和的)或饱和的。

在本发明的一个实施方案中，组合物包含由醇和酰基辅酶A产生的脂肪酯，其中所述醇的长度为至少约1个碳，例如，至少约2个、约3个、约4个、约5个、约6个、约7个、约8个、约10个、约12个、约14个、约16个或约18个碳，酰基辅酶A的长度为至少约2个碳，例如，至少约4个、约6个、约8个、约10个、约12个、约14个、约16个、约18个、约20个、约22个、约24个或约26个碳。在某些实施方案中，产生脂肪酯的醇和酰基辅酶A相差约2个、约4个、约6个、约8个、约10个、约12个或约14个碳原子。

在另一个实施方案中，脂肪酸衍生物组合物包含由醇和酰基ACP产生的脂肪酯，其中所述醇的长度为至少约1个，例如，至少约2个、约3个、约4个、约5个、约6个、约7个、约8个、约10个、约12个、约14个、约16个或约18个碳，所述酰基ACP的长度为至少约2个，例如，约4个、约6个、约8个、约10个、约12个、约14个、约16个、约18个、约20个、约22个、约24个或约26个碳。在某些实施方案中，产生脂肪酯的醇和酰基ACP相差约2、约4、约6、约8、约10、约12或约14个碳原子。

在本发明的一个实施方案中，脂肪酸衍生物组合物包含衍生物的混合物，所述衍生物包括游离脂肪酸。在一个实施方案中，游离脂肪酸以重量计的百分比为至少约0.5％，例如，至少约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约15％、约20％或约25％。在某个实施方案中，产生的脂肪酯以重量计的百分比为至少约50％，例如，至少约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％或约90％。在另一个实施方案中，游离脂肪酸之外的脂肪酸衍生物与游离脂肪酸的重量比为大于约90:1，例如，大于约80:1、约50:1、约20:1、约10:1、约9:1、约8:1、约7:1、约5:1、约2:1或约1:1。

在一个实施方案中，脂肪酸衍生物组合物包含衍生物的混合物，所述衍生物包括游离脂肪酸。在一个实施方案中，游离脂肪酸以重量计的百分比为至少约50％，例如，至少约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％或约90％。在某个实施方案中，产生的脂肪酯以重量计的百分比为至少约0.5％，例如，至少约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％或约50％。在另一个实施方案中，游离脂肪酸之外的脂肪酸衍生物与游离脂肪酸的重量比为小于约60:1，例如，小于约50:1、约40:1、约30:1、约20:1、约10:1、约1:1、约1:2、约1:3、约1:5或约1:10。

在本发明的一个实施方案中，脂肪酸衍生物组合物包括选自以下的一种或多种脂肪酯：癸酸乙酯、十二烷酸乙酯、十三烷酸乙酯、十四烷酸乙酯、十五烷酸乙酯、顺式-9-十六烯酸乙酯、十六烷酸乙酯、十七烷酸乙酯、顺式-11-十八烯酸乙酯、十八烷酸乙酯、癸酸甲酯、十二烷酸甲酯、十三烷酸甲酯、十四烷酸甲酯、十五烷酸甲酯、顺式-9-十六烯酸甲酯,十六烷酸甲酯、十七烷酸甲酯、顺式-11-十八烯酸甲酯、十八烷酸甲酯或以上的组合。

在本发明的一个实施方案中，脂肪酸衍生物组合物包括选自以下的一种或多种游离脂肪酸：辛酸、癸酸、十二烷酸、十四烷酸、十五烷酸、顺式-9-十六烯酸、十六烷酸、顺式-11-十八烯酸或以上的组合。

包含本发明脂肪酸衍生物的组合物可用作燃料。例如，脂肪酸衍生物可用作生物柴油、脂肪醇、脂肪酯、三酸甘油脂、汽油、柴油或喷气燃料或用作以上的组分。汽油或生物柴油组合物可用在内燃发动机中。喷气燃料可用在喷气发动机中。因此，本文提供了包含按本公开制备的脂肪酸衍生物的燃料组合物。

包含本发明脂肪酸衍生物的组合物可用作燃料添加剂。例如，可以将它们加到基于石油的柴油或生物柴油中，从而提高其可再生的燃料含量、润滑性、运动粘性、酸值、沸点、氧化稳定性、冷滤点、杂质谱、硫酸盐粉水平、十六烷值、浊点或倾点。因此，还提供了包含按本公开制备的脂肪酸衍生物的燃料添加剂组合物。

包含本发明脂肪酸衍生物的组合物还可用作生物原油组合物，该生物原油组合物可作为制备其它石油衍生化合物的原料。例如，可将按本发明制备的长链烃、内烯烃或端烯烃、烷、脂肪醛和脂肪酯进一步加工以产生燃料、燃料添加剂、燃料混合物和/或化学品。因此，提供了包含按本公开制备的脂肪酸衍生物的生物原油组合物。

包含本发明脂肪酸衍生物的组合物可用作生产去垢剂和表面活性剂、营养补充剂、聚合物、石蜡替代品、润滑剂、溶剂、个人护理品、橡胶加工添加剂、腐蚀抑制剂、乳化剂、塑料、纺织品、美容用品、纸产品、涂料、金属加工液、电介质、润滑油和/或软化剂的原料。因此，还提供了包含按本公开制备的脂肪酸衍生物的原料组合物。

附图简要说明

图1是鉴定了可以被过表达或减弱而增加脂肪酸衍生物产生的各种基因的表格。这个表格还鉴定了可以被进行调节而改变脂肪酸衍生物产物结构的各种基因。这些基因中的某些用于改变脂肪酸衍生物结构的基因也能增加脂肪酸衍生物的产生。

图2是说明β氧化途径的图示，包括由以下酶催化的步骤：(1)酰基辅酶A合酶(EC6.2.1-)；(2)酰基辅酶A脱氢酶(EC1.3.99.3)；(3)烯酰辅酶A水合酶(EC4.2.1.17)；(4)3-羟丁酰辅酶A表异构酶(EC5.1.2.3)；和(5)3-酮脂酰-辅酶A硫解酶(EC2.3.1.16)。β氧化循环的最后反应释放乙酰辅酶A和缩短了两个碳的酰基辅酶A脂肪酸，然后可以再进行β氧化反应。

图3是说明FAS生物合成途径的图示。

图4是说明依靠所提供的底物产生脂肪酯的生物合成途径的图示。

图5是说明产生脂肪醇的生物合成途径的图示。

图6描述了用pCDFDuet-1-fadD-acr1和含有各种硫酯酶基因的质粒共转化的菌株的脂肪醇产生。鉴定了饱和的C₁₀、C₁₂、C₁₄、C₁₆和C₁₈脂肪醇。

图7描述了实施例3所述的菌株的脂肪醇产生，所述菌株是用pCDFDuet-1-fadD-acr1和含有各种硫酯酶基因的质粒进行了共转化。所述菌株在25℃或37℃下、在含0.4％葡萄糖的M9矿质培养基的烧瓶中有氧生长。检测细胞沉淀和上清液中的脂肪醇，表明这些醇在细胞外的大量产生。25℃下的培养导致约25％的产物从细胞释放，而37℃下的培养导致约50％的产物从细胞释放。

图8A-D描述了表达醇乙酰基转移酶(AATs,EC2.3.1.84)的生产宿主和表达酯合酶(EC2.3.1.20、2.3.1.75)的生产宿主产生的辛酸辛酯(C₈C₈)的GS-MS谱。图8A显示菌株C41(DE3,ΔfadE/pHZ1.43)/pRSETB+pAS004.114B)的乙酸乙酯提取物的GC-MS谱，其中pHZ1.43质粒表达ADP1酯合酶(EC2.3.1.20、EC2.3.1.75)。图8B显示菌株C41(DE3,ΔfadE/pHZ1.43)/pRSETB+pAS004.114B)的乙酸乙酯提取物的GC-MS谱，其中pHZ1.43质粒表达SAAT。图8C显示菌株C41(DE3,ΔfadE/pHZ1.43)/pRSETB+pAS004.114B)的乙酰乙酸酯提取物的GC-MS谱，其中pHZ1.43质粒不含有ADP1(酯合酶)或者SAAT。图8D显示C41(DE3,ΔfadE/pHZ1.43)/pRSETB+pAS004.114B)所产生的C₈C₈的质谱和裂分模式(fragmentationpattern)的GC-MS谱，其中pHZ1.43质粒表达SAAT。

图9显示当来自贝氏不动杆菌(A.baylyi)ADP1(WSadp1)的酯合酶与来自萼距花(Cupheahookeriana)的硫酯酶在生产宿主中共表达时，产生的乙酯的分布(按照实施例9)。

图10描述了各种酯合酶在25℃下乙酯的产生。所述乙酯由携带各种酯合酶基因的重组大肠杆菌菌株产生。重组菌株是(1)C41(DE3,ΔfadEΔfabR)/pETDuet-1-’TesA+pCDFDuet-1-fadD带有1pHZ1.43；(2)pHZ1.97_377；(3)pHZ1.97_atfA2；(4)pHZ1.97_376；(5)pHZ1.97_atfA1；以及(6)没有质粒(对照)。

图11描述了各种大肠杆菌菌株产生的脂肪酸乙酯(FAEE)的酰基组成。所述重组菌株是(1)C41(DE3,ΔfadEΔfabR)/pETDuet-1-’TesA+pCDFDuet-1-fadD带有1pHZ1.43；(2)pHZ1.97_377；(3)pHZ1.97_atfA2；(4)pHZ1.97_376；(5)pHZ1.97_atfA1；以及(6)没有质粒(对照)。

图12描述了各种酯合酶在37℃下乙酯的产生。乙酯由携带各种酯合酶基因的重组大肠杆菌菌株产生。所述重组菌株是(1)C41(DE3,ΔfadEΔfabR)/pETDuet-1-’TesA+pCDFDuet-1-fadD带有1pHZ1.43；(2)pHZ1.97_377；(3)pHZ1.97_atfA2；(4)pHZ1.97_376；(5)pHZ1.97_atfA1；以及(6)没有质粒(对照)。

图13描述了转化体C41(DE3,ΔfadEΔfabR)/pETDuet-1-’TesA+pCDFDuet-1-fadD+pHZ1.97_atfA2的三个单菌落产生的游离脂肪酸(FFA)和脂肪酸乙酯(FAEE)的浓度。FFA被转化为脂肪酸乙酯(FAEE)，并通过GC/MS定量。

图14描述了FabA(SEQIDNO:33)和FabB(SEQIDNO:34)的控制区。FadR和FabR共有结合位点用黑底白字显示。垂直箭头指示可以进行突变从而改变fabA表达的位置。括号还指出了每个位置所建议的碱基。构成典型大肠杆菌启动子的-35和-10区的两个区如括号所示。还显示了使启动子更接近于共有启动子序列的建议突变。

图15A-B是GC/MS分析的色谱图。图15A描述用质粒pCDFDuet-1-fadD-WSadp1,pETDuet-1-’TesA转化的大肠杆菌菌株LS9001的培养物的乙酸乙酯提取物组分的色谱图。图15B显示用作参照的十六烷酸乙酯和油酸乙酯的色谱图。

图16是pOP-80质粒的图谱。

图17是pOP-80质粒的全DNA序列(SEQIDNO:1)。

图18是大肠杆菌密码子优化的fadD35基因(GenBank登录号NP_217021)的DNA序列(SEQIDNO:2)。

图19是大肠杆菌密码子优化的fadD1基因(GenBank登录号NP_251989)的DNA序列(SEQIDNO:3)。

图20是基于以NCBIGenBank登录号NC_000964存有的DNA序列的BsyhfLBspHIF引物(SEQIDNO:4)。

图21是基于以NCBIGenBank登录号NC_000964存有的DNA序列的BsyhfLEcoR引物(SEQIDNO:5)。

图22是来自枯草芽孢杆菌的yhfL基因的DNA序列(SEQIDNO:6)。

图23是基于以NCBIGenBank登录号NC_001141存有的DNA序列的Scfaa3pPciF引物(SEQIDNO:7)。

图24是基于以NCBIGenBank登录号NC_001141存有的DNA序列的Scfaa3pPciI引物(SEQIDNO:8)。

图25是来自酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的faa3基因(GenBank登录号NP_012257)的DNA序列(SEQIDNO:9)。

图26是基于以NCBIGenBank登录号NZ_AAVZ01000044存有的DNA序列的Smprk59BspF引物(SEQIDNO:10)。

图27是基于以NCBIGenBank登录号NZ_AAVZ01000044存有的DNA序列的Smprk59HindR引物(SEQIDNO:11)。

图28是PrkBsp引物(SEQIDNO:12)。

图29是编码来自嗜麦芽糖寡养单胞菌R551-3的蛋白ZP_01644857的DNA序列(SEQIDNO:13)。

图30是来自嗜麦芽糖寡养单胞菌ATCC17679的ZP_01644857的蛋白序列(SEQIDNO:14)。

图31是脂肪醛产生的新途径的示意图。

图32是诺卡氏菌NRRL5646car基因的核苷酸序列(SEQIDNO:15)和对应的氨基酸序列(SEQIDNO:16)的列表。

图33是CAR同源物的氨基酸序列基序的列表。

图34A-B是分别由咸海鲜球菌(Jeotgalicoccussp.)ATCC8456细胞和耐盐咸海鲜球菌(Jeotgalicoccushalotolerans)DSMZ17274细胞所产生的烯烃的GC/MS追踪。

图35A-B是分别由鳍型咸海鲜球菌(Jeotgalicoccuspinnipedalis)DSMZ17030细胞和嗜冷咸海鲜球菌(Jeotgalicoccuspsychrophilus)DSMZ19085细胞所产生的烯烃的GC/MS追踪。

图36A-B是咸海鲜球菌ATCC8456细胞所产生的两种α-烯烃的质谱裂分模式。化合物A被鉴定为1-十九烯，化合物B被鉴定为18-甲基-1-十九烯。

图37是咸海鲜球菌ATCC8456的16srRNA的系统发生分析图。

图38A-B是给予二十烷酸(图38A)或硬脂酸(图38B)时咸海鲜球菌ATCC8456细胞所产生的α-烯烃的GC/MS追踪。

图39是咸海鲜球菌ATCC8456细胞的无细胞裂解物所产生的α-烯烃(1-十七烯)的GC/MS追踪，其中与没有C₁₈脂肪酸底物的无细胞裂解物的追踪和C₁₈脂肪酸底物本身的追踪进行比较。

图40是来自咸海鲜球菌ATCC8456细胞的最终纯化的产α-烯烃的蛋白组分的SDS-PAGE凝胶电子图。

图41A-B分别是orf880的核苷酸序列(SEQIDNO:25)和氨基酸序列(SEQIDNO:26)。图41C是咸海鲜球菌ATCC8456的部分16srRNA序列(SEQIDNO:27)。

图42是表达咸海鲜球菌8456_orf880并给予硬脂酸时大肠杆菌所产生的α-烯烃的GC/MS追踪。

图43是利用ClustalW对8456_orf880同源物进行的自展系统发生分析的示意图。

图44描述了鉴定本发明中有用的前体硫酯酶的氨基酸基序。

图45A-B的表格列出了鉴定具有改变的性质的突变硫酯酶的测定结果。具体而言，图45A列出了对指定底物的活性(即催化速率)或对指定底物的特异性的Z评分至少为3的突变体；图45B的表格列举了脂肪酸衍生物的收率/产生增加和/或提高且Z评分至少为3的突变体。

图46A-E的表格列出了鉴定脂肪酯与其它产物(例如脂肪酯之外的脂肪酸衍生物)的收率比例改变的突变硫酯酶的测定结果。具体而言，图46A的表格显示对于脂肪酯与游离脂肪酸的收率比例或收率百分比的Z评分至少为3的突变体。图46B的表格显示对于脂肪酯与游离脂肪酸的收率比例或收率百分比的Z评分小于-3的突变体。图46C的表格显示对于脂肪酸衍生物的体内收率的Z评分至少为3的突变体。图46D的表格显示对于短链(例如C₈、C₉、C₁₀、C₁₁、C₁₂、C₁₃和/或C₁₄)脂肪酸衍生物与其它脂肪酸衍生物(例如短链脂肪酸衍生物之外的脂肪酸衍生物，包括例如，长链(例如C₁₅、C₁₆、C₁₇、C₁₈、C₁₉和/或C₂₀)脂肪酸衍生物)的收率比例的Z评分至少为3的突变体。图46E的表格显示对于短链(例如C₈、C₉、C₁₀、C₁₁、C₁₂、C₁₃和/或C₁₄)脂肪酸衍生物与其它脂肪酸衍生物(例如短链脂肪酸衍生物之外的脂肪酸衍生物，包括例如，长链(例如C₁₅、C₁₆、C₁₇、C₁₈、C₁₉和/或C₂₀)脂肪酸衍生物)的收率比例的Z评分小于-3的突变体。

图47是利用大肠杆菌‘TesA(即没有信号肽的TesA)的氨基酸残基作为参考序列用于编号目的，对‘TesA同源物进行的序列比对。

图48描述了MG1655(ΔfadE)pTrc-’TesA_fadD菌株的FAME滴度和组成。

图49描述了在25小时的发酵运行过程中，表达质粒上的fadD和‘tesA的MG1655(ΔfadE)和C41(ΔfadE)菌株的FAME滴度和组成。

图50描述了MG1655(ΔfadE)pTrc-’TesA_fadD菌株的FAME滴度和组成。

图51描述了在25小时的发酵运行过程中，表达质粒上的fadD和‘tesA的MG1655(ΔfadE)和C41(ΔfadE)菌株的FAME滴度和组成。

图52描述了在25小时的发酵运行过程中，表达质粒上的fadD和‘tesA的MG1655(ΔfadE)和C41(ΔfadE)菌株的FFA滴度和组成。

图53描述了在24小时的发酵运行过程中，表达质粒上的大肠杆菌‘tesA、发光发光杆菌(P.luminescens)‘tesA、哈维氏弧菌(V.harveyi)‘tesA和深海发光杆菌(P.profundum)tesB的MG1655(ΔfadE)菌株的FAME滴度。用mg/L和mg/L/OD来表示滴度。

图54是在24小时的发酵运行过程中，表达质粒上的大肠杆菌‘tesA、发光发光杆菌‘tesA、哈维氏弧菌‘tesA和深海发光杆菌tesB的MG1655(ΔfadE)菌株的FFA滴度。用mg/L(柱形)和mg/L/OD(三角形)来表示滴度。

图55对天然存在的硫酯酶的相关序列区进行比较，所述天然存在的硫酯酶含有对应于引入改变的性质的‘TesA中的突变的位置处的残基。用黑色来突出相关残基，并与天然存在的硫酯酶的对应残基对准。

图56列出了‘TesA同源物的GenBank登录号。

图57A-C描述了底物特异性(Z评分)与对应于SEQIDNO:31的‘TesA序列的氨基酸残基位置的关系，符号是代表对C₁₀特异性(图57A)、C₁₂特异性(图57B)和C₁₄特异性(图57C)的cons70比对中的保守水平。进一步描述了Z评分与位置所致的对C₁₀的底物特异性超过C₁₂和C₁₄(图57D)；Z评分与位置所致的对C₁₂的底物特异性超过C₁₀和C₁₄(图57E)；以及Z评分与位置所致的对C₁₄的底物特异性超过C₁₀和C₁₂(图57F)。

图58显示大肠杆菌‘TesA的氨基酸序列(SEQIDNO:31)。

图59显示编码大肠杆菌‘TesA的核苷酸序列(SEQIDNO:32)。

图60是大肠杆菌MG1655ΔfadE细胞培养物中游离脂肪酸(FFA)和脂酰甲酯(FAME)滴度的图，所述大肠杆菌MG1655ΔfadE细胞是用含有来自大肠杆菌(EcolA)、黑腐果胶杆菌(Pectobacteriumatrosepticum)(PatrA)、恶臭假单胞菌(PputA)、哈维氏弧菌(VharA)、发光发光杆菌(PlumA)的‘tesA同源物的pACYC进行了转化或用不含插入物的pACYC进行了转化(阴性对照)。

图61是大肠杆菌MG1655ΔfadE细胞培养物中FFA和FAME滴度的图，所述MG1655ΔfadE细胞过表达fadD和来自大肠杆菌(Ecoli)、黑腐果胶杆菌(Patr)、发光发光杆菌(Plum)、深海发光杆菌(Ppro)、哈维氏弧菌(VhA)、恶臭假单胞菌(Pput)的‘tesA、或者不表达‘tesA(阴性对照)。(用星号(*)标出的数据来自不同的实验)

图62显示表达野生型大肠杆菌‘tesA(WT)、S10C突变体(S10C)或不表达‘tesA(阴性对照)的大肠杆菌MG1655ΔfadE培养物中的FFA和FAME滴度。

图63显示在不存在外源酯合酶的情况下，表达硫酯酶的重组宿主细胞随发酵运行时间产生的FAME。

图64显示在不存在外源酯合酶情况下，表达硫酯酶的重组宿主细胞随发酵运行时间产生的FFA。

发明的详细描述

除非另外指出，本文使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的技术人员通常的理解具有相同的含义。尽管与本文描述的类似或者等同的方法和材料可用于本发明的实施或者试验，但下文描述了适合的方法和材料。通过引用将包括GenBank数据库序列在内的本文提到的所有公开、专利申请、专利和其它参考文献以其整体并入本文。如果有冲突，本说明书，包括定义在内，将提供参考。所述材料、方法和实例只是说明性的，而不是用于限制。

下面的详细描述和权利要求书将使本发明的其它特征和优势显而易见。

定义：

贯穿本说明书，可以参考基因名称或多肽名称的缩写，但是应当理解为这种缩写的基因或多肽名称分别代表基因或多肽的种类。这些基因名称包括编码相同多肽和具有相同生理功能的同源多肽的所有基因。多肽名称包括具有相同活性的所有多肽(例如催化相同基本化学反应的多肽)。

除非另外指出，本文所参考的登录号来源于美国国立卫生研究院维护的NCBI数据库(国立生物技术信息中心)。除非另外指出，所述登录号为该数据库截止2008年3月所提供的登录号。

EC编号由国际生物化学与分子生物学联合会命名委员会(NC-IUBMB，http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/)建立。本文所参考的EC编号来自京都基因与基因组百科全书(KyotoEncyclopediaofGenesandGenomics)维护的KEGG配体数据库，该数据库由东京大学部分资助。除非另外指出，所述EC编号是该数据库截止2008年3月所提供的编号。

本文所用的冠词“a”和“an”是指一个或多于一个(即，是指至少一个)该冠词的语法对象。作为举例，“元件(anelement)”表示一个元件或多于一个元件。

本文所用的术语“约”是指给定数值的±20％值。因此，“约60％”是指60±(60的20％)的值(即48-70)。

如本文所用，术语“醇脱氢酶”(EC1.1.1.*)是能催化脂肪醛转化为醇(例如脂肪醇)的多肽。此外，本领域技术人员应当理解，某些醇脱氢酶还催化其它反应。例如，某些醇脱氢酶允许除脂肪醛之外的其它底物。因此，这种非特异性醇脱氢酶也包括在本定义内。编码醇脱氢酶的多核苷酸序列在本领域内是已知的，且这些脱氢酶是可为公众所获得的。

术语“改变的性质”是指与前体多核苷酸或前体蛋白相比，突变多核苷酸或突变蛋白的一个或多个性质的改变。按照本发明，可以对蛋白进行有利改变的性质包括氧化稳定性、底物特异性、底物选择性、催化活性、热稳定性、pH稳定性、pH活性谱、对蛋白水解降解的抗性、K_m、k_cat、k_cat/K_m比、蛋白折叠、诱导免疫应答、与配体结合的能力、与受体结合的能力、分泌能力、以活性方式转运至膜的能力、出现在细胞表面上的能力、寡聚能力、信号转导能力、刺激细胞增殖的能力、抑制细胞增殖的能力、诱导凋亡的的能力、被磷酸化或糖基化修饰的能力、治疗疾病的能力。在本发明的一个实施方案中，提供的突变硫酯酶来自前体硫酯酶，其中与所述前体硫酯酶的性质相比，所述突变体在体外或体内具有至少一种改变的性质。在一个实施方案中，所述改变的性质可以是生物物理性质，如热稳定性(熔点T_m)、溶剂稳定性、溶质稳定性、氧化稳定性、亲油性、亲水性、四级结构、偶极矩或等电点。在一个实施方案中，所述改变的性质可以是生物化学性质，如pH最适度、温度最适度、离子强度最适度和/或酶催化参数(例如，产物分布、产物收率比例或收率百分比、特异活性、底物偏好性、底物亲和力、底物抑制、产物亲和力、周转率、产物抑制、动力学机制、K_m、k_cat、k_cat/K_m和/或V_Max)。在一个实施方案中，所述改变的性质是对特定底物的偏好性的改变，例如，对醇解或水解、酰基辅酶A或酰基-酰基载体蛋白底物、酯或硫酯底物、饱和或不饱和底物、不饱和位置、宽或窄的特异性(例如催化多种底物或仅催化特定碳链长度的底物的能力)的偏好性的改变。在一个实施方案中，所述改变的性质可以是对以下底物的偏好性或活性的增加：支链底物、具有特定分支位置的底物、羟酰基底物、酮脂酰基底物、产生具有所需燃料特性(即十六烷值、辛烷值、氧化稳定性、润滑性、引火点、粘性、沸点、熔点、倾点、浊点、冷滤点、冷流性、芳香度和/或碘值)的产物的底物。改变的性质还包括酯水解(例如所需产物分子的水解)的活性降低或减弱、或蛋白对细胞毒性的降低、和/或细胞中蛋白表达水平的改变。在具体的实施方案中，至少一种改变的性质是例如硫酯酶催化脂酰酯的直接或间接、体内或体外合成(例如通过酯交换)能力的改变。

如本文所用，“类似序列”是基因功能与参考基因(例如来自大肠杆菌的‘tesA基因)基本相同的序列。此外，类似基因与参考基因或多核苷酸(例如‘tesA基因或‘TesA硫酯酶的多核苷酸或多肽序列)的序列具有至少约20％，例如至少约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在其它的实施方案中，对序列应用多于一种上述性质。通过已知的序列比对法来确定类似序列。

术语“比对”是指比较两条或更多条多核苷酸或多肽序列而确定彼此的相互关系的方法。通常通过应用多种算法的计算机程序来进行比对，然而，也可以进行手动比对。比对程序通常在序列的可能比对中反复演算并用取代表进行比对评分，利用多种策略达到可能的最佳比对评分。常用的比对算法包括但不限于CLUSTALW(参见ThompsonJ.D.,HigginsD.G.,GibsonT.J.,CLUSTALW:improvingthesensitivityofprogressivemultiplesequencealignmentthroughsequenceweighting,position-specificgappenaltiesandweightmatrixchoice(CLUSTALW：通过序列权重、位置特异性空位罚分或权重矩阵选择来提高渐进多序列比对的敏感度),NucleicAcidsResearch22:4673-4680,1994)；CLUSTALV(参见LarkinM.A.,etal.,CLUSTALW2,ClustalW和ClustalX第二版,Bioinformatics23(21):2947-2948,2007)；Jotun-Hein,Muscleetal.,MUSCLE:amultiplesequencealignmentmethodwithreducedtimeandspacecomplexity(MUSCLE：减少时间和空间复杂性的多序列比对方法),BMCBioinformatics5:113,2004)；Mafft,Kalign,ProbCons,andT-Coffee(参见Notredameetal.,T-Coffee:Anovelmethodformultiplesequencealignments(T-Coffee：用于多序列比对的新方法),JournalofMolecularBiology302:205-217,2000)。实施一个或多个上述算法的示例性程序包括但不限于来自DNAStar(DNAStar,Inc.3801RegentSt.Madison,WI53705)的MegAlign、MUSCLE、T-Coffee、CLUSTALX、CLUSTALV、JalView、Phylip以及来自Accelrys(Accelrys,Inc.,10188TelesisCt,Suite100,SanDiego,CA92121)的DiscoveryStudio。在非限制性实例中，用MegAlign按以下参数来实施CLUSTALW比对算法：空位罚分10、空位长度罚分0.20、延迟分散序列(30％)DNA转换权重0.50,蛋白质权重矩阵Gonnet系列、DNA权重矩阵IUB。

术语“抗体”是指免疫球蛋白。抗体包括但不限于从需要产生抗体的任何物种直接获得的免疫球蛋白。此外，本发明包括修饰的抗体。该术语还指保留了与相同表位(完整抗体也与该表位结合)的结合能力的抗体片段，该术语包括多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、抗个体基因型(抗ID)抗体。抗体片段包括但不限于互补决定区(CDR)、单链片段可变区(scFv)、重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)。本发明还包括多克隆抗体和单克隆抗体。优选地，所述抗体是单克隆抗体。

术语“减弱”表示弱化、减少或消除。在一个实例中，具体的酶对反馈抑制或者非产物或者反应物的组分引起的抑制(非途径特异性反馈)的灵敏度降低，使得所述酶活性不受化合物存在的影响。在具体的实例中，fabH基因的表达是温度敏感性的，可以改变其序列从而降低对温度波动的敏感性。此外，当需要支链氨基酸时，可以减弱fabH基因的表达。在另一个实例中，经过修饰而活性更低的酶可以称作减弱的。对编码酶的序列进行功能性修饰可以用来减弱酶的表达。序列修饰可以包括例如基因序列或控制基因序列的转录或翻译的序列中一个或多个核苷酸的突变、缺失或插入，所述修饰减少或者抑制基因产物的产生，或者导致基因产物没有功能。例如，大肠杆菌中fabR的功能性缺失减轻了脂肪酸生物合成途径的抑制，允许大肠杆菌产生更多的不饱和脂肪酸(UFA)。在某些情况下，功能性缺失被描述为敲除突变。还有其它方法可以减弱酶的表达。例如，可以通过以下实现减弱：如上文所述修饰编码基因的序列；将基因置于活性较低的启动子的控制下；表达靶向于目的基因的干扰RNA、核酶或反义序列；通过改变物理或化学环境，比如温度、pH或溶质浓度，使得不能达到基因或基因产物的最佳活性；或者通过本领域已知的任何其它技术。

术语“生物原油”是指可以作为基于石油的燃料的替代品的生物燃料。此外，生物原油和石油原油一样，均可以转化为其它燃料，例如汽油、柴油、喷气燃料或燃料油(民用燃料油)。而且，生物原油与石油原油一样，可以转化为其它工业上有用的化学品，用于例如制药、美容用品、消费品、工业加工等。生物原油组合物可以包括例如烃、烃产品、脂肪酯和/或脂肪酮或以上的组合。在优选的实施方案中，生物原油组合物由烃，例如脂肪烃(例如，烷、烯、炔)或芳香烃组成。

术语“生物柴油”是指可以在柴油发动机中使用的特定类型的生物燃料。生物柴油可以替代通常来自石油的常规柴油。生物柴油可以采用纯的形式(被称为“纯”生物柴油)，或者作为以任何浓度与基于石油的柴油的混合物用于内燃柴油发动机中。生物柴油组合物还可以包含各种合适的添加剂。生物柴油可以由烃或酯组成。在一个实施方案中，生物柴油由诸如脂肪酸甲酯(FAME)或脂肪酸乙酯(FAEE)的脂肪酯组成。在优选的实施方案中，这些FAME和FAEE由碳链长度为约8-20、10-18或12-16的脂酰基部分组成。用作生物柴油的脂肪酯可以包含直链碳链、支链碳链、饱和碳链或不饱和碳链。

术语“生物燃料”是指来自生物质的任何燃料。生物质是可以被转化成生物燃料的生物材料。生物质的一个示例性来源是植物质。例如，玉米、甘蔗和柳枝稷可以用作生物质。生物质的另一个非限制性实例是动物质，如牛粪。生物质还包括来自工业、农业、林业和日常生活的废弃物。这类废弃物的实例包括而不限于发酵废料、稻草、木料、污物、垃圾与食物残余物以及甘油。生物质还包括碳源，如碳水化合物(例如糖)。生物燃料可以替代基于石油的燃料。例如，生物燃料包括交通工具燃料(例如汽油、柴油、喷气燃料等)、民用燃料和发电燃料。生物燃料是可再生的能源。生物燃料的非限制性实例包括生物柴油、烃(例如烷、烯、炔或芳香烃)和来自生物质的醇。

本文将术语“碳链长度”定义为硫酯酶底物或脂肪酸衍生物的碳链中的碳原子数。具体分子的碳链长度标记为C_x，其中下标“x”是指碳链中碳的数量。如本文所用，术语“长链”是指碳链长为约15至约20个碳的那些分子(例如C₁₅、C₁₆、C₁₇、C₁₈、C₁₉或C₂₀)。术语“短链”是指链长为约8至约14个碳的那些分子(例如C₈、C₉、C₁₀、C₁₁或C₁₂)。

术语“碳源”表示适合作为原核或者简单真核细胞生长的碳源的底物或者化合物。碳源可以是各种形式的，包括但不限于多聚体、碳水化合物、酸、醇、醛、酮、氨基酸、肽、气体(例如CO和CO₂)等。这些包括，例如，各种单糖，例如葡萄糖、果糖、甘露糖和半乳糖；寡糖，例如寡聚果糖和寡聚半乳糖；多糖，例如木糖和阿拉伯糖；二糖，例如蔗糖、麦芽糖和松二糖；纤维素物质，如甲基纤维素和羧甲基纤维素钠；饱和或者不饱和的脂肪酸酯，如琥珀酸酯、乳酸酯和乙酸酯；醇，如乙醇等，或者以上的混合物。此外，碳源还可以是光合作用产物，包括但不限于葡萄糖。甘油也可以是有效的碳源。合适的碳源可以从任何天然和可再生的来源产生，尤其包括来自农业、市政和工业废料的生物质，只要该材料可以作为发酵成分来提供碳源。生物质来源包括玉米杆、甘蔗、柳枝稷、动物质或废料。

术语“染色体整合”表示进入的序列被引入宿主细胞染色体中的过程。转化DNA的同源区与染色体的的同源区对齐。然后，同源性盒之间的序列可以以双交叉由进入的序列所替换(即同源重组)。在本发明的某些实施方案中，DNA构建体的失活染色体区段的同源部分与微生物染色体的固有染色体区的侧翼同源区对齐。随后，DNA构建体以双交叉使所述固有染色体区缺失。

术语“浊点”是指下述液体温度：在该温度下，溶解的固体不再完全可溶，沉淀为第二相，使流体具有浑浊的外观。这个术语与诸多应用有关并具有一定程度不同或完全不同的重要性。在石油工业中，浊点指的是这样的温度：在该温度以下，蜡或其它重烃在原油、提炼油或燃料中结晶，形成浑浊的外观。固化蜡的存在会影响流体的流动性质、增加燃料滤器/喷嘴及其它机器部件堵塞的倾向、造成蜡在冷表面(例如管道表面或热交换器表面)上的积累，甚至改变与水的乳化特性。浊点表明在冷的操作温度下，油堵塞滤器或小孔的倾向。非离子表面活性剂或乙二醇溶液的浊点是混合物开始分成两个相或更多个相，因此变得浑浊时的温度。这一行为是含有聚氧乙烯链的非离子表面活性剂的特性，该非离子表面活性剂可以表现出与水中温度行为相反的溶解度，因此随着温度提高可以在某个点“变清澈”。表现这一行为的乙二醇被称为“浊点乙二醇”，并被用作页岩抑制剂。浊点通常还受盐度影响，通常在盐分越高的流体中浊点越低。

术语“降低浊点的添加剂”是指可以加入组合物使如上所述的组合物的浊点降低或下降的添加剂。

术语“允许产物产生的条件”是指允许生产宿主产生需要的产物的任何发酵条件，所述需要的产物例如酰基辅酶A或脂肪酸衍生物，所述脂肪酸衍生物包括例如脂肪酸、烃、脂肪醇、蜡或脂肪酯。发酵条件通常包括多个参数。示例性的条件包括但不限于，温度范围、通风水平、pH范围和培养基组成(例如溶剂和溶质)。这些条件中的每一个单独地和联合地允许生产宿主生长。示例性的培养基包括培养液或凝胶。通常，合适的培养基包括可以被微生物直接代谢的碳源，如葡萄糖、果糖、纤维素等。此外，可以在培养基中使用酶来促进动员(例如淀粉或纤维素解聚成可发酵的糖)和随后的碳源代谢。为了确定培养条件是否适合产物的产生，可以培养生产宿主约4、8、12、24、36、48或72小时。在培养的过程中或培养后，可以获取样品并进行分析，从而确定培养条件是否允许产物产生。例如，可以检测样品中的生产宿主或生产宿主生长的培养基中所需产物的存在。当检测产物的存在时，可以使用诸如但不限于TLC、HPLC、GC/FID、GC/MS、LC/MS、MS的测定以及本文实例所提供的那些测定。

术语“共有序列”或“规范序列”是指原型氨基酸序列，具体的目的蛋白或序列的所有变体与所述原型氨基酸序列进行比较。这两个术语还指展示出目的多核苷酸序列中最普遍存在的核苷酸的序列。对蛋白的每个位置，共有序列给出了序列比对中该位置处最多的氨基酸。

如本文所用，术语“共有突变”是指起始基因和共有序列的序列差异。通过在序列比对中比较起始基因与共有序列的序列来鉴定共有突变。在某些实施方案中，将共有突变引入起始基因，使得起始基因与共有序列更相似。共有突变还包括将起始基因中的氨基酸变成另一个氨基酸的氨基酸改变，所述另一个氨基酸在多重序列比对(MSA)中该位置处出现的频率高于在起始基因中该位置处的氨基酸出现的频率。因此，术语“共有突变”是指用在MSA中比在天然氨基酸中更丰富的氨基酸取代起始基因中的氨基酸的任何氨基酸改变。

术语“保守型取代(conservativesubstitutions)”或“保守型取代(conservedsubstitutions)”所指的取代是例如一个或多个下述氨基酸取代：诸如甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的脂肪族氨基酸被另一个脂肪族氨基酸替代；丝氨酸被苏氨酸替代；苏氨酸被丝氨酸替代；诸如天冬氨酸和谷氨酸的酸性残基被另一个酸性残基替代；诸如天冬酰胺和谷氨酰胺的携带酰胺基的残基被另一个携带酰胺基的残基替代；诸如组氨酸、赖氨酸和精氨酸的碱性残基被另一个碱性残基替代；以及诸如色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸的芳香族残基被另一个芳香族残基替代；或者诸如甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和蛋氨酸的小氨基酸被另一个小氨基酸替代。通常不改变特定活性的氨基酸取代在本领域内是已知的，且例如在H.NeurathandR.L.Hill,Proteins,AcademicPress,NewYork,1979中有描述。有用的保守型修饰包括丙氨酸至半胱氨酸、甘氨酸或丝氨酸；精氨酸至异亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸或鸟氨酸；天冬酰胺至天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸或组氨酸；天冬氨酸至天冬酰胺、谷氨酰胺或谷氨酸；半胱氨酸至蛋氨酸、丝氨酸或苏氨酸；谷氨酰胺至天冬酰胺、天冬氨酸或谷氨酸；谷氨酸至天冬酰胺、天冬氨酸或谷氨酰胺；甘氨酸至天冬氨酸、丙氨酸或脯氨酸；组氨酸至天冬酰胺或谷氨酰胺；异亮氨酸至亮氨酸、蛋氨酸或缬氨酸；亮氨酸至异亮氨酸、蛋氨酸或缬氨酸；赖氨酸至精氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸或鸟氨酸；蛋氨酸至半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸；苯丙氨酸至组氨酸、左旋多巴、亮氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、3-苯脯氨酸、4-苯脯氨酸或5-苯脯氨酸；脯氨酸至L-1-噻唑烷-4-羧酸或D-1-噁唑烷-4-羧酸或L-1-噁唑烷-4-羧酸；丝氨酸至半胱氨酸、蛋氨酸或苏氨酸；苏氨酸至蛋氨酸、丝氨酸或缬氨酸；色氨酸至酪氨酸；酪氨酸至左旋多巴、组氨酸或苯丙氨酸；以及缬氨酸至异亮氨酸、亮氨酸或蛋氨酸。

术语“对应于”是指第一蛋白序列中的氨基酸残基与第二参考蛋白序列中的氨基酸残基在位置上相同，这是根据使用生物信息学技术(例如利用本文所述的方法进行序列比对)时，第一蛋白序列中的残基与参考序列中的残基对准。然后将第一蛋白序列中的对应残基被指定为第二参考蛋白序列中的残基编号。第一蛋白序列可以与第二蛋白序列类似或者与第二蛋白序列不类似，但是优选地，两个蛋白序列是类似序列。例如，当将图58中SEQIDNO:31的大肠杆菌‘TesA的氨基酸序列用作参考序列时，可以为另一个比对目的蛋白或类似蛋白中的每个氨基酸残基都指定对应于SEQIDNO:31的残基编号1-182的残基编号。例如，在图47中，比对的氨基酸序列参照或对应于大肠杆菌‘TesA的序列。因此，利用诸如本文所述的已知生物信息学技术，可以为另一个目的硫酯酶(前体硫酯酶或突变硫酯酶)中的给定位置指定‘TesA序列中的对应位置。

对于氨基酸序列，术语“缺失”表示从前体蛋白的氨基酸序列缺失或去除残基，这产生了与前体蛋白相比少了一个氨基酸残基的突变蛋白。该术语也可以应用于核苷酸序列，这表示从前体多核苷酸的多核苷酸序列缺失或去除残基。

对与前体硫酯酶，术语“来自”和“获自”指的是目的生物菌株产生的或可产生的硫酯酶，还指从该菌株分离的多核苷酸序列所编码的并在包含该多核苷酸序列的宿主生物中产生的硫酯酶。此外，该术语指由合成来源和/或cDNA来源的多核苷酸序列所编码的并具有目的硫酯酶的识别特征的硫酯酶。举例来说，“来自肠杆菌科(Enterobacteriacaea)的硫酯酶”是指具有肠杆菌科天然产生的硫酯酶活性的那些酶以及与肠杆菌科来源所产生的那些硫酯酶类似，但是是通过利用基因工程技术，由用编码所述硫酯酶的多核苷酸转化的非肠杆菌科生物所产生的硫酯酶。

术语“DNA构建体”和“转化DNA”在本文可互换使用，指的是用于将序列引入宿主细胞或生物中的DNA。通常，通过PCR或本领域技术人员已知的其它合适的技术在体外产生DNA构建体。在某些实施方案中，DNA构建体包含目的序列(例如进入的序列)。在某些实施方案中，序列与其它元件可操作地连接，所述其它元件例如控制元件(例如启动子等)。DNA构建体还可以包含选择标记。DNA构建体还可以包含侧翼为同源性盒的进入的序列。在另一个实施方案中，DNA构建体包含被添加到末端(例如填充序列或侧翼序列)的非同源序列。在某些实施方案中，将进入的序列的末端闭合，使得DNA构建体形成封闭的环。转化序列可以是野生型的、突变的或经修饰的。在某些实施方案中，DNA构建体包含与宿主细胞染色体同源的序列。在其它实施方案中，DNA构建体包含非同源的序列。一旦DNA构建体在体外组装好，其就可以用于1)将异源序列插入宿主细胞所需的靶序列中；2)诱变宿主细胞染色体的区(即用异源序列替代内源序列)；3)缺失靶基因；和/或(4)将复制质粒引入宿主中。

如果在多核苷酸的天然状态下或当用本领域技术人员已知的方法操孔多核苷酸时，所述多核苷酸可被转录和/或翻译产生RNA、多肽或以上的片段，则认为该多核苷酸“编码”RNA或多肽。这种多核苷酸的反义链也被认为编码RNA或多肽序列。正如本领域所已知的，DNA可以由RNA聚合酶转录产生RNA，并且RNA可以由逆转录酶逆转录产生DNA。因此，DNA可以编码RNA，且反之亦然。

在本文中，术语“等同物”是指由下述多核苷酸编码的硫酯酶：所述多核苷酸能在中度至最大严紧性的条件下与具有图58的SEQIDNO:31序列的多核苷酸杂交。例如，等同物表示与图58中SEQIDNO:31的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％和/或至少99％的序列同一性的等同的成熟硫酯酶。

“酯合酶”是能催化生化反应产生酯的肽。例如，酯合酶是能够参与将硫酯转化为脂肪酯的肽。在某些实施方案中，酯合酶将硫酯、酰基辅酶A转化为脂肪酯。在可选的实施方案中，酯合酶利用硫酯和醇作为底物产生脂肪酯。酯合酶能够利用短链和长链酰基辅酶A作为底物。此外，酯合酶能够利用短链和长链醇作为底物。酯合酶的非限制性实例是蜡合酶、蜡-酯合酶、酰基辅酶A:醇转酰基酶、酰基转移酶、脂酰辅酶A:脂肪醇酰基转移酶、脂酰基ACP转酰基酶以及醇乙酰基转移酶。将酰基辅酶A硫酯转化为蜡的酯合酶称为蜡合酶。示例性的酯合酶包括分类到酶分类号EC2.3.1.75中的那些酯合酶。术语“酯合酶”不包括还具有硫酯酶活性的酶。本文将同时具有酯合酶活性和硫酯酶活性的酶归为硫酯酶。

术语“表达的基因”是指被转录为信使RNA(mRNA)并然后被翻译为蛋白的基因，以及被转录为各种RNA的基因，所述各种RNA例如不被翻译为蛋白的转运RNA(tRNA)、核醣体RNA(rRNA)和调节RNA)。

术语“表达盒”或“表达载体”是指重组或合成产生的多核苷酸构建体，其具有一系列允许特定多核苷酸在靶细胞中转录的指定元件。可以将重组表达盒合并入质粒、染色体、线粒体DNA、质粒DNA、病毒或多核苷酸片段。通常，表达载体的重组表达盒部分包括待转录的多核苷酸序列和启动子以及其它序列。在具体的实施方案中，表达载体能在宿主细胞中并入和表达异源多核苷酸片段。多种原核和真核表达载体均可以购买到。合适的表达载体的选择属于本领域技术人员的公知常识。在本文中，术语“表达盒”还与“DNA构建体”及其语法上的等同物互换使用。

如本文所用，术语“脂肪酸衍生物”是指来自代谢途径的组合物，该途径包括硫酯酶反应。因此，脂肪酸衍生物产物可以是脂肪酸或脂肪酯产物或可以是脂肪酸或脂肪酯衍生的产物，所述脂肪酸或脂肪酯是硫酯酶反应的产物。因此，脂肪酸衍生物包括例如脂肪酸和/或脂肪酯产物或脂肪酸和/或脂肪酯衍生的产物，所述脂肪酸和脂肪酯是硫酯酶的直接反应产物。示例性的脂肪酸衍生物包括例如，短链和长链醇、烃、脂肪醇和酯，包括蜡、脂肪酸酯和/或脂肪酯。脂肪酸衍生物的具体非限制性实例包括脂肪酸、脂肪酸甲酯、脂肪酸乙酯、脂肪醇、脂肪烷基醋酸酯、脂肪醛、脂肪胺、脂酰胺、脂肪硫酸酯、脂肪醚、酮、烷、内烯烃、端烯烃、二羧酸、ω-二羧酸、二醇和端脂肪酸和/或内脂肪酸。

术语“脂肪酸衍生物酶”共同地或分别地指脂肪酸衍生物产生中可以表达或过表达的酶。这些酶可以是脂肪酸生物合成途径的一部分。脂肪酸衍生物合酶的非限制性实例包括脂肪酸合酶、硫酯酶、酰基辅酶A合酶、酰基辅酶A还原酶、醇脱氢酶、醇酰基转移酶、脂肪醇形成酰基辅酶A还原酶、脂肪酸脱羰基酶、羧酸还原酶、脂肪醇乙酰转移酶和酯合酶。脂肪酸衍生物酶将底物转化为脂肪酸衍生物。在某些情况下，合适的底物可以是第一脂肪酸衍生物，其被脂肪酸衍生物酶转化为不同的第二脂肪酸衍生物。

术语“脂肪醇”是指具有式ROH的醇。在某些实施方案中，脂肪醇是由脂肪酸或脂肪酸衍生物产生的醇。在一个实施方案中，R基的长度为至少约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个碳。R可以为直链或者支链。支链可以有一个或多个分支点。此外，支链可以包括环状分支，如环丙烷或环氧化物部分。而且，R可以是饱和的或不饱和的。如果是不饱和的，R可以有一个或多个不饱和点。在一个实施方案中，脂肪醇通过生物合成产生。脂肪醇可以具有多种用途。例如，脂肪醇可用来产生特种化学品。尤其是，脂肪醇可被用作生物燃料；用作脂肪、蜡、胶和树脂的溶剂；用在药膏、润肤剂和洗液中；用作润滑油添加剂；用在去垢剂和乳化剂中；用作纺织品抗静电剂和整理剂；用作增塑剂；用作非离子表面活性剂；以及用在美容用品中，例如作为增稠剂。

术语“脂肪醇形成肽”是指能催化酰基辅酶A转化为脂肪醇的肽，包括脂肪醇形成酰基辅酶A还原酶(FAR,EC1.1.1.*)、酰基辅酶A还原酶(EC1.2.1.50)或醇脱氢酶(EC1.1.1.1)。此外，本领域技术人员应当理解，某些脂肪醇形成肽还催化其它反应。例如，某些酰基辅酶A还原酶肽允许脂肪酸以外的底物。因此，也包括这些非特异性的肽。编码脂肪醇形成肽的多核苷酸序列是本领域内已知的，并且这些肽可为公众所获得。

术语“脂肪醛”是指具有式RCHO、特征为不饱和羰基(C＝O)的醛。在某些实施方案中，脂肪醛由脂肪酸或脂肪酸衍生物产生的醛。在一个实施方案中，R基的长度为至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个碳。R可以为直链或者支链。支链可以有一个或多个分支点。此外，支链可以是环状分支。而且，R可以是饱和的或不饱和的。如果是不饱和的，R可以有一个或多个不饱和点。在一个实施方案中，脂肪醛是通过生物合成产生。脂肪醛可以具有多种用途。例如，脂肪醛可用来产生特种化学品。尤其是，脂肪醛可用来生产聚合物、树脂、染料、调味剂、增塑剂、香水、药品和其它化学品。某些脂肪醛用作溶剂、防腐剂或消毒剂。诸如维生素和激素的某些天然的和合成的化合物也是醛类。

术语“脂肪醛生物合成多肽”、“羧酸还原酶”和“CAR”在本文中可互换使用。

术语“脂肪酯”是指具有大于5个碳原子的酯。在某些实施方案中，脂肪酯是由脂肪酸产生的酯，例如脂肪酸酯。在一个实施方案中，脂肪酯含有A侧(即连接于羧酸酯的氧的碳链)和B侧(即包含母体羧酸酯的碳链)。在具体的实施方案中，当脂肪酯来源于脂肪酸生物合成途径时，A侧来自醇，B侧来自脂肪酸。任何醇都可以用于形成脂肪酯的A侧。例如，醇可以来源于脂肪酸生物合成途径。可选地，可以通过非脂肪酸生物合成途径来产生醇。而且，醇可以是外源提供的。例如，当脂肪酯是由生物产生时，可以将醇提供在发酵液中。可选地，当脂肪酯是由也能产生醇的生物产生时，可以外源提供羧酸，诸如脂肪酸或乙酸。包含A侧或B侧的碳链可以是任意长度。在一个实施方案中，酯的A侧的长度为至少约1、2、3、4、5、6、7、8、10、12、14、16、18或20个碳。酯的B侧的长度为至少约4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26个碳。A侧和/或B侧可以是直链或支链。支链可以有一个或多个分支点。此外，支链可以包括诸如环丙烷或环氧化物部分的环形分支。此外，A侧和/或B侧可以是饱和或不饱和的。如果是不饱和的，A侧和/或B侧可以有一个或多个不饱和点。在一个实施方案中，脂肪酯是通过生物合成产生。在这个实施方案中，首先脂肪酸被“活化”。“活化的”脂肪酸的非限制性实例是酰基辅酶A、酰基ACP、酰基AMP和酰基磷酸酯。酰基辅酶A可以是脂肪酸生物合成或降解的直接产物。此外，可以从游离脂肪酸、辅酶A和三磷酸腺苷(ATP)合成酰基辅酶A。产生酰基辅酶A的酶的实例是酰基辅酶A合酶。脂肪酸被活化后，可以容易地将其转移到接受亲核体。示例性的亲核体是醇、巯醇、胺或磷酸酯。在另一个实施方案中，所述脂肪酯可以来源于脂酰基硫酯和醇。在一个实施方案中，所述脂肪酯是蜡。蜡可以来源于长链脂肪醇和长链脂肪酸。在另一个实施方案中，脂肪酯是脂肪酸硫酯，例如脂酰辅酶A(酰基辅酶A)。在其它实施方案中，所述脂肪酯是脂酰基泛酸酯、酰基酰基载体蛋白(酰基ACP)、脂酰基酶酯或者脂肪磷酸酯。可以由酰基酶酯中间体产生酯，这是通过酯键的醇解形成新的酯和游离酶。脂肪酯有很多用途。例如，脂肪酯可以用作生物燃料或表面活性剂或用作生物燃料或表面活性剂的组分。

本文所用的术语“脂肪酯与其它脂肪酸衍生物相比”是指脂肪酯与不是脂肪酯的其它脂肪酸衍生物总量相比的收率比例。换而言之，将脂肪酯的量与脂肪酯之外的脂肪酸衍生物进行比较。

术语“发酵生产率”或“生产率”是指产物产生的速率，表示为gL^-1h^-1。比生产率是用催化剂浓度标准化的生产率，表示为g/gL^-1h^-1g(催化剂)^-1。

术语“发酵滴度”或“滴度”是指反应产物的浓度，通常表示为g/L，但是也可以用其它单位(即摩尔、质量/质量、质量/体积或体积/体积)。

术语“发酵收率”或“收率”是指从给定量的原材料产生的产物的量，通常表示为产生的产物的质量除以所消耗的原材料的质量的比值(g产物/g原材料)。还可以表示为摩尔收率(产物摩尔数/原材料摩尔数)。

术语“现代碳分数”是指由国家标准和技术研究院(NIST)标准参考物质(SRM)4990B和4990C(分别称为草酸标准品HOxI和HOxII)所定义的参数f_M。基本定义涉及¹⁴C/¹²C同位素比率HOxI(参考AD1950)的0.95倍。这粗略等于衰变校正的工业革命前的树木。对于现今的生物圈(植物材料)而言，f_M约为1.1。

术语“功能测定”是指提供蛋白活性指示的测定。在特别优选的实施方案中，该术语是指用于分析蛋白在其天然角色中的功能性的测定系统。例如，就酶而言，功能测定涉及测定酶在催化反应中的作用。

“基因”是指编码多肽的多核苷酸(例如DNA片段)，并且包括编码区上游和下游的区以及各个编码片段(外显子)之间的插入序列(内含子)。

术语“同源基因”是指来自不同但相关的物种、彼此对应且彼此相同或相似的基因对。该术语包括在新物种的发育过程中，由物种形成过程分出的基因(例如直系同源基因)，以及由基因复制分出的基因(例如旁系同源基因)。

术语“内源蛋白”是指细胞中固有的或天然存在的蛋白。“内源多核苷酸”是指位于细胞中且不是利用重组工程技术被引入细胞中的多核苷酸。例如，当细胞被最初从自然界分离时，存在于所述细胞中的基因。即使已通过重组技术改变了诸如激活转录或翻译的启动子或增强子序列的控制序列，仍认为该基因是内源性的。相反，本文所用的术语“异源”是指不是在宿主细胞中天然存在的蛋白或多核苷酸。

术语“同源重组”是指两个DNA分子间或配对染色体间在相同或几乎相同的核苷酸序列位点处的DNA片段的交换。在某些实施方案中，染色体整合是同源重组。

本文所用的术语“同源序列”是指这样的多核苷酸或多肽序列：例如，当为了比较进行最佳比对时，所述多核苷酸或多肽序列与另一个多核苷酸或多肽序列具有约100％、约99％或更高、约98％或更高、约97％或更高、约96％或更高、约95％或更高、约94％或更高、约93％或更高、约92％或更高、约91％或更高、约90％或更高、约88％或更高、约85％或更高、约80％或更高、约75％或更高、约70％或更高、约65％或更高、约60％或更高、约55％或更高、约50％或更高、约45％或更高、或约40％或更高的序列同一性。在具体的实施方案中，同源序列可以保留相同类型和/或相同水平的特定目的活性。在某些实施方案中，同源序列具有85％-100％的序列同一性，而在其它的实施方案中，具有90％-100％的序列同一性。在具体的实施方案中，具有95％-100％的序列同一性。

“同源性”是指序列相似性或序列同一性。利用本领域内已知的标准技术来测定同源性(参见例如SmithandWaterman,Adv.Appl.Math.,2:482,1981；NeedlemanandWunsch,J.Mol.Biol.,48:443,1970；PearsonandLipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:2444,1988；Wisconsin遗传学软件包(GeneticsComputerGroup,Madison,WI)中的程序，如GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA；和Devereuxetal.,Nucl.AcidRes.,12:387-395,1984)。非限制性实例包括使用BLAST程序(Altschuletal.,GappedBLASTandPSI-BLAST:anewgenerationofproteindatabasesearchprograms(空位BLAST和PSI-BLAST：新一代蛋白数据库搜索程序),NucleicAcidsRes.25:3389-3402,1997)来鉴定认为是“同源”的序列。以下程序可以是合适的：近期的版本如2.2.16版、2.2.17版、2.2.18版、2.2.19版或最近的版本，其包括子程序，例如用于蛋白-蛋白比较的blastp、用于核苷酸-核苷酸比较的blastn、用于蛋白-核苷酸比较的tblastn或用于核苷酸-蛋白比较的blastx，并且使用如下的参数：返回序列的最大数是10,000或100,000、E-值(期望值)为1e-2或1e-5、字长为3、评分矩阵BLOSUM62、空位存在罚分11、空位延伸罚分1。例如，1e-5的E-值指示随机发生的同源匹配的几率是约1/10,000，进而为真实同源性提供高可信度。

术语“宿主菌株”或“宿主细胞”是指对包含本发明DNA的表达载体合适的宿主。

正如本领域已知的，术语“杂交”是指多核苷酸的链与互补链通过碱基配对连接的过程。如果多核苷酸序列与参考多核苷酸序列在中等至高严紧性杂交和洗涤条件下彼此特异性地杂交，则认为这两段序列是“选择性地杂交”。杂交条件是基于多核苷酸结合复合物或探针的熔点(T_m)。例如，“最大严紧性”通常发生在约Tm-5℃(低于探针T_m5℃)；“高严紧性”发生在低于T_m约5-10℃；“中等严紧性”发生在低于探针T_m约10-20℃；“低严紧性”发生在低于T_m约20-25℃。在功能上，最大严紧性条件可以用来鉴定与杂交探针具有严格同一性或接近严格同一性的序列；而中等或低严紧性杂交可以用来鉴定或检测多核苷酸序列同源物。中等和高严紧性杂交条件是本领域内公知的。高严紧性条件的实例包括：在约42℃下、在50％甲酰胺、5×SSC、5×Denhardt's溶液、0.5％SDS和100pg/mL变性载体DNA中杂交，然后是在室温下、2×SSC和0.5％SDS中洗涤两次，然后在42℃下、0.1×SSC和0.5％SDS中再洗涤两次。中等严紧性条件的实例包括：在37℃下、在含20％甲酰胺、5×SSC(150mMNaCl,15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5×Denhardt's溶液、10％硫酸葡聚糖和20mg/mL变性剪切的鲑鱼精DNA的溶液中孵育过夜，然后是在约37℃-约50℃下、l×SSC中洗涤滤器。本领域技术人员知道如何视情况调整温度、离子强度和其它条件来适应于诸如探针长度等因素。

术语“烃”是指含有碳(C)元素和氢(H)元素的化合物。所有烃均由碳骨架以及该骨架上连接的氢原子构成。有时，该术语被用作术语“脂肪烃”的简称。主要存在3种类型的烃：(1)芳香烃，其具有至少约一个芳香环；(2)饱和烃，亦称为烷，其缺少双键、三键或者芳香键；和(3)不饱和烃，其在碳原子之间具有一个或者多个双键或者三键，并且包括例如烯烃(例如二烯)和炔。

对于两条多核苷酸或多肽序列，术语“同一的”表示利用序列比较或分析算法(例如本文所述的那些算法)进行测定为最大一致性进行比对时，两段序列中的残基是相同的。例如，如果进行合适的比对时，两段序列中的对应片段在10个位置中的5个位置具有相同残基，则认为这两个序列具有50％的同一性。大多数生物信息学程序报道在比对序列区上的同一性百分比，所述比对序列区通常不是完整的分子。如果比对足够长且包含足够的相同残基，则可以计算期望值，所述期望值表示比对中的同一性不可能是由于随机几率发生的水平。

术语“改进性突变”或“性质增强性突变”是指蛋白中导致性质改变的突变，该性质的改变在蛋白的目的性质和/或所需性质方面赋予超过前体蛋白的表现。

当用于多肽序列时，术语“插入”是指前体多肽氨基酸序列中的插入，这产生了突变多肽，该突变多肽具有在两个已有连续氨基酸之间(即前体多肽中存在的邻近的氨基酸残基之间)插入的氨基酸。当用于多核苷酸序列时，术语“插入”是指在前体多核苷酸中两个已有连续核苷酸之间(即前体多核苷酸中存在的邻近核苷酸之间)插入一个或多个核苷酸。

对于将多核苷酸序列引入细胞中，术语“引入”是指适于将多核苷酸序列转移进细胞中的任何方法。所述引入方法包括但不限于，原生质体融合、转染、转化、接合和转导(参见例如Ferrarietal.,Genetics,inHardwoodetal,(eds.),Bacillus,PlenumPublishingCorp.,pp.57-72,1989)。

术语“分离的”或“纯化的”表示物质是从其初始环境中分出的，例如，如果该物质是天然存在的，则所述初始环境可以是天然环境，或者如果该物质是在重组宿主细胞发酵培养基中产生的，则所述初始环境可以是发酵液。如果具体组合物中某物质的浓度高于或低于纯化步骤之前该物质的浓度，则认为该物质是“纯化的”。例如，对于天然存在的或野生型的生物中发现的组合物，当最终组合物不含来自初始母体中的某些物质时，该组合物是“纯化的”。作为另一个实例，当组合物与重组宿主细胞发酵培养基中的其它成分组合时，如果当通过诸如离心或蒸馏的去除发酵中的某些成分(例如细胞碎片或其它发酵产物)的方式处理发酵培养基，则该组合物是“纯化的”。作为另一个实例，存在于活体动物中的天然存在的多核苷酸或多肽不是分离的，但是从天然系统中的某些或全部共存物质分出的相同的多核苷酸或多肽是分离的，不管这些过程是通过基因工程还是通过机械分离。这些多核苷酸可以是载体的一部分。可选地，这些多核苷酸或多肽可以是组合物的一部分。这些多核苷酸或多肽可以被认为是“分离的”，因为包含它们的载体或组合物不是其天然环境的一部分。在另一个实例中，如果多核苷酸或蛋白在电泳凝胶或印迹中基本上产生一条条带，则认为它是纯化的。

对于蛋白，术语“成熟的”表示蛋白或肽处于其最终功能形式的形式。举例来说，本发明硫酯酶的成熟形式包括图58中SEQIDNO:31的氨基酸残基1-182。

术语“修饰的脂肪酸衍生物”是指至少部分地从重组宿主细胞脂肪酸生物合成途径的一部分产生的产物，其中所述产物与该宿主细胞在不存在本发明的突变硫酯酶的情况下产生的产物不同。因此，如果将突变硫酯酶(或其天然存在的等同物)引入重组宿主细胞中，导致具有不同的产物谱的脂肪酸衍生物的产生，则在本发明的背景下脂肪酸物质是被“修饰的”，所述不同的产物谱例如具有特定链长的某些脂肪酸衍生物的浓度更高或更低，或者某类脂肪酸衍生物的浓度更高或更低。

术语“突变硫酯酶”或“变体硫酯酶”是指与前体硫酯酶相比包含突变的硫酯酶。

对于多核苷酸，术语“突变”是指对所述多核苷酸序列进行的改动，该改动能导致多核苷酸序列相对前体多核苷酸序列的变化。突变多核苷酸序列可以指未改变编码的氨基酸序列的改变，例如为了表达目的而进行的密码子优化，或突变多核苷酸序列还可以指以能产生编码的氨基酸序列的改动的形式修改密码子的改变。可以通过本领域技术人员已知的多种方法将突变引入多核苷酸中，包括随机诱变、位点特异性诱变、寡核苷酸定向诱变、基因混排、定向衍化技术、组合诱变、位点饱和诱变等。

对于蛋白，“突变(mutation)”或“突变(mutated)”表示对氨基酸序列的改动，该改动能导致蛋白序列相对前体蛋白序列的变化。突变可以指一个氨基酸被另一个氨基酸取代、一个或多个氨基酸残基的插入或缺失。尤其是，突变还可以是用非天然的氨基酸、化学修饰的氨基酸或类似残基取代氨基酸。突变还可以是序列的截短(例如缺失或切断)或来自前体序列的子序列。突变还可以是在蛋白中或在蛋白的任一末端添加子序列(例如将两个或更多个氨基酸的区段插入前体蛋白序列中两个连续氨基酸之间)，从而使所述蛋白的长度增加(或延长)。可以通过修饰对应于前体蛋白的DNA序列来进行突变。可以通过本领域内已知的方法将突变引入蛋白序列中，例如，通过产生编码相对于前体蛋白的突变的合成DNA序列、或通过化学法改变蛋白本身。本文所用的“突变体”是包含突变的蛋白。例如，还可以通过用野生型序列替换硫酯酶的一部分来产生突变体，所述野生型序列对应于所述硫酯酶的部分，但是在野生型序列中天然存在的特定位置处包含所需的改变。

在本发明背景下，“天然存在的等同物”是指包含天然存在的残基的天然存在的硫酯酶或其一部分，其中所述天然存在的残基对应于‘TesA中的突变(例如图58中SEQIDNO:31的突变)，所述‘TesA中的突变为‘TesA带来所需的改变的性质。图55提供了具有这种修饰的天然存在的等同硫酯酶的实例。

对于多核苷酸序列，术语“可操作地连接”是指一段多核苷酸序列与另一段多核苷酸序列建立起功能性关联。例如，如果多肽作为参与多肽分泌的前蛋白表达，则编码分泌前导子的DNA(例如信号肽)与编码多肽的DNA可操作地连接。如果启动子或增强子能影响编码序列的转录，则其与所述编码序列可操作地连接。如果核糖体结合位点的位置促进翻译，则其与编码序列可操作地连接。通常，“可操作地连接”表示被连接的DNA序列是相邻的，并且对于分泌前导子，被连接的DNA序列是相邻的且在同一个读码框中。

术语“操纵子区”是指这样一组相邻的基因：它们从共同的启动子转录为单个转录单元，并进而受共同调控。在某些实施方案中，操纵子包括调控基因。

术语“最佳比对”是指给出最高总体比对评分的比对。

术语“直系同源物”或“直系同源基因”是指不同物种中通过物种形成从共同的祖先基因演变而来的基因。通常，直系同源物在演变过程中保留了相同的功能。直系同源物的鉴定可用于在新测序的基因组中可靠地预测基因功能。

如果细胞中酶的表达水平高于其在对应的野生型细胞中的表达水平，则所述宿主细胞中发生“过表达(overexpressed)”或“过表达(overexpression)”。

术语“旁系同源物”或“旁系同源基因”是指由于基因组中复制而相关的基因。直系同源物在演变过程中保留了相同的功能，而旁系同源物演变出新的功能，尽管某些功能通常与最初的功能相关。旁系同源基因的实例包括但不限于，编码肌红蛋白的基因与编码血红蛋白的基因，这两个基因起源于同一祖先，但是演变出不同的功能。

术语“分配系数”表示化合物在有机相中的平衡浓度除以平衡时水相(例如在发酵液中)中的浓度。在本文描述的两相系统的一个实施方案中，有机相由生产过程中的脂肪酸衍生物形成。在某些情况下，还可以提供有机相，例如，可以向发酵液提供辛烷层来促进产物的分离。描述两相系统时，分配系数P通常以logP来表示。logP为1的化合物将以10:1分配到有机相中。logP为-1的化合物将以1:10分配到有机相中。通过选择合适的发酵液和有机相，具有高logP值的脂肪酸衍生物即使在发酵罐中的浓度非常低时也会分离到有机相中。

对于两个多肽、多核苷酸和/或基因序列(按需要)，术语“序列同一性百分比”、“氨基酸序列同一性百分比”、“基因序列同一性百分比”和/或“多核苷酸序列同一性百分比”是指当将序列进行最佳比对时，两个序列中相同残基的百分比。因此，80％氨基酸序列同一性表示两个最佳比对的多肽序列中的80％的氨基酸是相同的。

术语“质粒”是指用作克隆载体的环状双链(ds)DNA构建体，其在某些真核生物或原核生物中形成染色体外的自主复制的遗传元件或者整合入宿主染色体中。

术语“前体硫酯酶”是指例如通过重组或化学方法可以衍生出本发明突变硫酯酶的硫酯酶蛋白。前体硫酯酶的实例是来自植物、动物或微生物来源的天然存在的或野生型的硫酯酶。前体硫酯酶也可以是非天然存在的硫酯酶。非天然存在的硫酯酶的实例是通过例如随机突变、化学合成、分子演变或定点诱变产生的硫酯酶，其可以作为设计和/或制备本发明突变硫酯酶的有用的起点。

“引物”是当置于能引发与参考多核苷酸链互补的引物延伸产物的合成的条件下，能作为合成起点的寡核苷酸，无论它是纯化的限制性消化样品中天然存在的还是合成产生的。合适的条件包括例如，存在核苷酸和诸如DNA聚合酶的引发剂，以及合适的温度和pH。为了扩增的最大效率，引物优选是单链的，但是可选地，也可以是双链的。如果引物是双链的，则在用来制备延伸产物之前，可以首先对引物进行处理使其链分开。在具体的实施方案中，引物是寡脱氧核苷酸。在某些优选的实施方案中，引物的长度足以在引发剂的存在下引发延伸产物的合成。引物的精确长度取决于多个因素，包括温度、引物来源和扩增方法。

术语“探针”是指能与另一目的寡核苷酸杂交的寡核苷酸，无论它是纯化的限制性消化物中天然存在的还是通过合成、重组或PCR扩增产生的。探针可以是单链的或者双链的。探针可用于检测、鉴定和分离特定的基因序列。考虑到本发明所用的任何探针都可以用任何“报告分子”进行标记，以便可在任何检测系统中进行检测，所述检测系统包括但不限于酶系统(例如ELISA或其它基于酶的组织化学测定)、荧光系统、放射性系统和冷光系统。本发明并非意图受任何特定检测系统或标记所限制。

“生产宿主”是用于产生产物的细胞。正如本文所公开的，将生产宿主进行修饰使其表达或过表达所选基因，或者使其具有所选基因的减弱表达。生产宿主的非限制性实例包括植物、动物、人、细菌、酵母、蓝细菌、藻类和/或丝状真菌细胞。

“启动子”是功能为指导下游基因转录的多核苷酸序列。在优选的实施方案中，启动子适合于所表达的靶基因位于的宿主细胞。启动子以及其它转录和翻译调控多核苷酸序列(也成为“控制序列”)对于表达给定基因是必需的。通常，转录和翻译调控序列包括但不限于启动子序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列和增强子或激活子序列。

术语“启动子”或“增强子”是指真核生物中的转录控制信号。启动子和增强子由DNA序列的短列构成，其与参与转录的细胞蛋白特异性地相互作用(Maniatisetal.,Science,236:1237,1987)。已经从包括酵母、昆虫、哺乳动物和植物细胞的基因在内的大量真核生物来源分离到启动子和增强子元件。还从病毒中分离到启动子和增强子元件。在原核生物中也发现了诸如启动子和增强子的类似的控制元件。特定启动子和增强子的选择取决于用于表达目的蛋白的细胞类型。某些真核和原核启动子和增强子具有宽的生产宿主细胞范围，而其它的仅在有限的生产宿主细胞亚类中有功能(参见例如，Vossetal.,TrendsBiochem.Sci.,11:287,1986；Maniatisetal.，1987，同前)。术语“启动子元件”、“启动子”或者“启动子序列”是指作为开关激活基因的表达的DNA序列。如果基因被激活，就认为它被转录或者参与转录。转录涉及从基因合成mRNA。因此，启动子作为转录调节元件，并且还提供了基因转录为mRNA的起始位点。

对于多核苷酸，术语“性质”是指多核苷酸的可以选择或检测的任何特征或特性。这些性质包括但不限于，影响与多肽结合的性质、赋予包含特定多核苷酸的细胞的性质、影响基因转录的性质(例如启动子强度、启动子识别、启动子调控、增强子功能)、影响RNA加工的性质(例如RNA剪接、RNA稳定性、RNA构象和转录后修饰)、影响翻译的性质(例如水平、调控、mRNA与核糖体蛋白的结合、翻译后修饰)。例如，可以改变多核苷酸的转录因子结合位点、聚合酶、调控因子等，从而产生所需的性质或鉴定出不需要的性质。

对于蛋白质，术语“性质”是指蛋白质的可以选择或检测的任何特征或特性。

在本文中，术语“蛋白”和“多肽”可互换使用。本公开中使用依照IUPAC-IUB生物化学命名联合委员会(JCBN)所定义的氨基酸残基的3字母代码和1字母代码。还应当理解，由于遗传密码具有简并性，一个多肽可以由多于一个多核苷酸序列编码。酶是蛋白质。

在本文中，术语“收率比例和“收率百分比”可互换使用。它是指本发明的重组宿主所产生的相同混合物中，所需产物相对于其它产物的量。例如，可以提高所需产物的收率比例，使得在产物混合物中所需产物多于其它成分，从而降低纯化的负担。在另一个实例中，可以降低不需要的产物(即需要从所需产物中去除的组分)的收率比例，使得在产物混合物中不需要的产物少于需要的组分，从而达到相同的目的。本文将收率比例表示为“X与其它脂肪酸衍生物相比”的形式，将X的量与其它脂肪酸衍生物的量进行比较，X是一类脂肪酸衍生物(例如脂肪酯、特定链长的脂肪酸衍生物)，术语“其它脂肪酸衍生物”表示在相同的实验、培养或发酵运行中所产生的除了X之外的所有其它脂肪酸衍生物的总量。

术语“前序列”是指位于信号序列和成熟蛋白之间的氨基酸序列，其是蛋白分泌所必需的。在某些环境和合适的条件下，前序列的切割可以产生成熟的有活性的蛋白质/酶。

在本文中，当用来修饰术语“细胞”或“载体”时，术语“重组”是指通过引入异源多核苷酸序列而修饰的细胞或载体，或者是指细胞来自进行这种修饰的细胞。因此，例如，重组细胞表达的基因与天然形式的(非重组的)细胞中所见的形式不同，或者由于有意的人为干预，重组细胞表达非正常表达的、低表达的或根本不表达的天然基因。术语“重组(recombination)”、“重组(recombining)”和产生“重组(recombined)”多核苷酸通常是指将两个或更多个多核苷酸片段组装在一起，其中所述组装产生由组装部分形成的嵌合多核苷酸。

术语“调控片段”、“调控序列”或“表达控制序列”是指这样的多核苷酸序列：其与编码多肽链的氨基酸序列的另一段多核苷酸序列可操作地连接，从而影响该编码氨基酸序列的表达。调控序列可以阻止、抑制、促进或者甚至驱动可操作地连接的、编码氨基酸序列的多核苷酸序列的表达。

术语“选择标记(selectablemarker)”或“选择标记(selectivemarker)”是指能在宿主细胞中表达的、便于选择含有载体的那些宿主的多核苷酸(例如基因)。选择标记的实例包括但不限于抗生素标记。因此，术语“选择标记”是指当宿主细胞摄入进入的目的序列时或当某些其它反应发生时，能提供指示的基因。通常，选择标记是赋予宿主细胞抗生素抗性或代谢优势的基因，允许含有外源序列的细胞与未摄入所述外源序列的细胞相区别。“驻留(residing)选择标记”是位于待转化的微生物的染色体上的基因。驻留选择标记编码与转化构建体上的选择标记不同的基因。选择标记是本领域技术人员已知的。如上文所指出的，合适的标记是抗生素抗性标记，包括例如，amp^R、phleo^R、spec^R、kan^R、ery^R、tet^R、cmp^R和neo^R。参见例如Guerot-Fleury,Gene,167:335-337,1995；Palmerosetal.,Gene,247:255-264,2000；和Trieu-Cuotetal.,Gene,23:331-341,1983。可用于本发明的其它标记包括但不限于，诸如色氨酸的营养缺陷型标记和诸如6-半乳糖苷酶的检测标记。

术语“编码选择标记的核苷酸序列”是指能在宿主细胞中表达的多核苷酸序列，其中所述选择标记的表达使得含有表达基因的细胞能在存在相应的选择剂的条件下或者在缺失一种或多种必需营养素的条件下生长。

“信号序列”或“信号肽”是指参与蛋白的成熟或前体形式的分泌的多核苷酸或氨基酸序列。信号序列的这种定义是功能定义，表示包括由蛋白基因的N-末端部分所编码的、参与完成蛋白质的分泌的所有氨基酸序列。通常，它们与蛋白的N-末端部分或前体蛋白的N-末端部分结合，但这不是一定的。信号序列可以是内源的或者外源的。信号序列可以通常与蛋白质(例如硫酯酶)相联，或者可以源自或来自编码另一分泌蛋白的基因。示例性的外源信号序列包括来自枯草芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶信号序列的前七个氨基酸残基与来自迟缓芽孢杆菌(ATCC21536)的枯草杆菌蛋白酶信号序列的余下部分的融合。另一个示例性的信号序列包括TesA的信号序列，去除TesA的信号序列后则产生‘TesA。

对于两个多核苷酸或两个多肽，术语“基本上同一的”是指利用程序或算法(例如BLAST、ALIGN、CLUSTAL)并使用标准参数，多核苷酸或多肽与参考序列相比具有至少70％的序列同一性，例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。两个多肽基本上同一的一种指示可以是第一多肽与第二多肽发生免疫学交叉反应。通常，由于保守型氨基酸取代而不同的多肽可发生免疫学交叉反应。因此，例如，当两个肽的差别仅在于保守型取代时，一个多肽与另一多肽基本上是同一的。两个多核苷酸序列基本上同一的另一种指示是两个分子在严紧条件(例如在中等至最大严紧性的范围内)下彼此杂交。

“基本上纯化的”表示分子至少约60％不含、优选至少约75％不含、约80％不含、约85％不含，更优选至少约90％不含与其天然相关联的其它成分。本文中使用的术语“纯化的”或者“纯化”也指从样品中去除污染物。例如，去除污染物可以使样品中目的脂肪酸衍生物的百分比提高。例如，在植物、细菌、酵母或哺乳动物生产宿主细胞中表达脂肪酸衍生物之后，通过例如去除生产宿主细胞蛋白使脂肪酸衍生物得以纯化。该步骤也称为回收，其涉及分离和加工脂肪酸衍生物组合物，使得所述组合物在工业应用中是有用的，例如作为燃料或化学品。纯化后，样品中脂肪酸衍生物的百分比提高。术语“纯化的”并不要求绝对的纯，而是意图作为相对的名词。因此，例如，纯化的脂肪酸衍生物制剂是指其中的产物比细胞内环境中的产物浓度更高的制剂。例如，纯化的脂肪酯是指与伴随其的细胞组分(例如，多核苷酸、脂质、糖和其它肽)基本上分离的脂肪酯。在另一个实例中，纯化的脂肪酯制剂是指其中的脂肪酯基本上不含污染物(诸如发酵后可能存在的那些污染物)的制剂。例如，当样品重量的至少约50％由脂肪酯组成时，认为脂肪酯是“纯化的”。在另一个实例中，当样品重量的至少约60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或者99％或者更高百分比由脂肪酯组成时，认为脂肪酯是“纯化的”。

“取代”表示在特定位置处用另一个氨基酸替换前体蛋白序列中的氨基酸，从而产生前体蛋白的突变体。用作取代物的氨基酸可以是天然存在的氨基酸或者可以是合成的或非天然存在的氨基酸。

术语“表面活性剂”是指能够降低其溶解于的液体的表面张力的物质。它们通常由水溶性的头部和烃链或尾部组成。水溶性头部是亲水性的，并且可以是离子性的或者非离子性的。烃链是疏水性的。表面活性剂被用于大量产品，包括去污剂和清洁剂，还可用作纺织品、皮革和纸的辅剂，用于化工工艺、化妆品和药物、食品业、农业以及油回收。此外，它们还可以用于辅助提取和分离难以接近的环境或者水乳胶中的原油。根据用途的不同有4类表面活性剂。阴离子表面活性剂具有去污剂样活性，通常用于清洁用途。阳离子表面活性剂包含长链烃，通常被用于处理蛋白和合成的多聚体或者作为织物柔软剂和护发素的成分。两性表面活性剂也包含长链烃，一般用于洗发剂。非离子型表面活性剂通常用于清洁产品。

术语“合酶”是指催化合成过程的酶。本文所用的术语“合酶”包括合酶和合成酶。

术语“目的性质”是指起始基因的意图改变的性质。

术语“硫酯酶”是指具有硫酯酶活性的酶。硫酯酶包括硫酯水解酶，其被鉴定为酶类别E.C.3.1.2的成员，且可从多种来源获得。例如，VoelkerandDavies,J.Bact.,Vol.,176,No.23,pp.7320-27,1994、美国专利第5,667,997号和美国专利第5,455,167号中描述了植物硫酯酶。也可以从微生物来源获得硫酯酶，例如Akohetal.,Prog.LipidRes.,vol.43,no.6,pp.534-52,2004；DiczfalusyandAlexson,Arch.Biochem.Biophys.,vol.334,no.1,pp.104-12,1996；LarsonandKolattukudy,Arch.Biochem.Biophys.,vol.237,no.1,pp.27-37,1985；Lawsonetal.,Biochemistry,vol.33,no.32,pp.9382-88,1994；Leeetal.,Eur.J.Biochem.,vol.184,no.1,pp.21-28,1989；Naggertetal.,J.Biol.Chem.,vol.266,no.17,pp.11044-50,1991；Nieetal.,Biochemistry,vol.47,no.29,pp.7744-51,2008；SeayandLueking,Biochemistry,vol.25,no.9,pp.2480-85,1986；Spenceretal.,J.Biol.Chem.,vol.253,no.17,pp.5922-26,1978；和Zhuangetal.,Biochemistry,vol.47,no.9,pp.2789-96,2008中所述。例如，还可从蓝细菌、藻类、哺乳动物、昆虫和真菌来源获得硫酯酶。硫酯酶可以具有硫酯酶活性之外的活性，例如蛋白水解活性或氧酯水解活性。特别有用的硫酯酶是来自大肠杆菌的‘TesA(或硫酯酶I)酶，其是ChoandCronan,J.Biol.Chem.,vol.,268,no.13,pp.9238-45,1992中描述的全长TesA丝氨酸硫酯酶的截短形式。大肠杆菌‘TesA多肽包含182个氨基酸，其是切割的反应产物，其中去除了大肠杆菌TesA的26个氨基酸的前导序列。例如，大肠杆菌‘TesA具有图58的SEQIDNO:31的氨基酸序列。

术语“硫酯酶活性”是指催化硫酯切割反应的能力，硫酯切割反应通常涉及在巯基处将硫酯水解成酸和硫醇，但是也包括酯交换步骤，在酯交换中硫酯键被切割并形成新的酯键。通常，酰基ACP硫酯酶能催化酰基-酰基载体蛋白硫酯和/或脂酰辅酶A硫酯的水解切割。具有硫酯酶活性的酶的实例包括乙酰辅酶A水解酶、棕榈酰辅酶A水解酶、琥珀酰辅酶A水解酶、甲酰辅酶A水解酶、酰基辅酶A水解酶、棕榈酰蛋白硫酯酶和泛素硫酯酶。可以通过任何以下测定来确定硫酯酶活性：

酰基辅酶A水解测定：

将0.1M的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)、5μM的棕榈酰辅酶A、pH7.0的0.1M磷酸钾缓冲液(含0.01M的DTNB)用于配制完全测定混合物。因此，该测定混合物中终浓度为10μmol的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)、0.05μmol的DTNB和0.01μmol的棕榈酰辅酶A。然后将该完全测定混合物与硫酯酶混合，终体积为2.0mL。

利用13,600M^-1cm^-1的摩尔消光系数，通过监测405nm处的吸光值变化来检验对酰基辅酶A底物的切割率。

体内测定：

在诸如大肠杆菌的合适的宿主中表达目的硫酯酶。蛋白表达之后，用1NHCl将培养物酸化至约2.5的终pH，然后用等体积的乙酸乙酯提取。用羟化四甲铵(TMAH)将有机相中的游离脂肪酸衍生为各自的甲酯，然后在配备火焰电离检测器的气相色谱仪上分析产生的甲酯。

硫代内酯水解测定：

首先在0.1MHEPES缓冲液(pH7.3)中配制含25mML-高半胱氨酸硫代内酯(L-HcyT)和0.5mM5,5-二硫-双-2-硝基苯甲酸(DTNB)的试剂溶液。然后将酶加入该试剂溶液，通过在412nm处检测具有DTNB的自由巯基来监测L-HcyT水解(对于5-硫代-2-硝基苯甲酸ε＝13,600M^–1cm^-1)。

4-MU-6S-棕榈-βGlc测定：

首先制备含10μL硫酯酶和20μL底物溶液的反应混合物。底物溶液为含有0.64mMMU-6S-棕榈-β-Glc、15mM二硫苏糖醇(DTT)、0.375％(w/v)TritonX-100和0.1U来自杏仁的β-葡萄糖苷酶的McIlvain’s磷酸盐/柠檬酸盐缓冲液(pH4.0)。反应混合物于37℃孵育1小时。添加外源杏仁β-葡萄糖苷酶来定量水解反应中间体MU-6-硫代-β-葡萄糖苷。通过添加含0.025％TritonX-100的200μL0.5M碳酸钠(pH10.7)来终止水解反应，用荧光计测定释放的4-甲基伞形酮(MU)的荧光(λ_ex＝372,λ_em＝445nm)。

溶血磷脂酶测定：

将10μL硫酯酶与10μL3mM的1-油酰基-磷脂酰乙醇胺、25μL的100mMTris-HCl(pH7.0)和5μL的5mMEDTA混合来配制反应混合物。添加1.5mL的CHCl₃:CH₃OH(1:2)来终止反应，随后加水至总的水体积为0.9mL。然后利用40g悬浮于95mL1mM四硼酸钠中的SilicaGelH制备的板，通过薄层色谱法和合适的标准物来分析有机相。溶剂系统由CHCl₃:CH₃OH:H₂O(95:35:5)组成。

蛋白酶底物测定：

将含10μL酶与800μL含0.25％TritonX-100的12.5mM的Tris-HCl(pH8.0)和10μL溶于DMSO中的Cbz-Phe-ONp混合来配制反应混合物。通过监测405nm处的吸光值来测定经由底物切割释放的对硝基酚。

脂酰PNP水解测定：

首先配制含2％TritonX-100(溶于50mM磷酸钠(pH7.0)中)和10mMC₁₂-对硝基苯(酰基PNP)(溶于丙酮中)的试剂溶液。然后通过将600μL10mMC₁₂-PNP混于9.4-mL磷酸盐缓冲液中来配制C₁₂-PNP工作液。

通过向96孔板的每孔加入40μL的酰基PNP工作液，随后快速加入40μL的酶来进行测定。使溶液混合15秒，在酶标仪中于25℃读取405nm处的吸光值改变。

从硫酯形成酯：

配制含1.5μM硫酯酶、100μM豆蔻酰辅酶A、10％(v/v)甲醇和50mM磷酸钠(pH7.0)的反应混合物。将该反应混合物于20℃孵育1小时，并添加1NHCl使pH降至约2.5来终止。用等体积的乙酸乙酯对该混合物进行提取，通过GC-MS或诸如GC-FID、LC-MS或薄层色谱法的其它标准方法来测定产生的脂肪酯的量。

从酯形成酯：

配制含1.5μM硫酯酶、300μM月桂酰辅酶A、10％(v/v)甲醇和50mM磷酸钠(pH7.0)的反应混合物。将该反应混合物于20℃孵育1小时，并添加1NHCl使pH降至约2.5来终止。用等体积的乙酸乙酯对该混合物进行提取，通过GC-MS或诸如GC-FID、LC-MS或薄层色谱法的其它标准方法来测定产生的月桂酯的量。

术语“转化的”或“稳定转化的”细胞是指具有整合进基因组中的或能维持至少两代的游离质粒形式的非天然(异源)多核苷酸序列的细胞。

术语“转运蛋白”是指协助一种或多种化合物进入和/或输出生物或者细胞器的蛋白。在某些实施方案中，生产宿主功能性地表达编码ATP结合盒(ABC)转运蛋白的外源DNA序列，从而所述生产宿主将脂肪酸衍生物输出到培养基中。许多生物中都发现了ABC转运蛋白，诸如秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)、拟南芥、真养产碱杆菌(Alcaligeneseutrophns)(后来重新命名为Ralstoniaeutropha)或红串红球菌(Rhodococcuserythropolis)。ABC转运蛋白的非限制性实例包括CER5、AtMRP5、AmiS2和AtPGP1。在优选实施方案中，ABC转运蛋白是CER5(例如AY734542)。在其它实施方案中，所述转运蛋白是选自下述的外排蛋白：来自大肠杆菌的AcrAB、TolC、或AcrEF或者来自细长嗜热聚球蓝细菌(Thermosynechococcuselongates)BP-1的tll1618、tll1619和tll0139。在其它实施方案中，转运蛋白是选自黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)、秀丽隐杆线虫、结核分枝杆菌或酿酒酵母的脂肪酸转运蛋白(FATP)或任何一种本领域已知的哺乳动物FATP。例如，转运蛋白可用于提高不能自发分泌的产物的分泌或释放。当工程改造的宿主细胞能自发分泌或释放产物，但是释放缓慢或者不完全时，转运蛋白也是有用的。在那些情况下，转运蛋白可以通过使分泌步骤加速或者通过驱动分泌完成来提高分泌。

在本文中，“变体”与“突变体”可互换使用。

“载体”是指被设计成能将多核苷酸引入一种或多种细胞类型中的多核苷酸构建体。载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、盒等。在某些实施方案中，多核苷酸构建体包含编码硫酯酶(例如前体硫酯酶或成熟硫酯酶)的多核苷酸序列，该多核苷酸序列可操作地与能影响多核苷酸或基因在合适的宿主中表达的合适的前序列(例如分泌前序列)连接。

“蜡”是至少部分地包含脂肪酯的物质。在某些实施方案中，脂肪酯具有A侧和B侧，每侧都由中到长碳链构成。除了脂肪酯以外，蜡可以包含其它成分。例如，蜡可以包含烃、甾醇酯、脂肪醛、醇、酮、β-二酮、三酰甘油等。通常，在室温时，例如，在20℃时，蜡是固体。

对于基因或蛋白，“野生型”表示天然存在的多核苷酸或蛋白序列。在某些实施方案中，野生型序列指的是蛋白工程改造起点的目的序列。

脂肪酸衍生物的产生

按照本发明的实施方案，在能将碳源转化为脂肪酸衍生物的宿主细胞中表达本发明的新的硫酯酶。本发明涉及两个不同的实施方案：(1)发现突变硫酯酶能用来优化和/或“设计”脂肪酸衍生物组合物，以使这些组合物更有用，以及发现不同的突变能提供不同的目标性质；和(2)发现在不存在蜡合酶或酯合酶的情形下，硫酯酶在重组宿主细胞中发挥作用而直接产生脂肪酯产物。

按照本发明的实施方案，按本文方法、载体和细胞产生的脂肪酸衍生物组合物与用不含本发明硫酯酶变体的宿主细胞所产生的脂肪酸衍生物相比具有改动的或改变的性质。例如，还如本文所描述，利用本发明的硫酯酶能够开发出产生脂肪酸衍生物的生产工艺，与涉及野生型硫酯酶的相似工艺相比，该生产工艺具有改变的组成谱，例如，以下改变的性质：多种特定碳链长度的酰基基团的百分比、饱和或不饱和的酰基基团、不饱和位置、支链酰基基团、分支位置、羟酰基基团、酮酰基基团、产物中酯或游离脂肪酸的比例、短链(例如C₈、C₉、C₁₀、C₁₁、C₁₂、C₁₃和/或C₁₄)与长链(例如C₁₅、C₁₆、C₁₇、C₁₈、C₁₉和/或C₂₀)脂肪酸衍生物的比例或脂肪酸衍生物的收率。因此，可以将具有各种所需的性质的产物工程化，使得它们具有优化的十六烷值、辛烷值、氧化稳定性、润滑性、引火点、粘性、沸点、熔点、倾点、浊点、冷滤点、冷流性、芳香度和/或碘值。

脂肪酸衍生物可用作生物燃料和特种化学品或作为生物燃料和特种化学品的成分。脂肪酸衍生物以及从它们制备的产物包括燃料、燃料添加剂、燃料混合物、去垢剂和表面活性剂、营养补剂、聚合物、石蜡替代品、润滑剂、溶剂、个人护理品、橡胶加工添加剂、腐蚀抑制剂、乳化剂、塑料、纺织品、美容用品、纸产品、涂料、金属加工液、电介质、润滑油和软化剂。本文公开的方法和组合物允许产生具有特定的分支点、饱和度和碳链长度的脂肪酸衍生物。根据是需要较高收率比例或收率百分比的脂肪酯还是需要较低收率比例或收率百分比的脂肪酯，本文的方法和组合物还允许产生的脂肪酯的比例高于其它产物，或者脂肪酯的比例低于其它产物。例如，特别地，本文的方法和组合物允许产生的脂肪酸酯的比例大于游离脂肪酸，或者换而言之，允许脂肪酸酯的收率比例或收率百分比高于游离脂肪酸。可选地，例如，当不需要大量的脂肪酸酯时，本文的方法和组合物允许产生的脂肪酸酯的比例小于游离脂肪酸。此外，本文的方法和组合物允许产生的脂肪酸衍生物的收率提高。

可以用作生产宿主来产生脂肪酸衍生物的微生物的非限制性实例包括蓝细菌、藻类、细菌、酵母或丝状真菌。合适的生产宿主的其它非限制性实例包括植物、动物或人细胞。

可以由本文所述的生产宿主来产生醇(短链、长链、支链或不饱和的)。这些醇可以直接作为燃料或者可以用于产生脂肪酯。单独的脂肪酯或者脂肪酯与本文描述的其它脂肪酸衍生物的组合也可作为燃料或作为燃料成分。

同样，由本文所述的生产宿主产生的烃可以作为生物燃料或作为生物燃料成分。利用本文提供的教导，可以将这些基于烃的燃料设计成含有分支点、限定的饱和度和特定的碳链长度。当单独用作生物燃料或者与其它脂肪酸衍生物组合时，烃可以与合适的添加剂或其它常规燃料(例如，醇、来源于三甘油酯的柴油和基于石油的燃料)组合。

Knothe,FuelProcessingTechnology86:1059-1070,2005中表征了各种脂肪酯的十六烷值(CN)、粘度、熔点和燃烧热，通过引用将该文献全文并入本文。利用本文提供的教导，可以将生产宿主工程化，使其产生Knothe所述的任何脂肪酯。

I.脂肪酸衍生物的产生和提高生产/收率的修饰

可以将用于产生酰基辅酶A和/或脂肪酸衍生物的生产宿主进行重组修饰，使其包含过表达肽的多核苷酸序列。例如，可以修饰生产宿主来提高酰基辅酶A的产生，减少脂肪酸衍生物和脂肪酸生物合成途径中的中间体的分解代谢，或者减少脂肪酸生物合成途径中特定点的反馈抑制。除了修饰本文描述的基因外，也可以将其它细胞资源转为过量产生脂肪酸。例如可以减弱乳酸酯、琥珀酸酯和/或乙酸酯途径，并且过表达乙酰辅酶A羧化酶(acc)。对本文描述的生产宿主的修饰可以通过基因组改变、添加重组表达系统或者其组合。例如，可以利用合适的技术来修饰具体生产宿主中的一种或多种内源硫酯酶，使得突变硫酯与内源硫酯酶前体相比具有至少一种改变的性质，或者使得宿主细胞与进行基因组改变步骤之前的同一宿主细胞相比表现出至少一种改变的性质。

图2-5展示了所涉及的脂肪酸生物合成途径。以下A-G部分描述了这些途径中的步骤。不同酶催化途径中的不同步骤。因此，每个步骤都是过表达基因来产生更多酶，从而驱使产生更多脂肪酸和脂肪酸衍生物的潜在位点。也可以将编码该途径所需的酶的基因重组加入缺乏这些酶的生产宿主。最后，为了增加所需产生物的产生，可以减弱或阻断会与产生脂肪酸和脂肪酸衍生物的途径竞争的步骤。

按照本公开，本领域技术人员可以利用本发明的硫酯酶来制备产生脂肪酸衍生物的微生物，以及利用这些微生物来产生各种脂肪酸衍生物，其中这些脂肪酸衍生物具有改变的性质。还可以制备能更有效地产生这些脂肪酸衍生物的微生物，使得收率、生产率或发酵过程中的滴度达到所需的水平。

A.乙酰辅酶A-丙二酰辅酶A至酰基ACP

脂肪酸合酶(FAS)是催化酰基链起始和延长的一组肽(Marrakchietal.,BiochemicalSociety,30:1050-1055,2002)。酰基载体蛋白(ACP)与FAS途径中的酶一起控制所产生的脂肪酸的长度、饱和度和分支水平。该途径中的步骤由脂肪酸生物合成(fab)和乙酰辅酶A羧化酶(acc)基因家族的酶催化。根据所需的产物，可以减弱或者过表达这些基因中的一个或多个。

I.脂肪酸生物合成途径：乙酰辅酶A或丙二酰辅酶A至酰基ACP

生产宿主中的脂肪酸生物合成途径使用前体乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A。该途径中的步骤由脂肪酸生物合成(fab)和乙酰辅酶A羧化酶(acc)基因家族的酶催化。Heathetal.,Prog.LipidRes.40(6):467-97,2001中描述了这个途径，通过引用将该文献并入本文。

乙酰辅酶A被乙酰辅酶A羧化酶(Acc，由四个单独的基因accABCD编码的多亚基酶)羧化，形成丙二酰辅酶A。丙二酸基团由丙二酰辅酶A:ACP转酰基酶(FabD)转移给ACP，形成丙二酰ACP。然后发生缩合反应，丙二酰ACP与乙酰辅酶A合并，形成β-酮脂酰ACP。β-酮脂酰ACP合酶III(FabH)启动FAS循环，而β-酮脂酰ACP合酶I(FabB)和β-酮脂酰ACP合酶II(FabF)参与随后的循环。

然后，重复步骤循环，直到产生具有合适长度的饱和脂肪酸。首先，β-酮脂酰ACP被NADPH还原，形成β-羟酰ACP。这个步骤由β-酮脂酰ACP还原酶(FabG)催化。然后，β-羟酰ACP脱水，形成反式-2-烯酰-ACP。β-羟酰ACP脱水酶/异构酶(FabA)或β-羟酰ACP脱水酶(FabZ)催化这个步骤。NADPH依赖性反式-2-烯酰-ACP还原酶I、II或III(分别为FabI、FabK或FabL)还原反式-2-烯酰-ACP，形成酰基ACP。由β-酮脂酰-ACP合酶I或β-酮脂酰-ACP合酶II(分别为FabB或FabF)介导的丙二酰-ACP和酰基ACP的缩合起始随后的循环。

II.修饰脂肪酸生物合成途径来增加酰基ACP产生

可以将生产宿主生物进行工程化，使其过量产生乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A。这些生产宿主生物包括植物、动物或人细胞。诸如蓝细菌、藻类、细菌、酵母或丝状真菌的微生物可以用作生产宿主。可以作为生产宿主的微生物的非限制性实例包括大肠杆菌、酿酒酵母、解脂假丝酵母(Candidalipolytica)、聚球蓝细菌(Synechococcus)、集胞蓝细菌(Synechocystis)、衣藻(Clamydomonas)、节杆菌(Arthrobacter)AK19、粘红酵母、不动杆菌菌株M-1、解脂假丝酵母和其它产油微生物。可以对生产宿主联合地或者单独地进行几种不同的修饰，以实现乙酰辅酶A/丙二酰辅酶A/脂肪酸和脂肪酸衍生物产生的增加。

例如，为了增加乙酰辅酶A产生，可以在生产宿主中表达以下基因中的一个或多个：pdh、panK、aceEF(编码丙酮酸盐和2-酮戊二酸脱氢酶复合物的E1p脱氢酶组分和E2p二氢硫辛酰胺酰基转移酶组分)、fabH、fabD、fabG、acpP和fabF。在其它实例中，可以在生产宿主中表达编码脂酰辅酶A还原酶和醛脱羰酶的其它基因。本领域已知的是，可以构建含有一个或多个上述基因的质粒，其中所有基因受组成型启动子或者可控启动子的控制。这些基因的示例性GenBank登录号列在圆括号中：pdh(BAB34380,AAC73227,AAC73226)、panK(又称为coaA,AAC76952)、aceEF(AAC73227,AAC73226)、fabH(AAC74175)、fabD(AAC74176)、fabG(AAC74177)、acpP(AAC74178)和fabF(AAC74179)。

此外，可以通过以下方式减弱或者敲除工程微生物中fadE、gpsA、ldhA、pflb、adhE、pta、poxB、ackA和/或ackB的表达水平：用含有相应基因的无效突变或者缺失突变的条件性复制质粒或者非复制质粒进行转化，或者替换启动子或增强子序列。这些基因的示例性GenBank登录号列在圆括号中：fadE(AAC73325)、gspA(AAC76632)、ldhA(AAC74462)、pflb(AAC73989)、adhE(AAC74323)、pta(AAC75357)、poxB(AAC73958)、ackA(AAC75356)和ackB(BAB81430)。所得到的工程化生产宿主在合适的环境下生长时具有增加的乙酰辅酶A产生水平。

而且，可以通过用从头合成的质粒中包括的accABCD(例如GenBank登录号AAC73296,EC6.4.1.2)将上述生产宿主进行基因工程从而实现丙二酰辅酶A的过量产生。可以通过在重新合成的质粒中再包含编码脂肪酶(例如，GenBank登录号CAA89087和CAA98876)的基因实现脂肪酸的过量产生。

因此，在某些实例中，将乙酰辅酶A羧化酶过表达使其胞内浓度相对天然表达水平提高至少约2倍、至少约5倍或至少约10倍。

此外，可以利用PlsB(例如，GenBank登录号AAC77011)D311E突变体来增加可用的酰基辅酶A的量。

此外，可以在生产宿主中包含sfa基因(FabA的抑制基因，例如登录号AAN79592)的过表达来增加单不饱和脂肪酸的产生(Rocketal.,J.Bacteriology178:5382-5387,1996)。

B.利用硫酯酶使酰基ACP和/或酰基辅酶A转变为脂肪酯

在脂肪酸合成的典型微生物过程模型中，乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A通过一系列步骤被转化形成酰基ACP链。然后经由一系列可选的酶学步骤使酰基ACP转化为各种终产物，包括脂肪酸衍生物。例如，通常，通过硫酯酶、酰基辅酶A连接酶/合成酶和酯合酶的联合连续反应使酰基ACP转化为脂肪酯。这些酶在代谢途径中的商业用途的限制是需要从脂酰基ACP前体产生脂酰辅酶A底物，这需要至少两个酶学步骤和两个磷酸酐键耗费的代谢能量。用硫酯酶直接产生脂肪酯减轻了由这两个酶学步骤造成的ATP损失。最近得到证实，脂肪酶(其天然“醇”底物是水)也可以用来体外催化制备生物柴油的酯交换反应(即将三酰甘油和甲醇转化成脂肪酸甲酯和甘油)。然而，脂肪酶在胞内产生时通常对细胞有毒。

尽管已经公布了硫酯酶对水具有特异性，但本发明发现，在存在足量的醇的条件下，醇可以成为硫酯酶可接受的底物。在这种情况下，硫酯酶可以催化脂酰基酶中间体的醇解，就如同脂肪酶在体外进行的一样。因此，在正确的条件下，如果提供充足水平的合适的醇来驱动醇解反应，则能接受脂肪酯作为底物来形成脂肪酶中间体的酶可以用来合成所需的脂肪酸酯，所述脂肪酶中间体随后通过水解或酯交换被切割。具有可从酰基ACP直接产生酯这种能力的酶的实例除硫酯酶以外包括酰基转移酶、脂肪酶、酯酶和蛋白酶。可用的硫酯酶可以是如本文所定义的天然存在的硫酯酶和/或前体硫酯酶，或者可以是按照本公开制备的突变硫酯酶。本领域技术人员能确定利用特定酶从酰基ACP直接产生脂肪酯的适用度。例如，实施例32所提供的测定可用于测定直接的酯产生。

按照本发明的该方面，在存在或不存在酯合酶和/或脂酰辅酶A连接酶/合成酶的情况下，可以利用硫酯酶来直接产生脂肪酯。例如，可催化重组宿主菌株中脂肪酯直接产生的硫酯酶的表达可用来增补还表达酯合酶的菌株中的脂肪酯产生。此外，可催化重组宿主细胞中脂肪酯直接产生的硫酯酶的表达可用在没有酯合酶表达或酯合酶表达较低的情况中。

可以利用已进行修饰而具有与前体硫酯酶相比改变的性质的突变硫酯酶

C.酰基ACP至脂肪酸

I脂肪酸生物合成途径：酰基ACP至脂肪酸

如上文所述，乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A经过几个步骤的加工形成酰基ACP链。酶sn-甘油-3-磷酸酰基转移酶(PlsB)催化酰基基团从酰基ACP或酰基辅酶A转移到甘油-3-磷酸的sn-1位置。因此，PlsB是磷脂合成中的关键调节酶，磷脂合成是脂肪酸途径的一部分。抑制PlsB会导致长链酰基ACP水平增加，该反馈将抑制该途径中的早期步骤，这涉及诸如accABCD、fabH和fabI的基因。通过例如硫酯酶过表达将该调控解偶联导致脂肪酸产生增加。

II.修饰脂肪酸生物合成途径而产生所需类型或比例的脂肪酸

按照本发明，表达的硫酯酶与宿主菌株中的天然或内源硫酯酶相比具有改变的性质。为了将生产宿主工程化使其产生脂肪酸衍生物的同质群体，可以将一个或多个内源基因减弱或功能上缺失，并因此，可以表达本发明的一种或多种硫酯酶。例如，可以通过减弱利用C_18:1-ACP的硫酯酶C₁₈(例如GenBank登录号AAC73596和P0ADA1)并表达对C₁₀底物(即每个底物均含10个碳长的碳链)具有增加的特异性和/或活性(例如催化速率)的改变的硫酯酶来产生C₁₀脂肪酸衍生物(即每个脂肪酸衍生物均含10个碳长的碳链)。这产生了更加同质的脂肪酸衍生物群体，该脂肪酸衍生物群体中碳链长度为10的脂肪酸增多。在另一个实例中，通过减弱产生非C₁₂脂肪酸的内源硫酯酶并表达对C₁₂底物具有增加的特异性和/或活性(例如催化速率)的改变的硫酯酶来产生C₁₂脂肪酸衍生物。在另一个实例中，通过减弱产生非C₁₄脂肪酸的内源硫酯酶并表达对C₁₄底物具有增加的特异性和/或活性(例如催化速率)的改变的硫酯酶来产生C₁₄脂肪酸衍生物。在另一个实例中，产物混合物中短链(例如C₈、C₉、C₁₀、C₁₁、C₁₂、C₁₃和/或C₁₄)脂肪酸衍生物与其它非短链脂肪酸衍生物相比的收率比例增加。在另一个实例中，还可以实现产物混合物中短链(例如C₈、C₉、C₁₀、C₁₁、C₁₂、C₁₃和/或C₁₄)脂肪酸衍生物与其它非短链脂肪酸衍生物相比的收率比例降低。在另一个实例中，通过表达具有提高的催化速率和/或体内产生与收率的改变的硫酯酶可以产生收率更高和/或改善的游离脂肪酸衍生物。在另一个实例中，通过应用一种或多种特定的硫酯酶突变体可以使产生的脂肪酯与其它产物(例如游离脂肪酸)相比的收率比例或收率百分比增加或降低。利用本领域内已知的方法，例如通过细胞裂解之后进行放射性方法、HPLC、LC-MS和GC-MS可以证实乙酰辅酶A、丙二酰辅酶A和脂肪酸的过量产生。

在可选的实施方案中，本发明的硫酯酶可以与内源硫酯酶在宿主菌株中联合表达。在另一个可选的实施方案中，利用本领域技术人员已知的合适的基因组改变技术可以对一种或多种内源硫酯酶进行修饰，使得突变硫酯酶与内源硫酯酶前体相比具有至少一种改变的性质，和/或使得宿主细胞与应用所述基因组改变技术之前的宿主细胞相比表现出至少一种改变的性质。

D.脂肪酸至酰基辅酶A

I.脂肪酸转化为酰基辅酶A

酰基辅酶A合酶(ACS)通过两步机制将游离脂肪酸酯化成酰基辅酶A。游离脂肪酸首先通过ATP焦磷酸解作用转化成酰基AMP中间体(腺苷酸)。然后，腺苷酸中活化的羰基碳与辅酶A的巯基偶合，释放出AMP和酰基辅酶A终产物。参见Shockeyetal,Plant.Physiol.129:1710-1722,2002。

大肠杆菌ACS酶FadD和脂肪酸转运蛋白FadL通常是脂肪酸摄取系统的重要部分。FadL介导脂肪酸向细菌细胞内的转运，FadD介导酰基辅酶A酯的形成。当没有其它碳源可以利用时，细菌摄取外源脂肪酸，将其转化为酰基辅酶A酯，酰基辅酶A酯与转录因子FadR结合并抑制fad基因的表达，fad基因编码的蛋白负责脂肪酸转运(FabL)、活化(FadD)和β氧化(FadA、FadB、FadE和FadH)。当有备选碳源可以利用时，细菌将脂肪酸合成为酰基ACP，然后酰基ACP被用于磷脂合成，而不是作为β氧化的底物。因此，酰基辅酶A和酰基ACP是脂肪酸的独立来源，会产生不同的终产物。参见Cavigliaetal.,J.Biol.Chem.279(12):1163-1169,2004。

II.修饰脂肪酸生物合成途径而增加脂肪酸至酰基辅酶A的转化

可以利用已知的肽将生产宿主进行工程化，使其产生不同长度的脂肪酸，脂肪酸可以转化为酰基辅酶A。一种制备脂肪酸的方法涉及增加一种或者多种酰基辅酶A合酶肽(EC6.2.1.-)的表达或者表达所述这些酶的更有活性的形式。

表1列出了能够被表达从而产生酰基辅酶A和脂肪酸衍生物的酰基辅酶A合酶。可以测试这些酰基辅酶A合酶来优化使用脂酰辅酶A作为底物的任何途径。利用生物信息学和合成基因，可以在生产菌株中表达异源fadD基因，并评价它们产生生物柴油和可能的生物原油的能力。

表1：酰基辅酶A合酶

基于它们与大肠杆菌fadD的相似性，选择以下同源基因进行合成和评价：

来自结核分枝杆菌H37Rv的fadDD35[NP_217021]；

来自枯草芽孢杆菌的yhfL[NP_388908]；

来自铜绿假单胞菌PAO1的fadD1[NP_251989]；

来自酿酒酵母的编码Faa3p的fadD同源物[NP_012257]。

可以用于产生酰基辅酶A以及脂肪酸衍生物的来自真核生物的其它脂肪酸酰基辅酶A合酶包括Shockeyetal.,Plant.Physiol.129:1710-1722,2002(拟南芥)、Cavigliaetal.,J.Biol.Chem.279:1163-1169,2004(大鼠)以及Knolletal.,J.Biol.Chem.269(23):16348-56,1994(酵母)中描述的那些。编码这些合酶的基因序列是本领域已知的。参见例如Johnsonetal.,J.Biol.Chem.269:18037-18046,1994；Shockeyetal.,Plant.Physiol.129:1710-1722,2002；Blacketal.,J.BiolChem.267:25513-25520,1992。这些真核酰基辅酶A合酶尽管缺乏与大肠杆菌FadD序列的高同源性，但在敲除FadD的大肠杆菌中可以补充FadD活性。

A.酰基辅酶A至脂肪醇

1.酰基辅酶A至脂肪醇的转化

酰基辅酶A被NADH依赖性酰基辅酶A还原酶(例如，Acr1)还原为脂肪醛。然后，脂肪醛被NADPH依赖性醇脱氢酶(例如，YqhD)还原为脂肪醇。可选地，脂肪醇形成酰基辅酶A还原酶(FAR)催化酰基辅酶A还原为脂肪醇和辅酶ASH。FAR使用NADH或NADPH作为该四电子还原反应中的辅助因子。尽管产生醇的FAR反应经由醛中间体进行，但并不释放游离醛。因此，形成醇的FAR与执行酰基辅酶A的二电子还原的酶不同并产生游离脂肪醛作为产物(参见ChengandRussell,J.Biol.Chem.,279(36):37789–37797,2004；Metzetal.,PlantPhysiol.,122:635-644,2000)。

2.修饰脂肪酸生物合成途径而增加酰基辅酶A至脂肪醇的转化

可以利用已知的多肽将生产宿主进行工程化，使其由酰基辅酶A产生脂肪醇。一种制备脂肪醇的方法涉及增加脂肪醇形成酰基辅酶A还原酶(由诸如acr1的基因编码(EC1.2.1.50/1.1.1))、酰基辅酶A还原酶(EC1.2.1.50)和/或醇脱氢酶(EC1.1.1.1)的表达或者表达这些酶的更具活性的形式。

通常将脂肪醇描述为基于烃的表面活性剂。它们也作为表面活性剂的合适组分。为了产生表面活性剂，修饰生产宿主，使其能由可再生的碳源产生表面活性剂。这类生产宿主包括第一外源多核苷酸序列和第二外源多核苷酸序列，所述第一外源多核苷酸序列编码能够将脂肪酸转化为脂肪醛的蛋白，所述第二外源多核苷酸序列编码能够将脂肪醛转化为醇的蛋白。在某些实例中，第一外源多核苷酸序列编码脂肪酸还原酶。在一个实施方案中，第二外源多核苷酸序列编码哺乳动物微粒体醛还原酶或者长链醛脱氢酶。在另一个实例中，第一和第二外源多核苷酸序列来自于节杆菌AK19、粘红酵母、不动杆菌菌株M-1或者解脂假丝酵母。在一个实施方案中，第一和第二异源多核苷酸序列形成来自不动杆菌菌株M-1株或者解脂假丝酵母的多酶复合物。

编码可用于表面活性剂制备的脂肪酸至长链醇转化蛋白的异源DNA序列的其它来源包括但不限于，高山被孢霉(Mortierellaalpina)(ATCC32222)、弯曲隐球菌(Crytococcuscurvatus，又称为Apiotricumcurvatum)、Alcanivoraxjadensis(T9T＝DSM12718＝ATCC700854)、不动杆菌HO1-N(ATCC14987)和混浊红球菌(Rhodococcusopacus)(PD630DSMZ44193)。

在一个实例中，脂肪酸衍生物是饱和的或者不饱和的表面活性剂产物，其碳链长度为约6个-约36个碳原子、约8个-约30个碳原子、约10-约26个碳原子、约12-约20个碳原子或者约12-约16个碳原子。在另一个实例中，表面活性剂产物的碳链长度为约10-约18个碳原子或者约12-约14个碳原子。

用于产生表面活性剂的合适生产宿主包括真核或者原核微生物。示例性的生产宿主包括节杆菌AK19、粘红酵母、不动杆菌菌株M-1、拟南芥、解脂假丝酵母、酿酒酵母和诸如集胞蓝细菌(Synechocystisspp.)和聚球蓝细菌(Synechococcusspp.)的蓝细菌、诸如衣藻的藻类和工程化的能过表达乙酰辅酶A羧化酶的大肠杆菌。也可以使用具有合成高水平的脂质和油形式的表面活性剂前体的先天能力的生产宿主，例如混浊红球菌、节杆菌AK19、粘红酵母和工程化的能表达乙酰辅酶A羧化酶的大肠杆菌、以及其它产油蓝细菌、细菌、酵母和真菌。

B.脂肪醇至脂肪酯

可以利用已知的多肽将生产宿主工程化，使其产生不同长度的脂肪酯。一种制备脂肪酯的方法包括增加一种或者多种醇O-乙酰基转移酶肽(EC2.3.1.84)的表达或者表达这些酶的更具活性的形式。这些肽通过将乙酰辅酶A和醇转化为辅酶A和酯而催化醇的乙酰化。在某些实例中，醇O-乙酰基转移酶肽可以与选定的硫酯酶肽、FAS肽和脂肪醇形成肽联合表达，从而可以控制碳链长度、饱和度和分支度。在某些情况下，可以共表达bkd操纵子从而产生支链脂肪酸前体。

本文使用的醇O-乙酰基转移酶肽包括属于酶分类号EC2.3.1.84的肽，以及能够催化乙酰辅酶A和醇转化成辅酶A和酯的任何其它肽。此外，本领域技术人员应当理解，醇O-乙酰基转移酶肽还能催化其它反应。

例如，某些醇O-乙酰基转移酶肽除了脂肪醇和/或乙酰辅酶A硫酯外，还能接受其它底物，诸如其它醇和其它酰基辅酶A硫酯。因此，这些非特异性或者特异性不同的醇O-乙酰基转移酶肽也包括在内。各种醇O-乙酰基转移酶肽的序列是公开提供的。用于检测醇O-乙酰基转移酶肽活性的测定是本领域已知的。此外，还可以将O-乙酰基转移酶工程化，赋予其对供体酰基基团或者受体醇部分的新的活性和/或特异性。可以通过本领域记载的合理的和演化的方法产生工程化酶。

C.酰基辅酶A至脂肪酯

1.脂肪酯的产生

脂肪酯由酰基辅酶A:脂肪醇酰基转移酶(例如酯合酶)合成，该酶将长链脂肪醇与脂酰辅酶A通过酯键连接。已知酯合酶及其编码基因可以来自霍霍巴植物和细菌不动杆菌菌株ADP1(以前称为醋酸钙不动杆菌(Acinetobactercalcoaceticus)ADP1)。细菌酯合酶是双功能酶，其表现出酯合酶活性以及由二酰甘油底物和脂酰辅酶A形成三酰甘油的能力(酰基辅酶A:二甘油酰基转移酶(DGAT)活性)。基因wax/dgat编码酯合酶和DGAT。参见Chengetal.,J.Biol.Chem.279(36):37798–37807,2004；KalscheuerandSteinbuchel,J.Biol.Chem.278:8075-8082,2003。酯合酶还可以用于产生本文所述的能够作为诸如生物柴油的燃料的某些脂肪酯。

2.修饰脂肪酸生物合成途径而利用酯合酶产生脂肪酯

可以利用已知的多肽，设计由酰基辅酶A和醇产生包括蜡在内的脂肪酯。一种制备脂肪酯的方法包括增加一种或多种酯合酶(EC2.3.1.20,2.3.1.75)的表达，或者是表达这些酶的更具活性的形式。各种酯合酶肽序列可公开获得。美国专利第7,118,896号中提供了测定酯合酶活性的方法，通过引用将该专利全文并入本文。

在某些实施方案中，如果需要的产物是基于酯的生物燃料，则可以修饰生产宿主，使其能从可再生的能源产生酯。这类生产宿主包括编码酯合酶的外源基因，该酯合酶的表达能赋予所述生产宿主从可再生的能源合成饱和的、不饱和的或者支链脂肪酯的能力。在某些实施方案中，生物还可以表达编码以下示例性蛋白的基因：脂肪酸延长酶、酰基辅酶A还原酶、酰基转移酶、酯合酶、脂酰转移酶、二酰甘油酰基转移酶、硫酯酶和/或酰基辅酶A蜡醇酰基转移酶。在可选的实施方案中，所述生物表达编码双功能酯合酶/酰基辅酶A:二酰甘油酰基转移酶的基因。例如，所述双功能酯合酶/酰基辅酶A:二酰甘油酰基转移酶可以选自来自以下的多酶复合体：加州希蒙得木、不动杆菌菌株ADP1(以前称为醋酸钙不动杆菌ADP1)、博克岛食烷菌(Alcanivoraxborkumensis)、铜绿假单胞菌、Fundibacterjadensis、拟南芥或真养产碱杆菌(后重新命名为Ralstoniaeutropha)。在一个实施方案中，脂肪酸延长酶、酰基辅酶A还原酶或者蜡合酶获自和/或来自真养产碱杆菌(后重新命名为Ralstoniaeutropha)或其它在文献中已知能产生酯诸如蜡或脂肪酯的生物的多酶复合体。

编码可用于产生脂肪酯的酯合成蛋白的异源DNA序列的其它来源包括，但不限于高山被孢霉(例如，ATCC32222)、弯曲隐球菌(又称为Apiotricumcurvatum)、Alcanivoraxjadensis(例如T9T＝DSM12718＝ATCC700854)、不动杆菌HO1-N(例如ATCC14987)和混浊红球菌(例如PD630，DSMZ44193)。

可用于产生脂肪酯的生产宿主可以是真核或者原核微生物。产生脂肪酯的生产宿主的非限制性实例包括酿酒酵母、聚球蓝细菌、集胞蓝细菌、衣藻、解脂假丝酵母、大肠杆菌、节杆菌AK19、粘红酵母、不动杆菌菌株M-1、解脂假丝酵母和其它产油微生物。

在一个实例中，使用来自不动杆菌ADP1的、位于基因座AAO17391的酯合酶(在KalscheuerandSteinbuchel,J.Biol.Chem.278:8075-8082,2003中有描述，通过引用将该文献并入本文)。在另一个实例中，使用来自加州希蒙得木的、位于基因座AAD38041的酯合酶。

在某些实施方案中，用本文的方法和组合物产生的酯从宿主细胞分泌或释放，因此可在细胞外回收它们。任选地，诸如FATP家族成员的酯输出蛋白(exporter)可以用来协助酯释放入胞外环境。合适的酯输出蛋白的非限制性实例是来自黑腹果蝇的、位于基因座NP_524723的脂肪酸(长链)转运蛋白CG7400-PA同种型A。

D.酰基ACP、酰基辅酶A至烃

1.来自特定微生物的烃

已知多种微生物能产生烃，如烷烃、烯烃和类异戊二烯。这些烃中的许多来源于脂肪酸生物合成。通过控制天然生产宿主中与脂肪酸生物合成相关的基因，可以控制这些烃的产生。

例如，在布朗葡萄藻(Botryococcusbraunii)中，烃的生物合成通过脂肪醛的脱羰作用实现。由诸如脂酰辅酶A还原酶的酶还原脂酰硫酯而产生脂肪醛。因此，通过将布朗葡萄藻工程化，使其表达能控制进入烷生物合成的脂肪酸的链长的特定基因(诸如硫酯酶)，可以控制最终烷的结构。在布朗葡萄藻中表达导致支链脂肪酸生物合成的酶将产生支链烷。影响去饱和脂肪酸产生的基因的引入将产生烯烃。这些基因的其它组合可以进一步控制生成的烃的最终结构。

为了产生更高水平的天然的或者工程化的烃，可以表达、过表达或者减弱参与脂肪酸及其前体的生物合成或者参与其它产物的降解的基因。这些方法中的每一种都可用于在通过脂肪醇的还原产生烷的弗尼斯弧菌(Vibriofurnissii)M1和其它弗尼斯弧菌菌株中产生烷。除了弗尼斯弧菌外，可以使用其它利用脂肪酸途径的产烷生物。

这些方法中的每一种还可用于在藤黄微球菌(Micrococcusleuteus)、嗜麦芽糖寡养单胞菌的菌株和相关微生物中产生烯烃。这些微生物产生来源于脂肪酸前体的头对头缩合的长链烯烃。利用本文描述的方法控制脂肪酸前体的结构和水平将形成具有不同链长、分支特性和饱和度的烯烃。

还可以利用蓝细菌作为合适的生产宿主来产生脂肪酸衍生物，例如脂肪醇、脂肪酯和烃。例如集胞蓝细菌PCC6803和细长聚球蓝细菌(Synechococcuselongatus)PCC7942可以作为生产宿主，并且可以利用标准分子生物学技术将它们工程化(Thiel,Geneticanalysisofcyanobacteria(蓝细菌的遗传分析),in1TheMolecularBiologyofCyanobacteria,AdvancesinPhotosynthesisandRespiration(蓝细菌的分子生物学-光合作用和呼吸作用的研究进展)581-611(KluwerAcademicPublishers1994；KoksharovaandWolk,Appl.Microbiol.Biotechnol.,58:123-137,2002，通过引用将该文献的内容并入本文。可以在这些生物中容易地鉴定并分离出脂肪酸生物合成基因。

并且，许多蓝细菌是诸如十七烷的烃的天然生产者，因此含有烃生物合成基因，可以将所述烃生物合成基因解除调控和过表达并联合操纵其脂肪酸生物合成基因，从而增加烃的产生。

与其它细菌不同，某些蓝细菌(例如，集胞蓝细菌PCC6803)在它们的脂质中含有多不饱和脂肪酸(Murata,PlantCellPhysiol.,33:933-941,1992)，因此具有产生多不饱和脂肪酸衍生物的固有能力。最重要的是，蓝细菌是光合生物，通过采集阳光和固定二氧化碳来合成全部细胞碳。所以，蓝细菌中产生的脂肪酸衍生物直接来源于CO₂。

2.由伯醇还原产生烃

还可以利用用于还原伯醇的演变的氧化还原酶来产生烃。用脂肪伯醇在诸如弗尼斯弧菌M1的微生物中产生烷是已知的。参见例如Park,J.Bacteriol.,187:1426-1429,2005，通过引用将该文献的内容并入本文。可以用于从脂肪醇产生烃的氧化还原酶的一个实例是NAD(P)H依赖性氧化还原酶。可以利用演变基因工程产生合成的NAD(P)H依赖性氧化还原酶，并在生产宿主中表达该酶以产生脂肪酸衍生物。

使脂肪醇还原酶“演变”从而具有所需活性的方法是已知的，并可由本领域技术人员实施(KolkmanandStemmer,NatBiotechnol.19:423-8,2001；Nessetal.,AdvProteinChem.55:261-92,2000；MinshullandStemmer,CurrOpinChemBiol.3:284-90,1999；HuismanandGray,CurrOpinBiotechnol.Aug；13:352-8,2002；以及美国专利公开号2006/0195947)，通过引用将以上所有内容并入本文。

通过诸如易错PCR、位点特异性随机诱变、位点特异性饱和度诱变或者定点特异性诱变的标准方法产生NAD(P)H依赖性氧化还原酶的文库。此外，还可以通过将天然存在的NAD(P)H依赖性氧化还原酶编码序列进行“混排(shuffling)”来产生文库。该文库在诸如大肠杆菌的合适的生产宿主中表达。然后，对表达氧化还原酶文库的不同成员的个体菌落进行可以催化脂肪醇还原的氧化还原酶的表达的分析。

例如，每个细胞可以作为全细胞生物转化、细胞提取物或透化细胞进行分析。也可以分析从细胞纯化的酶。利用分光光度法或者荧光法监测NAD(P)H的脂肪醇依赖性氧化来鉴定脂肪醇还原酶。通过GC/MS、TLC或者其它合适的方法监测烷的产生。

采用这种方式鉴定的氧化还原酶用于产生烷、烯和相关的支链烃。这可以在体外或者体内实现。通过在诸如本文描述的那些产生脂肪醇的生物中表达演变的脂肪醇还原酶基因来实现体内产生。脂肪醇作为产生烷的醇还原酶的底物。也可以将其它氧化还原酶工程化，使其能催化该反应，例如利用分子氢、谷胱甘肽、FADH或者其它还原性辅酶的那些氧化还原酶。

3.酰基ACP至酮和/或烯烃的转化

如PCT公开号2008/147781A2中所述，通过酰基缩合酶的作用可以将酰基ACP转化为酮和/或内烯烃，通过引用将本公开内容并入本文。如在‘781公开中所述，酰基缩合肽包括能利用本文所述的方法催化酰基ACP、酰基辅酶A、酰基AMP、脂肪酸和以上的混合物进行缩合的肽。在某些实施方案中，这些酰基缩合肽具有高、中或低底物特异性。在某些实例中，酰基缩合肽的底物特异性较高，仅接受特定链长的底物。此外，本领域技术人员应当理解，某些酰基缩合肽还催化其它反应。‘781公开中公开了酰基缩合酶的实例。此外，‘781公开描述了可用于产生诸如内烯烃的烃的腺苷酸化蛋白、脱水酶和脱氢酶。

例如，利用‘781出版物中公开的多核苷酸和蛋白，可以将重组生物工程化，从而产生具有限定结构特征(例如分支度、饱和度或碳链长度)的烃和脂肪酮。制备烃的一个方法涉及增加一种或多种酰基缩合酶(使酰基辅酶A、酰基ACP、酰基AMP、酰基酯、脂肪酸或以上的混合物中的两个或更多个缩合的酶)的表达或表达这些酶的更具活性的形式。本领域技术人员应当理解，从这类缩合反应产生的产物根据缩合的酰基链而不同。可以产生的产物包括，例如，烃和诸如脂肪酮的烃中间体。可以通过在重组生物中表达各种酶或减弱各种酶的表达而将脂肪酮、烃和烃中间体改造为具有特定的碳链特性。按照本发明，本发明的突变硫酯酶可以用来操控酰基类碳链长度的范围。因此，通过利用具有特定底物特异性或选择性的突变硫酯酶，可以影响下游反应，以便产生预定的烯烃或酮产物谱。

4.脂肪酸至醛的转化

通过羧酸还原酶基因的作用可以将硫酯酶切割得到的脂肪酸转化为醛。醛本身可以是有用的产物，或者它们可以作为其它酶学催化反应的底物，例如，用于通过醇脱氢酶的酶学反应来产生脂肪醇，或用于通过脱羰酶的酶学反应来产生烷。按照本文的组合物和方法，可以操控羧酸还原酶的脂肪酸底物，以便获得醛或脂肪醇产物的预定的产物谱。

E.脂肪酸衍生物的释放—利用或不利用转运蛋白

如本文所描述，按照本文的方法、组合物、载体和宿主细胞产生的脂肪酸衍生物可以被分泌或自发释放，以便在胞外回收脂肪酸衍生物产物。自发分泌的速度可以足够快或不足够快，释放的水平可以足够完全或不足够完全。因此，任选地，转运蛋白可以用来促进脂肪酸衍生物运出生产宿主。已知转运蛋白和外排蛋白能够分泌多种化合物，并且能够被天然修饰为对特定类型的脂肪酸衍生物具有选择性。合适的转运蛋白的非限制性实例是ATP结合盒(ABC)转运蛋白、外排蛋白以及脂肪酸转运蛋白(FATP)。合适的转运蛋白的其它非限制性实例包括来自诸如秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)、拟南芥、真养产碱杆菌(Alkaligeneseutrophus)以及红串红球菌(Rhodococcuserythropolis)的生物的ABC转运蛋白。示例性的ABC转运蛋白包括CER5、AtMRP5、AmiS2或者AtPGP1。在优选的实施方案中，ABC转运蛋白是CER5(例如AY734542)。可以将含有表达合适的转运蛋白的基因的载体插入蛋白生产宿主来增加或驱动脂肪酸衍生物的释放。

按照本发明，脂肪酸衍生物产物的产生不需要对转运蛋白或外排蛋白修饰，可以根据释放脂肪酸衍生物的内在能力来选择生产宿主。而且，例如，简单地按照本发明的公开内容构建宿主细胞，已知不能被分泌的脂肪酸衍生物产物可以被分泌或自发释放。产物产生和释放到发酵液中的效率可以表达为胞内产物与胞外产物的比。在某些实例中，所述比可以是约100:1、50:1、20:1、10:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:10、1:20、1:30、1:40或1:50。

II.脂肪酸衍生物的碳链特性的选择

可以按照需要产生具有特定分支点、饱和度、碳链长度和酯特性的脂肪酸衍生物。可以选择天然产生特定衍生物的微生物作为生产宿主，并且在某些情况下，可以操孔它们的内源酶，进而产生具有所需特性的脂肪酸衍生物。可选地，可以将表达能够产生特定脂肪酸衍生物的酶的基因合适地插入生产宿主微生物中。

在某些实例中，可以将来自不同物种或工程化变体的外源FAS基因在生产宿主中表达，以实现与天然生产宿主的脂肪酸在结构上(例如长度、分支度，不饱和度等)不同的脂肪酸的生物合成。还可以选择或者改造这些异源基因产物，使其不受生产宿主细胞内的天然调控机制的影响，并因此能够控制所需商业产物的产生。例如，可以在合适的生产宿主中表达来自枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、链霉菌(Stretomycesspp.)、雷尔氏菌(Ralstonia)、红球菌(Rhodococcus)、棒状杆菌(Corynebacteria)、短杆菌(Brevibacteria)、分枝杆菌(Mycobacteria)、产油酵母等的FAS酶。这类外源酶的表达能够改变所产生的脂肪酸的结构。

当生产宿主经工程化而能产生具有特定不饱和度、分支度或者碳链长度的脂肪酸时，所得到的工程化的脂肪酸可以用于产生脂肪酸衍生物。由这类生产宿主产生的脂肪酸衍生物会表现出工程化脂肪酸的特性。

例如，可以将生产宿主工程化，使其产生支链短链脂肪酸，然后这些支链短链脂肪酸可以被生产宿主用来产生支链短链脂肪醇。同样，可以通过将生产宿主工程化，使其产生具有限定分支水平、不饱和度和/或碳链长度的脂肪酸来制备烃，并因此产生同质的烃群体。可以利用其它的步骤来提高所得产物的同质性。例如，当需要不饱和醇、脂肪酯或者烃时，可以将生产宿主生物工程化，使其产生低水平的饱和脂肪酸，另外可以对宿主进行修饰，使其表达其它去饱和酶，从而减少饱和产物的产生。

A.支链和环状部分

1.支链和环状脂肪酸衍生物工程化

脂肪酸是产生脂肪酸衍生物的关键中间体。利用支链或者环状脂肪酸可以制备含有分支点、环状部分及其组合的脂肪酸衍生物。

例如，大肠杆菌天然产生直链脂肪酸(sFA)。为了将大肠杆菌工程化而产生支链脂肪酸(brFA)，可以将提供支链前体的数个基因(例如，bkd操纵子)引入生产宿主并使其表达，从而允许由支链前体起始脂肪酸生物合成(例如fabH)。可以表达或过表达bkd、ilv、icm和fab基因家族来产生支链脂肪酸衍生物。同样，为了产生环状脂肪酸，可以将能提供环状前体的基因引入生产宿主并使其表达，从而允许由环状前体起始脂肪酸的生物合成。可以表达或过表达ans、chc和plm基因家族来产生环状脂肪酸。

此外，可以将生产宿主工程化，使其表达编码用于brFA延长的蛋白的基因(例如编码ACP、FabF等的基因)，和/或使通常产生sFA的相应的大肠杆菌基因缺失或减弱。对于这一点，将与引入的基因竞争的内源基因(例如fabH、fabF)缺失或减弱。

支链酰基辅酶A(例如，2-甲基-丁酰辅酶A、异戊酰辅酶A、异丁酰辅酶A等)是brFA的前体。在大多数含有brFA的微生物中，brFA是由支链氨基酸(例如，异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸)经过两步合成的(Kadena,Microbiol.Rev.55:288,1991)。可以将生产宿主工程化，使其表达或过表达参与这两个步骤的一种或多种酶来产生brFA或者过量产生brFA。例如，生产宿主可能有能够完成产生brFA的一个步骤的内源酶，因此只需要重组引入编码参与另一步骤的酶的基因。

可以将本发明的突变硫酯酶工程化，使其具有一个或多个改变的性质，例如，如本文所述的对支链或环链酰基辅酶A或酰基ACP化合物的改变的特异性和/或增加的活性(例如催化速率)。因此，可以使产生脂肪酸衍生物的重组细胞偏好于产生期望的支链或环链脂肪酸衍生物产物，这些产物可以具有成为终产物的高价值。

2.支链脂肪酸和支链脂肪酸衍生物的形成

形成brFA的第一个步骤是由支链氨基酸氨基转移酶产生相应的α-酮酸。生产宿主可以内源性地包含编码这类酶的基因，或可选地，可以重组引入这类基因。例如，大肠杆菌内源性地表达酶IlvE(EC2.6.1.42；GenBank登录号YP_026247)。在某些生产宿主中，可以不表达异源支链氨基酸氨基转移酶。但是，可以引入大肠杆菌IlvE或者任何其它支链氨基酸氨基转移酶(例如来自乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)的IlvE(GenBank登录号AAF34406)、来自恶臭假单胞菌的IlvE(GenBank登录号NP_745648)或者来自天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)的IlvE(GenBank登录号NP_629657))，如果它们不是内源的。如果氨基转移酶反应在所选生产宿主生物的brFA生物合成中是限速步骤，则可以过表达氨基转移酶。

第二个步骤是α-酮酸氧化脱羰基成为相应的支链酰基辅酶A。该反应由支链α-酮酸脱氢酶复合体(bkd；EC1.2.4.4.)(Denoyaetal.,J.Bacteriol.177:3504,1995)催化，所述复合体由E1α/β(脱羧酶)、E2(二氢硫辛酸转酰基酶)和E3(二氢硫辛酸脱氢酶)亚基构成。这些支链α-酮酸脱氢酶复合体与丙酮酸和α-酮戊二酸脱氢酶复合体类似。具有brFA和/或在支链氨基酸上生长的每种微生物都可以作为分离bkd基因的来源，用于在诸如大肠杆菌的生产宿主中表达。而且，大肠杆菌具有E3成分，作为其丙酮酸脱氢酶复合体的一部分(例如由lpd(EC1.8.1.4,GenBank登录号NP_414658)所编码)，因此仅表达E1α/β和E2bkd基因就足够了。表2列举了来自几种微生物的bkd基因的非限制性实例，这些基因可以被重组引入生产宿主并在其中表达，从而提供支链酰基辅酶A前体。具有这些bkd基因的微生物也可以作为生产宿主。

表2：来自所选微生物的bkd基因

在另一个实例中，可以通过共表达巴豆酰辅酶A还原酶(Ccr,EC1.6.5.5,1.1.1.1)和异丁酰辅酶A变位酶(大亚基IcmA、EC5.4.99.2；小亚基IcmB，EC5.4.99.2)在诸如大肠杆菌的生产宿主中产生异丁酰辅酶A(HanandReynolds,J.Bacteriol.179:5157,1997)。巴豆酰辅酶A是大肠杆菌和其它微生物中脂肪酸生物合成的中间体。表3给出了所选微生物中ccr和icm基因的非限制性实例。

表3：来自所选微生物的ccr和icm基因

除了bkd基因的表达之外，brFA生物合成的起始利用β-酮脂酰-酰基载体蛋白合酶III(FabH,EC2.3.1.41)，该酶对支链酰基辅酶A有特异性(Lietal.,J.Bacteriol.187:3795-3799,2005)。表4列出了这类FabH酶的非限制性实例。可以在生产宿主中表达参与任何含有brFA的微生物中的脂肪酸生物合成的fabH基因。来自不天然产生brFA的生产宿主的Bkd和FabH酶可能不支持brFA的产生，因此可以重组表达Bkd和FabH。可以将含有bkd和fabH基因的载体插入此类生产宿主。同样，Bkd和FabH的内源产生水平可能不足以产生brFA，因此可以过表达它们。另外，可以表达或过表达脂肪酸生物合成途径的其它成分，如酰基载体蛋白(ACP)和β-酮脂酰-酰基载体蛋白合酶II(由fabF(EC2.3.1.41)编码)(表4列出了候选基因的非限制性实例)。除了表达这些基因外，还可以将生产宿主中内源脂肪酸生物合成途径的某些基因减弱。可以将编码与产生brFA的途径的酶竞争底物的酶的基因减弱从而提高brFA的产生。例如，在大肠杆菌中最可能干扰brFA生物合成的候选者是fabH(GenBank登录号NP_415609)和/或fabF基因(GenBank登录号NP_415613)。

表4:来自具有brFA的所选微生物的fabH、ACP和fabF基因

如上文所提及的，通过联合表达支持brFA合成和醇合成的基因，可以制备支链醇。例如，当编码醇还原酶的基因(例如来自贝氏不动杆菌ADP1的acr1)与bkd操纵子在大肠杆菌宿主细胞中共表达时，所述宿主细胞可以合成异戊醇、异丁醇或2-甲基丁醇。同样，当acr1与ccr/icm基因在大肠杆菌宿主细胞中共表达时，所述宿主细胞可以合成异丁醇。

3.环状脂肪酸和脂肪酸衍生物的形成

为了将诸如大肠杆菌的生产宿主转化为能够合成ω-环状脂肪酸(cyFA)的生物，向生产宿主中引入并表达能够提供环状前体环己基羰基辅酶A(CHC-辅酶A)的基因(Croppetal.,NatureBiotech.18:980-983,2000)。对于其它生产宿主，例如细菌、酵母和丝状真菌，类似的转化也是可能的。

在大肠杆菌中提供CHC辅酶A的基因的非限制性实例包括：来自山丘链霉菌(Streptomycescollinus)的安三烯菌素基因簇的ansJ、ansK、ansL、chcA和ansM(Chenetal.,Eur.J.Biochem.261:pp.1999,1999)或者来自链霉菌HK803的磷内酯霉素B基因簇的plmJ、plmK、plmL、chcA和plmM(Palaniappanetal.,J.Biol.Chem.278:pp.35552,2003)以及来自山丘链霉菌、除虫链霉菌或者天蓝色链霉菌的chcB基因(Pattonetal.Biochem.,39:7959-7604,2000)(参见表5的GenBank登录号)。然后可以表达以上表4列出的基因，从而允许ω-环状脂肪酸的起始和延长。或者，可以从产生cyFA的微生物中分离同源基因并在大肠杆菌中表达。

表5：CHC-辅酶A合成的基因

*只有chcA在GenBank登录号U72144下有注释，ansJKLM参见Chenetal.(Eur.J.Biochem.261:98-107,1999

表4所列的基因(fabH、ACP和fabF)足以允许ω-环状脂肪酸的起始和延长，因为它们通常具有宽底物特异性。如果这些基因中的任何一个与表5的ansJKLM/chcAB或者pmlJKLM/chcAB基因的共表达不产生cyFA，则可以从产生cyFA的微生物中分离fabH、ACP和/或fabF同源物(例如通过利用简并PCR引物或者异源DNA序列探针)，并共表达这些同源物。表6列出含有ω-环状脂肪酸的微生物的非限制性实例。

表6：包含ω-环状脂肪酸的微生物的实例

*利用环庚基羰基辅酶A而不是环己基羰基辅酶A作为cyFA生物合成的前体

B.饱和度

脂肪酸是脂肪酸衍生物产生过程中的关键中间体。可以通过调节脂肪酸中间体的饱和度来控制脂肪酸衍生物的饱和度。可以表达或过表达sfa、gns和fab基因家族来控制脂肪酸的饱和度。

通过将生产宿主工程化使其过表达fabB，或者通过使生产宿主在低温(例如低于37℃)下生长，可以将生产宿主工程化使其产生不饱和脂肪酸。FabB偏好顺式-δ³癸烯酰-ACP，并导致大肠杆菌中不饱和脂肪酸产生。fabB基因的过表达导致产生高百分比的不饱和脂肪酸(deMendozaetal.,J.Biol.Chem.,258:2098-101,1983)。可以将fabB基因插入不是天然含有该基因的生产宿主并进行表达。然后，这些不饱和脂肪酸可以作为生产宿主中的中间体，所述生产宿主经工程化而能产生脂肪酸衍生物，如脂肪醇、脂肪酯、蜡、烯烃、烷等。

可选地，可以缺失脂肪酸生物合成的阻抑物，例如由fabR编码的阻抑物(GenBank登录号NP_418398)。这也导致大肠杆菌中不饱和脂肪酸产生的增加(Zhangetal.,J.Biol.Chem.277:15558,2002)。在其它生产宿主中可以进行类似的缺失。例如，通过fabM(编码反式-2,顺式-3-癸烯酰基ACP异构酶，GenBank登录号DAA05501)的过表达和来自肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)的fabK(编码反式-2-烯酰基-ACP还原酶II，GenBank登录号NP_357969)的受控表达(Marrakchietal.,J.Biol.Chem.277:44809,2002)，同时缺失大肠杆菌fabI(编码反式-2-烯酰基-ACP还原酶，GenBank登录号NP_415804)，可以实现不饱和脂肪酸的进一步增加。此外，为了提高不饱和脂肪酯的百分比，生产宿主还可以过表达fabB(编码β-酮脂酰-ACP合酶I，GenBank登录号：BAA16180,EC:2.3.1.41)、sfa(编码fabA的抑制物，GenBank登录号：AAC44390)以及gnsA和gnsB(两者均编码secG无效突变抑制物，GenBank登录号分别为ABD18647.1和AAC74076.1)。在某些实例中，可以减弱内源fabF基因，从而提高所产生的棕榈酸酯(C_16:1)的百分比。

可以将本发明的突变硫酯酶工程化，使之具有改变的性质，例如，对按本文所述制备的取代或未取代的酰基辅酶A或酰基ACP化合物的改变的特异性和/或增加的活性。因此，可以使产生脂肪酸衍生物的重组细胞偏向于产生具有所需饱和特性的脂肪酸衍生物产物，所述产物具有成为终产物的高价值。

C.链长和酯的特性

1.链长和奇数链的产生

通过选择对特定碳链长度的底物具有特异性和/或选择性的合适的突变硫酯酶，本文所述的方法允许产生不同链长的脂肪酯和脂肪酸衍生物。通过表达特定的硫酯酶，可以产生具有所需的碳链长度的脂肪酸和脂肪酸衍生物。在某些实施方案中，可以利用已知的基因组改变技术使内源硫酯酶突变。或者可以将编码特定硫酯酶的基因异源引入生产宿主中，使得产生具有特定碳链长度的脂肪酸或脂肪酸衍生物。在某些实施方案中，抑制内源硫酯酶的表达。可以将本发明的突变硫酯酶工程化，使之具有改变的性质，例如，对本文所述的特定链长的酰基辅酶A或酰基ACP化合物的改变的特异性和/或增加的活性。因此，可以使产生脂肪酸衍生物的重组细胞偏向于产生具有所需链长和/或成为终产物的高价值的脂肪酸衍生物产物。

在一个实施方案中，脂肪酸衍生物含有的碳链具有约4-36个碳原子、约6-32个碳原子、约10-30个碳原子、约10-18个碳原子、约24-32个碳原子、约26-30个碳原子、约26-32个碳原子、约5-10个碳原子、约10-16个碳原子或者约12-18个碳原子。在可选的实施方案中，脂肪酸衍生物含有的碳链具有少于约20个碳原子、少于约18个碳原子或少于约16个碳原子。在另一个实施方案中，脂肪酸酯产物是具有24-46个碳原子的碳原子含量的饱和或不饱和的脂肪酯产物。在一个实施方案中，脂肪酯产物具有24-32个碳原子的碳原子含量。在另一个实施方案中，脂肪酯产物具有14-20个碳的碳含量。在另一个实施方案中，脂肪酯是C_18:1的甲酯。在另一个实施方案中，脂肪酯是C_16:1的乙酯。在另一个实施方案中，脂肪酯是C_16:1的甲酯。仍然在另一个实施方案中，脂肪酯是辛醇的十八烷基酯。

某些微生物偏向于产生偶数或奇数碳链脂肪酸和脂肪酸衍生物。例如，大肠杆菌正常情况下产生偶数碳链脂肪酸和脂肪酸乙酯(FAEE)。令人惊讶的是，本文公开的方法可以用于改变这种产生。例如，在某些条件下可以使大肠杆菌产生奇数碳链脂肪酸和FAEE。

2.酯的特性

酯通常包括所谓的A侧和B侧。B侧由生产宿主生物中从头合成所产生的脂肪酸提供。在某些实施方案中，当生产宿主经另外的工程化而能产生包括脂肪醇的醇时，A侧也由该生产宿主生物产生。在仍然其它实施方案中，A侧也可以由生长培养基提供。通过选择所需的硫酯酶基因，可以将B侧(当产生脂肪醇时，还有A侧)设计成具有某些所需碳链特性。这些特性包括例如分支点、不饱和点和需要的碳链长度。因此，可以将本发明的突变硫酯酶工程化，使之具有改变的性质，例如，在接受某些酰基辅酶A或酰基ACP化合物作为本文所述的A侧链的偏好性方面的改变的特异性和/或增加的活性。因此，可以使产生脂肪酸衍生物的重组细胞偏向于产生作为有价值的终端产物的所需的脂肪酸衍生物。

当选择了特定的硫酯酶基因时，在A侧和B侧均由生产宿主利用脂肪酸生物合成途径中间体提供的情况下，它们会有类似的碳链特性。例如，至少约50％、60％、70％或者80％的产生的脂肪酯具有长度相差约2、4、6、8、10、12或者14个碳的A侧和B侧。A侧和B侧还可以表现出类似的分支度和饱和度。

除了产生提供给A侧的脂肪醇外，生产宿主还可以产生其它短链醇，如乙醇、丙醇、异丙醇、异丁醇和丁醇，可以利用本领域公知的技术将所述短链醇加至A侧。例如，生产宿主生物可以产生丁醇。为了制备产生丁醇的细胞，例如，可将菌株LS9001进一步工程化，使其在pBAD24表达载体中、在prpBCDE启动子系统下，表达大肠杆菌K12的atoB(乙酰辅酶A乙酰基转移酶)、溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibriofibrisolvens)的β-羟丁酰辅酶A脱氢酶、拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)的巴豆酸酶、拜氏梭菌的丁酰辅酶A脱氢酶、黄枝孢霉(Cladosporiumfulvum)的辅酶A酰化醛脱氢酶(ALDH)，和编码丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)的醛-醇脱氢酶的adhE。可以类似地修饰其它生产宿主生物以产生丁醇或其它短链醇。例如，可以利用Kalscheuer等所描述的方法(Microbiology152:2529-2536,2006,通过引用并入本文)在生产宿主中产生乙醇。

III.对生产菌株进行基因工程以增加/提高脂肪酸衍生物产生/收率

利用本领域已知的技术，可以将参与产生脂肪酸衍生物的生物合成途径的异源多核苷酸序列稳定引入或者瞬时引入生产宿主细胞。这类技术的非限制性实例包括电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质体介导的转染、接合作用、转导和基因组整合。对于稳定转化，DNA序列还可以包含选择标记，包括，例如抗生素抗性标记和弥补营养缺陷的基因。另一方面，还可以利用已知的基因组改变技术使参与产生脂肪酸衍生物的生物合成途径的内源多核苷酸序列进行突变。可以单独或组合应用这些策略。

本文的各种实施方案利用包含异源DNA序列的表达载体，所述异源DNA序列编码参与代谢途径或者生物合成途径的蛋白。合适的表达载体包括但不限于，病毒载体(诸如杆状病毒载体)、噬菌体(phage)载体(如噬菌体(bacteriophage)载体)、质粒、噬菌粒、粘粒、福斯质粒(fosmid)、细菌人工染色体、病毒载体(例如，基于以下病毒的病毒载体：牛痘病毒、脊髓灰质炎病毒、腺病毒、腺相关病毒、SV40、单纯疱疹病毒等)、基于P1的人工染色体、酵母质粒、酵母人工染色体和用于具体目的生产宿主(诸如大肠杆菌、豌豆假单胞菌(Pseudomonaspisum)和酿酒酵母)的任何其它载体。

有用的表达载体可以包括一种或者多种选择标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状。所述选择标记基因编码转化的生产宿主细胞在选择培养基中存活或者生长所必需的蛋白。未用含有选择标记基因的载体转化的生产宿主细胞不能在培养基中存活。通常的选择基因编码具有以下性质的蛋白：(a)赋予对抗生素或者其它毒素(例如，氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或者四环素)的抗性，(b)弥补营养缺陷型缺陷，或者(c)提供复合培养基没有的重要养分(例如，编码杆菌的D-丙氨酸外消旋物的基因)。在可选的实施方案中，选择标记基因是编码二氢叶酸还原酶或者赋予新霉素抗性(用于真核细胞培养)的基因，或者赋予四环素或者氨苄青霉素抗性(用于原核生产宿主细胞，诸如大肠杆菌)的基因。

在表达载体中，编码生物合成途径中的基因的DNA序列与合适的表达调控序列(启动子，增强子等)可操作地连接，以指导所编码基因产物的合成。这类启动子可以来源于微生物或者病毒，包括例如来自CMV和SV40。根据所用的生产宿主/载体系统，表达载体中可以使用任意数量的合适的转录和翻译控制元件，包括组成型和诱导型启动子、转录增强子元件、转录终止子等。参见例如，Bitteretal.,MethodsinEnzymology,153:516-544,1987。

适用于原核生产宿主细胞的启动子包括但不限于，能够识别T4、T3、Sp6和T7聚合酶的启动子，λ噬菌体的P_R和P_L启动子，大肠杆菌的trp、recA、热休克和lacZ启动子，枯草芽孢杆菌的α-淀粉酶和σ特异性启动子，杆菌的噬菌体的启动子，链霉菌启动子，λ噬菌体的int启动子，pBR322的β-内酰胺酶基因的bla启动子和氯霉素乙酰转移酶基因的CAT启动子。原核启动子的综述可参见Glick,J.Indust.Microbiol.1:277,1987；Watsonetal.,MOLECULARBIOLOGYOFTHEGENE(基因的分子生物学),第四版,BenjaminCummins(1987)；和Sambrooketal.,MolecularCloning:ALaboratoryManual(分子克隆：实验室手册)，第二版，(ColdSpringHarborLaboratoryPress1989)，通过引用将以上的公开内容并入本文。适用于真核生产宿主的真核启动子的非限制性实例来源于病毒，并且包括小鼠金属硫蛋白I基因的启动子(Hameretal.,J.Mol.Appl.Gen.1:273,1982)、疱疹病毒的TK启动子(McKnight,Cell,31:355,1982)、SV40早期启动子(Benoistetal.,Nature,290:304,1981)、巨细胞病毒启动子(Foeckingetal.,Gene45:101,1980)、酵母gal4基因启动子(Johnston,etal.,PNAS(USA)79:6971,1982；Silver,etal.,PNAS(USA)81:5951,1984)和IgG启动子(Orlandietal.,PNAS(USA)86:3833,1989)，通过引用将以上的公开内容并入本文。

可以用编码生物合成途径基因产物的异源基因序列对生产宿主进行遗传修饰，所述异源基因序列与诱导型启动子可操作地连接。诱导型启动子是本领域已知的。合适的诱导型启动子的非限制性实例包括受蛋白、代谢物或者化学品影响的启动子。这些启动子包括但不限于：牛白血病病毒启动子、金属硫蛋白启动子、地塞米松诱导型MMTV启动子、SV40启动子、MRPpolIII启动子、四环素诱导型CMV启动子(如人即时早期CMV启动子)以及来自trp和lac操纵子的那些启动子。

在一些实例中，用编码生物合成途径基因产物的异源基因序列对生产宿主进行遗传修饰，所述异源基因序列与组成型启动子可操作地连接。合适的组成型启动子是本领域已知的，包括组成型腺病毒主要晚期启动子、组成型MPSV启动子和组成型CMV启动子。

在一些实例中，修饰的生产宿主是用编码参与生物合成途径的单个蛋白的外源基因序列进行遗传修饰的宿主。在其它实施方案中，修饰的生产宿主是用编码两种或更多种参与生物合成途径的蛋白(例如生物合成途径的第一酶和第二酶)的外源基因序列进行遗传修饰的宿主。

当生产宿主经遗传修饰而表达两种或更多种参与生物合成途径的蛋白时，这些基因序列的每一个都可以包含于单个表达载体中或者分别的表达载体中。当这些基因序列包含于单个表达载体中时，在一些实施方案中，多核苷酸序列与常见的控制元件可操作地连接，其中所述常见控制元件控制单个表达载体中所有编码生物合成途径蛋白的基因序列的表达(例如启动子)。

当修饰的生产宿主是用编码两种或更多种参与生物合成途径的蛋白的异源DNA序列进行遗传修饰时，所述DNA序列之一可以与诱导型启动子可操作地连接，而所述DNA序列中的一个或者多个可以与组成型启动子可操作地连接。

在一些实施方案中，可以增加生物合成途径中间体的胞内浓度(即遗传修饰的生产宿主中的浓度)以进一步提高终产物的收率。有许多方式可以增加中间体的胞内浓度，包括但不限于，增加培养基中生物合成途径底物的浓度、增加生物合成途径中起作用的酶的催化活性、增加生物合成途径中起作用的酶的底物(例如，主要底物)的胞内量等。

在一些实例中，脂肪酸衍生物或者中间体在细胞的细胞质中产生。有许多方式可以增加细胞质浓度，包括但不限于，将脂肪酸与辅酶A结合而形成酰基辅酶A硫酯。此外，通过增加细胞中辅酶A的生物合成，可以增加酰基辅酶A的浓度，例如通过过表达泛酸盐生物合成相关基因(例如panD)或者敲除谷胱甘肽生物合成相关基因(例如谷胱甘肽合酶)。

可以在生产宿主的染色体中引入或者改动调控序列、编码序列及其组合。在某些实例中，所需重组序列整合进生产宿主基因组序列不需要使用诸如抗生素的选择标记。在某些实例中，基因组改变包括通过用对调控不敏感的启动子替换天然启动子而改变靶基因的控制序列。有很多方法可以实现这一点。例如，ValleandFlores,MethodsMol.Biol.267:113-122,2006描述了在大肠杆菌中过表达染色体基因的基于PCR的方法。通过引用将ValleandFlores的内容并入本文。另一种方法利用Courtetal.,PNAS(USA).100:15748-15753,2003开发的技术，基于使用单链寡核苷酸直接在染色体中产生特定突变，通过引用该文献的内容并入本文。该技术基于过表达来自λ噬菌体的β蛋白从而增强基因重组。这个方法的优点包括可以使用70个碱基长(或更长)的合成寡核苷酸来产生点突变、插入和缺失，从而省略了任何克隆步骤。此外，该系统效率足够高，不需要标记来分离所需的突变。

利用这一方法，可以改变基因的调控区，从而产生更强的启动子和/或消除阻抑物的结合位点。因此，可以在生产宿主生物中过表达所需基因。

IV.发酵

A.产生效率的最大化

通过采用特定的发酵技术可以增强脂肪酸衍生物的产生和分离。一种使产生最大化同时降低成本的方法是增加可转变为烃类产物的碳源的百分比。

在正常的细胞生命周期中，碳被用于产生脂、糖、蛋白、有机酸和多核苷酸的细胞功能中。降低生长相关活动所需的碳的量可以增加碳源转变为产出物的效率。可以通过首先使微生物生长到对数生长期的顶峰达到的所需密度来实现这一点。然后，可以利用复制检验点基因来终止细胞生长。具体来说，群体感应机制(综述于CamilliandBasslerScience311:1113,2006；VenturiFEMSMicrobioRev30:274-291,2006；和ReadingandSperandioFEMSMicrobiolLett254:1-11,2006中，通过引用将以上文献的公开内容并入本文)可用于激活静止期相关的基因。

在大肠杆菌中可以被激活以停止细胞复制和生长的基因包括umuDC基因，umuDC基因的过表达阻止静止期到指数生长期的进程(Murlietal.,J.ofBact.182:1127,2000)。UmuC是DNA聚合酶，其可以进行对非编码损伤的跨损伤合成，这是大部分UV和化学诱变作用的机制基础。umuDC基因产物用于跨损伤合成过程，并且还作为多核苷酸序列损伤检验点。umuDC基因产物包括UmuC、UmuD、umuD’、UmuD’₂C、UmuD’₂和/或UmuD₂。同时，可以激活产物生成基因，从而在产生脂肪酸衍生物的过程中，使复制和维持所用的途径的需求最小化。通过从头合成来自大肠杆菌的umuC和/或umuD与合适的终产物产生基因，还可以将生产宿主微生物工程化，使其在prpBCDE启动子系统下、在pBAD24中表达来自大肠杆菌的umuC和/或umuD。

输入碳转变为脂肪酯或烃类产物的百分比是成本动因。该过程的效率越高(即输入碳转变为脂肪酯或烃类产物的百分比越高)，则成本越低。对于含氧碳源(例如基于葡萄糖和其它糖的来源)，氧以二氧化碳的形式释放。每释放2个氧原子，同时还释放1个碳原子，这导致约34％(w/w)的最大理论代谢效率(对脂肪酸衍生产物而言)。但是对于其它烃类产物和碳源来说，该数字是变化的。文献中通常的效率是约小于5％。经工程化而能产生烃类产物的生产宿主的效率可以大于1％，例如大于约3％、5％、10％、15％、20％、25％或30％。在一个实例中，生产宿主表现出的效率为约10％至约25％。在其它实例中，这类生产宿主表现出的效率为约25％至约30％。在其它实例中，这类生产宿主表现出的效率大于30％。

可以将生产宿主另外地工程化，使其表达重组纤维素体，诸如PCT申请号PCT/US2007/003736中描述的那些(通过引用将其全文并入本文)，使得生产宿主能利用纤维素物质作为碳源。例如，可以将生产宿主另外工程化，使之表达转化酶(EC3.2.1.26)，从而可以利用蔗糖作为碳源。

同样，可以利用美国专利第5,000,000号、第5,028,539号、第5,424,202号、第5,482,846号和第5,602,030号(通过引用将以上文献的全文并入本文)中描述的方法将生产宿主工程化，从而使得生产宿主可以有效地同化碳并利用纤维素物质作为碳源。

在一个实例中，发酵室(fermentionchamber)包括经历连续还原的发酵运行物/混合物。在这种情况下，将产生稳定的还原环境。通过二氧化碳的释放(气态形式)保持电子平衡。增加NAD/H和NADP/H平衡也有利于稳定电子平衡。

通过将生产宿主工程化使其表达NADH:NADPH转氢酶也可以提高胞内NADPH的可利用度。一种或者多种NADH:NADPH转氢酶的表达将糖酵解中产生的NADH转化为NADPH，从而增加脂肪酸衍生物的产生。

B.小规模产烃

对于小规模烃产物生产，将携带pBAD24(带有氨苄青霉素抗性和终产物合成途径)和pUMVC1(带有卡那霉素抗性和乙酰辅酶A/丙二酰辅酶A过表达系统)的大肠杆菌BL21(DE3)细胞于37℃下、2L烧瓶中、在补充了75μg/mL氨苄霉素和50μg/ml卡那霉素的500mlLB培养液中>200rpm振荡孵育过夜，直到培养物达到OD₆₀₀大于0.8。达到OD₆₀₀大于0.8时，向细胞补充25mM的丙酸钠(pH8.0)以激活工程化基因系统进行生产，并通过激活UmuC和UmuD蛋白使细胞增殖停止。诱导步骤在30℃下进行6小时。孵育后，利用GC-MS检测培养基中的烃产物。

C.大规模产烃

对于大规模的产物生产，以10L、100L或更大的批量培养工程化生产宿主、发酵并根据其中合适的质粒中编码的具体基因来诱导表达所需产物。

例如，将来自500ml种子培养物的携带pBAD24(带有氨苄青霉素抗性和终产物合成途径)和pUMVC1(带有卡那霉素抗性和乙酰辅酶A/丙二酰辅酶A过表达)的大肠杆菌BL21(DE3)细胞以10L发酵运行物(或5L种子培养物用于100L发酵)在含有50μg/ml卡那霉素和75μg/mL氨苄青霉素的LB培养基(不含甘油)中在37℃下>200rpm振荡孵育，直到培养物达到OD₆₀₀大于0.8，该过程通常持续约16小时。持续补充发酵培养基，使磷酸钠维持在25mM、pH8.0，从而激活工程化基因系统进行生产，并通过激活UmuC和UmuD蛋白使细胞增殖停止。还持续向培养基中补充葡萄糖，将浓度维持在25g/100ml。

在诱导一小时后，每小时取出总细胞体积的不多于10％的部分，并使其静置而不搅动，这样可以使烃产物上升至表面，经历自发相分离。收集烃组分，将水相返回反应室。连续操作反应室。当OD₆₀₀降到约0.6以下时，用从种子培养物生长的新批次替换细胞。

对于蜡酯生产，将蜡酯分离，在1MHCl中简单清洗，并通过用蒸馏水充分洗涤，使其pH值回到pH7。

V.生产后加工

可以将发酵期间产生的脂肪酸衍生物从发酵培养基中分离出来。可以使用任何已知的从水性介质中分离脂肪酸衍生物的技术。示例性的分离法是两相(双相)分离法。该方法涉及在足以产生脂肪酸衍生物的条件下使基因工程化的生产宿主发酵，允许衍生物被收集到有机相中并从水性发酵液分离该有机相。该方法可以在分批以及连续发酵环境下实施。

双相分离是利用脂肪酸衍生物的相对不混溶性来促进分离。“不混溶性”是指化合物不溶于水的相对能力，由化合物的分配系数定义和/或确定。本领域技术人员应当理解，通过选择发酵液和有机相而使生成的脂肪酸衍生物具有高logP值，即使脂肪酸衍生物的浓度低，其也能被分离到发酵容器中的有机相。

通过本文组合物、载体、细胞和方法产生的脂肪酸衍生物在发酵液以及细胞质中是相对不混溶的。因此，脂肪酸衍生物会在胞内和/或胞外收集于有机相中。有机相中产物的收集将削弱脂肪酸衍生物对细胞功能的影响，并允许生产宿主产生更多的产物、持续更长的时间。

按照本公开产生的脂肪醇、脂肪酯、蜡和烃能够允许产生同质化合物，其中至少约60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％或者95％的合适产生的脂肪醇、脂肪酯和蜡的碳链长度相差少于约6个、少于约4个或者少于约2个碳。还可以使产生的这些化合物具有相对一致的饱和度，例如至少约60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％或者95％的脂肪醇、脂肪酯、烃和蜡是单不饱和、双不饱和或者三不饱和的。这些化合物可以直接用作产品、产品组分，例如作为燃料、去垢剂、润滑剂、个人护理添加剂、营养补剂等。这些化合物还可以用作后续反应的原料以制备其它产物，所述后续反应包括例如酯交换、氢化、催化裂解(通过氢化、高温裂解(pyrolisis)或者这两者)或者环氧化反应。

按照本文组合物、载体、细胞和方法产生的脂肪醇、脂肪酯、蜡和烃含有低量的不需要或不希望的元素，所述元素包括但不限于重金属。在某些实施方案中，按照本文所述产生的脂肪醇、脂肪酯、蜡和烃适当地含有低于约50ppm的砷、低于约300ppm的钙、低于约200ppm的氯、低于约50ppm的钴、低于约50ppm的铜、低于约300ppm的铁、低于以重量计约2％的水，低于约50ppm的铅、低于约50ppm的锰、低于约0.2ppm的汞、低于约50ppm的钼、低于以重量计约1％的氮、低于约200ppm的钾、低于约300ppm的钠、低于以重量计约3％的硫、低于50ppm的锌和/或低于700ppm的磷。

在某些实施方案中，按照本公开产生的脂肪醇、脂肪酯、蜡和烃含有约50％-约90％的碳、约5％-约25％的氢、或者约5％-约25％的氧。在其它实施方案中，按照本文所述产生的脂肪醇、脂肪酯、蜡和烃含有约65％-约85％的碳、约10％-约15％的氢、或者约10％-约20％的氧。

VI.燃料组合物

如本文所提供的，按本文所述的方法和组合物产生的某些脂肪酸衍生物对于用作燃料具有多种有利特征。本领域技术人员应当理解，根据燃料的预期目的，不同的脂肪酸衍生物可以具有优于其它脂肪酸衍生物的优势。例如，支链脂肪酸衍生物可更适于作为意图用在寒冷气候中的汽车燃料或汽车燃料的组分。同样，对于某些应用，产生的含氧更多或更少或者饱和度更高或更低的燃料可能更有利。

利用本文所述的方法，可以产生包含相对同质的脂肪酸衍生物同时具有所需特性/质量的燃料。这类基于脂肪酸衍生物的燃料可以用碳指纹法进行表征，与石油衍生的燃料或者源自甘油三酯的生物柴油相比，它们的优点在于不含杂质。基于脂肪酸衍生物的燃料可以与其它燃料或者燃料添加剂组合，以产生具有所需性质的燃料。

本文所公开的生产宿主和方法可用来产生游离脂肪酸和脂肪酯。在某些实施方案中，本文所公开的生产宿主和方法可用来产生更高和/或提高滴度或收率的脂肪酸衍生物，所述脂肪酸衍生物包括例如游离脂肪酸和/或脂肪酯。在某些实施方案中，生产宿主所产生的产物中游离脂肪酸的百分比是至少约1％，例如至少约2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％或25％。在某些实施方案中，生产宿主所产生的产物中脂肪酯的百分比是至少约50％，例如至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％。在某些实施方案中，生产宿主所产生的产物中脂肪酯与游离脂肪酸的比是约10:1、9:1、8:1、7:1、5:1、2:1或1:1。在某些实施方案中，生产宿主产生的脂肪酯是十二烷酸乙酯、十三烷酸乙酯、十四烷酸乙酯、十五烷酸乙酯、顺式-9-十六烯酸乙酯、十六烷酸乙酯、十七烷酸乙酯、顺式-11-十八烯酸乙酯、十八烷酸乙酯或以上的组合。在某些其它实施方案中，生产宿主所产生的脂肪酯是十二烷酸甲酯、十三烷酸甲酯、十四烷酸甲酯、十五烷酸甲酯、顺式-9-十六烯酸甲酯、十六烷酸甲酯、十七烷酸甲酯、顺式-11-十八烯酸甲酯、十八烷酸甲酯或以上的组合。在某些实施方案中，生产宿主产生的游离脂肪酸是十二烷酸、十四烷酸、十五烷酸、顺式-9-十六烯酸、十六烷酸、顺式-11-十八烯酸或以上的组合。

本文所公开的生产宿主和方法可用来产生不同比例的游离脂肪酸和脂肪酯。在某些实施方案中，可以按照本文所述的方法、组合物、载体和细胞对产物中游离脂肪酸的比例进行改动，使得其比例高于或低于产生的脂肪酯。在某些有关实施方案中，还可以按照本公开对产物中的脂肪酯的比例进行改动，使得其比例高于或低于其它产物(例如产生的游离脂肪酸)。在某些其它实施方案中，可以提高或降低具有特定碳链长度的脂肪酸衍生物的收率比例。

A.碳指纹法

生物学方法产生的脂肪酸衍生物代表了诸如醇、柴油和汽油的燃料的新来源。按照本文所描述的方法和组合物产生的生物燃料在此以前还未能从可再生来源产生并且是新的物质组合物。根据双碳同位素指纹法，可以将这些新的燃料与来自石化碳的燃料区分开来。此外，通过双碳同位素指纹法(参见，美国专利第7,169,588号，通过引用将其全文并入本文，特别是第4栏第31行到第6栏8行)，可以确定生物来源的碳的具体来源(例如葡萄糖相比于甘油)。

基于¹⁴C(f_M)和双碳同位素指纹法，可以将脂肪酸衍生物及相关的生物燃料、化学品和混合物与石化来源的对应物区分开来。

本文描述的脂肪酸衍生物可以用于产生生物燃料和化学品。根据双碳同位素指纹法，可以将本发明提供的新的基于脂肪酸衍生物的产品与完全来源于石化来源的物质区分开。能够区分这些产品对于在商业上追踪这些物质很有用。例如，同时含有“新的”和“旧的”碳同位素谱的燃料或化学品可以与仅由“旧的”物质构成的燃料和化学品区分开。因此，本物质可以在商业上进行跟踪或“追踪”，或者根据其独特的谱而被鉴定为生物燃料。此外，可以鉴定其它竞争物质是生物学来源的还是来源于石化资源。

在某些实例中，制备的生物燃料组合物包括δ¹³C为约-10.9至约-15.4的脂肪酸衍生物，其中所述脂肪酸衍生物占组合物中生物来源物质(即源自可再生资源，如纤维素质和糖)的至少约85％。在其它实例中，所述生物燃料组合物包括具有下式的脂肪酸衍生物：

X——(CH(R))_nCH₃

其中X＝CH₃、–CH₂OR¹、–C(O)OR²或者–C(O)NR³R⁴；

对于每个n，R为独立地不存在、或为H或者低级脂肪族；

N＝约8-约34的整数，优选为约10-约24的整数；

R¹、R²、R³、R⁴＝独立地选自H或低级烷基。

通常，当R是低级脂肪族基团时，R代表分支的、不分支的或者环状的低级烷基或者低级烯基部分。示例性的R基包括，但不限于，甲基、异丙基、异丁基、仲丁基、环戊烯基等。脂肪酸衍生物的特征还在于具有约-10.9至约-15.4的δ¹³C，并且脂肪酸衍生物占组合物中生物来源物质的至少约85％。在某些实例中，生物燃料组合物中脂肪酸衍生物的特征在于现代碳分数(f_M ¹⁴C)为至少约1.003、1.010或者1.5。

B.杂质

按照本公开制备的脂肪酸衍生物可用作生物燃料以及其它工业化学品的成分或用于制备生物燃料以及其它工业化学品。这些脂肪酸衍生物直接从脂肪酸制得，而不是通过甘油三酯的化学加工制备。因此，包含所公开的脂肪酸衍生物的燃料和其它工业化学品包含的杂质比例如来源于甘油三酯的产物包含的杂质通常更少，所述来源于甘油三酯的产物例如来源于植物油和脂肪的燃料。

按照本公开制备的粗脂肪酸衍生物生物燃料(在将脂肪酸衍生物与诸如基于石油的燃料的其它燃料混合前)包含的酯交换催化剂少于石化柴油或者经由一个或多个酯交换步骤产生的其它生物柴油。脂肪酸衍生物可以包含低于约2.0％，例如，低于约1.5％、1.0％、0.5％、0.3％、0.1％、0.05％或者0％的酯交换催化剂或者来自酯交换催化剂的杂质。酯交换催化剂的非限制性实例包括，氢氧化物催化剂，如NaOH、KOH和LiOH；和酸性催化剂，如无机酸催化剂和路易斯酸催化剂。催化剂和来自酯交换催化剂的杂质的非限制性实例包括锡、铅、汞、镉、锌、钛、锆、铪、硼、铝、磷、砷、锑、铋、钙、镁、锶、铀、钾、钠、锂及以上的组合。

与其它类型生物燃料的胶凝点相比，按照本公开制备的粗脂肪酸衍生物生物燃料(在将脂肪酸衍生物与一种或多种其它燃料混合前)倾向于具有低胶凝点，尤其是当脂肪酸衍生物产物包含C_16:1乙酯或C_18:1乙酯时。

同样，按照本公开制备的粗脂肪酸衍生物生物燃料(在将脂肪酸衍生物与诸如石化柴油或生物柴油的一种或多种其它燃料混合前)包含的甘油(或者丙三醇)少于由甘油三酯制备的生物燃料。脂肪酸衍生物可以包含以重量计低于约2.0％，例如低于约1.5％、1.0％、0.5％、0.3％、0.1％、0.05％或者0％的甘油。

源自本文中的脂肪酸衍生物的粗生物燃料包含的游离醇(例如用于产生酯的醇)也少于由甘油三酯制备的生物柴油。这在一定程度上是由于本公开的生产宿主利用醇的效率。例如，脂肪酸衍生物可以包含以重量计低于约2.0％、1.5％、1.0％、0.5％、0.3％、0.1％、0.05％或者0％的游离醇。

源自所公开的脂肪酸衍生物的生物燃料的特征还可以在于，与石油来源的柴油相比，其硫浓度低。源自本文中的脂肪酸衍生物的生物燃料具有以重量计低于约2.0％，例如低于约1.5％、1.0％、0.5％、0.3％、0.1％、0.05％或者0％的硫。

C.添加剂和燃料组合物

燃料添加剂用于提高燃料或者发动机的性能。例如，燃料添加剂可用于改变冰点/胶凝点、浊点、润滑性、粘性、氧化稳定性、引燃性、辛烷值和闪点。在美国，所有的燃料添加剂必须在环境保护署(EnvironmentalProtectionAgency)注册登记。通过联系EPA或者浏览该机构的网站可以公开获得出售燃料添加剂的公司和燃料添加剂的名称。本领域技术人员应当理解，本文描述的脂肪酸衍生物可以与一种或者多种燃料添加剂混合以提供需要的性能。

可以将本文所述的脂肪酸衍生物配制成合适的燃料添加剂，该燃料添加剂增强燃料或发动机的性能。例如，可以将本文所述的脂肪酸衍生物配制成赋予发动机部件诸如耐磨保护性的所需的性质的润滑性改良剂。因此，提供了包含按本公开产生的脂肪酸衍生物的添加剂组合物。在另一个实例中，可以将本文所述的脂肪酸衍生物配制成腐蚀抑制剂。

本文描述的脂肪酸衍生物可以与其它燃料混合，所述其它燃料例如一种或多种源自甘油三酯的生物柴油、诸如乙醇和丁醇的各种醇以及诸如汽油和柴油的源自石油的产品。在某些情况下，制备具有低胶凝点的脂肪酸衍生物，如C_16:1乙酯或者C_18:1乙酯。可以将这种低胶凝点的脂肪酸衍生物与由甘油三酯制备的一种或多种生物柴油混合，从而使所得燃料的胶凝点低于仅含有由甘油三酯制备的一种或多种生物柴油的燃料。同样，可以将诸如C_16:1乙酯或者C_18:1乙酯的脂肪酸衍生物与石油来源的柴油混合以提供包含以重量计至少约5％且经常大于约5％的生物柴油的混合物。在一些实例中，所述燃料混合物包含以重量计至少约10％、15％、20％、30％、40％、50％和60％的脂肪酸衍生物。

在某些实施方案中，燃料组合物还可以包含合成燃料。可以适当地使用获自煤、天然气或生物质的任何合成材料。在其它实施方案中，所述合成燃料包含基于以下方法的燃料或其组合：Fischer-Tropsch、Bergius、Mobil、Karrick。在其它实施方案中，所述合成燃料包含基于以下方法的燃料或其组合：煤变油(Coal-To-Liquids)(CTL法)、气变油(Gas-To-Liquids)(GTL法)、生物质变油(Biomass-To-Liquids)(BTL法)、煤和生物质变油(CoalandBiomass-To-Liquids)(CBTL法)。在示例性的实施方案中，所述合成燃料包含基于Fischer-Tropsch法的燃料。

本文公开的燃料组合物中合成燃料的量可以为约5％-约90％、约5％-约80％、约5％-约70％、约5％-约60％或约5％-约50％。

在某些实施方案中，可以将生物燃料组合物制备成包括至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％或者95％的脂肪酸衍生物，所述脂肪酸衍生物包括8:0、10:0、12:0、14:0、14:1、16:0、16:1、18:0、18:1、18:2、18:3、20:0、20:1、20:2、20:3、22:0、22:1或者22:3的碳链。这类生物燃料组合物还可以包含至少一种选自以下的添加剂：可以将浊点降低到低于约5℃或者低于约0℃的浊点降低添加剂；表面活性剂；微乳剂；至少约5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％或者95％的来自甘油三酯的柴油燃料；石油来源的汽油；或者来自石油的柴油燃料。

在某些实施方案中，包含利用本方法、载体、细胞和组合物产生的脂肪酯的燃料组合物还包含一种或多种柴油燃料添加剂。理想情况下，合适的添加剂是不但能提供改良的性能还能提供与燃料组合物中的成分和通常与柴油发动机有关的装置的相容性的那些添加剂。其它合适的燃料添加剂的示例性实例包括引燃改良剂或十六烷值改良剂、去垢剂、分散剂、抗磨剂、粘性指数改良剂、摩擦改良剂、润滑性改良剂、稳定剂、抗氧化剂、腐蚀抑制剂、杀生物剂、金属减活化剂和少量的其它任选的添加剂，所述任选的添加剂包括而不限于消泡剂和密封固定剂(sealfix)。

在具体的实施方案中，通常添加引燃改良剂或十六烷值改良剂来提高柴油发动机性能。示例性的十六烷值改良剂包括2’-乙基已基硝酸酯和其它烷基硝酸酯。加入燃料组合物中的十六烷值改良剂的量可以占燃料组合物总重量的约0.01wt.％-约1.0wt.％，例如，约0.05wt.％-约0.5wt.％。

在某些实施方案中，包含按本公开产生的脂肪酯的燃料组合物可以包含多种去垢剂和/或分散剂，用于从柴油发动机部件结合和分散或去除有害沉积物。合适的去垢剂通常包含极性头部和长的疏水性尾部，所述极性头部包含酸性有机化合物金属盐。示例性的去垢剂包括含硼砂的碳酸盐、含硼砂的磺酸盐，所述含硼砂的磺酸盐优选是高碱性的。参见例如美国专利第4,744,920号、第4,965,003号，通过引用将两篇专利的公开内容并入本文。示例性的分散剂包括而不限于羧基分散剂、琥珀酰亚胺分散剂、胺分散剂和曼尼希分散剂(Mannichdispersant)。参见例如美国专利第3,172,892号、第3,438,757号、第3,980,569号和第6,165,235号，通过引用将以上专利的公开内容并入本文。燃料组合物中分散剂的量可以占燃料组合物总重量的约0.01wt.％-约0.1wt.％，例如，0.03-约0.05wt.％。

在某些实施方案中，可以将该抗磨剂加入燃料组合物中，从而提供抗磨和抗氧化作用，所述抗磨剂包括例如二烃基二硫代磷酸金属盐。参见例如美国专利第5,898,023号，通过引用将该专利的公开内容并入本文。

在具体的实施方案中，燃料组合物中润滑性改良剂的量可以为约1ppm-约50,000ppm，例如，约10ppm-约20,000ppm或约25ppm-约10,000ppm。润滑性改良剂的非限制性实例包括酯和脂肪酸，所述酯和脂肪酸可以与按本方法产生的那些酯和脂肪酸相同或者不相同。

在具体的实施方案中，用来提高燃料组合物的贮存稳定性的稳定剂的量可以为燃料组合物总重量的约0.001wt.％-约2wt.％，例如约0.01wt.％-约1wt.％。示例性的稳定剂是叔烷基伯胺。

抗氧化剂防止由燃料在贮存中的氧化而引起的燃料系统组件上胶质沉积物的形成和/或抑制某些燃料组合物中过氧化物的形成。抗氧化剂的量可以为燃料组合物总重量的约0.001wt.％-约5wt.％，例如，约0.01wt.％-约1wt.％。

腐蚀抑制剂保护诸如管道和贮罐的燃料处理系统中的含铁金属免受腐蚀。已知某些腐蚀抑制剂还能赋予额外的润滑性，因此当需要额外的润滑性时，这些腐蚀抑制剂是特别合适的。燃料组合物中腐蚀抑制剂的量可以占燃料组合物总重量的约0.001wt.％-约5wt.％，例如，约0.01wt.％-约1wt.％。

杀生物剂用来防止燃料组合物中微生物的生长，燃料组合物中杀生物剂的浓度可以占燃料组合物总重量的约0.001wt.％-约5wt.％，例如，约0.01wt.％-约1wt.％。

金属减活化剂抑制某些金属(尤其是铜)对燃料氧化的催化效应，燃料组合物中金属减活化剂的浓度可以占燃料组合物总重量的约0.001wt.％-约5wt.％，例如，约0.01wt.％-约1wt.％。

此外，可以少量加入粘性改良剂和摩擦改良剂，粘性改良剂通常是数均分子量为约5,000-约250,000的聚合材料，摩擦改良剂通常是含硫的有机钼化合物。也可以将消泡剂以小于约10ppm的量加入燃料组合物中，消泡剂通常包括烷基异丁烯酸酯聚合物或二甲基硅聚合物。此外，燃料组合物中可以包含密封固定剂可以加入密封固定剂来确保合适的弹性体密封以及防止提前的密封失败。

实施例

以下实施例描述了将生产宿主进行工程化，使其产生特定脂肪酸衍生物。脂肪酸衍生物产生所涉及的生物合成途径如附图所示。

例如，图3是FAS途径示意图，其显示了直接参与酰基ACP合成的酶。为了增加诸如蜡、脂肪酯、脂肪醇和烃的脂肪酸衍生物的产生，可以过表达或者突变一种或者多种本文所述的酶以减少反馈抑制，从而增加所产生的酰基ACP的量。此外，可以使对中间体进行代谢而产生非基于脂肪酸的产物(例如副反应)的酶在功能上缺失或者减弱，从而增加通过脂肪酸生物合成(FAS)途径的碳通量。以下实施例中，描述了许多为了增加脂肪酸产生而经修饰的生产宿主。

图4和图5显示了可以进行改造从而分别产生脂肪酯和脂肪醇的生物合成途径。利用属于标明的酶类别成员的几种不同多肽，可以实现每一底物(例如，乙酰辅酶A、丙二酰辅酶A、酰基ACP、脂肪酸和酰基辅酶A)向每一产物(例如乙酰辅酶A、丙二酰辅酶A、酰基ACP、脂肪酸、酰基辅酶A、脂肪醛、脂肪酯和脂肪醇)的转化。

以下实施例描述了已经工程化或者可以进行工程化从而产生特定脂肪醇、脂肪酯和烃的微生物。

实施例1.生产宿主的构建

示例性的生产宿主是LS9001。通过将购自Overpress(SaintBeausine,France)的C41(DE3)中的fadE基因(酰基辅酶A脱氢酶)敲除来制备LS9001。

简单来说，通过利用引物YafV_NotI和Ivry_Ol来扩增fadE的上游约830bp并利用引物Lpcaf_ol和LpcaR_Bam来扩增fadE的下游约960bp来制备大肠杆菌的fadE敲除菌株。使用重叠PCR产生使完整fadE基因发生框内缺失的构建体。将fadE缺失构建体克隆到温度敏感性质粒pKOV3中，该质粒包含用于反选择的sacB基因，并按照Link等人(J.Bact.179:6228-6237,1997)的方法进行fadE的染色体缺失。所获菌株不能降解脂肪酸和脂酰辅酶A。该敲除菌株在本文中指定为大肠杆菌(DE3,ΔfadE)。

按照Datsenko等人(PNAS(USA),97:6640-6645(2000))描述并进行了如下改动的方案，构建了另一个fadE缺失菌株MG1655。用于产生缺失的两个引物是：

Del-fadE-F:

5’-AAAAACAGCAACAATGTGAGCTTTGTTGTAATTATATTGTAAACATATTGATTCCGGGGATCCGTCGACC；(SEQIDNO:69)和

Del-fadE-R:

5’-AAACGGAGCCTTTCGGCTCCGTTATTCATTTACGCGGCTTCAACTTTCCTGTAGGCTGGAGCTGCTTC(SEQIDNO:70)。

Del-fadE-F和Del-fadE-R引物都包含与大肠杆菌fadE基因同源的50个碱基，并且将这两个引物用来按所述的PCT从质粒pKD13扩增卡那霉素抗性盒。用获得的PCR产物转化含有pKD46的电转感受态大肠杆菌MG1655细胞。先按Datsenko(同上)所述用阿拉伯糖对该细胞诱导3-4小时。于37℃下在SOC培养基中生长3小时以后，将细胞接种于含50g/mL卡那霉素的Luria琼脂板上。37℃过夜孵育之后，分离抗性菌落。通过利用引物fadE-L2和fadE-R1的PCR扩增验证了某些菌落中fadE基因的破坏，fadE-L2和fadE-R1被设计为位于fadE基因的侧翼。

fadE-L25’-CGGGCAGGTGCTATGACCAGGAC(SEQIDNO:71)；和

fadE-R15’-CGCGGCGTTGACCGGCAGCCTGG(SEQIDNO:72)

在验证了合适的fadE缺失之后，利用pCP20质粒使一个菌落去除Km^R标记。将得到的菌株指定为MG1655(ΔfadE)。

对fadE缺失的宿主进行进一步的调整。引入携带负责大肠杆菌中乙酰辅酶A羧化酶活性的4个基因(accA、accB、accC和accD，GenBank登录号：NP_414727、NP_417721、NP_417722、NP_416819,EC6.4.1.2)的质粒。分两步将accABCD基因作为双顺反子操纵子克隆入pACYCDuet-1(Novagen,Madison,WI)的NcoI/HindIII和NdeI/AvrII位点，所获质粒被指定为pAS004.126。可选地，可以将生产宿主工程化，使其表达胚芽乳酸杆菌(Lactobacillusplantarum)的accABCD。

生产宿主内包含的其它修饰包括以下：过表达aceEF(编码丙酮酸盐和2-酮戊二酸脱氢酶复合物的E1p脱氢酶组分和E2p二氢硫辛酰胺酰基转移酶组分)；以及过表达来自大肠杆菌、欧洲亚硝化单胞菌(Nitrosomonaseuropaea)(ATCC19718)、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、链霉菌(Stretomycesspp.)、雷尔氏菌、红球菌、棒状杆菌、短杆菌、分枝杆菌和产油酵母的fabH/fabD/fabG/acpP/fabF(编码FAS)。同样，可以将生产宿主工程化，使其表达来自豌豆(Pisumsavitum)的accABCD(编码乙酰辅酶A羧化酶)。但是，当生产宿主也产生丁醇时，较不希望其表达豌豆同源物。

在某些生产宿主中，利用Link等人(J.Bacteriol.179:6228-6237,1997)的方法敲除或者减弱基因。被敲除或者减弱的基因包括gpsA(编码生物合成sn-甘油3-磷酸脱氢酶,GenBank登录号NP_418065,EC:1.1.1.94)、ldhA(编码乳酸脱氢酶,GenBank登录号NP_415898,EC:1.1.1.28)、pflb(编码甲酸乙酰基转移酶1,GenBank登录号:P09373,EC:2.3.1.54)、adhE(编码醇脱氢酶,GenBank登录号：CAA47743,EC:1.1.1.1、1.2.1.10)；pta(编码磷酸转乙酰酶,GenBank登录号：NP_416800,EC:2.3.1.8)、poxB(编码丙酮酸氧化酶,GenBank登录号：NP_415392,EC:1.2.2.2)、ackA(编码醋酸激酶,GenBank登录号：NP_416799,EC:2.7.2.1)及以上的组合。

同样，将PlsB[D311E]突变引入LS9001以减弱plsB以用于fadE缺失。该突变减少了转向产生磷脂的碳的量。通过用谷氨酸的GAA密码子取代天冬氨酸311的GAC密码子来制备编码PlsB[D311E]的等位基因。通过基因合成制备改变的等位基因，并利用Link等人的方法(参见上文)将染色体plsB野生型等位基因替换为突变的plsB[D311E]等位基因。

实施例2.生产宿主的修饰

构建下列质粒用于表达脂肪酸衍生物合成中使用的各种蛋白。利用标准分子生物学方法制备构建体。所有被克隆的基因均置于IPTG-诱导型启动子(例如，T7启动子、tac启动子或者lac启动子)的控制下。

将大肠杆菌的‘tesA基因(硫酯酶A基因，GenBank登录号NP_415027，其不含前导序列(SEQIDNO:31)(ChoandCronan,J.Biol.Chem.,270:4216-9,1995,EC:3.1.1.5,3.1.2.-))克隆入NdeI/AvrII消化的pETDuet-1载体(本文所述的pETDuet-1可获自Novagen,Madison,WI)中。将编码加利福尼亚桂树(Umbellulariacalifornica)、萼距花(Cupheahookeriana)和樟树(Cinnamonumcamphorum)的FatB型植物硫酯酶(TE)的基因(GenBank登录号：UcFatB1＝AAA34215，ChFatB2＝AAC49269，ChFatB3＝AAC72881，CcFatB＝AAC49151)分别克隆入3种不同的载体：(i)NdeI/AvrII消化的pETDuet-1，(ii)XhoI/HindIII消化的pBluescriptKS+(Stratagene,LaJolla,CA)(用于产生N端lacZ::TE融合蛋白)；和(iii)XbaI/HindIII消化的pMAL-c2X(NewEnglandLab,Ipswich,MA)(用于产生N端malE::TE融合蛋白)。将来自大肠杆菌的fadD基因(编码酰基辅酶A合酶)克隆入NcoI/HindIII消化的pCDFDuet-1衍生物，所述衍生物在其NdeI/AvrII位点包含来自贝氏不动杆菌ADP1的acr1基因(酰基辅酶A还原酶)。

表7总结了用于制备数个示例性生产宿主的质粒。

表7：生产宿主中使用的质粒总结

本领域技术人员应当理解，可以使用不同的质粒和基因组修饰获得类似的菌株。

选中的表达质粒含有相容的复制子和抗生素抗性标记，从而产生4质粒表达系统。

在某些实施方案中，可以用下述质粒共转化LS9001：(i)任意TE表达质粒，(ii)fadD表达质粒，其也表达acr1和(iii)酯合酶表达质粒。

对于本领域技术人员显而易见的是，当用IPTG诱导LS9001时，所得菌株会从例如葡萄糖的碳源产生增加浓度的脂肪醇。

实施例3.重组大肠杆菌菌株中脂肪醇的产生

通过在生产宿主中外源性表达硫酯酶基因和酰基辅酶A还原酶基因来产生脂肪醇。具体来说，将质粒pCDFDuet-1-fadD-acr1(酰基辅酶A还原酶)和pETDuet-1-‘TesA(硫酯酶)转化入大肠杆菌菌株LS9001，并用补充了100mg/L壮观霉素和50mg/L羧苄青霉素的LB平板选择相应的转化体。将LS9001/pCDFDuet-1-fadD-acr1的4个转化体独立地接种于3mL补充了50mg/L羧苄青霉素和100mg/L壮观霉素的M9培养基中。包含所述转化体的样品在25℃的摇床(以约250rpm振荡)中培养，直到它们达到0.5的OD₆₀₀。然后，每种样品取1.5mL转移入包含30mL上述M9培养基的250mL烧瓶中。所获培养物在25℃的摇床中生长，直到它达到0.5-1.0的OD₆₀₀。然后添加IPTG至终浓度1mM。细胞继续生长40小时。

然后将细胞以4,000rpm离心沉淀，并将细胞团悬浮于1.0mL甲醇中。然后将3mL乙酸乙酯与悬浮细胞混合，随后添加3mLH₂O。然后用超声处理所述混合物20分钟。将所获样品以4,000rpm离心5分钟。然后，将包含脂肪醇的有机相(上层相)进行GC/MS分析。总的醇(包括十四烷醇、十六烷醇、十六烯醇和十八烯醇)的滴度是约1-10mg/L。当以相同条件并按照相同方案培养仅携带空载体的大肠杆菌菌株时，只获得0.2-0.5mg/L的脂肪醇滴度。

实施例4.含有奇数碳链且不含重金属的脂肪酸(FA)和脂肪酸乙酯(FAEE)的制备

1.生物柴油样品#23-30的制备

通过经工程化而产生脂肪酯的大肠杆菌菌株(C41DE3ΔfadEΔfabR‘TesAfadDadp1ws)的生物反应器培养来制备生物柴油样品#23-30(“样品#23-30”)。培养物扩增利用了两阶段接种方案。第一个阶段包括将1mL大肠杆菌产酯菌株冻存液接种到带有遮挡的250mL烧瓶中的50mLLB培养基(补充了100μg/L羧苄青霉素和100μg/L壮观霉素)中。将这个种子瓶于37℃孵育约7小时(终OD₆₀₀＝4.5,pH6.7)。之后取3mL初级培养物转移到三个带遮挡的2L瓶中的每一个，所述瓶中含有350ml缓冲的F1基本培养基，所述培养基还含有100μg/L羧苄青霉素和100μg/L壮观霉素。使用的摇瓶缓冲液是终浓度为200mM(pH7.2)的Bis-Tris丙烷。随后将这些次级种子瓶于37℃下孵育约18小时(终OD₆₀₀＝12,pH5.5)，内容物用于接种三个14L生物反应器，接种后起始体积是6.5升缓冲的F1基本培养基。这些生物反应器同样含有100μg/L羧苄青霉素和100μg/L壮观霉素。

这些14L生物反应器最初在37℃培养，利用搅拌和氧富集级联环(enrichmentcascadeloops)将溶氧水平保持在30％的饱和度。用1MH₂SO₄和无水氨气将发酵混合物的pH维持在7.2。当基础培养基中最初的5g/L葡萄糖被消耗尽时，开始在每个生物反应器中加入主要由43％(w/v)葡萄糖构成的营养补料。然后在发酵运行期间人工调节葡萄糖溶液的补料速度，从而在发酵运行期间保证剩余葡萄糖处于低水平(但不是0)。培养物的OD₆₀₀达到30时，用1mMIPTG(终浓度)诱导培养物。在该诱导点，将生物反应器的培养温度降到30℃，向培养物中加入约15mL/L(6.5到7升)乙醇，并始终通过HPLC进行监测。定时向生物反应器中额外加入乙醇以保持剩余浓度为约20mL/L。培养约60小时后，收获生物反应器的内容物，从三个生物反应器中的每个收获到约10L培养液。

将这些收获的培养液合并，用等体积的乙酸乙酯、在室温下搅拌提取两小时。然后将培养液提取物离心(3,500rpm,30分钟)来分离液层，然后取出有机层用于进一步处理。经旋转蒸发(Büchi,R-200)将乙酸乙酯几乎全部从有机层去除(GC/FID测定得出<0.3％的残存)，剩下约90ml深色油样液体。该液体命名为样品#23-30。

2.样品#23-30中FA和FAEE的定量

用配备30m×0.25mm(0.10μm膜)DB-5柱的Agilent5975BMSD系统进行GC-MS。柱温为100℃等温3分钟。柱子的温度被设置成以20℃/分钟的速度从100℃升到320℃。当达到320℃的最终温度时，柱在该温度保持等温5分钟。上样体积是1μL。载气氦以1.3mL/分钟释放。质谱仪配备电子碰撞电离源。电离源温度设定为300℃。FAEE标准品(例如，十二烷酸乙酯、十四烷酸乙酯、顺式-9-十六烯酸乙酯、十六烷酸乙酯、十八烷酸乙酯，全部>99％)；脂肪酸甲酯(FAME)标准品(例如，十二烷酸甲酯、十四烷酸甲酯、十五烷酸甲酯、顺式-9-十六烯酸甲酯、十六烷酸甲酯、顺式-11-十八烯酸甲酯，全部>99％)；三甲基硅烷基重氮甲烷(TMSD,己烷中2M)；盐酸(37％)；甲醇(>99.9％)；以及乙酸乙酯(>99.9％)均购自Sigma-Aldrich并直接使用未经预先纯化。

通过向1ml样品中(1mg/mL，溶于乙酸乙酯)加入50μL三甲基硅烷基重氮甲烷(TMSD)、8μLHCl和36μL甲醇来衍生样品#23-30。将混合物室温孵育1小时。

定量前，用两种方法鉴定样品#23-30中的FAEE和FAME。首先，将每种化合物的GC保留时间与已知标准品的保留时间进行比较。然后，通过将化合物的质谱与质谱库中标准品的质谱匹配来证实每种化合物的鉴定。

当可获得FAEE或FAME标准品时，FAEE或FAME的定量可以通过制作校准曲线(浓度相对于仪器反应)来确定。然后得到仪器反应与分析物浓度间的线性关系。通过获取样品中化合物的仪器反应并参照校准曲线来确定样品中化合物的浓度。

当无法获得FAEE标准品时，用平均仪器反应来确定化合物的浓度。将所有已有校准曲线的斜率和截距平均。根据这些平均值，确定浓度和仪器反应之间的线性关系。然后，利用公式1，通过将未知化合物的仪器反应参考仪器反应与浓度之间的线性关系来确定未知化合物的浓度。

公式1：浓度＝(仪器反应-平均截距)/平均斜率

对FAME进行鉴定和定量后，根据FAME的浓度以及FA与FAME的分子量之比来确定相关游离脂肪酸的浓度。最后，将FAEE和FA的浓度(mg/L)转化为生物柴油样品中的百分比(w/w％)。

表8列出了样品#23-30中的FAEE和FA的浓度。FAEE和FA的总浓度是80.7％。剩下的未知化合物可以通过LC/MS/MS方法分析。十五烷酸乙酯、顺式-9-十六烯酸乙酯、十六烷酸乙酯和顺式-11-十八烯酸乙酯是样品#23-30的主要成分。

表8：样品#23-30中FAEE和FA的百分比

*百分比是w/w％

未预料到的是样品#23-30含有奇数FA和FAEE。

3.样品#23-30的定量元素分析

已知重金属对于催化裂化过程中使用的催化剂是有害的。为了测量样品#23-30中的重金属水平，将样品#23-30送到GalbraithLaboratories,Inc，进行砷、钙、碳、氯、钴、铜、氢、铁、KarlFisher水、铅、锰、镁、汞、钼、氮、钾、钠、硫、锌、氧和磷的定量元素分析。下文描述了制备和分析方法。结果如表9所示。除了碳(73.38％)、氯(91ppm)、氢(12.1％)、KarlFisher水(0.998％)、汞(0.057ppm)、氧(14.53％)和磷(343ppm)，表9中的所有量均低于定量水平(LOQ)。因此，样品#23-30不含有高水平的所关注的重金属。

方法G-52,Rev6：微波消解样品用于进行金属分析

称适量样品到微波容器中，四舍五入到最接近的0.001g。然后向微波容器中加入合适的试剂。如果观察到肉眼可见的反应，则允许反应停止之后再盖上微波容器。然后根据厂商的说明，将容器密封并放到微波中。每个容器的温度在5分钟内达到最低180±10℃。使其在最低180±10℃保持10分钟。在微波程序结束时，允许容器冷却至少5分钟然后再取出。然后打开容器并将其转移到容量瓶中，用于通过合适的技术进行分析。

方法G-55，Rev3：用于测定卤素的Parr氧弹燃烧

称取样品到燃烧杯中，加入矿物油作为助燃剂。对于氯(Cl)和溴(Br)的测量，向氧弹中加入1％过氧化氢溶液。对于硫(S)的测量，加入0.01N氢氧化钠溶液。将样品和杯与合适的吸收液一起封闭于Parr氧燃烧弹中。用氧气排空燃烧弹，然后加压达到25-30atm氧气压，并点燃。之后，充分混合燃烧弹的内容物，并将其转移到烧杯中，进行后续分析。

方法G-30B，Rev7：用于金属分析的无机和有机化合物的湿灰消解

用H₂SO₄焦化样品。如果分析形成不溶性硫酸盐的金属，用HClO₄和HNO₃来焦化有机物质。将样品焦化后，加入HNO₃并使样品回流以溶解存在的金属。如果溶液变浑浊，加入HCl以助于完全消解。如果样品中有硅，则可以使用HF，但这仅在硅不是目标分析物的情况下。所有用到的HF都只能容纳在Teflon容器中。将澄清的消解液定量转移到A级容量瓶中并加至终体积。然后分析样品。

方法ME-4ARev2：通过抑制型离子色谱测定阴离子

方法S-300Rev7：通过库仑滴定(KarlFischer)测定水

本方法结合了库仑和KarlFischer滴定法。将样品与主要含有碘离子(I^-)和二氧化硫的胺-甲醇混合物进行混合。允许在阳极经电解产生的碘与水反应。这种情况下，根据法拉第定律，产生的碘与电流量成正比。并且，因为1摩尔水与1摩尔碘进行化学计量反应，1mg水相当于10.71库仑电流。利用这个规律，湿度计直接根据电解所需的库仑量确定水的量。这个过程包括直接导入和蒸发器预处理技术。

方法E16-2，Rev9(TraceE16-2A)：利用LECOSC-432DR测定硫

SC-432DR硫分析仪是一种非分散的红外数控仪器，该仪器设计用于测量各种无机和有机物中的硫含量。将样品在纯氧中1350±50℃下燃烧。硫被氧化为二氧化硫，并通过红外吸收定量。SC-432DR配备有两个检测器、高倍率红外池和低倍率红外池。

方法ME-2，Rev14：碳、氢和氮的测定

这个仪器在纯氧中、950℃、在静态下燃烧样品，从而产生CO₂、H₂O和N₂的燃烧产物。PE-240在自求积分式稳态导热分析仪中自动分析这些产物。可以加入钨酐促进燃烧。对于难以燃烧的样品，可以延长燃烧时间(例如，硬烧模式)。

方法ME-70，Rev4：电感耦合等离子体原子发射光谱法

这个方法描述了利用同步光学系统和轴向或径向检测等离子体通过ICP-AES的多元素测定。该仪器通过光谱学测量特征性的发射谱。将样品雾化并且将得到的气溶胶转移到等离子焰矩。通过高频感应耦合等离子体产生元素特异性的发射谱。发射谱被光栅光谱仪分散，通过光敏设备监测发射线的强度。痕量元素测定需要进行背景校正。分析过程中，与样品的分析物线相邻进行背景的测量。要根据分析物线相邻的谱的复杂性来确定背景强度测量所选择的位置，无论是在分析线的一侧或两侧。在一种分析模式中，使用的位置应当尽量不受光谱干扰，并且应当反映出与在所测分析物波长发生的相同的背景强度变化。在线加宽的情况中，不需要进行背景校正，因为这时的背景校正实际上会使分析结果退化。

方法E80-2,Rev4：汞的测定(自动冷蒸汽技术)

这个方法是基于EPASW846方法7471A。冷蒸汽原子吸收是基于原子吸收的一般理论，该理论认为分析物的自由原子从灯源吸收与分析物浓度成比例的能量。通过利用含有待测金属的灯，得到吸收所需的确切波长并极大地降低干扰。冷蒸汽原子吸收利用这个原理，用二氯化锡(II)(SnCl₂)还原汞离子，使汞原子释放。氮气携带原子通过光学池，汞灯在一端，检测器在另一端。因为采用了冷蒸汽法而不是火焰法，未被消化的有机化合物因其广泛的吸收波长而成为干扰因素。

表9:样品#23-30的定量元素分析

“<”表示结果低于LOQ。*氧含量是从100％中减去所有其它元素观察到的结果而确定的。

实施例5.生产宿主中脂肪醇的产生和释放

在仅利用葡萄糖作为唯一碳源和能源培养的大肠杆菌中表达acr1(编码酰基辅酶A还原酶)。大肠杆菌产生少量的脂肪醇，如十二烷醇(C_12:0-OH)、十四烷醇(C_14:0-OH)和十六烷醇(C_16:0-OH)。在其它样品中，FadD(酰基辅酶A合酶)与acr1共同在大肠杆菌中表达。观察到脂肪醇产生增加5倍。

其它样品中，将按实施例1所述构建的携带accABCD的质粒中的acr1、fadD、accABCD(乙酰辅酶A羧化酶)以及各种分别的硫酯酶(TE)在野生型大肠杆菌C41(DE3)和大肠杆菌C41(DE3ΔfadE，缺少酰基辅酶A脱氢酶的菌株)中表达。这导致脂肪醇产生的进一步增加和脂肪醇谱的调节(参见图6)。例如，该系统中大肠杆菌’^TesA(pETDuet-1-’TesA)的过表达实现C_12:0-OH、C_14:0-OH和C_16:0-OH增加约60倍，其中C_14:0-OH是主要的脂肪醇。当表达ChFatB3酶(pMAL-c2X-TEcu中来自萼距花的FatB3)时，获得非常类似的结果。当表达UcFatB1酶(pMAL-c2X-TEuc中来自加利福尼亚桂树的FatB1)时，脂肪醇产生增加约20倍，并且C_12:0-OH是主要的脂肪醇。

ChFatB3和UcFatB1的表达还分别导致产生显著量的不饱和脂肪醇C_16:1-OH和C_14:1-OH。在从’tesA表达产生的样品的上清液中也发现了脂肪醇。在37℃下，发现上清和细胞沉淀中的脂肪醇的量近似相等。而在25℃下，在上清液中发现约25％的脂肪醇。参见图7。

实施例6.使用多种酰基辅酶A还原酶产生脂肪醇

本实施例描述了使用多种酰基辅酶A还原酶产生脂肪醇。脂肪醇可以是终产物。可选地，还可以将生产宿主细胞工程化，使其额外表达/过表达酯合酶以产生脂肪酯。

将编码来自各种来源的脂酰辅酶A还原酶(表10)的四个基因中的每一个对大肠杆菌表达进行密码子优化，并由CodonDevices,Inc.(Cambridge,MA)合成。每一个合成基因中均作为NdeI-AvrII片段克隆到pCDFDuet-1-fadD载体中(实施例2中描述)。将每个携带这些酰基辅酶A还原酶基因以及大肠杆菌fadD基因的质粒转化到大肠杆菌菌株C41(DE)中(购自Over-expression)。

将重组菌株在37℃下、在3mLLB培养液(补充了100mg/L壮观霉素)中过夜培养。取0.3mL过夜培养物转移到30mL新鲜的M9培养基(含有100mg/L壮观霉素)中，在25℃培养。培养物达到0.5的OD₆₀₀时，加入1mMIPTG。给予各培养物提供三种脂肪酸中的一种(浓度0.1％、溶于水、pH7.0)。所述三种脂肪酸是十二烷酸钠、豆蔻酸钠或者棕榈酸钠。未添加脂肪酸的培养物作为对照。诱导后，培养物在25℃相同温度下再培养40小时。

利用GC-MS，按照以上实施例3和/或实施例4所述的，对发酵结束时的脂肪醇收率进行定量。表11显示了由相应脂肪酸所产生的脂肪醇。结果表明：这三种酰基辅酶A还原酶，即Acr1、AcrM和BmFAR，可以将所有三种脂肪酸都转化为相应的脂肪醇。结果还表明：当底物是豆蔻酸盐和棕榈酸盐时，hFAR和JjFAR都有活性。但是，当底物是十二烷酸时只有很低的活性或者没有活性。mFAR1和mFAR2仅对豆蔻酸盐表现出低活性，对其它两种脂肪酸没有活性。

表10:酰基辅酶A还原酶

酰基辅酶A还原酶	蛋白ID(登录号)	蛋白来源
			mFAR1	AAH07178	小家鼠
mFAR2	AAH55759	小家鼠
			JjFAR	AAD38039	加州希蒙得木
BmFAR	BAC79425	家蚕
			Acr1	AAC45217	贝氏不动杆菌ADP1
AcrM	BAB85476	不动杆菌M1
			hFAR	AAT42129	智人

表11:脂肪醇产生

注:^a这种情况中仅对十六烷醇进行了定量，

^b给予的脂肪酸/产生的脂肪醇。

^c产生的脂肪醇的峰面积。

实施例7.中链脂肪酯

醇乙酰转移酶(AAT，EC2.3.1.84)负责各种植物中酰基乙酸酯的产生，其可用于产生中等链长的脂肪酯，如辛酸辛酯、辛酸癸酯、癸酸癸酯等。从中链醇(如C₆和C₈)和中链酰基辅酶A或者脂肪酸(如C₆和C₈)合成的脂肪酯的熔点相对低。例如，己酸己酯具的熔点为约-55℃，而辛酸辛酯的熔点为约-18℃至约-17℃。这些化合物的低熔点使得它们适于作为生物燃料。

本实施例中，将编码硫酯酶的SAAT基因与来自大肠杆菌的fadD和acr1(来自贝氏不动杆菌ADP1的醇还原酶)在生产宿主大肠杆菌C41(DE3,ΔfadE)(如国际申请号PCT/US08/058788中所描述，通过引用将该申请的公开内容并入本文)中共表达。发酵液中提供了辛酸。这导致辛酸辛酯的生成。同样，当在生产宿主中表达来自贝氏不动杆菌ADP1的酯合酶基因而不是SAAT基因时，产生辛酸辛酯。

利用DNA2.0(MenloPark,CA94025)合成重组SAAT基因。合成的DNA序列是基于公开的基因序列(GenBank登录号AF193789)，并经修饰去除了NcoI位点。将合成的SAAT基因(作为BamHI-HindIII片段)克隆入用BamHI和HindIII线性化的pRSETB(Invitrogen,Calsbad,California)。将所获质粒pHZ1.63A与pAS004.114B共转化入大肠杆菌生产宿主，pAS004.114B携带来自大肠杆菌的fadD基因和来自贝氏不动杆菌ADP1的acr1基因。将转化体培养于3mL含有2％葡萄糖的M9培养基中。在IPTG诱导并添加0.02％辛酸后，允许培养物在25℃生长40小时。然后，向全培养物中添加3mL乙酰乙酸酯，并用混合器混合几次。利用GC/MS分析乙酰乙酸酯相。

令人惊讶的是，在乙酰乙酸酯提取物中没有发现酰基乙酸酯。但是，发现了辛酸辛酯。然而，不含SAAT基因的对照菌株[C41(DE3,ΔfadE)/pRSETB+pAS004.114B]未产生辛酸辛酯。此外，菌株[C41(DE3,ΔfadE)/pHZ1.43B+pAS004.114B]产生辛酸辛酯，其中pHZ1.43携带来自贝氏不动杆菌ADP1的酯合酶基因(参见图8A-D)。

SAAT活性产生辛酸辛酯这一发现使制备诸如辛酸辛酯、癸酸辛酯的中链脂肪酯成为可能，这些中链脂肪酯的熔点低，适于作为生物燃料且适于取代基于甘油三酯的生物柴油。

实施例8.大肠杆菌菌株LS9001中脂肪酯的产生

通过将大肠杆菌生产宿主工程化，使其表达脂肪醇形成酰基辅酶A还原酶、硫酯酶和酯合酶从而产生脂肪酯。因此，生产宿主产生酯的A侧和B侧两者，而两侧的结构均受硫酯酶基因表达的影响。

用携带来自贝氏不动杆菌ADP1的酯合酶基因(质粒pHZ1.43)、来自萼距花的硫酯酶基因(质粒pMAL-c2X-Tech)和来自大肠杆菌的fadD基因(质粒pCDFDuet-1-fad)的质粒转化LS9001菌株。

按下述构建携带酯合酶(WSadp1,GenBank登录号AA017391,EC2.3.175)的质粒pHZ1.43。首先利用来自贝氏不动杆菌ADP1的基因组DNA序列作为模板并利用下列引物扩增Wsadp1基因：

WSadp1_NdeI,5’-TCATATGCGCCCATTACATCCG-3’(SEQIDNO:35)；和

WSadp1_Avr,5’-TCCTAGGAGGGCTAATTTAGCCCTTTAGTT-3’(SEQIDNO:36)。

然后，用NdeI和AvrII消化PCR产物，并克隆入pCOLADeut-1而产生pHZ1.43。随后，将携带wSadp1的质粒与pETDuet-1’TesA和pCDFDuet-1-fadD-acr1共转化入大肠杆菌菌株LS9001，并在补充了50mg/L卡那霉素、50mg/L羧苄青霉素和100mg/L壮观霉素的LB平板上选择转化体。

将3个转化体接种于3mLLBKCS(补充了50mg/L卡那霉素、50mg/L羧苄青霉素、100mg/L壮观霉素和10g/L葡萄糖的LB培养液)，在37℃下、在摇床(250rpm振荡)上孵育。当培养物达到约0.5的OD₆₀₀时，将1.5mL每种培养物转移到含有50mLLBKCS的250mL烧瓶中。然后将烧瓶在37℃下、摇床(250rpm)上孵育，直至培养物达到约0.5-约1.0的OD₆₀₀。然后添加IPTG至1mM的终浓度。将诱导的培养物在37℃下、摇床上(250rpm)再孵育40-48小时。

然后将培养物转移到50mL锥形管中，将细胞以3,500×g离心约10分钟。然后将每一细胞沉淀与5mL乙酸乙酯混合。利用GC/MS分析乙酸乙酯提取物。脂肪酯(包括C₁₆C₁₆、C_14: ₁C₁₆、C_18:1C_18:1、C₂C₁₄、C₂C₁₆、C₁₆C_16:1和C₂C_18:1)的滴度是约10mg/L。当在相同条件和相同方案下培养只携带空载体的大肠杆菌菌株时，在乙酸乙酯提取物中只发现了0.2mg/L的脂肪酯。

实施例9.生产宿主中脂肪乙酯的产生和释放

用携带来自贝氏不动杆菌的酯合酶基因(质粒pHZ1.43)、来自萼距花的硫酯酶基因(质粒pMAL-c2X-TEcu)和来自大肠杆菌的fadD基因(质粒pCDFDuet-1-fadD)的质粒转化LS9001菌株。

将重组菌株培养于25℃、3mL含有50mg/L卡那霉素、100mg/L羧苄青霉素和100mg/L壮观霉素的M9培养基中。在IPTG诱导后，将培养基调整至终浓度1％乙醇和2％葡萄糖。

IPTG诱导后，让培养物生长40小时。通过3,500×g离心10分钟，从消耗的培养基分离细胞。将细胞沉淀重悬于3mLM9培养基中。然后用1倍体积的乙酸乙酯提取细胞悬液和消耗的培养基。对从细胞悬液和上清液得到的乙酸乙酯相进行GC-MS分析。

C₁₆乙酯是对这种硫酯酶的最主要的酯类，并且生成的脂肪酯中的20％从细胞释放(参见图9)。含有pCOLADuet-1(酯合酶基因的空载体)、pMAL-c2X-TEuc(含有来自加利福尼亚桂树的fatB)和pCDFDuet-1-fadD(来自大肠杆菌的fadD基因)的对照大肠杆菌菌株C41(DE3,ΔfadE)未能产生可检测量的脂肪酸乙酯。利用商品化的棕榈酸乙酯作为参照来定量脂肪酸酯。

利用本文描述的方法(但是是向发酵液中添加甲醇或者异丙醇)也产生了脂肪酯。产生预期的脂肪酯。

实施例10.各种硫酯酶对重组大肠杆菌菌株产生的脂肪乙酯组成的影响。

将硫酯酶FatB3(萼距花)、’TesA(大肠杆菌)和FatB(加利福尼亚桂树)与酯合酶(来自贝氏不动杆菌)同时表达。通过下述构建了包含具有fadD基因的pCDFDuet-1(Novagen,Madison,WI)骨架的质粒pHZ1.61：用pHZ1.43的NotI-AvrII片段替换NotI-AvrII片段(携带acr1基因)，从而使得fadD和ADP1酯合酶位于同一质粒中，并且两个编码序列中的每一个均受分别的T7启动子的控制。pHZ1.61的构建使得可以利用两质粒系统而不是三质粒系统。然后将pHZ1.61与携带本文所述不同硫酯酶基因的各种质粒中的一种共转化入大肠杆菌C41(DE3,ΔfadE)。

利用本文描述的技术，测定这些转化体产生的总脂肪酸乙酯(上清液和胞内的脂肪酸乙基液)。脂肪酸乙酯的滴度和组成总结于表12。

表12：重组大肠杆菌C41(DE3,ΔfadE)/pHZ1.61和携带各种硫酯酶基因的质粒产生的脂肪酸乙酯的滴度(mg/L)和组成。

硫酯酶	C₂C₁₀	C₂C_12:1	C₂C₁₂	C₂C_14:1	C₂C₁₄	C₂C_16:1	C₂C₁₆	C₂C_18:1	总
										‘TesA	0.0	0.0	6.5	0.0	17.5	6.9	21.6	18.1	70.5
ChFatB3	0.0	0.0	0.0	0.0	10.8	12.5	11.7	13.8	48.8
										ucFatB	6.4	8.5	25.3	14.7	0.0	4.5	3.7	6.7	69.8
pMAL	0.0	0.0	0.0	0.0	5.6	0.0	12.8	7.6	26.0

注：‘TesA,pETDuet-1-‘TesA；chFatB3,pMAL-c2X-TEcu；ucFatB,pMAL-c2X-TEuc；pMAL,pMAL-c2X,用于本研究的硫酯酶的空载体。

实施例11.利用各种酯合酶产生生物燃料

根据NCBIGenBank报导的相应多核苷酸序列并进行轻度修饰，合成了四个编码酯合酶的基因。所述修饰包括去除内部NcoI、NdeI、HindIII和AvrII限制性位点，而不对相应氨基酸序列引入其它改变。合成的4个目的基因中的每一个在5’端有NdeI位点并且在3’端有AvrII位点。然后将所述序列克隆到pCOLADuet-1(Novagene)中的NdeI和AvrII位点，产生pHZ1.97-376、pHZ1.97-377、pHZ1.97-atfA1和pHZ1.97-atfA2。以下表13列出了携带4个目的基因之一的质粒以及每个基因各自的GenBank登录号和GenPeptide登录号。

表13：酯合酶

将4个质粒中的每个都转化到大肠杆菌C41(DE3,ΔfadEΔfabR)/pETDuet-1-’TesA+pCDFDuet-1-fadD中。从每次转化选出三个转化体进行发酵研究，测定它们合成脂肪酸乙酯的能力。发酵步骤如实施例6所述，但在两个不同温度(25℃或37℃)下进行。菌株C41(DE3,ΔfadEΔfabR)/pETDuet-1-’TesA+pCDFDuet-1-fadD+pHZ1.43(表达ADP1酯合酶)用作阳性对照，C41(DE3,ΔfadEΔfabR)/pETDuet-1-’TesA+pCDFDuet-1-fadD作为阴性对照。

4个酯合酶基因中的每个在大肠杆菌菌株中表达，其中fadE和fabR活性减弱并且‘tesA和fadD过表达，这使得各个菌株在25℃下产生约250mg/L的FAEE。这与表达ADP1的酯合酶的阳性对照产生的量相同。相反，阴性对照菌株在相同条件下、于25℃产生少于50mg/L的FAEE(参见图10)。由这四种酯合酶产生的FAEE的脂酰基组成与ADP1酯合酶产生的FAEE脂酰基组成类似(参见图11)。

37℃下进行发酵的结果表明，携带pHZ1.97_aftA2的菌株和携带pHZ1.97_376的菌株比携带pHZ1.43的阳性对照产生更多的FAEE(参见图12)。携带pHZ1.97_aftA2的菌株和携带pHZ1.97_376的菌株还产生大量游离脂肪酸(参见图13)。而携带pHZ.143的菌株没有积累游离脂肪酸。这些结果表明这四种酯合酶能够接受乙醇和多种酰基辅酶A作为底物。

实施例12.使用真核生物酯合酶产生生物燃料

本实施例描述了来自酿酒酵母的酯合酶的克隆和表达。采用标准分子生物学技术制备质粒。

表14：带有eeb1的质粒

*酿酒酵母基因eeb1(GenBank登录号YPL095C)是由酿酒酵母基因组DNA序列通过PCR扩增的，所用的引物引入了5’BamHI和3’HindIII位点。

用大肠杆菌C41(DE3ΔfadE)生产宿主表达各种质粒。将大肠杆菌细胞培养于M9基本培养基(含有6g/LNa₂HPO₄、3g/LKH₂PO₄、0.5g/LNaCl、1g/LNH₄Cl、1mg/L硫胺(维生素B1)、1mMMgSO₄、0.1mMCaCl₂、0.4％(w/v)或2％(w/v)葡萄糖)中。通过将脂肪酸钠盐或钾盐溶于蒸馏去离子水(pH7.0)制备所有脂肪酸储备液。辛酸储备液购自Sigma,St.Louis,MO。

用含有质粒pCDFDuet-1-acr1、pMAL-c2X-TEuc(ucFatB)和pGL10.59(eeb1)的C41(DE3ΔfadE)菌株进行发酵。对照菌株是携带pCDFDuet-1-acr1、pMAL-c2X-TEuc和pCOLADuet-1空载体的C41(DE3ΔfadE)菌株。将每个转化的三个菌落中的每一个用于接种M9+0.4％葡萄糖起始培养物，所述培养物中添加了羧苄青霉素(100μg/mL)、壮观霉素(100μg/mL)和卡那霉素(50μg/mL)。将培养物于37℃过夜培养。将起始培养物以1:100稀释接种3mLM9培养基+0.4％葡萄糖来制备生产培养物。将生产培养物于37℃培养至OD₆₀₀＝0.6，然后用1mMIPTG进行诱导，添加1％乙醇，在25℃下再培养40小时。用等体积的乙酸乙酯经剧烈涡旋30秒来提取全细胞培养物。取有机相，并采用检测FAEE的alkane_1_splitless_ctc.m方法在GC/MS中检测有机相，所述方法描述于上文实施例4的第2部分“样品#23-30中FA和FAEE的定量”。

样品中未检测到FAEE峰。为了确定是否eeb1被正确表达，利用SDS-PAGE分析了IPTG诱导的和未诱导的培养物。未能检测到对应于Eeb1(约52kDa)大小的条带。这表明对于该特定质粒系统，Eeb1未被很好地表达。

使用不同表达载体进行了另外的表达试验。将基因克隆到载体pMALc2x中，该载体将靶蛋白表达为麦芽糖结合蛋白(MBP)融合体。对全细胞裂解物进行的SDS-PAGE分析揭示，用1mMIPTG诱导的培养物产生了合适大小的、对应于Eeb1-MBP融合体(约92kDa)的条带。未诱导的细胞中不存在该条带。国际申请号PCT/US08/058788中详细描述了该实验，通过引用将该申请的公开内容全文并入本文。

用携带质粒pCDFDuet-1-acr1和pGL10.104(eeb1)的C41(DE3ΔfadE)大肠杆菌菌株评价Eeb1的酶活性。带有pCDFDuet-1-acr1和pMALc2x的C41(DE3ΔfadE)作为对照菌株。从每个转化中挑出3个菌落，其中的每一个菌落都用来接种添加了羧苄青霉素(100μg/mL)和壮观霉素(100μg/mL)的M9+0.4％葡萄糖过夜起始培养物。用起始培养物的1:100稀释液接种10mLM9+0.4％葡萄糖生产培养物。将生产培养物在37℃培养，直到OD₆₀₀＝0.4-0.5，然后用1mMIPTG进行诱导。向每个培养物添加约1％乙醇、辛酸(终体积的约0.01％或约0.02％)和/或癸酸(终体积的约0.02％)。发酵在25℃下持续24小时。向培养物中加入1/10体积的12MHCl和等体积乙酸乙酯并涡旋30秒进行提取。如上文所述，利用GC/MS分析样品。

GC/MS数据显示，表达eeb1且给予了辛酸和乙醇的细胞可以检测到对应辛酸乙酯的峰。载体对照菌株也显示C₂C₈峰，虽然这个峰小于表达eeb1的细胞的峰。

添加0.02％癸酸的细胞生长情况不好，因此以下研究中使用0.01％或0.005％的癸酸。为了检测Eeb1在合成脂肪酸酯中利用乙醇以外的其它醇的能力，使用相同的菌株进行发酵：带有pCDFDuet-1-acr1和pGL10.104的C41(DE3ΔfadE)。按照上文所述培养细胞。在诱导时，给细胞添加0.02％辛酸和1％甲醇、乙醇、丙醇或者异丙醇。还给细胞添加了0.01％或0.005％癸酸和1％乙醇。在诱导后，发酵于25℃持续24小时。为了准备进行GC/MS分析，将培养物离心分出沉淀和上清液。将沉淀重悬于等体积的新鲜M9+0.4％葡萄糖培养液中。如上所述对重悬的沉淀和上清液进行提取并利用GC/MS进行分析。

所有上清液样品均含有大量脂肪酸，但未检测到脂肪酸酯。同样，使用GC/MS测定时，载体对照沉淀样品不含脂肪酸酯峰。但是，添加C₁₀脂肪酸的细胞显示了被鉴定为癸酸的峰。

来自表达Eeb1并添加了C₈脂肪酸和丙醇或乙醇的细胞的沉淀样品显示出对应于丙酯或乙酯的小峰。添加甲醇或异丙醇的细胞未检测到峰。添加0.01％或0.005％C₁₀脂肪酸和乙醇的培养物还产生了C₂C₁₀FAEE，但FAEE存在于沉淀样品中。

结果表明：Eeb1能够利用辛酸或癸酸合成FAEE，也能够利用甲醇产生辛酸甲酯。但是，这些化合物是高度挥发性的，因此GC/MS数据可能不能准确地反映真实滴度。为了更准确地测量产物形成，使用十六烷覆盖层来促进捕获易挥发的FAEE。

利用带有pCDFDuet-1-acr1和pGL10.104的菌株C41(DE3ΔfadE)来评价Eeb1对脂肪酸底物的活性，给予所述菌株不同链长的脂肪酸。如前所述培养细胞，但在OD₆₀₀＝0.8-0.9时进行诱导，以促进诱导后细胞更好地生长。在此时，给细胞添加1％乙醇和0.02％C₈脂肪酸或者0.01％的以下脂肪酸的组合：C₁₀、C₁₂、C₁₄和C₁₆。用20％总体积的十六烷覆盖添加C₈或C₁₀脂肪酸的培养物。诱导后，发酵在25℃下再进行24小时。为了分析产物，用培养物的1/10体积的HCl和与培养物等体积的乙酸乙酯如本文所述对全培养物(不将上清与沉淀分开)进行提取。用hex_1_splitless_ctc.m程序将十六烷处理的样品直接上样到GC/MS中，该程序描述于上文实施例4的第2部分“样品#23-30中FA和FAEE的定量”中。

载体对照均未显示任何可检测的FAEE峰。对于添加C₈和C₁₀的细胞，十六烷样品中检测到大的C₂C₈和C₂C₁₀峰，但乙酸乙酯样品中没有检测到。这表明十六烷能够成功捕获挥发性的FAEE。对于乙酸乙酯样品的剩余部分，可以检测到C₂C₁₂和C₂C₁₄FAEE的小峰，但检测不到C₂C₁₆FAEE。因此，Eeb1利用链长为C₈-C₁₄的脂肪酸产生乙酯。相比较长链的脂肪酸，Eeb1更偏好C₈和C₁₀。

实施例13.利用重组序列的基因组整合来产生过表达大肠杆菌fabA和/或fabB基因的宿主菌株

已知fabR基因的产物作为fabA和fabB基因表达的阻抑物。还知道FadR是相同基因的激活剂。Zhangetal.,J.Biol.Chem.277:15558-15565,2002公开了FabR及预测的共有结合序列。图14显示了共有结合序列以及它们相对大肠杆菌的fabA和fabB基因的位置。

制备了大肠杆菌fabR敲除菌株。使用引物TrmA_R_NotI和FabR_FOP扩增fabR的上游约1000bp，用引物SthA_F_Bam和FabR_ROP扩增fabR的下游约1000bp。采用重叠PCR制备完整fadE基因框内缺失的构建体。将fabR缺失构建体克隆到温度敏感型质粒pKOV3中，该质粒含有用于反选择的SacB。按照Linketal.,J.Bact.179:6228-6237,1997所述的方法，制备fabR的染色体缺失。

表15：fabR敲除引物

实施例14.生产宿主的构建

表16鉴定了本文所述的某些基因的同源物，已知它们在产生生物柴油、脂肪醇和烃的微生物中表达。为了增加诸如表16中鉴定的那些微生物的生产宿主中脂肪酸的产生并从而增加烃的产生，可以表达异源基因，例如来自大肠杆菌的基因。

本领域技术人员应当理解，也可以利用本文描述的方法表达、过表达或者减弱对于表16提供的微生物来说是内源性的基因。此外，可以在内源性产烃的生产宿主中表达、过表达或者减弱表16中所述的基因，以产生具有限定碳链长度、饱和点和分支点的特定烃。.

表16：烃生产宿主

表16的登录号来自于GenBank，截止到2007年4月15号的Release159.0，表16的EC号来自KEGG，截止到2007年4月的Release42.0(加上每日更新直至并包括2007年5月9日)，解淀粉欧文氏菌菌株Ea273的结果来自于Sanger测序中心，截止到2007年5月9日的完整猎枪序列，欧文氏菌的位置代表Sanger假染色体上的位置，弗尼斯弧菌M1的序列来自于VFM1假染色体，v2建成(v2build)，截止到2006年9月28日，并且包括完整的基因，还可能包括侧翼序列。

实施例15.其它示例性的生产菌株

表17提供了其它示例性的生产菌株。描述了产生脂肪酸、脂肪醇和蜡酯的两种示例性生物合成途径。例如，表17提供了产生脂肪酸的实例1和实例2。实例1中用于产生脂肪酸的生产宿主菌株是工程化而具有所需的合成酶活性的生产宿主细胞。每个“X”指示具有与诸如乙酰辅酶A羧化酶、硫酯酶和酰基辅酶A合酶活性的活性相关的基因。生产宿主细胞可以选自细菌、酵母和真菌。如表17所示，可以利用所示外源基因产生其它生产宿主。

表17:可用于制备基因工程化生产菌株的基因的组合

实施例16.利用其它酰基辅酶A合酶过量产生酰基辅酶A

通过基于来自下述生物的所需序列合成密码子优化的基因，可以在大肠杆菌中表达大肠杆菌fadD的同源物：结核分枝杆菌HR7Rv(NP_217021,FadDD35)、枯草芽孢杆菌(NP_388908,YhfL)、酿酒酵母(NP_012257,Faa3p)或铜绿假单胞菌PAO1(NP_251989)。可以将合成基因设计为包含NcoI和HindII相容性突出。然后如上所述，将酰基辅酶A合酶克隆到NcoI/HindIII消化的pTrcHis2载体中(InvitrogenCorp.,Carlsbad,California)，并在大肠杆菌菌株MG1655ΔfadE中表达。大肠杆菌中的表达引起酰基辅酶A的产生增加。

也可以通过以下产生脂肪酸衍生物(例如FAEE)：用pTrcHis2载体中的各种酰基辅酶A与来自pCL1920的相容性质粒共转化大肠杆菌菌株MG1655ΔfadE，所述来自pCL1920的相容性质粒含有来自萼距花的硫酯基因并且有或者没有来自贝氏不动杆菌的酯合酶。所得生产宿主在含有乙醇的培养基中如上文所述进行培养时会产生FAEE。

实施例17.利用其它酰基辅酶A合酶来过量产生酰基辅酶A

许多大肠杆菌FadD同源物的DNA序列或蛋白序列已知。但是，仅有少数的生物化学特性已有描述。参见例如，Knolletal.,J.Biol.Chem.269(23):16348-56,1994；Shockeyetal.,PlantPhysiol.132:1065-1076,2003。而且，它们是否能以足够高水平的活性形式表达而用于商业目的还不清楚。为了探索将异源酰基辅酶A合酶用于产生酯的可能性，如下文所述，克隆并表达了几种酰基辅酶A合酶基因。虽然本实施例描述了用分别的硫酯酶、酯合酶和酰基辅酶A合酶基因的质粒转化生产宿主，但也可以将这些基因合并入单一质粒中用于转化生产宿主。

1pOP-80质粒的构建

为了过表达基因，通过用限制性酶AflII和SfoI(NewEnglandBioLabsInc.Ipswich,MA)消化pCL1920来构建基于pCL1920的低拷贝质粒，pCL1920是商品载体并携带强的转录启动子(LernerandInouye,NAR18:4631,1990)。所述消化产生三个DNA序列片段。利用凝胶纯化试剂盒(Qiagen,Inc.Valencia,CA)将3737bp的片段进行凝胶纯化。同时，通过使用引物LF3025’-ATATGACGTCGGCATCCGCTTACAGACA-3’(SEQIDNO:41)和LF303:5’-AATTCTTAAGTCAGGAGAGCGTTCACCGACAA-3’(SEQIDNO:42)的PCR扩增含有来自商品质粒pTrcHis2(Invitrogen,Carlsbad,CA)的trc启动子和lacI区的片段。这两个引物还在PCR产物末端分别引入了限制性酶ZraI(gacgtc)和AflII(cttaag)的识别位点。扩增后，用PCR纯化试剂盒(Qiagen,Inc.Valencia,CA)纯化PCR产物，并遵照生产商推荐的条件用ZraI和AflII进行消化(NewEnglandBioLabsInc.,Ipswich,MA)。消化后，将PCR产物进行凝胶纯化并与来源于pCL1920的3737bp的DNA序列片段连接。

用连接混合物转化TOP10化学感受态细胞(Invitrogen,Carlsbad,CA)后，在含有100μg/mL壮观霉素的Luria琼脂板上选择转化体。37℃过夜培养后，可以看到许多菌落。将这些菌落中存在的质粒纯化，用限制性酶分析，然后测序。保留以此方式产生的一个质粒，命名为pOP-80，并用于进一步的实验。pOP-80的图谱如图16所示。

确认了质粒pOP-80相关区的DNA序列。发现在两个片段连接的接合处每个末端丢失了3-4个碱基。这可能是因为外切核酸酶活性损害其中一个限制性酶。这些小的缺失有可能对任何相关质粒功能没有影响。将得到的质粒用于本实施例所述的所有表达试验。质粒的完整序列如图17中的SEQIDNO:1所公开。

2来自结核分枝杆菌HR7Rv的fadD35的克隆

利用以GenBank登录号NP_217021保存在NCBI的fadD35基因的蛋白序列作为起始点，由DNA2.0Inc.(MenloPark,CA)合成了大肠杆菌密码子优化的基因。合成的基因在5’末端含有独特的NcoI位点，在3’末端含有独特的EcoRI位点。DNA2.0Inc.提供的合成基因被克隆在质粒pJ201:16084中。通过NcoI和EcoRI的消化而从该质粒释放fadD35基因。该片段的序列如图18的SEQIDNO:2所示。将SEQIDNO:2公开的DNA序列片段与事先用NcoI和EcoRI消化的pOP-80连接。将连接混合物转化到TOP10化学感受态细胞(Invitrogen,Carlsbad,CA)中，然后将细胞接种在含有100μg/mL壮观霉素的Luria琼脂板上，37℃培养过夜。筛选出第二天出现的菌落，鉴定含有正确质粒的菌株。该质粒命名为pDS9。

3来自铜绿假单胞菌PAO1的fadD1的克隆

利用以GenBank登录号NP_121989保存在NCBI的fadD1基因的蛋白序列作为起始点，由DNA2.0Inc.(MenloPark,CA)合成了大肠杆菌密码子优化的基因。合成的基因在5’末端含有独特的BspHI位点，在3’末端含有独特的EcoRI位点。DNA2.0Inc.提供的合成基因被克隆在质粒pJ201:16083中。通过BspHI和EcoRI的消化而从该质粒释放fadD1基因。该片段的序列如图19中的SEQIDNO:3所示。将得到的SEQIDNO:3的DNA序列片段与事先用NcoI和EcoRI消化的pOP-80连接。将连接混合物转化到TOP10化学感受态细胞(Invitrogen,Carlsbad,CA)中，然后将细胞接种在含有100μg/mL壮观霉素的Luria琼脂板上，37℃培养过夜。筛选出第二天出现的菌落，鉴定含有正确质粒的菌株。该质粒命名为pDS8。

4来自枯草芽孢杆菌的yhfL的克隆

通过使用枯草芽孢杆菌I168染色体DNA序列作为模板和基于以GenBank登录号NC_000964保存在NCBI的DNA序列而设计的两个引物进行PCR来扩增yhfL基因。两个引物的序列是：

BsyhfLBspHIF:5’-CATCATGAATCTTGTTTC-3’(SEQIDNO:4)(图20)

BsyhfLEcoR:5’-CGGAATTCTTATTGGGGCAAAATATC-3’(SEQIDNO:5)(图21)

这两个引物在5’末端引入BspHI识别位点，在3’末端引入EcoRI识别位点。用ZeroBluntTOPOPCR克隆试剂盒(Invitrogen,Carlsbad,CA)将PCR产物直接克隆到pCR-BluntII-TOPO载体中。携带yhfL基因的质粒命名为pDS1。为了亚克隆yhfL，用BspHI和EcoRI消化质粒pDS1。将得到的DNA序列片段SEQIDNO:6(图22)进行凝胶纯化并克隆到事先用NcoI和EcoRI消化的pOP-80中。携带克隆到pOP-80中的枯草芽孢杆菌yhfL基因的质粒命名为pDS4。

5来自酿酒酵母的faa3p(NP_012257)的克隆

通过使用商品酿酒酵母染色体DNA序列ATCC204508D(美国典型培养物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection),Manassas,VA)作为模板和基于以GenBank登录号NC_001141保存在NCBI的DNA序列而设计的两个引物进行PCR来扩增faa3p基因。两个引物的序列是：

Scfaa3pPciF:5’-CGACATGTCCGAACAACAC-3’(SEQIDNO:7)(图23)

Scfaa3pPciI:5’-GCAAGCTTCTAAGAATTTTCTTTG-3’(SEQIDNO:8)(图24)

这两个引物在5’末端引入PciI识别位点，在3’末端引入HindIII识别位点。

用ZeroBluntTOPOPCR克隆试剂盒(Invitrogen,Carlsbad,CA)将PCR产物直接克隆到pCR-BluntII-TOPO载体中。携带faa3p基因的质粒命名为pDS2。为了亚克隆faa3p，用PciI和HindIII消化质粒pDS2。将DNA序列片段(SEQIDNO:9)(图25)进行凝胶纯化并克隆到事先用NcoI和HindIII消化的pOP-80中。携带克隆到pOP-80中的酿酒酵母faa3p基因的质粒命名为pDS5。

6嗜麦芽糖寡养单胞菌R551-3的ZP_01644857的克隆

蛋白ZP_01644857的结构基因序列可从NCBI获得，它是作为基因座NZ_AAVZ01000044的一部分。通过使用嗜麦芽糖寡养单胞菌R551-3染色体DNA序列作为模板和基于保存的DNA序列而设计的两个引物进行PCR来扩增所述基因。两个引物的序列是：

Smprk59BspF:5’-AGTCATGAGTCTGGATCG-3’(SEQIDNO:10)(图26)

Smprk59HindR:5’-GGAAGCTTACGGGGCGGGCG-3’(SEQIDNO:11)(图27)

这两个引物在5’末端引入BspHI识别位点，在3’末端引入HindIII识别位点。

用ZeroBluntTOPOPCR克隆试剂盒(Invitrogen,Carlsbad,CA)将PCR产物直接克隆到pCR-BluntII-TOPO载体中。携带编码蛋白ZP_01644857的基因的质粒命名为pDS3。为了便于该基因的进一步亚克隆，通过使用引物PrkBsp-5’-GCGAACGGCCTGGTCTTTATGAAGTTCGGTGG-3’(SEQIDNO:12，图28)和QuikChange多重定点诱变试剂盒(Stratagene,LaJolla,CA)的定点诱变而将内部的BspHI位点移除。通过DNA测序确认正确突变后，用BspHI和HindIII消化所得质粒，并命名为pDS6。将DNA序列片段进行凝胶纯化并克隆到事先用NcoI和HindIII消化的pOP-80中。携带克隆到pOP-80中的编码蛋白ZP_01644857的基因的质粒命名为pDS7。ZP_01644857的蛋白序列如(图29)(SEQIDNO:13)所示。

7构建菌株用于产生脂肪酯

首先分别用携带大肠杆菌’tesA基因的质粒pETDuet-1-‘TesA(实施例2中描述)和携带atfA2酯合酶基因的质粒pHZ1.97(实施例9中描述)转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株。两个基因都受可被IPTG诱导的T7启动子的控制。用携带异源fadD基因的重组质粒中的每一个转化携带两个质粒的两个独立转化体，并在含有100μg/mL羧苄青霉素、50μg/mL卡那霉素和100μg/mL壮观霉素的Luria琼脂板上进行选择。评价携带三个质粒的三个独立菌落的脂肪酯产生。

8利用来自嗜麦芽糖寡养单胞菌R551-3的ZP_01644857产生的脂肪酯的分析

为了评价来自嗜麦芽糖寡养单胞菌R551-3的蛋白ZP_01644857在生产宿主产生脂肪酯的用途，用携带大肠杆菌’tesA基因的质粒pETDuet-1-’TesA(实施例2中描述)、携带atfA2酯合酶基因的质粒pHZ1.97(实施例9中描述)以及携带编码蛋白ZP_01644857的基因的质粒pDS7(本实施例上面描述)转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株。如实施例4所述将生产宿主发酵产生脂肪酯。作为对照，将含有质粒pETDuet-1-’TesA、pHZ1.97和pCL1920的第二大肠杆菌菌株BL21(DE3)ΔfadE作为生产宿主产生脂肪酯。

下文的表18显示了这些生产宿主的脂肪酯收率。

表18.产生ZP_01644857的生产宿主的脂肪酯收率

^a对照：含有质粒pETDuet-1-’TesA、pHZ1.97和pCL1920的菌株BL21(DE3)DfadE。

^b含有质粒pETDuet-1-’TesA、pHZ1.97和pDS7的菌株BL21(DE3)DfadE。

^c这些数值代表3个培养物的均值。

实施例18.β-氧化的下调

本实施例描述了大肠杆菌菌株MG1655ΔfadEΔydiO的制备。

可以通过减弱本文所述的任何β-氧化酶学反应(见图2)来消除或减弱脂肪酸的降解。例如，可以用引物扩增ydiO上游和用其它引物扩增ydiO下游来进一步工程改造大肠杆菌菌株MG1655ΔfadE。然后可以利用重叠PCR来制备完整ydiO基因框内缺失的构建体。然后将ydiO缺失构建体克隆到温度敏感型质粒pKOV3中，该质粒含有用于反选择的sacB基因。然后按照Linketal.,J.Bact.179:6228-6237,1997的方法来制造ydiO的染色体缺失。所得菌株不能降解脂肪酸和脂酰辅酶A。例如，在Campbelletal.,Mol.Microbiol.47:793-805,2003中描述了产生fadE和ydiO双敲除的其它方法。

还可以通过选择或利用不含有β-氧化途径的生产宿主来避免脂肪酸降解。例如，链球菌的几个种已被测序并且未发现β-氧化基因。

实施例19.其它酯合酶的鉴定

本实施例提供了其它酯合酶以及使用这些合酶产生脂肪酯的方法。

利用生物信息学鉴定出另外一些酯合酶。这些酯合酶含有的基序与诸如ADP1中发现的基序的其它已知基序不同。下文表19指出了基序中的差异。

表19:酯合酶基序的比较

可以采用标准分子生物学技术克隆鉴定的序列。可以用本文描述的载体表达这些序列并用于制备各种脂肪酯。基序还可以用于鉴定其它酯合酶。

实施例20.产物表征

为了对脂肪醇和脂肪酯进行表征和定量，采用了电子碰撞质谱(MS)与气相色谱(GC)的联合检测法。首先用过量的N-三甲基硅烷(TMS)咪唑将脂肪醇样品衍生化以增加检测灵敏度。脂肪酯不需要衍生化。将脂肪醇-TMS衍生物和脂肪酯溶于诸如乙酸乙酯的合适的挥发性溶剂中。

利用以下方法在30mDP-5毛细柱上分析样品。无分流注射1μL到GC/MS柱后，烘箱保持在100℃持续3分钟。以20℃/分钟的速率将温度逐渐升至320℃。烘箱在320℃再保持5分钟。载气氦气的流速是1.3mL/分钟。MS四极在50-550m/z进行扫描。将产物峰的保留时间和裂解谱与可靠参照进行比较以证实峰的种类。

例如，十六烷酸乙酯在10.18分钟洗脱(图15A-B)。容易观察到284质量单位的母离子。更多的是质谱裂解期间产生的子离子。最普遍的子离子是80质量单位的子离子。衍生化脂肪醇十六烷醇-TMS在10.29分钟洗脱，观察到313的母离子。最普遍的离子是299质量单位的M-14离子。

利用本文所述的GC/MS方法，通过注射各种浓度的合适可靠参照进行量化。利用这个信息绘制了反应(总集成化离子计数)相对浓度的标准曲线。

实施例21.对属于α-烯烃生产者的咸海鲜球菌属的微生物的鉴定和重新分类

之前报道炎白色微球菌(Micrococcuscandicans)ATCC8456能合成碳链长度范围为C₁₈至C₂₀的脂肪烃(Morrisonetal.,J.Bacteriol.108:353-358,1971)。为了鉴定由该菌株产生的烃，将ATCC8456细胞在30℃下、于15mLTSBYE培养基(3％胰蛋白酶大豆培养基+0.5％酵母提取物)中培养40-48小时。将5mL培养物的细胞沉淀，重悬在1mL甲醇中，超声30分钟并用4mL己烷提取。溶剂蒸发后，将样品重悬于0.1mL己烷中，通过GC-MS来分析。烃被鉴定为下列α-烯烃：15-甲基-1-十七烯(a-C₁₈)、16-甲基-1-十七烯(i-C₁₈)、1-十九烯(n-C₁₉)、17-甲基-1-十九烯(a-C₂₀)和18-甲基-1-十九烯(i-C₂₀)(参见图34(i＝异、a＝反、n＝直链)和图36)。

基于以下分析，确定了ATCC8456在之前被错误鉴定为属于微球菌属(Micrococci)。通过利用引物Eubac27和1492R(参见DeLongetal.,PNAS89:5685,1992)对部分16srRNA基因进行扩增和测序来重新评估ATCC8456的系统分类。用RibosomalDatabaseProjectII的分类程序(http://rdp.cme.msu.edu/index.jsp)分析ATCC8456的16srRNA序列。基于该分析，将该菌株鉴定为属于咸海鲜球菌属。咸海鲜球菌属之前已有描述(Jung-Hoonetal.,Int.J.Syst.Evol.Microbiol.53:595-602,2003)。

利用ATCC8456的G+C含量进行了其它分析。咸海鲜球菌是与葡萄球菌(Staphylococcus)属相关的低G+C的革兰氏阳性细菌(参见图37)。另一方面，微球菌是高G+C的革兰氏阳性细菌。对来自ATCC8456基因组DNA的黏粒文库的数个克隆的末端进行测序。基于约4,000bp的DNA序列，G+C含量测定为约36％。针对非冗余蛋白数据库的核苷酸序列检索说明：与数据库信息匹配的所有序列均与来自低G+C革兰氏阳性细菌的蛋白相似，例如与属于葡萄球菌属或芽孢杆菌属的种的蛋白相似，但是与属于微球菌属的种的蛋白不同。

然后，对ATCC8456全基因组进行分析。基于约2.1MB的DNA序列，全基因组的G+C含量测定为约36.7％。相反，已知微球菌属细菌的细菌具有高G+C基因组，例如藤黄微球菌(Micrococcusluteus)NCTC2665基因组的G+C含量为72.9％(GenBank登录号ABLQ01000001-68)。基于G+C含量分析，确定ATCC8456微生物不属于微球菌属。

还检验了其它咸海鲜球菌菌株以确定它们是否产生α-烯烃。检验了下列咸海鲜球菌菌株：耐盐咸海鲜球菌DSMZ17274、嗜冷咸海鲜球菌DSMZ19085和鳍型咸海鲜球菌DSMZ17030。将每种菌株培养于15mLTSBYE培养基(3％胰蛋白酶大豆培养基+0.5％酵母提取物)中，分离烃并按上述通过GC-MS进行分析。所有三种菌株产生的α-烯烃与ATCC8456产生的α-烯烃相似(图34B、34C和34D描述了分别由耐盐咸海鲜球菌DSMZ17274细胞、鳍型咸海鲜球菌DSMZ17030细胞和嗜冷咸海鲜球菌DSMZ19085细胞产生的烃的GC-MS追踪)。这些数据显示咸海鲜球菌属普遍具有产α-烯烃的能力。

实施例22.通过给予脂肪酸使ATCC8456细胞产生增加水平的烯烃和产生ATCC8456细胞通常不产生的α-烯烃

脂肪酸二十烷酸(直链C₂₀脂肪酸)、16-甲基十八烷酸和17-甲基十八烷酸(支链C₁₉脂肪酸)被鉴定为ATCC8456的脂质组分。推断这些脂肪酸作为直接前体，脱羧作用以后，分别用于生物合成1-十九烯、15-甲基-1-十七烯和16-甲基-1-十七烯。为了增加α-烯烃产生以及产生ATCC8456细胞通常不产生的烯烃，按下述进行脂肪酸供给实验。

ATCC8456细胞培养于15mLTSBYE培养基(含3％胰蛋白酶大豆培养基+0.5％酵母提取物)中。以0.5g/L(0.05％)的终浓度向培养基中添加脂肪酸。在30℃培养40-48小时以后，将5mL培养物的细胞沉淀，重悬在1mL甲醇中，超声30分钟并用4mL己烷提取。溶剂蒸发后，将样品重悬于0.1mL己烷中，通过GC-MS进行分析。

当向培养物给予二十烷酸时，观察到1-十九烯产生增加约18倍(参见图38A；黑色表示未给予脂肪酸和灰色表示给予脂肪酸)。当向培养物给予硬脂酸或棕榈酸时，分别观察到α-烯烃1-十五烯和1-十七烯的产生增加(参见图38B)。ATCC8456细胞通常不产生这些烯烃。这表明脂肪酸是α-烯烃的直接前体，咸海鲜球菌可以用来在体内将脂肪酸通过酶学过程转化为α-烯烃。

可选地，可以向静止的咸海鲜球菌细胞提供各种脂肪酸以获得相似的结果。

实施例23.利用细胞提取物和部分纯化的蛋白体外合成α-烯烃

用ATCC8456的无细胞提取物将游离脂肪酸转化为α-烯烃。用下列步骤产生无细胞提取物：将ATCC8456细胞于30℃下在TSBYE培养基(含3％胰蛋白酶大豆培养基+0.5％酵母提取物)中振荡培养24小时。然后通过在3,700rpm离心20分钟从培养物沉淀细胞。然后将细胞沉淀重悬于含0.1MNaCl和2.0mM二硫苏糖醇(浓度为0.1g/mL细胞)的50mMTris缓冲液(pH7.5)中。向置于冰上的细胞浆添加200单位/mL的溶葡萄球菌素(Sigma)。细胞裂解反应持续30分钟。然后以12W对在冰上对细胞进行超声处理，处理3个循环，每个循环为超声1.5秒，随后静止1.5秒。超声共持续9秒。重复该步骤5次，超声循环之间间隔1分钟。然后将裂解的细胞于12,000rpm离心10分钟以沉淀细胞碎片。取出上清液(无细胞提取物)，并用于游离脂肪酸到α-烯烃的转化。

获得无细胞提取物后，按照下文所述，利用无细胞提取物将游离脂肪酸硬脂酸和二十烷酸转化为α-烯烃。首先，在1％Tergitol溶液(Sigma,St.Louis,MO)中制备5％的硬脂酸钠或硬脂酸钾储备液。然后，于室温下将6μl储备液添加至1mL无细胞提取物中来获得1mM终浓度的游离脂肪酸盐。室温下反应3小时。通过向混合物添加200μl乙酸乙酯来回收α-烯烃，简单涡旋，简单离心，然后取出有机相。通过GC/MS鉴定和/或检测α-烯烃。

图39显示了获得的产物的GC/MS追踪。在样品1中，没有向无细胞提取物添加硬脂酸。在样品2中，用含有0.1M氯化钠的50mMTris缓冲液(pH7.5)替代无细胞提取物，并向其中添加硬脂酸。在样品中，将硬脂酸添加到无细胞提取物中。7.62分钟时的峰与1-十七烯(Sigma)具有相同的保留时间和相同的质谱。当在相似条件下加入二十烷酸时，形成了1-十九烯。

将无细胞提取物煮沸消除添加游离脂肪酸时的α-烯烃产生。该数据强有力地表明ATCC8456催化剂是基于蛋白质。

ATCC8456无细胞提取物产生α-烯烃不需要其它辅助因子。当向无细胞提取物添加1mM浓度的数种辅助因子时，没有观察到α-烯烃的合成增加。测试的辅助因子是NAD+、NADP+、NADH、NADPH、FADH₂、SAM、ATP和辅酶A。此外，测试了Mg²⁺，但是以10mM的浓度。还通过用10kDa截留膜透析无细胞提取物1.5小时来检测辅助因子需求，透析体积大于细胞提取物体积的200倍，所用的透析缓冲液为含有0.1M氯化钠的50mMTris(pH7.5)。透析后没有观察到α-烯烃的合成减少。此外，当向反应混合物中加入10mMEDTA(pH7.5)时，没有观察到α-烯烃的合成减少。

通过进行硫酸铵沉淀来进一步富集ATCC8456无细胞提取物。首先，向无细胞提取物加入足量的硫酸铵，使硫酸铵浓度达到50％(wt/vol)饱和。在冰上轻轻搅拌混合物60分钟，然后于13,000rpm离心30分钟。回收上清液，并再次加入硫酸铵，使硫酸铵浓度达到65％(wt/vol)。将混合物在冰上混合60分钟，并再次离心30分钟。弃掉上清液。将沉淀重悬于含有0.1M氯化钠的50mMTris缓冲液(pH7.5)中。然后用上面提到的缓冲液透析该混合物，以去除硫酸铵。用硫酸铵处理的无细胞提取物具有与无细胞提取物相同的α-烯烃合成活性。

实施例24.对将脂肪酸转化为α-烯烃的蛋白进行纯化和鉴定

为了分离ATCC8456细胞产生α-烯烃所必需的蛋白，进行下述蛋白纯化步骤。首先，将6LATCC8456细胞于30℃下在TSBYE培养基中振荡培养24小时。通过3,700rpm离心20分钟来沉淀细胞，并弃掉上清液。将细胞沉淀重悬于含有50mMTris(pH8.0)、0.lMNaCl、2.0mMDTT和细菌蛋白酶抑制剂的100mL溶液中。然后以30,000psi的压力使细胞浆通过弗氏压碎器一次。然后，如实施例3所描述对细胞浆进行超声处理以破碎DNA。将无细胞提取物在4℃下以10,000rpm离心60分钟。然后取出上清液并添加硫酸铵至50％(wt/vol)的终浓度。在4℃下轻轻搅拌混合物60分钟，并以10,000rpm离心30分钟。取出上清液并再加入硫酸铵至65％(wt/vol)饱和。再次在4℃下搅拌混合物60分钟，并以10,000rpm离心30分钟。弃掉上清液。将余下的沉淀重悬于50mL的50mMTris(pH8.0)和2.0mMDTT中。

使混合物在4℃下以3mL/分钟通过5mL的HiTrapSP柱(GEHealthcare)。以下缓冲液被用作洗脱梯度：含有50mMTris(pH8.0)和2.0mMDTT的缓冲液A；含有50mMTris(pH8.0)、1.0MNaCl和2.0mMDTT的缓冲液B。将混合物上样到柱以后，用40％的缓冲液B洗涤柱。接下来以3.0mL/分钟进行20分钟的40％的缓冲液B至100％的缓冲液B的梯度。梯度洗脱期间收集5mL流分。如实施例3所述检测每个流分的活性。含有α-烯烃产生活性的流分通常在600-750mMNaCl浓度间洗脱。然后将含有活性的流分合并，并透析到缓冲液A中。

然后将透析的蛋白流分于4℃下以4mL/分钟上样到1mLResourceQ(GEHealthcare)柱上。HiTrapSP柱所用的缓冲液B也用于ResourceQ柱。以4mL/分钟进行7分钟的0％的缓冲液B至25％的缓冲液B的梯度洗脱。收集1.5mL流分，并测定活性。活性流分在150至200mMNaCl浓度间洗脱。然后将含有活性的流分合并，并用MilliporeAmicon蛋白浓缩器(4mL和10kDa的排阻尺寸)浓缩至约50μL。用Bradford检测(Bio-Rad)测定大约的蛋白浓度。最终的蛋白浓度为约5mg/mL-约10mg/mL。然后将30μL蛋白和合适的蛋白分子量标记上样到SDSPAGE凝胶(Invitrogen)。用SimpleSafe考马斯亮蓝染色(Invitrogen)对凝胶进行染色。图40显示了代表性的凝胶。在50kDa和20kDa处观察到两个强的蛋白条带。

为了确定蛋白条带中实际的蛋白，从凝胶切下条带，用胰酶消化并用LC/MS/MS进行分析。使用Mascot程序(Mannetal.,Anal.Chem.66:4390-4399,1994)分析LC/MS/MS数据。对ATCC8456基因组进行测序。将基因组数据用来说明LC/MS/MS数据，并用来确定蛋白条带中实际的蛋白。50kDa条带与ORF880匹配度很高。该匹配所得的Mascot评分是919的高分。此外，ORF880的预测分子量为48,367Da。orf880的核苷酸和氨基酸序列分别展示在图41A和41B中。

实施例25.咸海鲜球菌ATCC8456_ORF880在大肠杆菌中的异源表达

咸海鲜球菌ATCC8456Orf880被鉴定为催化游离脂肪酸到α-烯烃转化的高度纯化的酶流分中两种主要蛋白中的一种。将编码ATCC8456_orf880的基因组DNA克隆入受T7启动子控制的pCDF-Duet1，并按照下文所述，用各种载体转化大肠杆菌。培养大肠杆菌细胞，并如实施例23所述，分析细胞产生的烃。当向用含8456_orf880的载体转化的大肠杆菌培养物提供0.05％硬脂酸时，8456_orf880的表达导致在大肠杆菌中形成1-十七烯(参见图42，其描述了不表达8456_orf880(黑色)或表达8456_orf880(灰色)的大肠杆菌的α-烯烃的GC/MS追踪)。相反，向用载体对照(不含ATCC_orf880)转化的大肠杆菌培养物添加0.05％硬脂酸时，没有引起1-十七烯的产生。这表明8456_orf880在大肠杆菌异源宿主中从游离脂肪酸合成α-烯烃。该结果表明可以在异源生物中进行α-烯烃的生物合成。此外，当向表达8456_orf880蛋白的大肠杆菌细胞提供0.05％的棕榈酸或0.05％的二十烷酸时，分别观察到产生1-十五烯或1-十九烯。

实施例26.利用在大肠杆菌中异源表达并纯化的ORF880在体外合成α-烯烃

将编码ATCC8456_orf880的基因组DNA克隆入受T7启动子控制的载体pET15b(Novagen)的NdeI和XhoI位点，以用于在大肠杆菌中表达并进行纯化。该质粒表达N-末端带His标记形式的8456_orf880。

利用常规化学转化技术，用pET15b-ORF880转化大肠杆菌BL21菌株(DE3)(Invitrogen)。通过以下进行蛋白表达：首先将大肠杆菌菌株的菌落接种至5mL补充了100mg/L羧苄青霉素的LB培养基中，并于37℃过夜振荡来产生起始培养物。该起始培养物用来接种1L补充了100mg/L羧苄青霉素的LB培养基。将培养物于37℃下振荡，直到OD₆₀₀值达到0.6。将培养物置于冰上10分钟，然后添加IPTG至250μM的终浓度。然后将培养物于18℃下振荡约18小时。将培养物在4℃下以3,700rpm离心20分钟。将沉淀重悬于含有100mM磷酸钠缓冲液(pH7.2)并补充了细菌蛋白酶抑制剂(GBiosciences)的30mL缓冲液中。将细胞在冰上以12W超声9秒：超声1.5秒，随后停止1.5秒。重复该步骤5次，每次超声循环之间间隔1分钟。将无细胞提取物在4℃下以10,000rpm离心30分钟。将5mLNi-NTA(Qiagen)加至上清液中，并于4℃下轻轻搅拌混合物。使浆液通过柱，从而从裂解液取出树脂。然后用含有100mM磷酸钠缓冲液(pH7.2)和30mM咪唑的30mL缓冲液洗涤树脂。最后，用100mM磷酸钠缓冲液(pH7.2)和250mM咪唑的15ml溶液洗脱蛋白。用200倍体积的100mM磷酸钠缓冲液(pH7.2)透析蛋白溶液。用Bradford检测(Bio-Rad)测定蛋白浓度。获得了125μg/mL的蛋白。

为了测定ORF880体外的脂肪酸底物特异性，制备下列脂肪酸的钾盐：十四烷酸、十六烷酸、十八烷酸、二十烷酸和二十二烷酸(Sigma)。用2％乙醇和2％Tergitol溶液(Sigma,St.Louis,MO)将脂肪酸溶液制备为20mM的终浓度。

测定脱羧反应和生产的动力学。制备含有以下反应物的200μl反应混合物：1.25μM的ORF880、200μM的十八烷酸钾、200μl二硫苏糖醇和100mM磷酸钠缓冲液(pH7.2)。反应混合物于室温下孵育，一式二份地采集5分钟至120分钟之间的时间点的样品。通过添加100μl乙酸乙酯来终止反应并进行提取，所述乙酸乙酯含有5mg/L的作为内参的1-十八烯。利用GC/MSalkane1splitless方法，利用以下参数对样品进行分析：运行时间：20分钟；柱：HP-5-MS货号19091S-433E(30米长；I.D.:0.25mm窄径柱；膜：0.25μM)；样品：标准乙酸乙酯提取物；进样：1μlAgilent6850入口；入口：300℃不分流；载气：氦；流速：1.3mL/分钟；柱温：100℃保持5分钟，20℃/分钟升至320℃，320℃保持5分钟；接口：Agilent5975BVLMSD；接口温度：300℃；扫描：50-500M/Z。利用溶解于乙酸乙酯中的1-十七烯产生校准曲线。基于本分析，测定出从5分钟至60分钟产物的产生是线性的。

为了测定不同脂肪酸底物的反应速率，制备下述200μl反应混合物：1.0μMORF880酶、200μM的测试脂肪酸盐、200μL二硫苏糖醇和100mM磷酸钠缓冲液(pH7.2)。反应于室温下进行，一式三份地采集20分钟和47分钟的时间点的样品，使用上文所述的提取和分析步骤。利用可获得的化学标准品产生参照曲线。在某些情况下，无法获得化学标准品。在该情况下，例如，将顺式-9-二十一烯作为1-二十一烯的参照、9-二十三烯用作1-二十三烯的参照。测定每种底物在47分钟和20分钟时的平均α-烯烃浓度的差值，然后用该差值除以27分钟来计算活性。结果总结在表20中。

表20：ORF880对不同脂肪酸底物的活性

底物	活性(产生的烯烃nM/分钟)
		十四烷酸	22.9
十六烷酸	181.9
		十八烷酸	77.2
二十烷酸	19.7
		二十二烷酸	30.6

这些结果表明：异源表达的ORF880能在体外将脂肪酸底物转化为烯烃。这些数据还显示：当酸脂肪酸底物是十六烷时，ORF880的活性更高。

实施例27.大肠杆菌MG1655ΔFadD中异源表达咸海鲜球菌ATCC8456_ORF880实现从葡萄糖产生α-烯烃

1.fadD缺失菌株的构建

利用λ红系统(Datsenkoetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.97:6640-6645,2000)按下述缺失大肠杆菌MG1655的fadD基因：

用以下引物从pKD3扩增氯霉素乙酰基转移酶基因：

fad1:5’-TAACCGGCGTCTGACGACTGACTTAACGCTCAGGCTTTATTGTCCACTTTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG-3’(SEQIDNO:43)；和

fad2:5’-CATTTGGGGTTGCGATGACGACGAACACGCATTTTAGAGGTGAAGAATTGCATATGAATATCCTCCTTTAGTTCC-3’(SEQIDNO:44)。

使该PCR产物电穿孔进入大肠杆菌MG1655(pKD46)。将细胞接种于L-氯霉素(30μg/mL)(L-Cm)板上，于37℃下过夜培养。选择单菌落，将其接种于另一个L-Cm板上，并于42℃下培养。然后将这些菌落贴到L-Cm和L-羧苄青霉素(100μg/mL)(L-Cb)板上，并且在37℃下过夜培养。通过PCR评价Cm^R和Cb^S的菌落，从而确保PCR产物插入正确的位点。利用以下引物对这些细菌的菌落裂解物进行PCR验证：

fadF:5’-CGTCCGTGGTAATCATTTGG-3’(SEQIDNO:45)；和

fadR:5’-TCGCAACCTTTTCGTTGG-3’(SEQIDNO:46)。

ΔfadD::Cm缺失体的预期大小为约1200bp(图10)。利用Datsenkoetal.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.97:6640-6645,2000中所描述的FLP辅助质粒去除氯霉素抗性基因。用引物fadF和fadR进行缺失的PCR验证。MG1655fadD菌株不能在M9+油酸盐琼脂板(油酸盐作为碳源)上生长，也不能在M9+油酸盐液体培养基中生长。

2.咸海鲜球菌ATCC8456_orf880在大肠杆菌MG1655ΔfadD中的表达

将为大肠杆菌中的表达进行了密码子优化的、编码ATCC8456_orf880的基因组DNA克隆入受P_trc启动子控制的载体OP80(pCL1920衍生载体)，并用获得的载体转化大肠杆菌MG1655ΔfadD。在37℃下、在补充了20μg/mL尿嘧啶和100μg/mL壮观霉素的M9矿质培养基中培养该大肠杆菌细胞。葡萄糖(1％,w/v)是唯一的碳源和能量来源。当培养物的OD₆₀₀达到0.8-1.0时，加入IPTG(1mM)，并将温度换成25℃。于25℃下再生长18-24小时以后，将10mL培养物的细胞沉淀，重悬于1mL甲醇中，超声30分钟，并用4mL己烷提取。溶剂蒸发后，将样品重悬于0.1mL己烷中并通过GC-MS进行分析。与仅有载体的对照相反，用携带orf880的载体转化的大肠杆菌细胞产生α-烯烃：1-十五烯和十七碳二烯。该结果表明：当在葡萄糖上培养时，ORF880的表达赋予大肠杆菌生物合成α-烯烃的能力，并且直接前体是大肠杆菌中最丰富的脂肪酸，即十六烷酸和异油酸(11-顺式-十八烯酸)。

实施例28.羧酸还原酶(CAR)同源物的鉴定

来自诺卡氏菌(Nocardiasp.)菌株NRRL5646的羧酸还原酶(CAR)可以将羧酸还原成对应的醛，而不需要单独的活化酶，例如酰基辅酶A合酶(Lietal.,J.Bacteriol.179:3482-3487,1997；Heetal.,Appl.Environ.Microbiol.70:1874-1881,2004)。利用NRRL5646CAR氨基酸序列(Genpept登录号AAR91681)作为查询序列的BLAST搜索鉴定了约20个同源序列。评价了表21中列出的3个同源物在大肠杆菌中表达时在体内将脂肪酸转化成脂肪醛的能力。在核苷酸序列水平，carA、carB和fadD9分别表现出与诺卡氏菌NRRL5646的car基因(AY495697)的62.6％、49.4％和60.5％的同源性。在氨基酸水平，CARA、CARB和FadD9分别表现出与诺卡氏菌NRRL5646的CAR的62.4％、59.1％和60.7％的同一性。

表21：CAR样蛋白和对应的编码序列。

实施例29.CAR同源物在大肠杆菌中的表达

1.质粒构建

构建三种大肠杆菌表达质粒，用于表达编码表22列出的CAR同源物的基因。首先，利用引物fadD9F和FadDR(参见表22)从结核分枝杆菌H37Rv(获自TheUniversityofBritishColumbia,andVancouver,BCCanada)的基因组DNA扩增fadD9。首先将PCR产物克隆入PCR-blunt(Invitrogen)，然后以NdeI-AvrII片段释放。然后将所述NdeI-AvrII片段克隆入pACYCDuet-1(Novogen)的NdeI和AvrII位点之间，产生pACYCDuet-1-fadD9。

分别利用引物CARMCaF和CARMCaR或者CARMCbF和CARMCbR(参见表22)从耻垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmatis)MC2155(获自ATCC(ATCC23037D-5))的基因组DNA扩增carA和carB基因。首先将每种PCR产物克隆入PCR-blunt，然后以NdeI-AvrII片段释放。然后将这两个片段中的每一个亚克隆入pACYCDuet-1(Novogen)的NdeI和AvrII位点之间，产生pACYCDUET-carA和pACYCDUET-carB。

表22.用于扩增编码CAR同源物的基因的引物

fadD9F	CAT ATGTCGATCAACGATCAGCGACTGAC(SEQ ID NO:47)
		fadD9R	CCTAGG TCACAGCAGCCCGAGCAGTC(SEQ ID NO:48)
CARMCaF	CAT ATGACGATCGAAACGCG(SEQ ID NO:49)117 -->
		CARMCaR	CCTAGG TTACAGCAATCCGAGCATCT(SEQ ID NO:50)
CARMCbF	CAT ATGACCAGCGATGTTCAC(SEQ ID NO:51)
		CARMCbR	CCTAGG TCAGATCAGACCGAACTCACG(SEQ ID NO:52)

2.脂肪醛产生的评价

将分别的编码CAR同源物的质粒(pACYCDUET-fadD9、pACYCDUET-carA和pACYCDUET-carB)与pETDuet-1-’TesA(在PCT/US08/058788中描述，通过引用将本专利的公开并入本文)共转化进大肠杆菌菌株C41(DE3,ΔfadE)(在PCT/US08/058788中描述)。

在37℃下、在3mL补充了羧苄青霉素(100mg/L)和氯霉素(34mg/L)的LB培养基中培养该大肠杆菌转化体。过夜培养后，将15μl培养物转移至2mL补充了羧苄青霉素和氯霉素的新鲜LB培养基。培养3.5小时后，将2mL培养物转移进含有20mL具有2％葡萄糖和羧苄青霉素与氯霉素的M9培养基的125mL烧瓶中。当培养物的OD₆₀₀达到0.9时，向每个烧瓶加入1mMIPTG。于37℃培养20小时后，向每个烧瓶加入20mL乙酸乙酯(含1％乙酸，v/v)，用于提取发酵期间产生的有机化合物。按下述用GC/MS直接分析该乙酸乙酯粗提物。无前导序列的‘TesA和三种car基因中的任何一种在大肠杆菌中的共表达导致产生可检测到的脂肪醛。在一个发酵中，LS9001/pACYCDUETcarB+pETDuet-1-’TesA产生平均120mg/L的脂肪醛。十二烷醛的保留时间为6.959分钟、7-十四烯醛为8.247分钟、十四烷醛为8.37分钟、9-十六烯醛为9.433分钟、十六烷醛为9.545分钟、11-十八烯醛为10.945分钟。大量脂肪醛的存在与CAR作为生成醛的脂肪酸还原酶(AFAR)是一致的。该机制与生成醇的脂酰辅酶A还原酶(FAR)(例如JjFAR)和脂酰辅酶A还原酶(例如Acr1)不同。

3.CAR同源物的底物偏好性

在所评价的三种CAR同源物中观察不同的底物偏好性。与碳链长度大于12的其它脂肪酸相比，FadD9表现出对C₁₂脂肪酸的强的偏好性。CarA和CarB表现出比FadD9更宽的底物范围

4.脂肪醛的定量和鉴定

使用配备有30m×0.25mm(0.10μm膜)DB-5柱的Agilent5975BMSD系统进行GC-MS。柱温度为在100℃下等温3分钟。将柱的程序设计为以20℃/分钟的速率从100℃升高到320℃。在达到最终温度时，将柱在320℃下保持等温5分钟。上样体积为1μL。以1.3mL/分钟释放载气氦。质谱仪装备有电子轰击电离源。将电离源温度设为300℃。

定量前，用两种方法鉴定各种醛。第一，将每种化合物的GC保留时间与已知标准物(例如月桂醛(十二烷醛))的保留时间进行比较。第二，通过将化合物的质谱与质谱库中的标准物的质谱匹配来证实每种化合物的鉴定。

实施例30.通过大肠杆菌MG1655(DE3,ΔFAD)中CAR同源物的异源表达来产生脂肪醇

1.fadD缺失菌株的构建

利用λ红系统(Datsenkoetal.,PNAS(USA).97:6640-6645,2000)按下述缺失大肠杆菌MG1655的fadD基因：

用以下引物从pKD3扩增氯霉素乙酰基转移酶基因：

使该PCR产物电穿孔进入大肠杆菌MG1655(pKD46)。将细胞接种在L-氯霉素(30μg/mL)(L-Cm)板上，并且在37℃下过夜培养。选择单菌落，接种于另一个L-Cm板上，并于42℃培养。然后将这些菌落贴到L-Cm和L-羧苄青霉素(100μg/mL)(L-Cb)板上，并且在37℃下过夜培养。通过PCR评价Cm^R和Cb^S的菌落，从而确保PCR产物插入正确位点。利用以下引物对这些细菌的菌落裂解物进行PCR验证：

fadF:5’-CGTCCGTGGTAATCATTTGG-3’(SEQIDNO:45)；和

fadR:5’-TCGCAACCTTTTCGTTGG-3’(SEQIDNO:46)。

ΔfadD::Cm缺失体的预期大小为约1200bp。利用Datsenkoetal.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.97:6640-6645,2000中所述的FLP辅助质粒去除氯霉素抗性基因。用引物fadF和fadR进行缺失的PCR验证。MG1655ΔfadD菌株不能在M9+油酸盐琼脂板(油酸盐作为碳源)上生长，也不能在M9+油酸盐液体培养基中生长。通过反式提供的大肠杆菌fadD基因(在pCL1920-Ptrc中)来弥补生长缺陷。

2.MG1655(DE3,ΔfadD)菌株的构建

为了产生T7反应性菌株，利用λDE3溶原化试剂盒(Novagen)，该试剂盒是设计用于使λDE3前噬菌体位点特异性地整合进大肠杆菌宿主染色体中，使得溶原化的宿主可用于表达克隆进T7表达载体中的靶基因。λDE3是重组噬菌体，其携带受lacUV5控制的T7RNA聚合酶的克隆基因。简言之，将宿主菌株在37℃下、在补充有0.2％麦芽糖、10mMMgSO₄和抗生素的LB培养基中培养，直至OD₆₀₀为0.5。接下来，使10⁸pfuλDE3、10⁸pfu辅助噬菌体和10⁸pfu选择噬菌体与10μl宿主细胞一起孵育。宿主/噬菌体混合物于37℃下孵育20分钟，从而允许噬菌体吸附到宿主上。最后，将混合物用移液管吸到补充有抗生素的LB板上。使用铺板珠将混合物均匀铺开，并且将板倒转、在37℃下孵育过夜。

评价λDE3溶原候选者的支持T7测试噬菌体生长的能力。T7测试噬菌体是T7噬菌体缺失突变体，它是完全缺陷型的，除非宿主细胞能提供活性T7RNA聚合酶。在IPTG的存在下，T7测试噬菌体在真正的λDE3溶原上产生非常大的斑块，而在没有诱导剂的情况下观察到非常小的斑块。在缺少IPTG的情况下，斑块的相对大小能指示溶原中T7RNA聚合酶的基础水平表达，并且在不同宿主细胞背景之间可以明显变化。

以下步骤用于确定DE3溶原现象的存在。首先，在37℃下、在补充有0.2％麦芽糖、10mMMgSO₄以及抗生素的LB中培养候选菌落，直到OD₆₀₀达到0.5。然后将T7测试噬菌体的小份在1×噬菌体稀释缓冲液中稀释到2×10³pfu/mL的滴度。在两个平行管中，将100μL宿主细胞与100μL稀释的噬菌体混合。将宿主/噬菌体混合物在室温下孵育10分钟，从而允许噬菌体吸附到宿主上。然后，将3mL熔化的顶层琼脂糖加入包含宿主和噬菌体的各管中。将一个平行管的内容物接种在LB板上并且将另一个平行管的内容物接种在补充有0.4mMIPTG(异丙基-b-硫代半乳吡喃糖苷)的LB板上来评价T7RNA聚合酶的诱导。允许平板静置5分钟，直到顶层琼脂糖固化。然后将平板在30℃下倒置过夜。

3.MG1655(DE3,ΔfadD,yjgB::kan)菌株的构建

利用以下λ红系统(Datsenkoetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:6640-6645,2000)的方案构建yjgB敲除菌株MG1655(DE3,ΔfadD,yjgB::kan)：

用以下引物从pKD13扩增卡那霉素抗性基因：

yjgBRn:5’-GCGCCTCAGATCAGCGCTGCGAATGATTTTCAAAAATCGGCTTTCAACACTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG-3’(SEQIDNO:53)；和

yjgBFn:5’-CTGCCATGCTCTACACTTCCCAAACAACACCAGAGAAGGACCAAAAAATGATTCCGGGGATCCGTCGACC-3’(SEQIDNO:54)。

然后，使PCR产物电穿孔进入大肠杆菌MG1655(DE3，ΔfadD)/pKD46。将细胞接种在卡那霉素(50μg/mL)(L-Kan)板上，并且在37℃下过夜培养。选择单菌落，将其接种于另一L-Kan板上，并于42℃下培养。然后将这些菌落贴到L-Kan和羧苄青霉素(100mg/mL)(L-Cb)板上，于37℃过夜培养。通过PCR评价kan^R和Cb^S的菌落，从而确保PCR产物插入正确位点。利用以下引物对这些细菌的菌落裂解物进行PCR验证：

BF:5’-GTGCTGGCGATACGACAAAACA-3’(SEQIDNO:55)；和

BR:5’-CCCCGCCCTGCCATGCTCTACAC-3’(SEQIDNO:56)。

yjgB::kan敲除体的预期大小是约1450bp。

4.使用MG1655(DE3，ΔfadD)菌株在脂肪醇产生的方面评价FadD

在实施例2中，fadE缺失菌株用于在大肠杆菌中从‘TesA、CAR同源物和内源醇脱氢酶产生脂肪醛和脂肪醇。为了证明CAR同源物利用脂肪酸作为底物而不是用酰基辅酶A，使大肠杆菌(fadD)中编码酰基辅酶A合酶的基因缺失，使得产生的脂肪酸不能被辅酶A活化。用pETDuet-1-’TesA和pACYCDuet-1-carB转化大肠杆菌菌株MG1655(DE3,ΔfadD)。利用本文所述的方法评价转化体中脂肪醇的产生。这些转化体产生约360mg/L的脂肪醇(十二烷醇、十二烯醇、十四烷醇、十四烯醇、十六烷醇、十六烯醇和十八烯醇)。

YjgB是醇脱氢酶。为了确认YjgB是负责将脂肪醛转化为其对应脂肪醇的醇脱氢酶，将pETDuet-1-’TesA和pACYCDuet-1-fadD9共转化进MG1655(DE3,ΔfadD)或MG1655(DE3,ΔfadD,yjgB::kan)中。同时，用pETDuet-1-’tesA-yjgB和pACYCDuet-1-fadD9转化MG1655(DE3,ΔfadD,yjgB::kan)。

在37℃下、在3mL补充了羧苄青霉素(100mg/L)和氯霉素(34mg/L)的LB培养基中培养该大肠杆菌转化体。过夜培养后，将15μl培养物转移至2mL补充了羧苄青霉素和氯霉素的新鲜LB培养基。在生长3.5小时之后，将2mL培养物转移进包含20mL具有2％葡萄糖、羧苄青霉素以及氯霉素的M9培养基的125mL的烧瓶中。当培养物的OD₆₀₀达到0.9时，向每个烧瓶加入1mMIPTG。于37℃培养20小时后，向每个烧瓶加入20mL乙酸乙酯(含1％乙酸，v/v)，用于提取发酵期间产生的脂肪醇。按下述用GC/MS直接分析乙酸乙酯粗提物。

yjgB敲除菌株导致十二烷醛的大量积累和较低的脂肪醇滴度。yjgB敲除菌株中质粒pETDuet-1-’tesA-yjgB的yjgB表达有效地消除了十二烷醛的积累。该数据表明YjgB参与将十二烷醛转化为十二烷醇，并且表明大肠杆菌中可能存在用于将其它醛转化为醇的其它醇脱氢酶。十二烷醛在yjgB敲除菌株中积累，但是在野生型菌株(MG1655(DE3,ΔfadD))或具有yjgB表达质粒的yjgB敲除菌株中没有观察到十二烷醛积累。

实施例31.‘TesA库的建立

在本实施例中，描述制备‘TesA突变体库的方法。合适的表达载体能在宿主菌株中产生‘TesA蛋白，所述合适的表达载体例如编码‘TesA的pACYC-‘TesA，所述‘TesA是缺少信号肽的截短的TesA。质粒pACYC-‘TesA包含在trc启动子调控下的‘tesA序列、转录终止子、p15a复制起点、编码lacIq的开放读码框和β-内酰胺酶抗生素抗性基因。

图58提供了‘TesA蛋白的氨基酸序列(SEQIDNO:31)。

QuikChange诱变试剂盒(Stratagene)允许容易地构建大量的突变体。用该试剂盒来构建每个‘TesA突变体的起始是使用含有一个或多个错配碱基的两个互补引物，所述一个或多个错配碱基是为了在所需位置改变编码的氨基酸。引物长度为25-45个核苷酸，熔解温度>78℃，用下列公式计算熔解温度：

T_m＝81.5+0.41(％GC)675/N

其中T_m是熔解温度，％GC是引物中鸟嘌呤核苷或胞苷残基的百分比，N是引物中核苷酸的数量，

例如，引物：

CACGTTATTGATTCTGGGTAATAGCCTGAGCGCCGGGTATCG(SEQIDNO:57)和

CGATACCCGGCGCTCAGGCTATTACCCAGAATCAATAACGTG(SEQIDNO:58)

是用于使残基9处的天冬氨酸突变为天冬酰胺，其中划线的碱基指示改变的密码子。

所述引物用于聚合酶链式反应中，其中以pACYC-‘TesA作为模板，利用以下温度循环程序：95℃持续1分钟；随后是18个循环，每个循环为95℃持续50秒，60℃持续50秒和68℃持续5分钟；和68℃持续7分钟。然后用限制性酶DpnI消化反应产物，用于选择性降解甲基化的模板DNA。然后将余下的DNA转化入大肠杆菌，用于分离质粒克隆，随后对该质粒克隆进行测序以确保获得了所需的取代。

实施例32.测定

在以下实施例中，描述了测定蛋白含量、游离脂肪酸水平以及酰基PNP和酰基辅酶A底物的水解的测定。下文还列出了本文所用的具体测定。

1.测定细胞裂解物中蛋白含量的检测

制备产生‘TesA变体的大肠杆菌表达培养物的细胞裂解物用于表征。为了产生表达培养物，在37℃下、在含1％(w/v)葡萄糖和100μg/mL羧苄青霉素的LB培养基中将种子培养物过夜培养。然后将种子培养物以1:100稀释于相同的培养基中，并于37℃下振荡(200rpm)培养3小时。然后向每种培养物的40μL小份中添加360μL补充了100μg/mL羧苄青霉素的LS9-1培养基(如下述)，并于96孔培养板中培养。再培养3小时后，加入异丙基-β-D-1-硫代半乳吡喃糖苷(IPTG，1mM终浓度)和Bis-Tris丙烷(pH7.0，0.1M终浓度)，并允许培养物过夜生长。

通过将表达培养物离心(3,500rpm，10分钟)来收获细胞沉淀。弃去生长培养基，将细胞沉淀保存于-80℃。为了制备可溶提取物，使冷冻的细胞沉淀在配制于25mM磷酸钠(pH7.0)中的50％BugBuster(EMDBiosciences,产品分类号70584-4)中裂解。搅动40分钟后，通过离心使细胞裂解物澄清(3,500rpm，10分钟)。然后利用二喹啉甲酸(BCA)测定，按照生产商提供的方案(ThermoScientific,产品分类号23225)测定细胞裂解物上清液中的蛋白浓度。然后将上清液用在下述测定中。

培养基：

1L含1.0％葡萄糖的LS9-1培养基：

200mL5×盐溶液

100μL硫胺(B1)

1mlMgSO₄

100μLCaCl₂

50mL20％葡萄糖

1mL微量无机物

1mL尿嘧啶

加水至1L(先制备为750mL)

TM溶液(过滤除菌的)：

27g/LFeCl₃-6H₂O

2g/LZnCl₂-4H₂O

2g/LCaCl₂-6H₂O

2g/LNa₂MoO₄-2H₂O

1.9g/LCuSO₄-5H₂O

0.5g/LH₃BO₃

100mL/L浓HCl

q.s.w/Milli-Q水

2.游离脂肪酸分析

‘TesA变体在大肠杆菌表达培养物中产生，对该培养物产生的游离脂肪酸进行分析。为了产生表达培养物，首先在37℃下、在含1％(w/v)葡萄糖和100μg/mL羧苄青霉素的LB培养基中将种子培养物过夜培养，然后将该种子培养物以1:100稀释于相同培养基中，并于37℃振荡(200rpm)培养3小时。然后向40μL的每种培养物中添加360μL补充了100μg/mL羧苄青霉素的LS9-1培养基，并于96孔培养板中培养。再培养3小时后，加入异丙基-β-D-1-硫代半乳吡喃糖苷(IPTG，1mM终浓度)和Bis-Tris丙烷(pH7.0，0.1M终浓度)，并允许该培养物过夜生长。

然后用1NHCl将该培养物酸化至约2.5的终pH，并用600μL乙酸乙酯提取。用羟化四甲铵(TMAH)将有机相中的游离脂肪酸衍生为各自的甲酯，然后在配备火焰电离检测器的气相色谱仪上分析产生的甲酯。

3.脂酰PNP水解测定

在本测定系统中，所用的试剂是：

1.配制在50mM磷酸钠(pH7.0)中的2％TritonX-100

2.配制在丙酮中的10mM酰基对硝基酚(酰基PNP)

为了配制酰基PNP工作液，将600μL酰基PNP储备液添加至9.4mL磷酸缓冲液中并充分混合。

通过将40μL酰基PNP工作液加至96孔板的每孔中，随后快速添加40μL澄清的细胞裂解物来进行测定。将溶液混合15秒，利用酶标仪在25℃下读取405nm处的吸光值变化。将酯酶活性表示为(ΔA405/秒)_突变体/(ΔA405/秒)_野生型的比，其中(ΔA405/秒)_突变体是含突变‘TesA的样品在405nm下每秒的吸光值变化，(ΔA405/秒)_野生型是含野生型‘TesA的样品在405nm下每秒的吸光值变化。

4.酰基辅酶A水解测定

在本测定系统中，所用的试剂溶液是：

配制在50mM磷酸钠(pH7.0)中的10mM酰基辅酶A

配制在乙腈中的50mM磷酸钠(pH8.0)、50mM单溴二胺(MBB)(Novagen,产品分类号596105)。

为了配制酰基辅酶A工作液，将0.5mL酰基辅酶A储备液和0.5mLMBB储备液添加至29mL磷酸盐缓冲液中，然后混合。

通过将60μL酰基辅酶A工作液加至黑色96孔板的每孔中，随后快速添加40μL澄清的细胞裂解物来进行测定。混合15秒后，利用25℃下酶标仪的荧光(λ_ex＝380nm,λ_em＝480nm)来监测反应进程。将酰基辅酶A硫酯酶活性表示为(ΔRFU/秒)_突变体/(ΔRFU/秒)_野生型的比值，其中(ΔRFU/秒)_突变体是含突变‘TesA的样品中每秒的相对荧光单位的变化，(ΔRFU/秒)_野生型是含野生型‘TesA的样品中每秒的相对荧光单位的变化。

5.应用Z评分法

按以下的Z评分法确定Z评分。

将样品的Z评分定义为样品信号偏离于对照群体信号平均值的标准差数。Z评分用来将突变体按照感兴趣的性质进行分类，所述感兴趣的性质例如底物链长特异性、对酯键的偏好性相对超过对硫酯键、对硫酯键的偏好性相对超过对酯键和产生的酯的比例或百分比。用下列计算来确定Z评分：

Z＝(样品值–对照平均值)/对照的标准差

用来产生本文的突变‘TseA库的阳性对照是野生型‘TesA。

在正态分布中，约2.1％的数据高于平均值2倍或更多倍的标准差，约0.1％的数据高于平均值3倍或更多倍的标准差。因此，2或大于2、3或大于3、-2或小于-2、-3或小于-3以及以此类推的Z评分用来定义不太可能随机发生的更加严格的数据类别。

将Z评分大于3的那些变体标记为对某些链长底物的偏好性和/或催化速率具有改进的性质。同样，在其它情况下，将Z评分大于3的那些变体标记为提供的脂肪酯的收率比例或收率百分比高于或强于游离脂肪酸。此外，在其它情况下，将Z评分为-3或小于-3的那些变体标记为提供的脂肪酯的收率比例或收率百分比低于游离脂肪酸。

将底物特异性值定义为给定突变体对一种底物的动力学斜率除以对PNP测定中的三种底物(C₁₀、C₁₂、C₁₄)的动力学斜率的总和，其中所述动力学斜率是观察到的给定酯底物水解的初始速率。

例如，为了计算出对C₁₀的底物特异性值：

C₁₀底物特异性值＝突变体斜率C₁₀/(突变体斜率C₁₀+C₁₂+C₁₄)

接下来计算底物特异性Z评分。首先计算出阳性对照的底物特异性值的平均值和标准差(对于每个平板)，并应用下列公式：

突变体C₁₀底物特异性Z评分＝(突变体底物特异性值C₁₀–平均底物特异性值)/底物特异性值标准差

另一个实例，为了计算出酯特异性值：

酯特异性值＝突变体斜率C₁₄-PNP/突变体斜率C₁₄-辅酶A

接下来计算酯特异性Z评分。首先计算阳性对照的酯特异性值的平均值和标准差(对于每个平板)，并应用下列公式：

突变体酯特异性Z评分＝(突变体酯特异性值–平均酯特异性值)/酯特异性值标准差

酯特异性Z评分大于3的那些变体被定义并标记为对酯的偏好性超过硫酯和/或对酯的活性(即催化速率)超过硫酯。将酯特异性Z评分小于-3的那些变体标记为对硫酯的偏好性超过酯。

实施例33.‘TesA变体的游离脂肪酸分析

在本实施例中，提供了鉴定‘TesA变体的各种性质的测定结果。利用上文实施例32中描述的方法进行该分析。在图45和46的表格中，用“变体密码”表示突变，所述变体密码的每一个提供野生型氨基酸，接着是在氨基酸序列中的位置，接着是取代氨基酸(例如“S10A”表示氨基酸序列第10位的丝氨酸被该具体变体中的丙氨酸取代)。

实施例34.‘TesA变体的分析

图45和46中提供了‘TesA变体的测定结果。利用上文实施例32中描述的方法进行该分析。如图45所示，分析了对C₁₀、C₁₂和C₁₄底物的活性水平和底物特异性。

图45列举了突变‘TesA库中的某些‘TesA变体的性质指数，其表明了超过野生型酶的改进性质。图45A-B列举了‘TesA突变体对某些链长底物的特异性的性质指数。

图46A列举了提供的脂肪酯的收率比例或收率百分比高于或强于游离脂肪酸的‘TesA突变体。图46B列举了提供的脂肪酯的收率比例或收率百分比低于游离脂肪酸的‘TesA突变体。表中仅列举了Z评分大于3的突变体，不包括具有较低活性的其它突变体。尽管提供了数据，但是Z评分较低的数据也可能鉴定出有价值的突变体，并且图45中提供的截取值为3的Z评分并非意图限制本发明的范围。

图57A-C中以沿着‘TesA分子全长的图的形式呈现结果。

1.‘TesA变体的脂肪酸产生活性

利用上文实施例32中描述的方法提供‘TesA变体的脂肪酸产生活性的测定结果。

2.‘TesA变体的脂酰PNP测定

图45中提供了‘TesA变体的脂酰PNP活性的测定结果。利用上文实施例32中描述的方法进行该分析。

3.‘TesA变体的酰基辅酶A分析

图45中提供了‘TesA变体的酰基辅酶A活性的测定结果。利用上文实施例32中描述的方法进行该分析。

4.对硫酯(酰基辅酶A)的偏好性超过酯(酰基PNP)

利用上文实施例32中描述的方法提供‘TesA变体的酰基辅酶A活性和酰基PNP活性的测定结果。

5.对酯(酰基辅酶A)的偏好性超过硫酯(酰基辅酶A)

实施例35.在不存在酯合酶的情况下直接产生脂肪酯

在本实施例中，说明了‘TesA在存在醇的情况下体外催化脂酰辅酶A通过酯交换成为对应脂肪酯的能力。重组表达大肠杆菌‘TesA酶，并将其纯化为N-末端带6×His标签的蛋白的同质群体。具体而言，将编码来自大肠杆菌的硫酯酶I(图58的SEQIDNO:31)的‘TesA基因插入携带N-末端6×His标签的pET15-b载体(Novagen)中，并将插入后的载体转化入BL21-DE3细胞用于表达。在37℃下、以200rpm、在LB培养基中培养细胞，直到OD₆₀₀达到1.0，用0.5mMIPTG(终浓度)诱导，然后在28℃再生长5小时。以6,000rpm离心收获后，将沉淀重悬于40mL的100mMTris-HCl(pH7.4)中，超声处理，并以10,000rpm离心20分钟。然后将澄清的裂解物上样到His结合柱(Calbiochem)上，并按厂商说明纯化蛋白。然后将洗脱下的蛋白透析进含25mM磷酸钠(pH7.2)和10％甘油的缓冲液中，用于保存和使用。测定纯化后的‘TesA酶的硫酯酶活性。

‘TesA催化脂酰辅酶A转化为脂肪酯的过程涉及在辅酶A部分从活性位点移出之后由醇对羰基中心进行亲核攻击。在不存在‘TesA的情况下，对乙醇引起的棕榈酸自发酯交换速率进行分析，从而证明乙醇可以取代水作为亲核体来形成脂肪酯而不是脂肪酸。

因此，4mM(约1mg/mL)的棕榈酸(C₁₆-COOH)(Sigma)的小份与不同量的乙醇于室温下孵育不同的时间段。用1:1体积比的乙酸乙酯提取样品，并利用GC-MS分析提取物中棕榈酸乙酯的存在。结果总结在以下的表23中，其表明乙醇和棕榈酸间的自发酯交换的转化率小于.01摩尔/摩尔棕榈酸。

表23

*:两个数据点的平均值

对‘TesA体外催化棕榈酰辅酶A底物的酯交换率进行分析。在存在或不存在1.5μM纯化的‘TesA的情况下，于室温下、在含100μM棕榈酰辅酶A、100μM磷酸缓冲液(pH7.0)和1mMBSA的缓冲液中进行反应1小时。乙醇浓度为0-60％(v/v)。1:1体积比的乙酸乙酯用于终止反应和进行随后的提取。用GC-MS监测棕榈酸乙酯的形成。表24总结了该结果。

表24

结果表明：在存在乙醇的情况下，‘TesA硫酯酶能有效催化酰基辅酶A、棕榈酰辅酶A通过酯交换成为棕榈酸乙酯。所获得的最高收率是23.5摩尔/摩尔棕榈酰辅酶A。鉴于与存在‘TesA的情况相比棕榈酸自发转化为棕榈酸酯的收率非常低(即，指示出增加>1,000倍)，所以该转化是酶学反应。基于我们的数据，最高酯交换收率发生在10-20％(v/v)的乙醇水平。更高的醇浓度对酶稳定性和/或活性造成不良影响，因此造成酯收率较低。

从这些结果得出这样的结论：在存在醇的情况下，硫酯酶可以催化酰基辅酶A底物的直接酯化。可以通过改变醇(例如使用甲醇、丙醇或丁醇)和/或醇浓度来改变酯产物。

实施例36.硫酯酶导致脂肪酯的体内产生

在本实施例中，研究了在不存在异源表达的酯合酶的情况下，‘TesA在体内产生酯的能力。在不存在异源表达的酯合酶的情况下，在大肠杆菌菌株MG1655(ΔfadE)中观察到酯的形成，所述大肠杆菌菌株还携带人工操纵子，所述操纵子含有trc启动子控制下的‘tesA和fadD以及卡那霉素标记基因。将该操纵子整合进染色体，打断天然的lacZ基因。在摇瓶发酵中检测该菌株，利用含以下成分的培养基：6g/LNa₂HPO₄、3g/LKH₂PO₄、0.5g/LNaCl、1g/LNH₄Cl、1mg/L硫胺、1mMMgSO₄、0.1mMCaCl、还补充了另外的NH₄Cl(另外1g/L)、Bis-Tris缓冲液(0.2M)、TritonX-100(0.1％v/v)和微量无机物(27mg/LFeCl₃-6H₂O、2mg/LZnCl₂-4H₂O、2mg/LCaCl₂-6H₂O、2mg/LNa₂MoO₄-2H₂O、1.9mg/LCuSO₄-5H₂O、0.5mg/LH₃BO₃、100mL/L浓HCl)。

用从甘油储备液或从单菌落的刮落物接种LB+抗生素前种子培养基。培养6至8小时，直到OD₆₀₀>1.0。用LB前种子培养物接种添加2％葡萄糖(w/v)+抗生素过夜种子培养物的发酵培养基，接种浓度为4％(v/v)。在125mL带有遮挡的烧瓶中制备15mL发酵培养基+3％葡萄糖(w/v)+抗生素生产培养物。用适量的过夜种子培养物来接种生产培养物，使得生产培养物烧瓶中的起始OD₆₀₀为约0.5。允许该烧瓶培养至OD₆₀₀达到1.0，此时用1mMIPTG(终浓度)诱导培养物，并提供甲醇或乙醇(2％v/v)。允许发酵持续进行至指明的诱导后时间。所有的培养步骤于32℃下进行伴随200rpm的振荡。

用标准微提取步骤进行全发酵液的提取。简而言之，将500μl发酵液转移至微离心管中，添加100μl1M的HCl。用500μl乙酸乙酯提取酸化的培养物，涡旋5分钟，并以最高速度离心1分钟。利用GC-FID对有机层中同时存在的脂肪酸甲酯(FAME)和游离脂肪酸(FFA)的量和同时存在的脂肪酸乙酯(FAEE)和FFA的量进行分析。

在含FAEE和FFA的样品中，在定量前，用二(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺将FFA衍生化。

培养并在诱导时提供2％甲醇的MG1655(ΔfadE)pTrc-’TesA_fadD菌株到24小时的时间点产生了2g/L的总FAME，在48小时发酵结束时产生了3.5g/L的总FAME(图48)。检测到少量的FFA，共约100mg/L。培养物在24小时后达到了最高密度(约11的OD₆₀₀)，并且在接下来的24小时不再继续生长。具体的生产率被计算为在24小时为约200mg/L/OD，在48小时为约300mg/L/OD。这些数据表明：由于’tesA和fadD的过表达，即便是不存在蜡合酶的情况下，依然能观察到FAME的产生。

为了评价FadD或‘TesA独立产生FAME的能力，进行第二次发酵，其中测试了携带具有fadD或‘tesA或fadD和‘tesA的质粒的两种不同的大肠杆菌菌株。所有的质粒都是以pACYC为基础的，并且由trc启动子驱动表达。检验了三种不同的MG1655(ΔfadE)菌株，一种仅具有fadD质粒、一种仅具有‘tesA质粒以及一种具有‘tesA和fadD，其中‘tesA位于fadD的上游。检测了两种C41(ΔfadE)，两种都携带‘tesA和fadD，但是这两个基因相对启动子的顺序不同。如上述在培养基中培养这些菌株，在诱导时提供2％的甲醇，并在诱导后再生长25小时。只表达fadD的菌株没有产生任何FAME，而‘tesA菌株仅产生约150mg/L的FAME(图49)。具有‘tesA和fadD的菌株产生的FAME高于只具有‘TesA的菌株。两种C41菌株产生的FAME进一步提高，其中携带的质粒中fadD位于‘tesA上游的菌株产生的FAME超过以相反顺序表达‘tesA和fadD的菌株。这提示较高的FadD表达增强了‘TesA产生酯的能力。由于‘TesA可以切割酰基ACP和酰基辅酶A，因此，由FadD产生的酰基辅酶A可能允许由‘TesA产生的FFA返回硫酯酶，从而通过水解转化回FFA或者通过醇解一直向FAME转变。对FFA滴度的测定得到这样的结论：只有表达‘TesA的菌株才产生大量的FFA，而表达fadD的菌株产生非常少量的FFA(图50)。

测试了‘TesA利用乙醇直接形成脂肪酸乙酯(FAEE)的能力。测试了来自上述实验的两种MG1655(ΔfadE)菌株，即fadD过表达菌株和‘TesA过表达菌株。本实验中还包括具有受trc启动子控制的、整合的‘tesA_fadD操纵子的MG1655(ΔfadE)。按上述方案培养所有的菌株。诱导时，向所有菌株提供2％(v/v)的甲醇或2％(v/v)的乙醇。此外，为MG1655(ΔfadE)+fadD菌株提供0.05％(w/v)的C_14:0脂肪酸，从而确保FadD可获得足够的游离脂肪酸底物来催化可能的醇解反应。允许发酵持续24小时。

在这些发酵条件下，单独的FadD还是不能产生所需的C₁C_14:0FAME或C₂C_14:0FAEE，这表明FadD对于酯形成是不足够的(图51)。然而，单独的‘TesA能产生FAEE，并且同上文中一样，‘tesA和fadD的过表达所产生的总FAEE超过仅具有‘tesA的菌株。尽管总FAEE的滴度低于FAME的滴度，但是该数据表明‘TesA还能利用甲醇之外的乙醇来形成脂肪酯。对这些发酵条件下FFA形成的分析表明提供乙醇的菌株与提供甲醇的菌株表现相似(图52)。

fadD样品中存在的FFA几乎全部都是发酵中给予的C_14:0FFA所贡献的。表达‘tesA的菌株产生大量的FFA，而表达‘tesA和fadD的菌株表现出相当少的FFA积累。在存在‘TesA的情况下，观察到只有14％的FFA转化为FAME或只有2.3％的FFA转化为FAEE。在存在‘TesA和FadD的情况下，观察到几乎100％的FFA转化为FAME或FAEE。这些数据表明‘TesA对于脂肪酸醇酯的形成是必需的且是足够的，但是FadD与‘TesA的过表达对于增加FAME和FAEE的形成是重要的。

之前的结果表明，当在发酵期间提供合适的醇时，大肠杆菌‘TesA能产生FAME和FAEE。为了确定这是否是专属于大肠杆菌‘TesA的功能，研究了其它异源表达的硫酯酶产生FAME的能力。在菌株MG1655(ΔfadE)中从基于pACYC的质粒过表达来自发光发光杆菌和哈维氏弧菌的‘TesA同源物与来自深海发光杆菌的TesB，并将它们与来自之前发酵的大肠杆菌‘TesA过表达菌株一起进行测试。在发酵培养基中进行摇瓶发酵，诱导后允许继续培养24小时。结果表明两个‘TesA同源物也能产生FAME(图53)。发光发光杆菌‘TesA产生的FAME水平与大肠杆菌‘TesA相当，而哈维氏弧菌‘TesA能比大肠杆菌‘TesA产生更多的FAME。当分析FFA滴度时，发光发光杆菌‘TesA产生的FFA比大肠杆菌‘TesA少，但是哈维氏弧菌‘TesA比其大肠杆菌同源物产生更高的FFA滴度(图54)。有趣的是，哈维氏弧菌‘TesA是高活性的，且能比表达大肠杆菌‘TesA的对照菌株产生更高的FAME和FFA滴度；而且，哈维氏弧菌‘TesA的FFA到FAME的转化率超过30％，而大肠杆菌‘TesA’仅为14％。此外，尽管产生的总FAME的滴度较低，但是表达发光发光杆菌‘TesA的菌株表现出FAME占总FAME+FFA滴度超过60％。

1.其它‘TesA同源物的酯合酶活性

将来自大肠杆菌、黑腐果胶杆菌、深海发光杆菌、发光发光杆菌、恶臭假单胞菌和哈维氏弧菌的‘TesA同源物克隆入trc启动子控制下的表达载体pACYC中。为了实现胞质表达，以缺少信号肽序列的截短基因的形式克隆所有序列。表26列出了同源物的DNA和氨基酸序列。表27列出了氨基酸序列的比对。

将质粒转化进大肠杆菌MG1655ΔfadE中，并于37℃下、在含100μg/mL羧苄青霉素的LB琼脂板上过夜培养。选择单菌落，并于37℃下、在含1％(w/v)葡萄糖和100μg/mL羧苄青霉素的LB培养液中培养，直至OD₆₀₀值达到约1.0。然后将200μL培养物稀释到1.8mL含100μg/mL羧苄青霉素的M9培养基中。使培养物于37℃下生长3小时以后，添加IPTG(1mM终浓度)以及Bis-Tris丙烷缓冲液(0.1M,pH7.0)和甲醇(2％v/v)。

于37℃下生长20小时以后，添加100μL1N的HCl和250μL乙酸乙酯对1mL的培养物进行提取。乙酸乙酯溶液中包含C₂₀游离脂肪酸内标。

在配备火焰电离检测器的气相色谱仪TraceGCUltra(ThermoElectronCorp)中分析脂肪酸和甲酯。产生的脂肪酸(FFA)和脂酰甲酯(FAME)的总量在研究的同源物中有差异(参见图60)。

大肠杆菌‘TesA产生约300mg/L的总脂产物，而恶臭假单胞菌同源物产生的总脂产物接近该量的4倍。产生的FAME的比例还取决于所表达的‘TesA同源物。来自恶臭假单胞菌的’TesA产生的总产物中只有3％是FAME，而由哈维氏弧菌‘TesA产生的总产物中超过25％是FAME。这些结果表明酯形成受‘TesA催化和影响，而不是不受酶影响的纯粹的化学过程。这符合该活性属于酶的氨基酸序列的功能，并且可以将其工程化，从而提高或降低产酯生的倾向。

为了确定FadD过表达是否能提高FAME滴度，将携带pCL1920质粒上受trc启动子控制的fadD基因的质粒转化进大肠杆菌MG1655ΔfadE中。于37℃下、在含100μg/mL羧苄青霉素和100μg/mL壮观霉素的LB琼脂板上将转化的细胞过夜培养。选择单菌落，并于37℃下、在含1％(w/v)葡萄糖、100μg/mL羧苄青霉素和100μg/mL壮观霉素的LB培养液中培养，直至OD₆₀₀值达到约1.0。然后将200μL培养物稀释到1.8mL含100μg/mL羧苄青霉素和100μg/m壮观霉素的M9培养基中。将培养物于37℃下生长3小时以后，添加IPTG(1mM终浓度)以及Bis-Tris丙烷缓冲液(0.1M,pH7.0)和甲醇(2％v/v)。

于37℃下生长20小时以后，通过添加100μL1N的HCl和250μL乙酸乙酯对1mL的培养物进行提取。乙酸乙酯溶液中包含C₂₀游离脂肪酸内标。

在配备火焰电离检测器的气相色谱仪TraceGCUltra(ThermoElectronCorp)中分析脂肪酸和甲酯。如之前对于大肠杆菌’TesA所观察到的，FadD的共表达增加所有的受试同源物产生的FAME的比例(参见图61)。因此，酰基辅酶A合酶与‘TesA同源物的联合共表达可以用来增加酯的产生。有趣的是，当共表达FadD时，来自恶臭假单胞菌的‘TesA产生的FFA加FAME的总滴度很低。这提示恶臭假单胞菌‘TesA可能对酰基ACP底物比对酰基辅酶A具有更高的特异性，并且可以与酯合酶或对酰基辅酶A具有更高活性的其它硫酯酶共表达，以进一步增加酯的产生。

2.‘TesA突变体增强酯合成

如以上提到的，对‘TesA同源物的研究已经表明‘TesA的酯合酶活性是可工程化的特性；即，可以改变所述酶的氨基酸序列来增加酯的产生。为此，构建了具有增强的酯合酶活性的大肠杆菌‘TesA突变体。用半胱氨酸取代Ser10(Ser10是‘TesA活性位点中的亲核丝氨酸残基)而产生S10C突变体，从而得到能产生更高比例的FAME的改进的‘TesA酶。

将编码野生型大肠杆菌‘TesA、编码S10C突变体或不编码‘TesA的质粒转化进大肠杆菌MG1655ΔfadE中，并于37℃下、在含100μg/mL羧苄青霉素的LB琼脂板上过夜培养。选择单菌落，并于37℃下、在含1％(w/v)葡萄糖和100μg/mL羧苄青霉素的LB培养液中过夜培养。然后将培养物以1:100稀释到补充了1％(w/v)葡萄糖和100μg/mL羧苄青霉素的新鲜LB培养基中，并于37℃下培养，直至OD₆₀₀值达到约1.0。然后将200μL培养物稀释到1.8mL的含100μg/mL羧苄青霉素的M9培养基中。培养物于37℃下生长3小时以后，添加IPTG(1mM终浓度)以及Bis-Tris丙烷缓冲液(0.1M,pH7.0)和甲醇(2％v/v)。

在配备火焰电离检测器的气相色谱仪TraceGCUltra(ThermoElectronCorp)中分析脂肪酸和甲酯。野生型大肠杆菌‘TesA培养物中的脂肪酸(FFA)和脂酰甲酯(FAME)的总量(316mg/L)大于S10C突变体(136mg/L)，但是S10C中FAME的比例(47％)大于野生型‘TesA中观察到的FAME的比例(9％)。这表明可以对‘TesA序列进行修饰，从而影响所产生的酯的比例(参见图62)。

实施例37.在发酵罐中不存在蜡合酶的情况下产生FAME

本实施例表明上文实施例36中描述的过程可以扩大化，从而按照本发明以商业规模生产脂肪酸酯。

将冻存的细胞在LB培养液中复苏4-8小时，然后在规定培养基中培养，所述培养基包含：1.5g/LKH₂PO₄、4.54g/LK₂HPO₄-3H₂O、4g/L(NH₄)₂SO₄、0.15g/LMgSO₄-7H₂O、20g/L葡萄糖、200mMBis-Tris缓冲液(pH7.2)和1.25mL/L的维生素溶液。微量金属溶液含27g/LFeCl₃·6H₂O、2g/LZnCl₂·4H₂O、2g/LCaCl₂·6H₂O、2g/LNa₂MoO₄·2H₂O、1.9g/LCuSO₄·5H₂O、0.5g/LH₃BO₃和100mL/L浓HCl。维生素溶液含0.42g/L核黄素、5.4g/L泛酸、6g/L尼亚新、1.4g/L吡多辛、0.06g/L生物素和0.04g/L叶酸。

在严格控制温度、pH、搅拌、通风和溶解氧的条件下，将100mL过夜生长的培养物接种至发酵罐中2L相同的培养基中，但该培养基仅含2g/L葡萄糖。发酵罐中的条件是32℃、pH6.8和溶解氧(DO)水平为饱和度30％。通过添加NH₄OH来维持pH，NH₄OH还能作为细胞生长的氮源。当最初的葡萄糖被消耗殆尽时，向发酵罐中提供含60％葡萄糖、3.9g/LMgSO₄-7H₂O和10mL/L微量无机物溶液的补料。将补料速率设置成与细胞生长速率匹配，从而避免葡萄糖在发酵罐中积累。通过避免葡萄糖积累，可以降低或消除诸如醋酸盐、甲酸盐和乙醇的副产物的形成，否则这些副产物是大肠杆菌常常产生的。在最初的16-24小时，以指数方式提供补料，允许细胞以固定的生长速率生长。当给料速率达到所需的最大值(6至10g葡萄糖/L发酵罐/小时)时，使剩余的发酵运行维持在该水平。在早期生长阶段，通过添加1mMIPTG和25mL/L的纯甲醇来诱导FAME的产生。允许发酵持续进行3天。在运行期间添加甲醇数次以补充以被细胞消耗的甲醇，但是大部分都通过废气蒸发而损失。所述添加物用来将发酵液中的甲醇浓度维持在10-30mL/L，以便保证有效的生产同时避免细胞生长抑制。

通过检测OD₆₀₀(600nm处的光密度)、葡萄糖消耗和酯产生来关注发酵的进程。

通过高压液相色谱(HPLC)来分析整个发酵过程的葡萄糖消耗。按本领域内对于某些糖和有机酸常用的方法进行HPLC分析，例如，使用以下条件：配备折光率检测器的AgilentHPLC1200系列；柱：AminexHPX-87H,300mm×7.8mm；柱温：35℃；流动相：0.01MH₂SO₄(水性)；流速：0.6mL/分钟；上样体积：20μl。

通过配备火焰电离检测器的气相色谱仪(GC-FID)来分析脂肪酸甲酯和脂肪酸乙酯的产生。用1:1体积/体积比的乙酸乙酯来从发酵液提取样品。在强烈涡旋后，将样品离心，并通过气相色谱(GC)分析有机相。分析条件如下：

仪器：美国热电公司(ThermoElectronCorporation)的TraceGCUltra，装备火焰电离检测器(FID)；

柱：美国热电公司的DB-1(1％二苯基硅氧烷；99％二甲基硅氧烷)CO1UFM1/0.1/501DET，相pH5，FT：0.4μm，长5m，id：0.1mm；

进样条件：250℃不分流，根据样品浓度使用3.8分钟1/25分流法，75mL/分钟的分流；

载气，流速：氦，3.0mL/分钟；

加热块温度：330℃；

柱温：50℃保持0.5分钟；100℃/分钟升至330℃；330℃保持0.5分钟；

检测器温度：300℃；

上样体积：2μL；

运行时间/流速：6.3分钟/3.0mL/分钟(不分流法)，3.8分钟/1.5mL/分钟(1/25分流法)，3.04分钟/1.2mL/分钟(1/50分流法)。

本方案应用于两种不同菌株的发酵运行：ID1(MG1655ΔfadE::P_TRCtesA-fadD)和IDG5(MG1655ΔfadEΔfhuAΔadhΔldhΔpflB::P_TRCtesA,P_T5LfadD)，这两种菌株均不含有编码酯合酶的基因。接种后4小时，通过添加IPTG来诱导细胞，向发酵罐供应甲醇，以提供用于产生FAME的醇。在分别的实验中，以两种不同的最大给料速率6g/L/h和10g/L/h向培养物提供葡萄糖。

如图63和图64所示，对于两种菌株以及在每个葡萄糖给料速率时，培养物表现出对产生FAME的偏好性超过游离脂肪酸。在70小时的发酵中，当以6g/L/h给料时，ID1产生了约19g/L的FAME和小于1g/L的FFA；当以10g/L/h给料时，ID1产生了28g/L的FAME和约1g/L的FFA。IDG5在较低的葡萄糖给料时产生了20g/L的FAME和小于1g/L的FFA，而在较高的葡萄糖给料时产生了25g/L的FAME和约10g/L的FFA。

实施例38.基于蛋白工程化结果鉴定改变性质的天然存在的硫酯酶

本文进行的大肠杆菌‘TesA工程化实验可用于鉴定很多氨基酸残基，这些氨基酸残基的突变导致性质改变。‘TesA是属于SGNH家族的酶，SGNH家族代表一大类的酶。‘TesA的其它同源物可能用于利用本文描述的途径来产生生物柴油。本实施例鉴定了与‘TesA相比可能具有改变的性质的‘TesA同源物。下文概括了该方法。

用下文概括的策略鉴定‘TesA的同源物

图55显示了在对应于’TesA筛选中鉴定出的位置具有取代的同源物。还显示了同源物的ID和目的位置附近的序列比对。

等同项

尽管本文清楚地公开了本发明的具体实施例，但是以上的说明书和实施例是示例性的而非限制性的。在阅读本说明书(包括实施例)后，本发明的多种变形对本领域技术人员是显而易见的。应当参考实施例及其等同项的全部范围以及说明书及这些变形来确定本发明的全部范围。

将本申请中引用的所有出版物、专利、专利申请和其它参考文献通过引用全部并入本文，如同特别和单独指出通过引用将每一个出版物、专利、专利申请和其它参考文献并入本文。

优选的实施方式：

1.来自前体硫酯酶的突变硫酯酶，其中与所述前体硫酯酶相比，所述突变体在体外和/或体内具有至少一种改变的性质。

2.如项目1所述的突变硫酯酶，其中所述前体硫酯酶包含一个或多个选自以下的序列：

(a)G–D-S-L-X(5)-M(SEQIDNO:28)，其中：

“X”是指任何氨基酸残基，如果存在其相邻括号中的数字，则该数字是指该氨基酸残基区段中X残基的数量，第2位的D残基可用N或T取代，第4位的L残基可用C或Q取代，以及第10位的M残基可用C、D、L、N、T或V取代；和/或

(b)V-X(2)-G-X-N-D-X-L(SEQIDNO:29)，其中：

每个“X”是指任何氨基酸残基，如果存在其相邻括号中的数字，则该数字是指该氨基酸残基区段中X残基的数量，第1位的V残基可用L取代，第6位的N残基可用V、L、C、A、G、H、I、T或W取代，第7位的D残基可用E取代，第9位的L残基可用I、W、F、T、M、A、E、N或V取代；和/或

(c)D-X(2)-H-P-X(7)-I(SEQIDNO:30)，其中：

每个“X”是指任何氨基酸残基，如果存在其相邻括号中的数字，则该数字是指该氨基酸残基区段中X残基的数量，第5位的P残基可用G、A、F、L、S或V取代，第13位的I残基可用L或V取代。

3.如项目1所述的突变硫酯酶，其中所述前体硫酯酶

(a)与SEQIDNO:31具有至少约30％的序列同一性；

(b)与SEQIDNO:31具有至少约40％的序列同一性；

(c)与SEQIDNO:31具有至少约55％的序列同一性；

(d)与SEQIDNO:31具有至少约70％的序列同一性；

(e)与SEQIDNO:31具有至少约85％的序列同一性；

(f)与SEQIDNO:31具有至少约90％的序列同一性；或

(g)与SEQIDNO:31具有至少约95％的序列同一性。

4.如项目1所述的突变硫酯酶，其中编码所述前体硫酯酶的多核苷酸

(a)与SEQIDNO:32具有至少约30％的序列同一性；

(b)与SEQIDNO:32具有至少约40％的序列同一性；

(c)与SEQIDNO:32具有至少约55％的序列同一性；

(d)与SEQIDNO:32具有至少约70％的序列同一性；

(e)与SEQIDNO:32具有至少约85％的序列同一性；

(f)与SEQIDNO:32具有至少约90％的序列同一性；或

(g)与SEQIDNO:32具有至少约95％的序列同一性；

5.如项目1所述的突变硫酯酶，其中所述至少一种改变的性质是改变的体外和/或体内底物特异性。

6.如项目5所述的突变硫酯酶，其中所述改变的体外和/或体内底物特异性是对于C₁₀、C₁₂或C₁₄底物或对于酯底物或硫酯底物的增加的活性。

7.如项目1所述的突变硫酯酶，其中所述至少一种改变的性质是脂肪酯与其它脂肪酸衍生物相比的体外和/或体内的收率比例的改变。

8.如项目7所述的突变硫酯酶，其中所述脂肪酯与其它脂肪酸衍生物相比的收率比例的改变是脂肪酯与游离脂肪酸相比的体外和/或体内的收率比例的增加。

9.如项目7所述的突变硫酯酶，其中所述脂肪酯与其它脂肪酸衍生物相比的收率比例的改变是脂肪酯与游离脂肪酸相比的体外和/或体内的收率比例的降低。

10.如项目1所述的突变硫酯酶，其中所述至少一种改变的性质是体外和/或体内的脂肪酸衍生物的增加的收率。

11.如项目1所述的突变硫酯酶，其中所述至少一种改变的性质是短链脂肪酸衍生物与其它脂肪酸衍生物相比的体外和/或体内的收率比例的增加。

12.如项目1所述的突变硫酯酶，其中所述至少一种改变的性质是短链脂肪酸衍生物与其它脂肪酸衍生物相比的体外和/或体内的收率比例的降低。

13.如项目11或12所述的突变硫酯酶，其中所述短链脂肪酸衍生物选自C₈、C₉、C₁₀、C₁₁、C₁₂、C₁₃和/或C₁₄脂肪酸衍生物。

14.如项目11或12所述的突变硫酯酶，其中所述其它脂肪酸衍生物选自C₁₅、C₁₆、C₁₇、C₁₈、C₁₉和/或C₂₀脂肪酸衍生物。

15.如项目13或14所述的突变硫酯酶，其中所述脂肪酸衍生物选自游离脂肪酸、脂肪酯、脂肪醛和脂肪醇。

16.编码项目1-15中任一项所述的突变硫酯酶或其天然存在的等同物的多核苷酸。

17.包含项目16所述的多核苷酸的载体。

18.包含项目16所述的多核苷酸的重组宿主细胞。

19.包含项目17所述的载体的重组宿主细胞。

20.如项目18或19所述的重组宿主细胞，其中编码硫酯酶突变体或其天然存在的等同物的多核苷酸被整合入所述宿主细胞的染色体中。

21.包含项目16所述的多核苷酸或项目17所述的载体的重组细胞，其中fadE、gpsA、IdhA、pflB、pta、poxB、ackA、ackB、plB和/或sfa中的一个或多个被减弱。

22.包含项目16所述的多核苷酸或项目17所述的载体的重组细胞，所述重组细胞还包含一种或多种编码一种或多种脂肪酸衍生酶的多核苷酸。

23.如项目22所述的重组细胞，其中所述一种或多种脂肪酸衍生酶选自：酰基辅酶A合酶、酯合酶、醇酰基转移酶、醇脱氢酶、酰基辅酶A还原酶、脂肪酸脱羧酶、羧酸还原酶、脂肪醇乙酰转移酶、脱羰酶和/或脂肪醇形成酰基辅酶A还原酶。

24.包含项目16所述的多核苷酸或项目17所述的载体的重组细胞，所述重组细胞还包含一种或多种编码一种或多种酰基辅酶A合酶的多肽，所述酰基辅酶A合酶选自fadD、fadK、BH3102、yhfL、Pfl-4354、EAV15023、fadD1、fadD2、RPC_4074、fadDD35、fadDD22、faa3和/或编码GenBank登录号ZP_01644857蛋白的基因。

25.包含项目16所述的多核苷酸或项目17所述的载体的重组细胞，所述重组细胞还包含一种或多种编码以下的多核苷酸：

(a)一种或多种酯合酶；

(b)一种或多种脂肪醛生物合成酶；

(c)一种或多种脂肪醇产生基因；或

(d)一种或多种烯烃产生基因。

26.包含项目16所述的多核苷酸或项目17所述的载体的重组细胞，其中一种或多种编码酰基辅酶A脱氢酶的基因被减弱或缺失。

27.产生脂肪酸衍生物的方法，包括在允许脂肪酸衍生物产生的条件下培养项目18-26中任一项所述的重组细胞。

28.细胞外产生脂肪酸衍生物的方法，包括在允许表达突变硫酯酶或其天然存在的等同物的条件下培养项目18-26中任一项所述的重组细胞，收获所述细胞，裂解所述细胞，以及在允许脂肪酸衍生物产生的条件下向所述细胞裂解物提供底物。

29.如项目27或28所述的方法，其中所述脂肪酸衍生物是修饰过的脂肪酸衍生物。

30.按照项目27-29中任一项所述的方法产生的脂肪酸衍生物。

31.如项目30所述的脂肪酸衍生物，其中所述脂肪酸衍生物是下述产品或者下述产品的组分：燃料、燃料添加剂、混合燃料、去垢剂、表面活性剂、营养补剂、聚合物、石蜡替代品、润滑剂、溶剂、个人护理品、橡胶加工添加剂、腐蚀抑制剂、乳化剂、塑料、纺织品、美容用品、纸产品、涂料、金属加工液、电介质、润滑油或软化剂。

32.包含一种或多种项目30所述的脂肪酸衍生物的生物燃料组合物。

33.包含项目32所述的生物燃料组合物的燃料组合物。

34.如项目33所述的燃料组合物，还包含基于石油的燃料。

35.如项目34所述的燃料组合物，还包含合成的燃料。

36.如项目35所述的燃料组合物，还包含十六烷值改良剂、降低浊点的添加剂、去垢剂、分散剂、抗磨剂、润滑性改良剂、稳定剂、抗氧化剂、腐蚀抑制剂、杀生物剂、金属减活化剂、粘性改良剂、摩擦改良剂、消泡剂和密封固定剂中的一种或多种。

Claims

1.重组细胞，其包含能将C₁₀、C₁₂或C₁₄脂酰基底物转化为脂肪酯的工程化硫酯酶，其中所述工程化硫酯酶的氨基酸序列具有与SEQIDNO:73具有至少约70％的序列同一性并且在选自以下的氨基酸位置处进行取代：第10、78、80、101、108、111、117、118、122、145、152和178位。

2.权利要求1所述的重组细胞，其中所述工程化硫酯酶具有一个或多个选自以下的特征：

(a)第10位的氨基酸残基是半胱氨酸；

(b)第78位的氨基酸残基是蛋氨酸；

(c)第80位的氨基酸残基是色氨酸；

(d)第101位的氨基酸残基是亮氨酸、丙氨酸或缬氨酸；

(e)第108位的氨基酸残基是色氨酸；

(f)第111位的氨基酸残基是酪氨酸或色氨酸；

(g)第117位的氨基酸残基是精氨酸；

(h)第122位的氨基酸残基是精氨酸；

(i)第145位的氨基酸残基是丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸或苏氨酸；

(j)第152位的氨基酸残基是精氨酸；和

(k)第178位的氨基酸残基是苏氨酸或色氨酸。

3.权利要求1所述的重组细胞，其中所述脂肪酯是脂肪酸甲酯(FAME)。

4.权利要求1所述的重组细胞，其中所述工程化硫酯酶是TesA酶。

5.权利要求4所述的重组细胞，其中所述TesA酶获自细菌，所述细菌选自：大肠杆菌、黑腐果胶杆菌、深海发光杆菌、发光发光杆菌、恶臭假单胞菌和哈维氏弧菌。

6.权利要求4所述的重组细胞，其中所述TesA酶在氨基酸位置第10位处进行取代。

7.权利要求6所述的重组细胞，其中在所述氨基酸位置第10位处，丝氨酸被取代为半胱氨酸。

8.权利要求1所述的重组细胞，其中所述重组细胞是微生物细胞。

9.权利要求8所述的重组细胞，其中所述微生物细胞是大肠杆菌。

10.权利要求8所述的重组细胞，其中所述微生物细胞能自发分泌或释放所述脂肪酯。

11.权利要求1所述的重组细胞，其中所述细胞进一步工程化而外源表达酯合酶。

12.权利要求11所述的重组细胞，其中所述酯合酶获自细菌，所述细菌选自：栖藻海杆菌DG893、水油海杆菌VT8、海杆菌ELB17。

13.权利要求1所述的重组细胞，其中所述细胞进一步工程化而外源表达酰基辅酶A合酶(FadD)。

14.细胞培养物，其包含权利要求1所述的重组细胞。