CN105646911B - 一种pH和还原响应性的肝靶向载药微球及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种具有肝主动靶向功能以及具有pH和还原刺激响应性的微球、制备方法和在医药上的用途。其特征为：(1)载体组成为半乳糖改性明胶‑聚(β‑氨基酯)，微球以半乳糖改性明胶、端基为仲胺基含有二硫键的线性聚(β‑氨基酯)为单体，以二醛为交联剂，经乳化交联法制备；(2)载药微球具有抗肿瘤药和半乳糖改性明胶‑聚(β‑氨基酯)的组成成分，是以盐酸阿霉素为抗肿瘤药模型药物，分散在单体半乳糖改性明胶和线性聚(β‑氨基酯)中，加入交联剂后，两种单体发生交联反应所形成的微球；(3)所制备的微球对肝细胞有很好的识别特性，对模型药物有很好的pH和还原刺激释放性能，可进一步研制开发为治疗肝癌的新型靶向制剂。
Description
技术领域
本发明涉及一种新型的微球，具体涉及具有肝主动靶向功能并且具有pH和还原刺激响应性的微球以及其制备方法和在医学上的用途，属于高分子材料和生物医学工程领域。
技术背景
肝癌已位列我国肿瘤引起死亡的第二位，化疗是中晚期肝癌无法进行肝移植和肝切除时重要的治疗手段。抗肿瘤药物往往因为理化性质差、半衰期短和作用无选择等，导致治疗效果差和严重的毒副反应。通过将药物包埋、聚集或吸附在对特定环境刺激具有响应性的载体内部，避免化疗药物与正常组织的直接相互作用，使药物只在作用部位释放，可提高药物的选择性、降低药物的毒副作用。
肿瘤组织与正常组织相比，实体瘤内的pH值更低，呈弱酸性，而正常组织细胞外基质和血液中pH维持在7.4。另外，血液中还原性谷胱甘肽(GSH)的浓度为10～100μM，但在肿瘤细胞内其浓度则上升到1～10mM。利用肿瘤组织与正常组织的这些在pH和还原性上的差异，开发了对pH、还原刺激具有响应性的抗肿瘤药物的载药系统。
2013年，Polymer Chemistry(Issue 4，pp1199-1207)报道了采用原子转移自由基聚合反应合成单甲氧基聚乙二醇-聚N，N’-二乙基氨乙基丙烯酸酯共聚体(mPEG-b-PDEA)，经季胺化交联反应后制备了mPEG-b-PDEA水凝胶，以这种水凝胶作为抗肿瘤药阿霉素的载体，在生理条件下保持稳定的核-壳结构，而在酸性和还原性的肿瘤组织和细胞内能够快速释放出药物，从而实现药物释放的智能性，但是该载体材料不具有主动靶向功能，不能实现抗肿瘤药的靶向输送。
发明内容
有鉴于此，本发明所要解决的技术问题是提供一种具有肝主动靶向功能并且具有pH和还原刺激响应性的微球以及其制备方法，载药微球能通过靶向性提高化疗药的治疗效果并减轻化疗药引起的不良反应、耐药性等，可用于肝癌的靶向治疗。
本发明提供了一种具有肝主动靶向功能并且具有pH和还原刺激响应性的半乳糖改性明胶-聚(β-氨基酯)微球(galG-PBAE微球)，其特征是：具有如式(I)的结构的半乳糖改性明胶-聚(β-氨基酯)(galG-PBAE)的组成成分，微球由半乳糖改性明胶(galG)单体、端基为仲胺基含有二硫键的线性聚(β-氨基酯)(PBAE)单体通过交联剂的乳化交联反应而得到。
所述的单体galG，具有式(II)的结构，由半乳糖(gal)对明胶(gel)通过改性反应得到；
所述的单体PBAE，具有式(III)的结构，n为聚合度。由双(烯丙酰氧乙基)二硫醚(IV)与N，N’-二甲基烃二胺(V)反应得到。式(v)中，R1为-(CH2)2-、-(CH2)3-、-(CH2)4-、-(CH2)5-、-(CH2)6-、 或
所述的交联剂为二醛，具有式(VI)的结构。式(VI)中，R2为没有原子、-CH2-、-(CH2)2-、-(CH2)3-、-(CH2)4-、或即所用的交联剂为乙二醛、丙二醛、丁二醛、戊二醛、己二醛、对苯二甲醛、间苯二甲醛或邻苯二甲醛。
本发明还提供了一种具有肝主动靶向功能并且具有pH和还原刺激响应性的载药/半乳糖改性明胶-聚(β-氨基酯)微球(载药/galG-PBAE微球)，其特征在于：具有抗肿瘤药和galG-PBAE的组成成分，是将抗肿瘤药分散在单体galG和单体PBAE中，加入交联剂后，两种单体发生交联反应所形成的微球。
所述的抗肿瘤药为盐酸阿霉素(DOX)或其他抗肿瘤药；
所述的单体galG，具有式(II)的结构，由半乳糖(gal)对明胶(gel)通过改性反应得到；
所述的单体PBAE，具有式(III)的结构，n为聚合度。由双(烯丙酰氧乙基)二硫醚(IV)与N，N’-二甲基烃二胺(V)反应得到。式(V)中，R1为-(CH2)2-、-(CH2)3-、-(CH2)4-、-(CH2)5-、-(CH2)6-、 或
所述的交联剂为二醛，具有式(VI)的结构。式(VI)中，R2为没有原子、-CH2-、-(CH2)2-、-(CH2)3-、-(CH2)4-、或即所用的交联剂为乙二醛、丙二醛、丁二醛、戊二醛、己二醛、对苯二甲醛、间苯二甲醛或邻苯二甲醛。
本发明同时还提供了一种具有肝主动靶向功能以及具有pH和还原刺激响应性的galG-PBAE微球的制备方法，其特征是：以galG和PBAE为单体，以二醛为交联剂，经乳化交联法制备。制备的具体步骤为：
(1)将单体galG和单体PBAE按比例加入水中，搅拌分散均匀后，制得水相。
单体galG和单体PBAE的质量比为(1～2)∶(1～2)，单体galG和单体PBAE分散在水中的总体积浓度为25～200mg/ml；
(2)将乳化剂按比例分散在液体石蜡中，制得油相。
所用乳化剂为span 80或tween 80，乳化剂在液体石蜡中的体积浓度为0.5％～5％；
(3)在温度为25～85℃和搅拌速度为50～1500rpm的条件下，将水相滴加至油相。
所用油相体积是水相体积的5～50倍；
(4)在温度为-5℃～10℃和搅拌速度为50～1500rpm的条件下，加入交联剂进行交联反应。
所用交联剂为乙二醛、丙二醛、丁二醛、戊二醛、己二醛、对苯二甲醛、间苯二甲醛或邻苯二甲醛，其用量为galG和PBAE两者总质量的0.5～5倍；
(5)收集固形物，用异丙醇、正丙醇、乙醇、甲醇或丙酮洗涤后，再用石油醚洗涤，真空干燥，得到galG-PBAE微球。
本发明另外还提供了一种具有肝主动靶向功能并且具有pH和还原刺激响应性的载药微球的制备方法，其特征是，以galG和PBAE为单体，以二醛为交联剂，以DOX为抗肿瘤药模型药物，经乳化交联法制备载药/galG-PBAE微球。
所述的载药/galG-PBAE微球的制备方法，包括如下步骤：
(1)将单体galG和单体PBAE按比例加入水中，搅拌分散后，按比例加入抗肿瘤模型药物DOX，搅拌均匀，制得水相。
单体galG和单体PBAE的质量比为(1～2)∶(1～2)，单体galG和PBAE两者的总质量为抗肿瘤模型药物DOX质量的5～50倍，单体galG和单体PBAE分散在水中的总体积浓度为25～200mg/ml；
(2)将乳化剂按比例分散在液体石蜡中，制得油相。
所用乳化剂为span 80或tween 80，乳化剂在液体石蜡中的体积浓度为0.5％～5％；
(3)在温度为25～85℃和搅拌速度为50～1500rpm的条件下，将水相滴加至油相。
所用油相体积是水相体积的5～50倍；
(4)在温度为-5℃～10℃和搅拌速度为50～1500rpm的条件下，加入交联剂进行交联反应。
所用交联剂为乙二醛、丙二醛、丁二醛、戊二醛、己二醛、对苯二甲醛、间苯二甲醛或邻苯二甲醛，其用量为galG和PBAE两者总质量的0.5～5倍；
(5)收集固形物，用异丙醇、正丙醇、乙醇、甲醇或丙酮洗涤后，再用石油醚洗涤，真空干燥，得到载DOX/galG-PBAE微球。
所述的单体galG(II)的制备方法，由β-D-半乳糖(IIa)经O-乙酰化保护和溴代反应合成1-溴代-2，3，4，6-四乙酰氧基-β-D-半乳糖(IIb)，与硫脲缩合后得到2，3，4，6-四乙酰氧基-1-硫代-β-D-半乳糖基-2’-异硫脲氢溴酸盐(IIc)，在缚酸剂存在下与氯乙腈反应得到2，3，4，6-四乙酰氧基-1-腈甲基硫代-β-D-半乳糖(IId)，在甲醇钠存在下与甲醇缩合得到2-亚氨基-2-甲氧乙基-1-硫代-β-D-半乳糖(IIe)，后者与明胶缩合得到galG。具体反应步骤为：
所述的单体PBAE(III)的制备方法，由双(2-羟乙基)二硫醚(IIIa)在三乙胺(TEA)存在下与丙烯酰氯(IIIb)反应得到双(烯丙酰氧乙基)二硫醚(IIIc)，后者与N，N’-二甲基烃二胺经迈克尔加成聚合反应得到PBAE。具体反应步骤为：
本发明与现有技术相比，具有如下的优点：
(1)微球表面经交联形成的西弗碱以及线性聚(β-氨基酯)分子内的β-氨基酯键均在酸性越低的条件下水解越快，使制备的载药微球在正常组织中保持结构完整，而在酸性更低的肿瘤组织中快速裂解释放药物，这种结构使得制备的载药微球具有pH刺激响应性；另外，在线性聚(β-氨基酯)中引入了对还原性敏感的二硫键，使得制备的载药微球在正常组织中保持完整结构，而在还原性的肿瘤组织中快速裂解释放药物，这种结构使得制备的微球同时又具备还原刺激响应性；
(2)微球表面引入了半乳糖基配体，该配体能够选择性的识别只表达于哺乳动物肝细胞表面的去唾液酸糖蛋白受体(ASGR)，使微球通过配体-受体相互作用选择性地粘附于肝细胞表面，表现出主动肝靶向功能。这种肝靶向性使微球选择性地聚集于肝组织中，在癌化区域pH、还原双重刺激下快速释放药物，使肝癌细胞长时间浸润于高浓度的化疗药物中，增强了药效，减轻了不良反应、耐药性等；
(3)本发明的优点还在于原料廉价易得、制备工艺简单、制备条件要求低、包封率高、微球粒径适宜，所用的明胶和聚(β-氨基酯)具有良好的生物相容性，是作为药物传递体系的优选材料。
附图说明
图1实施例1中所制备的载DOX/galG-PBAE微球在pH5.5、pH 7.4、pH 5.5和DTT10mM溶液中累积释药量随时间的关系
图2实施例1中所制备的载DOX/galG-PBAE微球与表达ASGR的HepG2细胞和不表达ASGR的Hela细胞的粘附倒置荧光显微镜照片，其中(a)为HepG2细胞与载DOX/galG-PBAE微球，(b)为Hela细胞与载DOX/galG-PBAE微球
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐明本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1
(1)制备半乳糖改性明胶(II)
1-溴代-2，3，4，6-四乙酰氧基-β-D-半乳糖(IIb)的制备：16ml乙酸酐在0℃搅拌下加入0.08ml HClO4，然后在30min内缓慢加入4gβ-D-半乳糖(IIa)，升温至35～40℃反应30min。在冰浴冷却下依次加入1.2g红磷、2.3ml Br2和1.5ml水，升高温度至18～20℃反应2h。加入20ml氯仿，搅拌后倒入冰水中。过滤、分液，水相用20ml氯仿萃取两次，合并氯仿，用饱和NaHCO3、蒸馏水洗涤至水相为中性。加入无水MgSO4干燥过夜，减压旋蒸除去氯仿得到黄色糖浆样物。用乙醚溶解并加入石油醚至产生的白色沉淀恰好不再溶解时为止，置于冰箱中结晶，得到白色晶体IIb，熔点为78～80℃。
2，3，4，6-四乙酰氧基-1-硫代-β-D-半乳糖基-2’-异硫脲氢溴酸盐(IIc)的制备：2.79g IIb和0.515g硫脲加入到预先加有5ml无水丙酮并带有回流装置的干燥三颈烧瓶中，60℃回流30min，稍冷后置于冰箱中结晶。得到白色晶体IIc，熔点为168～170℃。
2，3，4，6-四乙酰氧基-1-腈甲基硫代-β-D-半乳糖(IId)的制备：1.9g的IIb和1ml氯乙腈加入到10ml体积比为1∶1的丙酮和水的混合溶剂中，搅拌至固体全部溶解后加入0.8g K2CO3和1g NaHSO3，在室温下继续搅拌30min。然后加入70ml冰水并剧烈搅拌2h。过滤收集固体、真空干燥后，经10ml甲醇重结晶得到IId，熔点为95～97℃。
2-亚氨基-2-甲氧乙基-1-硫代-β-D-半乳糖(IIe)的制备：1.209g IIc和0.016g甲醇钠加入到30ml的无水甲醇中，37℃下反应9h。减压旋蒸除去甲醇得到黄色糖浆物(IId)。
半乳糖改性明胶(II)的制备：0.5g明胶加入到50ml硼酸缓冲溶液(pH 8.0)中配成明胶溶液，加入0.5g IId，室温下反应24h。加入醋酸调节pH至4～5淬灭反应，然后用半透膜透析48h，冻干得到半乳糖改性明胶(II)。
(2)制备端基为仲胺基含有二硫键的线性聚(β-氨基酯)(III)
双(烯丙酰氧乙基)二硫醚(IIIa)的制备：0.60g双(2-羟乙基)二硫醚用15ml无水四氢呋喃溶解，冷却至-10℃，加入2.2ml三乙胺搅拌10min。滴加1.45g丙烯酰氯溶于5ml无水四氢呋喃的溶液，缓慢升温至20℃继续反应12h。反应结束后过滤除去产生的固体，减压旋蒸除去四氢呋喃，得到的黄色粘稠液体用CHCl3溶解，分别用饱和Na2CO3溶液和蒸馏水洗涤至中性。CHCl3层经无水MgSO4过夜干燥后，过滤，旋蒸，粗产物经硅胶柱层析分离(洗脱剂为乙酸乙酯∶正己烷＝1∶3的混合溶剂)，得到淡黄色液体IIIa。
端基为仲胺基含有二硫键的线性聚β-氨基酯(III)的制备：115mg IIIa溶解于10ml无水四氢呋喃，在N2保护下加入52.8mgN，N’-二甲基乙二胺，升温至50℃避光反应48h。旋蒸除去四氢呋喃，残余物缓慢滴加至剧烈搅拌的冷的无水乙醚中，析出得到淡黄色粘稠物III。
(3)制备微球
空载微球的制备：
将40.5mg质量比为1∶1的半乳糖改性明胶(II)和聚β-氨基酯(III)溶于1ml蒸馏水。用饱和Na2CO3溶液调节pH至9，得到水相。
将0.15ml span 80加入到15ml液体石蜡中，于50℃和转速600rpm搅拌30min，得到油相。
在600rpm的搅拌速度下，将水相逐滴加入到油相中。冷却至0℃，加入0.5g 25％的戊二醛，于0℃下避光反应2h。然后加入15ml异丙醇，继续搅拌30min，过滤，固形物经异丙醇、石油醚洗涤3～4次后得到空载微球。
所得空载微球为球形，分散性好，平均粒径为7.9μm，对人肝癌细胞HepG2和人子宫瘤细胞Hela两类细胞间的粘附有高选择性，能够通过表面的半乳糖基特异性识别ASGR而具有主动肝靶向功能。
载药微球的制备：
除水相配制时加入4.5mg盐酸阿霉素外，其余按本实施例中空载微球的制备方法。该水相的配制过程为：将40.5mg质量比为1∶1的半乳糖改性明胶(II)和聚β-氨基酯(III)溶于1ml蒸馏水，加入4.5mg盐酸阿霉素，搅拌均匀。用饱和Na2CO3溶液调节pH至9，得到水相。
所得载药微球为球形，分散性好，平均粒径为7.0μm；载药量为6.61％，包封率为66.08％。该载DOX/galG-PBAE微球在降低pH或增大还原剂二硫苏糖醇(DTT)的浓度时均能加快药物的释放，同时降低pH和增大DTT的浓度时释放速度加快且释药量显著增加(见图1)；对人肝癌细胞HepG2的粘附能力强，而对人子宫瘤细胞Hela细胞的粘附能力弱(见图2)，说明制备的载DOX/galG-PBAE微球能够通过表面的半乳糖基特异性识别ASGR而具有主动肝靶向功能。
实施例2
按实施例1的方法制备半乳糖改性明胶。
按实施例1的方法以69.6mg N，N’-二甲基丁二胺代替N，N’-二甲基乙二胺，制备两端为仲胺基重复单元中含有二硫键的线性聚(β-氨基酯)。
空载微球的制备：
将45mg质量比为2∶1的半乳糖改性明胶和聚β-氨基酯溶于1ml蒸馏水。用饱和Na2CO3溶液调节pH至9，得到水相。
将0.25ml span 80加入到50ml液体石蜡中，在85℃和转速550rpm搅拌30min，得到油相。
在550rpm的搅拌速度下，将水相逐滴加入到油相中。继续搅拌20min后，冷却至-5℃，加入0.1g 25％的戊二醛，于-5℃下避光反应2h。然后加入15ml乙醇，继续搅拌30min，过滤，固形物经乙醇、石油醚洗涤3～4次后得到空载微球。
所得空载微球为球形，分散性好，平均粒径为26.1μm，对HepG2和Hela两类细胞间的粘附有高选择性，能够通过表面的半乳糖基特异性识别ASGR而具有主动肝靶向功能。
载药微球的制备：
除水相配制时加入9mg盐酸阿霉素外，其余按本实施例中空载微球的制备方法。
所得载药微球为球形，分散性好，平均粒径为27.4μm；载药量为10.38％，包封率为63.78％。该载药微球在pH 5.5和10mM DTT的环境中释药，24h累积释放药量78.36％；对HepG2和Hela两类细胞间的粘附有高选择性，能够通过表面的半乳糖基特异性识别ASGR而具有主动肝靶向功能。
实施例3
按实施例1的方法制备半乳糖改性明胶。
按实施例1的方法以86.4mg N，N’-二甲基己二胺代替N，N’-二甲基乙二胺，制备两端为仲胺基重复单元中含有二硫键的线性聚(β-氨基酯)。
空载微球的制备：
将50mg质量比为1∶2的半乳糖改性明胶和聚β-氨基酯溶于2ml蒸馏水。用饱和Na2CO3溶液调节pH至9，得到水相。
将0.5ml span 80加入到10ml液体石蜡中，在25℃和转速50rpm搅拌30min，得到油相。
在50rpm的搅拌速度下，将水相逐滴缓慢加入到油相中。继续搅拌20min后，冷却至5℃，加入62.5mg40％的乙二醛，于5℃下避光反应2h。然后加入15ml甲醇，继续搅拌30min，过滤，固形物经甲醇、石油醚洗涤3～4次后得到空载微球。
所得空载微球为球形，分散性好，平均粒径为56.0μm，对HepG2和Hela两类细胞间的粘附有高选择性，能够通过表面的半乳糖基特异性识别ASGR而具有主动肝靶向功能。
载药微球的制备：
除水相配制时加入1mg盐酸阿霉素外，其余按本实施例中空载微球的制备方法。
所得载药微球为球形，分散性好，平均粒径为54.5μm；载药量为1.46％，包封率为61.78％。该载药微球在pH 5.5和10mM DTT的环境中释药，24h累积释放药量75.62％；对HepG2和Hela两类细胞间的粘附有高选择性，能够通过表面的半乳糖基特异性识别ASGR而具有主动肝靶向功能。
实施例4
按实施例1的方法制备半乳糖改性明胶。
按实施例1的方法以81.6mg N，N’-二甲基对苯二胺代替N，N’-二甲基乙二胺，制备两端为仲胺基重复单元中含有二硫键的线性聚(β-氨基酯)。
空载微球的制备：
将100mg质量比为1∶1的半乳糖改性明胶和聚β-氨基酯溶于0.5ml蒸馏水。用饱和Na2CO3溶液调节pH至9，得到水相。
将1ml tween 80加入到25ml液体石蜡中，于50℃和转速1500rpm搅拌30min，得到油相。
在1500rpm的搅拌速度下，将水相逐滴加入到油相中。继续搅拌20min后，冷却至10℃，加入0.1g对苯二甲醛，于10℃下避光反应2h。然后加入30ml丙酮，继续搅拌30min，过滤，滤渣经丙酮、石油醚洗涤3～4次后得到空载微球。
所得空载微球为球形，分散性好，平均粒径为19.5μm，对HepG2和Hela两类细胞间的粘附有高选择性，能够通过表面的半乳糖基特异性识别ASGR而具有主动肿靶向功能。
载药微球的制备：
除水相配制时加入10mg盐酸阿霉素外，其余按本实施例中空载微球的制备方法。
所得载药微球为球形，分散性好，平均粒径为18.2μm；载药量为6.18％，包封率为65.12％。该载药微球在pH 5.5和10mM DTT的环境中释药，24h累积释放药量80.12％；对HepG2和Hela两类细胞间的粘附有高选择性，能够通过表面的半乳糖基特异性识别ASGR而具有主动肝靶向功能。
Claims (10)
1.一种具有肝主动靶向功能并且具有pH和还原刺激响应性的微球，其特征在于：具有如式(I)的结构的半乳糖改性明胶-聚(β-氨基酯)的组成成分，是由单体半乳糖改性明胶、单体端基为仲胺基含有二硫键的线性聚(β-氨基酯)与交联剂反应所形成的微球；
所述的单体半乳糖改性明胶，具有式(II)的结构，由半乳糖(gal)对明胶(gel)通过改性反应得到；
所述的单体端基为仲胺基含有二硫键的线性聚(β-氨基酯)，具有式(III)的结构，n为聚合度，由式(IV)所示的双(烯丙酰氧乙基)二硫醚与式(V)所示的N，N’-二甲基烃二胺反应得到；式(V)中，R1为-(CH2)2-、-(CH2)3-、-(CH2)4-、-(CH2)5-、-(CH2)6-、
所述的交联剂为二醛，具有式(VI)的结构，式(VI)中，R2为没有原子、-CH2-、-(CH2)2-、-(CH2)3-、-(CH2)4-、
2.一种具有肝主动靶向功能并且具有pH和还原刺激响应性的载药微球，其特征在于：具有抗肿瘤药和半乳糖改性明胶-聚(β-氨基酯)的组成成分，是将抗肿瘤药分散在单体半乳糖改性明胶和单体端基为仲胺基含有二硫键的线性聚(β-氨基酯)中，加入交联剂后，两种单体发生交联反应所形成的载药微球；
所述的抗肿瘤药为盐酸阿霉素或其他抗肿瘤药；
所述的单体半乳糖改性明胶，具有式(II)的结构，由半乳糖(gal)对明胶(gel)通过改性反应得到；
所述的单体端基为仲胺基含有二硫键的线性聚(β-氨基酯)，具有式(III)的结构，n为聚合度，由式(IV)所示的双(烯丙酰氧乙基)二硫醚与式(V)所示的N，N’-二甲基烃二胺反应得到；式(V)中，R1为-(CH2)2-、-(CH2)3-、-(CH2)4-、-(CH2)5-、-(CH2)6-、
所述的交联剂为二醛，具有式(VI)的结构，式(VI)中，R2为没有原子、-CH2-、-(CH2)2-、-(CH2)3-、-(CH2)4-、
3.一种如权利要求1所述微球的制备方法，其特征在于：以半乳糖改性明胶和端基为仲胺基含有二硫键的线性聚(β-氨基酯)为单体，以二醛为交联剂，经乳化交联法制备，制备的具体步骤如下：
(1)将单体半乳糖改性明胶和单体端基为仲胺基含有二硫键的线性聚(β-氨基酯)按比例加入水中，搅拌分散均匀后，制得水相；
单体半乳糖改性明胶和单体端基为仲胺基含有二硫键的线性聚(β-氨基酯)的质量比为(1～2)∶(1～2)，单体半乳糖改性明胶和单体端基为仲胺基含有二硫键的线性聚(β-氨基酯)分散在水中的总体积浓度为25～200mg/ml；
(2)将乳化剂按比例分散在液体石蜡中，制得油相；
所用乳化剂为span 80或tween 80，乳化剂在液体石蜡中的体积浓度为0.5％～5％；
(3)在温度为25～85℃和搅拌速度为50～1500rpm的条件下，将水相滴加至油相；
所用油相体积是水相体积的5～50倍；
(4)在温度为-5℃～10℃和搅拌速度为50～1500rpm的条件下，加入交联剂进行交联反应；
所用交联剂用量为半乳糖改性明胶和端基为仲胺基含有二硫键的线性聚(β-氨基酯)两者总质量的0.5～5倍；
(5)收集固形物，用异丙醇、正丙醇、乙醇、甲醇或丙酮洗涤后，再用石油醚洗涤，真空干燥，得到微球。
4.根据权利要求3所述微球的制备方法，其特征在于：所用单体半乳糖改性明胶(II)的制备方法是，由β-D-半乳糖(IIa)经O-乙酰化保护和溴代反应合成1-溴代-2，3，4，6-四乙酰氧基-β-D-半乳糖(IIb)，与硫脲缩合后得到2，3，4，6-四乙酰氧基-1-硫代-β-D-半乳糖基-2’-异硫脲氢溴酸盐(IIc)，在缚酸剂存在下与氯乙腈反应得到2，3，4，6-四乙酰氧基-1-腈甲基硫代-β-D-半乳糖(IId)，在甲醇钠存在下与甲醇缩合得到2-亚氨基-2-甲氧乙基-1-硫代-β-D-半乳糖(IIe)，后者与明胶缩合得到单体半乳糖改性明胶，具体反应步骤为：
5.根据权利要求3所述微球的制备方法，其特征在于：所用单体端基为仲胺基含有二硫键的线性聚(β-氨基酯)(III)的制备方法是，由双(2-羟乙基)二硫醚(IIIa)在三乙胺存在下与丙烯酰氯(IIIb)反应得到双(烯丙酰氧乙基)二硫醚(IIIc)，后者与N，N’-二甲基烃二胺经迈克尔加成聚合反应得到单体端基为仲胺基含有二硫键的线性聚(β-氨基酯)，具体反应步骤为：
6.一种如权利要求2所述载药微球的制备方法，其特征在于：以半乳糖改性明胶和端基为仲胺基含有二硫键的线性聚(β-氨基酯)为单体，以二醛为交联剂，以抗肿瘤药盐酸阿霉素为模型药物，经乳化交联法制备，制备的具体步骤如下：
(1)将单体半乳糖改性明胶和单体端基为仲胺基含有二硫键的线性聚(β-氨基酯)按比例加入水中，搅拌分散后，按比例加入抗肿瘤模型药物盐酸阿霉素，搅拌均匀，制得水相；
单体半乳糖改性明胶和单体端基为仲胺基含有二硫键的线性聚(β-氨基酯)的质量比为(1～2)∶(1～2)，单体半乳糖改性明胶和单体端基为仲胺基含有二硫键的线性聚(β-氨基酯)两者的总质量为抗肿瘤模型药物盐酸阿霉素质量的5～50倍，单体半乳糖改性明胶和单体端基为仲胺基含有二硫键的线性聚(β-氨基酯)分散在水中的总体积浓度为25～200mg/ml；
(2)将乳化剂按比例分散在液体石蜡中，制得油相；
所用乳化剂为span 80或tween 80，乳化剂在液体石蜡中的体积浓度为0.5％～5％；
(3)在温度为25～85℃和搅拌速度为50～1500rpm的条件下，将水相滴加至油相；
所用油相体积是水相体积的5～50倍；
(4)在温度为-5℃～10℃和搅拌速度为50～1500rpm的条件下，加入交联剂进行交联反应；
所用交联剂用量为半乳糖改性明胶和端基为仲胺基含有二硫键的线性聚(β-氨基酯)两者总质量的0.5～5倍；
(5)收集固形物，用异丙醇、正丙醇、乙醇、甲醇或丙酮洗涤后，再用石油醚洗涤，真空干燥，得到载药微球。
7.根据权利要求6所述载药微球的制备方法，其特征在于：所用单体半乳糖改性明胶(II)的制备方法是，由β-D-半乳糖(IIa)经O-乙酰化保护和溴代反应合成1-溴代-2，3，4，6-四乙酰氧基-β-D-半乳糖(IIb)，与硫脲缩合后得到2，3，4，6-四乙酰氧基-1-硫代-β-D-半乳糖基-2’-异硫脲氢溴酸盐(IIc)，在缚酸剂存在下与氯乙腈反应得到2，3，4，6-四乙酰氧基-1-腈甲基硫代-β-D-半乳糖(IId)，在甲醇钠存在下与甲醇缩合得到2-亚氨基-2-甲氧乙基-1-硫代-β-D-半乳糖(IIe)，后者与明胶缩合得到单体半乳糖改性明胶，具体反应步骤为：
8.根据权利要求6所述载药微球的制备方法，其特征在于：所用单体端基为仲胺基含有二硫键的线性聚(β-氨基酯)(III)的制备方法是，由双(2-羟乙基)二硫醚(IIIa)在三乙胺存在下与丙烯酰氯(IIIb)反应得到双(烯丙酰氧乙基)二硫醚(IIIc)，后者与N，N’-二甲基烃二胺经迈克尔加成聚合反应得到单体端基为仲胺基含有二硫键的线性聚(β-氨基酯)，具体反应步骤为：
9.权利要求1所述的微球在制备pH和还原双刺激响应性以及肝靶向性的抗肿瘤药物载体的应用。
10.权利要求2所述的载药微球在制备治疗肝癌药物的应用。
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