CN105613707A - 枯草芽孢杆菌生物保鲜剂及在大黄鱼保鲜中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明利用枯草芽孢杆菌作为生物保鲜剂在大黄鱼保鲜中应用，所述枯草芽孢杆菌的枯草芽孢杆菌BSh0851。本发明还提供了大黄鱼防腐保鲜方法，用碎冰将鲜活大黄鱼失活，将枯草芽孢杆菌粗提物和尼萨普林、壳聚糖溶液混合喷洒在鱼体，于4℃冰箱内冰上贮藏。本发明方法工艺简单、安全，防腐保鲜效果显著，有效延长了水产品货架期，且更好的保持了水产品的原有鲜度、风味及质感。
Description
技术领域
本发明属于水产品防腐保鲜技术，具体涉及枯草芽孢杆菌作为生物保鲜剂在大黄鱼防腐保鲜中的应用以及保鲜防腐的方法。
背景技术
水产品是人们食品的重要组成部分，冰鲜保藏是水产在市场流通的主要方式之一。由于水产品含有丰富的蛋白质等营养物质，容易引起腐败细菌快速生长繁殖，腐败物质大量积累，因而极易变质，影响到水产品的质量，甚至威胁人的身体健康。因此，水产品的保鲜方法成为目前的研究热点。目前，应用于水产品的保鲜技术主要有低温保鲜、化学保鲜、气体保鲜、辐射保鲜和生物保鲜等。生物保鲜以其安全性高、能耗低的优势成为开发新热点。植物源保鲜剂主要起抗氧化作用；动物源抑菌剂如鱼精蛋白；水产品中常用的微生物源抑菌剂主要有乳酸菌产生的乳酸菌素、纳它霉素等。动/植物来源的保鲜剂受原料限制，价格较高；而目前产业化的微生物源保鲜剂均为微生物代谢物，日益受到重视。
枯草芽孢杆菌菌株具有抑制病原菌和微藻的活性，被允许使用在果蔬、鱼饲料中。
发明内容
本发明的目的在于提供一种枯草芽孢杆菌作为生物保鲜剂在水产品保鲜防腐中的应用，为水产品特别是冰鲜大黄鱼的保鲜提供新的途径。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本应用中所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌（Bacillussubtulis）BSh0851，保藏日期为2009年12月13日，保藏单位是中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCCNo.3502。
所述枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）为革兰氏阳性菌，芽孢椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大，菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，常形成皱醭；需氧菌，可利用蛋白质、多种糖及淀粉，V-P阳性。
采用优化培养后的培养条件，通过液体发酵制得含有高活性物质的发酵液，并采用酸沉淀的方法得到脂肽类活性物质粗提物。粗提物产量为0.45g/L，对105cfu/mL嗜冷杆菌、105cfu/mL假单胞菌和105cfu/mL希瓦氏菌3菌混合液的抑菌率为33%。
将0.3mg/mL粗提物与0.3mg/mL尼萨普林和20mg/mL壳聚糖盐酸盐配伍，制成混合保鲜剂。使用本发明的保鲜剂对大黄鱼进行保鲜，储藏5天后，挥发性盐基氮（TVB-N）和微生物以及感官指标均符合我国鲜大黄鱼等相关卫生标准（SC/T3101-2010）中一级鲜度，防腐保鲜效果显著，延长了大黄鱼的货架期。结果表明枯草芽孢杆菌发酵液粗提物能够有效地抑制大黄鱼表面细菌的生长，同时对大黄鱼鱼肉的脂肪酸氧化和新鲜度也有一定的改善效果。
大黄鱼保鲜方法是用碎冰将鲜活大黄鱼失活，将枯草芽孢杆菌粗提物、尼萨普林、壳聚糖盐酸盐溶液混合喷洒在鱼体，于4℃冰箱内冰上贮藏。
具体包括以下步骤：（1）种子液制备：从营养琼脂斜面培养基上挑取一接种环已活化的枯草芽孢杆菌接种到种子培养基中，37℃，200r/min，培养24h；种子培养基为牛肉膏3g、氯化钠5g、蛋白胨10g、蒸馏水1000mL、pH7.0-7.2；
（2）发酵液培养基制备：酵母浸膏14g，无水葡萄糖14g，MgSO41g，蒸馏水1000mL，pH7.0；
（3）枯草芽孢杆菌无菌体发酵液的制备：在步骤（2）制得的发酵液中接入步骤（1）制得的种子液，接种量为7%；调节初始pH值8；培养温度38℃，转速100r·min-1，装液量150mL/250mL摇瓶；在此条件下培养24h；
（4）无菌发酵液的制备：将步骤（3）所述枯草芽孢杆菌培养液在10000r/min离心15min后，用0.22μm滤膜过滤，即为无菌体的发酵滤液；
（5）发酵液粗提物制备：将步骤（4）所述无菌发酵液用2mol/L的HCl调至pH2.0，于4℃放置3d，再次10000r/min离心10min，收集沉淀物，溶解于无菌水中，并用NaCl调节pH至7；
（6）步骤（5）所得发酵液经酸沉得到抑菌活性物质即抑菌脂肽类物质的产量为0.45g/L，对105cfu/mL嗜冷杆菌、105cfu/mL假单胞菌和105cfu/mL希瓦氏菌3菌混合液的抑菌率为33%；
（7）将步骤（5）的粗提物稀释为活性物质量为0.3mg/mL，与0.3mg/mL尼萨普林和20mg/mL壳聚糖盐酸盐制成混合保鲜剂；
（8）于在冰鲜大黄鱼全表面，每隔12h喷洒步骤（7）制得的混合保鲜剂，每尾大黄鱼每次喷洒的用量约为5mL。
本发明的有益效果如下：1、枯草芽孢杆菌作为一种饲料用益生菌，其代谢产物添加对人体安全无害。2、该枯草芽孢杆菌粗提物的抑菌谱较广，能够有效的抑制革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的生长，且在4℃条件下保藏具有显著的作用，从而对大黄鱼的防腐保鲜起到很好的效果。3、该枯草芽孢杆菌来源复合保鲜剂在对大黄鱼等水产品保鲜的过程中能够有效保持水产品的新鲜度、感官性状等。
具体实施方式
本发明以挥发性盐基氮（TVB-N），硫代巴比妥酸（TBA），菌落总数等指标评价枯草芽孢杆菌来源复合保鲜剂对养殖冰鲜大黄鱼保鲜效果。
参考水产品中挥发性盐基氮的测定标准（SC/T3032-2007）规定的测定挥发性盐基氮的方法。称10g（精确到0.01g）于均质杯中，再加入90mL高氯酸溶液，均质2min，用滤纸过滤或离心分离，滤液于2℃-6℃的环境条件下贮存，可保存2d。将10mL2%的硼酸倒入50mL锥形瓶，加1-2滴混合指示剂，将硼酸置于冷凝管下端，并使冷凝管下端浸入液面，精确吸取上述样品滤液2mL于蒸馏器反应内，加1%氧化镁混悬液5mL，迅速盖塞、加水，通入蒸汽。待蒸汽充满蒸馏器内部，由冷凝管出现第一滴冷凝水开始计算，蒸馏5min即停止，吸收液用约0.01mol/L盐酸标准溶液滴定。终点呈红色，同时作试剂空白试验。TVB-N值单位为mgN/100g。挥发性盐基氮（TVBN）是判断鱼类鲜度的主要化学指标之一，鱼一级鲜度的TVBN值在5-10mg/100g，一般鲜度的鱼TVBN值在15-25mg/100g，当TVBN值达到30-40mg/100g则鱼已腐败。
菌落总数测定方法:参照食品安全国家标准-食品微生物学检验中的菌落总数测定操作（GB4789.2-2010）。国家标准GBT18108-2008对鲜海水鱼细菌菌落数做出规定：鱼肉中细菌总数≤104cfu/g为一级鲜度（A级）标准,≤105cfu/g标准为腐败终点（C级）标准。
将新鲜大黄鱼分4组，分别采用壳聚糖盐酸盐、枯草芽孢杆菌粗提物-壳聚糖盐酸盐和枯草芽孢杆菌粗提物-尼萨普林-壳聚糖盐酸盐复合保鲜剂进行保鲜；并作1组对照，为了保证实验影响因素的一致性，对照组喷洒无菌水。
（1）种子液制备：从营养琼脂斜面培养基上挑取一接种环已活化的枯草芽孢杆菌接种到种子培养基中，37℃，200r/min，培养24h；种子培养基为牛肉膏3g、氯化钠5g、蛋白胨10g、蒸馏水1000mL、pH7.0-7.2；
（2）发酵液培养基制备：酵母浸膏14g，无水葡萄糖14g，MgSO41g，蒸馏水1000mL，pH7.0；
（3）枯草芽孢杆菌无菌体发酵液的制备：在步骤（2）制得的发酵液中接入步骤（1）制得的种子液，接种量为7%；调节初始pH值8；培养温度38℃，转速100r·min-1，装液量150mL/250mL摇瓶；在此条件下培养24h；
（4）无菌发酵液的制备：将步骤（3）所述枯草芽孢杆菌培养液在10000r/min离心15min后，用0.22μm滤膜过滤，即为无菌体的发酵滤液；
（5）发酵液粗提物制备：将步骤（4）所述无菌发酵液用2mol/L的HCl调至pH2.0，于4℃放置3d，再次10000r/min离心10min，收集沉淀物，溶解于无菌水中，并用NaCl调节pH至7，获得枯草芽孢杆菌粗提物；
将枯草芽孢杆菌粗提物稀释为活性物质量为0.3mg/mL，与0.3mg/mL尼萨普林和20mg/mL壳聚糖盐酸盐制成混合保鲜剂。
实施例1
采用枯草芽孢杆菌粗提物-尼萨普林-壳聚糖盐酸盐复合保鲜剂进行保鲜。将冰鲜大黄鱼正反面均匀喷洒大约10mL的保鲜剂。
贮藏：将大黄鱼在4℃冰上贮藏。贮藏5天（d）后，菌落总数超过105cfu/g，6天（d）后挥发性盐基氮（TVB-N）含量超过25mg/100g，货架期结束。
实施例2
采用枯草芽孢杆菌粗提物-壳聚糖盐酸盐复合保鲜剂进行保鲜。将冰鲜大黄鱼正反面均匀喷洒大约10mL的保鲜剂。
贮藏：将大黄鱼在4℃冰上贮藏。贮藏3.5天（d）后，菌落总数超过105cfu/g，4天（d）后挥发性盐基氮（TVB-N）含量超过25mg/100g，货架期结束。
实施例3
采用壳聚糖盐酸盐复合保鲜剂进行保鲜。将冰鲜大黄鱼正反面均匀喷洒大约10mL的保鲜剂。
贮藏：将大黄鱼在4℃冰上贮藏。贮藏2.5天（d）后，菌落总数超过105cfu/g，3天（d）后挥发性盐基氮（TVB-N）含量超过25mg/100g，货架期结束。
实施例4（比实施例）将冰鲜大黄鱼正反面均匀喷洒大约10mL的无菌水。贮藏：将大黄鱼在4℃冰上贮藏。贮藏2天（d）后，菌落总数超过105cfu/g，且挥发性盐基氮（TVB-N）含量超过25mg/100g，货架期结束。
实施例5
枯草芽孢杆菌的分离和鉴定
（1）该菌株分离自蜜蜂体内。从蜂箱中随机取意大利蜜蜂工蜂成虫30只，放在无菌的离心管中。在无菌操作下，加入70%的酒精浸泡5s，取出虫体置于0.1%升汞液中消毒2min，移至灭菌水中换洗3次，然后把虫体置于无菌的离心管中，加入5mL的无菌水，震荡，取50μL涂布于培养基上，检查体表灭菌是否完全。消毒后的蜂体放在消毒的蜡盘中于超净工作台上解剖。取出其肠道在无菌的研钵中加入1mL无菌水研磨，将研磨液用无菌水稀释成10-1-10-6，各稀释度取50μL用平板涂布法进行分离，各稀释度重复3次，在30℃的恒温培养箱中培养72h后，标记表征不同的菌落以便纯化培养，并按可数性原则对每个平板上不同的菌落进行计数。挑取表征不同的单菌落细菌划线纯化、获得纯培养、斜面保种。选取菌落生长稀疏、适当稀释度计算菌落数，求出3个重复的平均值。计算出每克(毫升)肠道中的细菌数。每克（mL）肠道中的细菌数(菌落形成单位)=平板上菌落数×稀释倍数／平板上加菌液的量（mL）。
（2）蜜蜂肠道细菌的鉴定
参照《常见细菌系统鉴定手册》（东秀珠；蔡妙英，2001）和《伯杰氏细菌鉴定手册》（1984）第八版实验方法，进行革兰氏染色，鞭毛染色，芽孢染色，葡萄糖氧化发酵，接触酶，吲哚，V-P，M.R，明胶液化，产H2S，苯丙氨酸，脱氨酶，柠檬酸盐、丙二酸盐、蔗糖、乳糖和甘露糖利用，硝酸盐还原等实验进行各科的分属，并对各属鉴定特征进行描述。
鉴定得到分离纯化的目的菌株为枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）。革兰氏阳性菌，芽孢椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大，菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，常形成皱醭；需氧菌，可利用蛋白质、多种糖及淀粉，V-P阳性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (6)
1.一种枯草芽孢杆菌，其特征在于：所述的菌株为枯草芽孢杆菌BSh0851，保藏日期为2009年12月13日，保藏单位是中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.3502。
2.一种如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在制备生物保鲜剂中的应用。
3.根据权利要求2所述的枯草芽孢杆菌生物保鲜剂，其特征在于：所述保鲜剂为枯草芽孢杆菌粗提物稀释为活性物质量为0.3mg/mL，与0.3mg/mL尼萨普林和20mg/mL壳聚糖盐酸盐制成混合保鲜剂。
4.根据权利要求2所述的枯草芽孢杆菌生物保鲜剂，其特征在于：枯草芽孢杆菌粗提物的制备方法为：
（1）种子液制备：从营养琼脂斜面培养基上挑取一接种环已活化的枯草芽孢杆菌接种到种子培养基中，37℃，200r/min，培养24h；种子培养基为牛肉膏3g、氯化钠5g、蛋白胨10g、蒸馏水1000mL、pH7.0-7.2；
（2）发酵液培养基制备：酵母浸膏14g，无水葡萄糖14g，MgSO41g，蒸馏水1000mL，pH7.0；
（3）枯草芽孢杆菌无菌体发酵液的制备：在步骤（2）制得的发酵液中接入步骤（1）制得的种子液，接种量为7%；调节初始pH值8；培养温度38℃，转速100r·min-1，装液量150mL/250mL摇瓶；在此条件下培养24h；
（4）无菌发酵液的制备：将步骤（3）所述枯草芽孢杆菌培养液在10000r/min离心15min后，用0.22μm滤膜过滤，即为无菌体的发酵滤液；
（5）发酵液粗提物制备：将步骤（4）所述无菌发酵液用2mol/L的HCl调至pH2.0，于4℃放置3d，再次10000r/min离心10min，收集沉淀物，溶解于无菌水中，并用NaCl调节pH至7。
5.如权利要求2所述的枯草芽孢杆菌生物保鲜剂在大黄鱼防腐保鲜中的应用。
6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：大黄鱼保鲜方法是用碎冰将鲜活大黄鱼失活，将枯草芽孢杆菌粗提物、尼萨普林、壳聚糖盐酸盐溶液混合喷洒在鱼体，每隔12h喷洒所述生物保鲜剂，每尾大黄鱼每次喷洒的用量为5-10mL；于4℃冰箱内冰上贮藏。
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