[go: up one dir, main page]

CN105543372B - 一种检测染色体罗氏易位的方法 - Google Patents

一种检测染色体罗氏易位的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105543372B
CN105543372B CN201610034367.4A CN201610034367A CN105543372B CN 105543372 B CN105543372 B CN 105543372B CN 201610034367 A CN201610034367 A CN 201610034367A CN 105543372 B CN105543372 B CN 105543372B
Authority
CN
China
Prior art keywords
chr22
chr21
chr15
chr14
chr13
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201610034367.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105543372A (zh
Inventor
冯涛
费嘉
杨凯
刘小军
徐艳文
周灿权
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Zhongyi Kangwei Medical Devices Co ltd
First Affiliated Hospital of Sun Yat Sen University
Original Assignee
Beijing Zhongyi Kangwei Medical Devices Co ltd
First Affiliated Hospital of Sun Yat Sen University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Zhongyi Kangwei Medical Devices Co ltd, First Affiliated Hospital of Sun Yat Sen University filed Critical Beijing Zhongyi Kangwei Medical Devices Co ltd
Priority to CN201610034367.4A priority Critical patent/CN105543372B/zh
Publication of CN105543372A publication Critical patent/CN105543372A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105543372B publication Critical patent/CN105543372B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了一种检测染色体罗氏易位的方法，以及该方法中使用的SNP位点及引物组合物。本发明的方法实用、简便、通用性强，并且结合了高通量测序技术，有着成本低、灵敏度高、特异性强、准确性高的优点。

Description

一种检测染色体罗氏易位的方法
技术领域
本发明涉及分子诊断学领域，具体涉及一种检测染色体罗氏易位的方法，其能够针对父母是罗氏易位携带者的家系，检测正常及易位携带者胚胎和胎儿。
背景技术
罗氏易位(Robertsonian translocation，ROB)，以第一次发现该种易位方式的美国生物学家William Rees Brebner Robertson命名，是主要发生于5条近端着丝粒染色体(13、14、15、21和22号染色体)的一种染色体易位(Robertson WRB.Chromosomestudies.I.Taxonomic relationships shown in the chromosomes of Tettigidae andAcrididae.V-shaped chromosomes and their significance in Acrididae,Locustidaeand Gryllidae:chromosome and variation.J Morph 1916,27:179-331)。当两个近端着丝粒染色体在着丝粒部位或在着丝粒附近部位发生断裂后，二者的长臂在着丝粒处接合在一起，形成一条由长臂构成的衍生染色体，也称丝端融合，是染色体平衡易位的一种。两个短臂则构成一个小染色体，小染色体往往在第二次分裂时丢失。罗氏易位是一种常见的染色体结构异常，在新生儿中的发生率为1.23/1000(Nielsen J,Wohlert M.Chromosomeabnormalities found among 34910newborn children:results from 13-yearincidence study in Arhus,Denmark.Hum Genet.1991,87:81–83)。由于染色体短臂主要包括随机重复DNA和核糖体RNA基因，而这种基因在五条染色体中都存在，所以罗氏易位虽然有染色体短臂的丢失，却不会造成致病表型。虽然表型正常，然而携带者生殖细胞在第一次减数分裂过程中，易位染色体和相应两个正常染色体配对会形成三价染色体，这种结构会导致交替、邻式和不常见的3:0三种分裂方式，只有交替可以产生正常或者平衡的配子，其他两种方式产生非平衡的配子，这种占大部分的非平衡配子也是易位携带者出现妊娠困难或者妊娠过程中反复流产的原因，甚至导致染色体拷贝数异常的13-Patau综合征等先天缺陷患儿的出生。目前越来越多的罗氏易位携带者寻求试管婴儿技术进行胚胎植入前诊断。
试管婴儿技术是将卵子与精子取出后置于特定的培养液内培养、受精，受精卵在恒温孵箱中发育为胚胎后移植回母体子宫，最终发育成胎儿。挑选健康胚胎移植是成功预防的关键。胚胎植入前遗传学筛查是指胚胎植入着床之前进行染色体数目和结构异常的检测，挑选染色体正常的胚胎植入子宫，以期获得正常的后代。目前罗氏易位的胚胎移植前诊断的方法包括SNP芯片和荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization，FISH)。SNP芯片是目前最常用的检测技术，但是这项技术只能检测胚胎染色体拷贝数的变化，不能区分罗氏易位中正常与携带易位的胚胎。FISH利用荧光标记的特异核酸探针与细胞内相应的靶DNA分子杂交，通过在荧光显微镜下观察荧光信号，来确定结合了荧光探针的DNA分子在染色体中的定位。但FISH作为检查单个细胞核的方法是存在一定缺陷的，有7％的假阴性(Colls P,Escudero T,Cekleniak N,Sadowy S,Cohen J,MunnéS.I ncreasedefficiency of preimplantation genetic diagnosis for infertility using"noresult rescue".Fertil Steril.2007,88(1):53-61)。
自然流产是妇产科的一种常见病，其发生率约占全部妊娠的10％～15％，其发生受很多因素的影响，如胚胎因素、胎盘因素、母体因素及环境因素等，其中胚胎染色体异常是导致流产发生的主要原因。对流产组织进行染色体检测分析胚胎停育、流产的原因，不仅为临床咨询提供理论依据，同时为孕妇再次妊娠提供指导。目前，利用FISH技术对稽留流产绒毛及胎儿不同部位组织进行最常见的染色体异常检测。FISH技术作为一种靶向性检测技术，商品化的探针有限，其在很大程度上是受到探针的类型、数量及成本较高等限制，在同一时间内也无法对大量的异常基因或染色体进行检测。此外由于FISH技术的局限性，FISH不能检测染色体结构异常，可能会导致一部分染色体结构异常的患者被漏诊(李阳洋，章勤.自然流产绒毛染色体核型分析的研究现状.实用妇产科杂志，2012，28：431-433)。
综上所述，急需开发一种能够检测试管婴儿技术中胚胎和流产组织罗氏易位的新方法。
发明内容
本发明设计了一种基于高通量测序技术检测染色体罗氏易位的方法，以筛查完全正常及易位携带者的胚胎、胎儿或流产组织。
本发明的第一方面提供了一种检测染色体罗氏易位的方法，包括以下步骤：
(1)获取亲代双方和子代的DNA样本；
(2)从染色体近端着丝粒附近区域筛选高频突变SNP位点作为标记；
(3)检测子代DNA样本的染色体拷贝数；
(4)针对步骤(2)筛选的SNP位点，确定亲代双方和子代目标位点的基因型；
(5)基于亲代双方和子代的基因型及家系关系，分析亲代双方和子代的单体型；
(6)根据子代的染色体拷贝数检测结果、亲代双方携带染色体罗氏易位的核型、以及亲代双方和子代的单体型，分析子代的染色体罗氏易位情况。
优选地，所述方法用于检测人类染色体，尤其是第13、14、15、21和22号染色体中任意两条染色体之间发生的易位。
在一个特定的实施方案中，亲代DNA样本是从外周血样本中提取的父母基因组DNA；子代DNA样本选自胚胎或胎儿的滋养层细胞全基因组扩增产物，或流产组织提取的基因组DNA，优选体外培养的胚胎的囊胚期滋养层细胞全基因组扩增产物。
上述步骤(2)中SNP位点的筛选标准为：
a.位点位于着丝粒附近10Mb区域内；
b.千人基因组数据库或者dbSNP数据库中收录，优先选择目标人群中最小等位基因频率(MAF)大于0.2的SNP；
c.SNP位点附近序列在人类基因组中不具有同源性。
在一个特定的实施方案中，所述SNP位点包括来自发生易位的每条染色体的至少1个SNP位点，优选至少10个SNP位点，更优选至少50个SNP位点SNP位点。
优选地，所述SNP位点选自以下SNP位点或其任意组合：chr13:19602195，chr13:19625370，chr13:19646283，chr13:19692745，chr13:19713634，chr13:19722801，chr13:19732341，chr13:19784913，chr13:19843135，chr13:19877547，chr13:19883672，chr13:19896927，chr13:19917509，chr13:20494558，chr13:20709214，chr13:20747500，chr13:20784332，chr13:20825315，chr13:20864572，chr13:20881859，chr13:20908501，chr13:20938952，chr13:20951425，chr13:20992333，chr13:21012562，chr13:21066214，chr13:21092894，chr13:21112935，chr13:21527671，chr13:21553971，chr13:21575458，chr13:21607760，chr13:21636136，chr13:21655335，chr13:21683681，chr13:21801501，chr13:22197910，chr13:22249975，chr13:22270788，chr13:22340074，chr13:22396664，chr13:22417688，chr13:22473749，chr13:22504691，chr13:22515844，chr13:22523279，chr13:22538311，chr13:22561684，chr13:22640820，chr13:22751654，chr13:22768476，chr13:22780737，chr13:22799808，chr13:22819627，chr13:22835073，chr13:22892864，chr13:22980146，chr14:19472367，chr14:20326905，chr14:20349694，chr14:20383719，chr14:20420387，chr14:20517369，chr14:20527044，chr14:20565487，chr14:20643775，chr14:20670979，chr14:20731036，chr14:20820537，chr14:20905141，chr14:20918598，chr14:21008574，chr14:21048774，chr14:21091127，chr14:21156472，chr14:21195967，chr14:21237137，chr14:21263166，chr14:21313819，chr14:21325985，chr14:21388266，chr14:21452591，chr14:21519915，chr14:21580671，chr14:21625262，chr14:21789092，chr14:21981923，chr14:22053817，chr14:22090208，chr14:22138437，chr14:22210067，chr14:22244363，chr14:22263821，chr14:22312275，chr14:22324460，chr14:22351977，chr14:22361282，chr14:22375208，chr14:22393124，chr14:22428984，chr14:22452496，chr14:22489611，chr14:22518909，chr14:22526966，chr14:22563283，chr14:22611651，chr14:22626948，chr14:22657897，chr14:22702039，chr14:22731529，chr14:22734948，chr14:22741160，chr14:22772663，chr14:22861948，chr14:22972955，chr15:20022190，chr15:20049922，chr15:20189367，chr15:20191854，chr15:20192138，chr15:20454253，chr15:20470948，chr15:20564500，chr15:20569241，chr15:20586537，chr15:20586966，chr15:20590656，chr15:20616721，chr15:20626721，chr15:20646773，chr15:20848359，chr15:20849625，chr15:20852181，chr15:20862156，chr15:20863958，chr15:21905797，chr15:21928397，chr15:21938184，chr15:21940649，chr15:22013203，chr15:22299435，chr15:22302182，chr15:22376163，chr15:22427155，chr15:22441959，chr15:22476195，chr15:22520388，chr15:22539952，chr15:22780065，chr15:22798800，chr15:22833272，chr15:22854479，chr15:22869870，chr15:22893990，chr15:22905599，chr15:22916637，chr15:22923869，chr15:22940961，chr15:22971662，chr15:23000363，chr15:23010627，chr15:23020535，chr15:23044004，chr15:23053813，chr15:23064687，chr15:23721906，chr15:23730971，chr15:23746510，chr15:23767135，chr15:23781336，chr15:23793989，chr15:23816231，chr15:23893430，chr15:23929209，chr15:24006330，chr15:24055535，chr15:24129894，chr15:24166516，chr15:24196094，chr15:24236177，chr15:24278723，chr15:24319610，chr15:24350583，chr15:24471640，chr15:24824114，chr15:24870875，chr15:24913763，chr15:24943341，chr15:24974072，chr21:14640496，chr21:14643423，chr21:14695894，chr21:14756515，chr21:14818516，chr21:14890028，chr21:15012159，chr21:15026905，chr21:15170049，chr21:15280687，chr21:15300595，chr21:15445542，chr21:15479041，chr21:15501432，chr21:15548748，chr21:15566056，chr21:15588845，chr21:15625530，chr21:15654618，chr21:15681452，chr21:15720558，chr21:15763305，chr21:15842397，chr21:15884516，chr21:15916232，chr21:15942816，chr21:15984234，chr21:16027704，chr21:16063848，chr21:16122140，chr21:16160041，chr21:16193235，chr21:16238898，chr21:16315932，chr21:16353639，chr21:16384555，chr21:16448591，chr21:16578538，chr21:16645724，chr21:16717265，chr21:16833315，chr21:16881542，chr21:17000938，chr21:17054831，chr21:17140290，chr21:17203891，chr21:17295288，chr21:17340912，chr21:17536247，chr21:17640426，chr21:17673255，chr21:17713264，chr21:17748703，chr21:17781159，chr21:17823782，chr21:18003355，chr21:18046650，chr21:18114449，chr21:18151760，chr21:18182817，chr21:18250262，chr21:18337678，chr21:18385770，chr21:18420873，chr21:18457287，chr21:18586049，chr21:18650837，chr21:18740886，chr21:18858018，chr21:18936951，chr21:19002939，chr21:19064396，chr21:19139888，chr21:19254923，chr21:19316600，chr22:16415691，chr22:16554800，chr22:16848067，chr22:16850056，chr22:16850858，chr22:16851557，chr22:16852464，chr22:16852792，chr22:16853453，chr22:16854397，chr22:16855647，chr22:16856500，chr22:16857432，chr22:16858287，chr22:16860547，chr22:16861742，chr22:16867995，chr22:17031697，chr22:17271213，chr22:17293257，chr22:17409957，chr22:17442318，chr22:17469090，chr22:17525677，chr22:17563259，chr22:17587785，chr22:17619511，chr22:17656792，chr22:17682387，chr22:17715164，chr22:17739757，chr22:17761489，chr22:17785311，chr22:17805528，chr22:17841251，chr22:17883346，chr22:17916190，chr22:17939998，chr22:17981144，chr22:18012297，chr22:18054406，chr22:18212058，chr22:18276198，chr22:18354015，chr22:18395978，chr22:18466951，chr22:18531582，chr22:18581715，chr22:18628321，chr22:18894617，chr22:18966077，chr22:19004846，chr22:19025459，chr22:19098323，chr22:19142652，chr22:19236590，chr22:19362714，chr22:19431588，chr22:19536367，chr22:19643965，chr22:19716983，chr22:19759532，chr22:19808057，chr22:19859087，chr22:19909387，chr22:19972494，chr22:20016622，chr22:20051573，chr22:20081918，chr22:20135421，chr22:20175034，chr22:20216874，chr22:20278637，chr22:20745699，chr22:20787955，chr22:20855585，chr22:20881195，chr22:20924097，chr22:20983921，chr22:21028224。最优选地，所述SNP位点包括来自发生易位的每条染色体的上述全部SNP位点。
在一个特定的实施方案中，上述步骤(3)和(4)中检测染色体拷贝数的方法独立地选自测序方法和芯片方法。其中，所述测序方法为高通量测序方法，优选Ion Torrent PGM或Illumina Miseq；所述的芯片方法为人全基因组SNP芯片，优选Illumina全基因组SNP芯片。
优选地，在本发明的检测方法中，亲代双方一方为正常核型，另一方为罗氏易位携带者，子代中包括罗氏易位染色体三体或者单体的个体。
特别地，上述步骤(6)中的判断标准如下：
a.如果某一子代为染色体m三体，则其染色体n中来源于亲代罗氏易位携带者的单体型B为易位染色体单体型，相应地，来源于亲代罗氏易位携带者染色体n的另一种单体型b为正常染色体单体型；进一步地，通过观察其他子代的单体型，与染色体n单体型B连锁的来源于亲代罗氏易位携带者的染色体m单体型A也是易位染色体单体型，相应地，来源于亲代罗氏易位携带者染色体m的另一种单体型a为正常染色体单体型；由此，可以判断携带染色体m单体型A和染色体n单体型B的子代为易位携带者，携带染色体m单体型a和染色体n单体型b的子代为正常核型；
b.如果某一子代为染色体m单体，则其染色体n中来源于亲代罗氏易位携带者的单体型B为正常染色体单体型，相应地，来源于亲代罗氏易位携带者染色体n的另一种单体型b为易位染色体单体型；进一步地，通过观察其他子代的单体型，与染色体n单体型b连锁的来源于亲代罗氏易位携带者的染色体m单体型a也是易位染色体单体型，相应地，来源于亲代罗氏易位携带者染色体m的另一种单体型A为正常染色体单体型；由此，可以判断携带染色体m单体型A和染色体n单体型B的子代为正常核型，携带染色体m单体型a和染色体n单体型b的子代为易位携带者；
其中，染色体m和染色体n为亲代罗氏易位携带者基因组中发生罗氏易位的两条染色体，A和a为来源于亲代罗氏易位携带者染色体m的单体型，B和b为来源于亲代罗氏易位携带者染色体n的单体型。
以13、14号染色体易位为例：
携带者 +13胚胎 +14胚胎 -13胚胎 -14胚胎 易位胚胎 正常胚胎
Chr13 Aa Aa A - a A a
Chr14 Bb B Bb b - B b
根据上表所示，若13号染色体为三倍体或者单倍体，可以推测罗氏易位携带者14号染色体中B型为易位染色体单体型，b型为正常染色体单体型，通过其他携带B型或者b型的胚胎可以进而推测13号染色体中A型为易位染色体单体型，a型为正常染色体单体型；
若14号染色体为三倍体或者单倍体，可以推测罗氏易位携带者13号染色体中A型为易位染色体单体型，a型为正常染色体单体型，通过其他携带A型或者a型的胚胎可以进而推测携带14号染色体B为易位染色体单体型，b为正常染色体单体型。
所以携带13号染色体a型及14号染色体b型为正常胚胎，而携带13号染色体A型及14号染色体B型为易位携带者胚胎。
本发明的上述方法尤其适用于试管婴儿的胚胎植入前诊断。
本发明的第二方面提供了一种用于检测染色体罗氏易位的引物组合物，所述引物组合物能够扩增近端着丝粒染色体的着丝粒附近区域高频突变SNP位点的序列。优选地，所述引物组合物用于检测人类染色体罗氏易位，尤其是第13、14、15、21和22号染色体中任意两条染色体之间发生的易位。
所述SNP位点的筛选标准为：
a.位点位于着丝粒附近10Mb区域内；
b.千人基因组数据库或者dbSNP数据库中收录，优先选择目标人群中最小等位基因频率(MAF)大于0.2的SNP；
c.SNP位点附近序列在人类基因组中不具有同源性。
在一个特定的实施方案中，所述SNP位点包括来自发生易位的每条染色体的至少1个SNP位点，优选至少10个SNP位点，更优选至少50个SNP位点SNP位点。
优选地，所述SNP位点选自以下SNP位点或其任意组合：chr13:19602195，chr13:19625370，chr13:19646283，chr13:19692745，chr13:19713634，chr13:19722801，chr13:19732341，chr13:19784913，chr13:19843135，chr13:19877547，chr13:19883672，chr13:19896927，chr13:19917509，chr13:20494558，chr13:20709214，chr13:20747500，chr13:20784332，chr13:20825315，chr13:20864572，chr13:20881859，chr13:20908501，chr13:20938952，chr13:20951425，chr13:20992333，chr13:21012562，chr13:21066214，chr13:21092894，chr13:21112935，chr13:21527671，chr13:21553971，chr13:21575458，chr13:21607760，chr13:21636136，chr13:21655335，chr13:21683681，chr13:21801501，chr13:22197910，chr13:22249975，chr13:22270788，chr13:22340074，chr13:22396664，chr13:22417688，chr13:22473749，chr13:22504691，chr13:22515844，chr13:22523279，chr13:22538311，chr13:22561684，chr13:22640820，chr13:22751654，chr13:22768476，chr13:22780737，chr13:22799808，chr13:22819627，chr13:22835073，chr13:22892864，chr13:22980146，chr14:19472367，chr14:20326905，chr14:20349694，chr14:20383719，chr14:20420387，chr14:20517369，chr14:20527044，chr14:20565487，chr14:20643775，chr14:20670979，chr14:20731036，chr14:20820537，chr14:20905141，chr14:20918598，chr14:21008574，chr14:21048774，chr14:21091127，chr14:21156472，chr14:21195967，chr14:21237137，chr14:21263166，chr14:21313819，chr14:21325985，chr14:21388266，chr14:21452591，chr14:21519915，chr14:21580671，chr14:21625262，chr14:21789092，chr14:21981923，chr14:22053817，chr14:22090208，chr14:22138437，chr14:22210067，chr14:22244363，chr14:22263821，chr14:22312275，chr14:22324460，chr14:22351977，chr14:22361282，chr14:22375208，chr14:22393124，chr14:22428984，chr14:22452496，chr14:22489611，chr14:22518909，chr14:22526966，chr14:22563283，chr14:22611651，chr14:22626948，chr14:22657897，chr14:22702039，chr14:22731529，chr14:22734948，chr14:22741160，chr14:22772663，chr14:22861948，chr14:22972955，chr15:20022190，chr15:20049922，chr15:20189367，chr15:20191854，chr15:20192138，chr15:20454253，chr15:20470948，chr15:20564500，chr15:20569241，chr15:20586537，chr15:20586966，chr15:20590656，chr15:20616721，chr15:20626721，chr15:20646773，chr15:20848359，chr15:20849625，chr15:20852181，chr15:20862156，chr15:20863958，chr15:21905797，chr15:21928397，chr15:21938184，chr15:21940649，chr15:22013203，chr15:22299435，chr15:22302182，chr15:22376163，chr15:22427155，chr15:22441959，chr15:22476195，chr15:22520388，chr15:22539952，chr15:22780065，chr15:22798800，chr15:22833272，chr15:22854479，chr15:22869870，chr15:22893990，chr15:22905599，chr15:22916637，chr15:22923869，chr15:22940961，chr15:22971662，chr15:23000363，chr15:23010627，chr15:23020535，chr15:23044004，chr15:23053813，chr15:23064687，chr15:23721906，chr15:23730971，chr15:23746510，chr15:23767135，chr15:23781336，chr15:23793989，chr15:23816231，chr15:23893430，chr15:23929209，chr15:24006330，chr15:24055535，chr15:24129894，chr15:24166516，chr15:24196094，chr15:24236177，chr15:24278723，chr15:24319610，chr15:24350583，chr15:24471640，chr15:24824114，chr15:24870875，chr15:24913763，chr15:24943341，chr15:24974072，chr21:14640496，chr21:14643423，chr21:14695894，chr21:14756515，chr21:14818516，chr21:14890028，chr21:15012159，chr21:15026905，chr21:15170049，chr21:15280687，chr21:15300595，chr21:15445542，chr21:15479041，chr21:15501432，chr21:15548748，chr21:15566056，chr21:15588845，chr21:15625530，chr21:15654618，chr21:15681452，chr21:15720558，chr21:15763305，chr21:15842397，chr21:15884516，chr21:15916232，chr21:15942816，chr21:15984234，chr21:16027704，chr21:16063848，chr21:16122140，chr21:16160041，chr21:16193235，chr21:16238898，chr21:16315932，chr21:16353639，chr21:16384555，chr21:16448591，chr21:16578538，chr21:16645724，chr21:16717265，chr21:16833315，chr21:16881542，chr21:17000938，chr21:17054831，chr21:17140290，chr21:17203891，chr21:17295288，chr21:17340912，chr21:17536247，chr21:17640426，chr21:17673255，chr21:17713264，chr21:17748703，chr21:17781159，chr21:17823782，chr21:18003355，chr21:18046650，chr21:18114449，chr21:18151760，chr21:18182817，chr21:18250262，chr21:18337678，chr21:18385770，chr21:18420873，chr21:18457287，chr21:18586049，chr21:18650837，chr21:18740886，chr21:18858018，chr21:18936951，chr21:19002939，chr21:19064396，chr21:19139888，chr21:19254923，chr21:19316600，chr22:16415691，chr22:16554800，chr22:16848067，chr22:16850056，chr22:16850858，chr22:16851557，chr22:16852464，chr22:16852792，chr22:16853453，chr22:16854397，chr22:16855647，chr22:16856500，chr22:16857432，chr22:16858287，chr22:16860547，chr22:16861742，chr22:16867995，chr22:17031697，chr22:17271213，chr22:17293257，chr22:17409957，chr22:17442318，chr22:17469090，chr22:17525677，chr22:17563259，chr22:17587785，chr22:17619511，chr22:17656792，chr22:17682387，chr22:17715164，chr22:17739757，chr22:17761489，chr22:17785311，chr22:17805528，chr22:17841251，chr22:17883346，chr22:17916190，chr22:17939998，chr22:17981144，chr22:18012297，chr22:18054406，chr22:18212058，chr22:18276198，chr22:18354015，chr22:18395978，chr22:18466951，chr22:18531582，chr22:18581715，chr22:18628321，chr22:18894617，chr22:18966077，chr22:19004846，chr22:19025459，chr22:19098323，chr22:19142652，chr22:19236590，chr22:19362714，chr22:19431588，chr22:19536367，chr22:19643965，chr22:19716983，chr22:19759532，chr22:19808057，chr22:19859087，chr22:19909387，chr22:19972494，chr22:20016622，chr22:20051573，chr22:20081918，chr22:20135421，chr22:20175034，chr22:20216874，chr22:20278637，chr22:20745699，chr22:20787955，chr22:20855585，chr22:20881195，chr22:20924097，chr22:20983921，chr22:21028224。最优选地，所述SNP位点包括来自发生易位的每条染色体的上述全部SNP位点。
在一个特别优选的实施方案中，所述引物组合物选自以下正向引物和反向引物组成的引物对，或其任意组合：
(1)扩增第13号染色体的SNP位点的引物选自以下引物对：正向引物序列SEQ IDNO:2n-1，反向引物序列SEQ ID NO:2n；其中，n为选自1-57的自然数；
(2)扩增第14号染色体的SNP位点的引物选自以下引物对：正向引物序列SEQ IDNO:2n-1，反向引物序列SEQ ID NO:2n；其中，n为选自58-115的自然数；
(3)扩增第15号染色体的SNP位点的引物选自以下引物对：正向引物序列SEQ IDNO:2n-1，反向引物序列SEQ ID NO:2n；其中，n为选自116-189的自然数；
(4)扩增第21号染色体的SNP位点的引物选自以下引物对：正向引物序列SEQ IDNO:2n-1，反向引物序列SEQ ID NO:2n；其中，n为选自190-264的自然数；
(5)扩增第22号染色体的SNP位点的引物选自以下引物对：正向引物序列SEQ IDNO:2n-1，反向引物序列SEQ ID NO:2n；其中，n为选自265-344的自然数。
优选地，所述引物组合物包括用于扩增发生易位的每条染色体的SNP位点的至少1对引物，优选至少10对引物，更优选至少50对引物，最优选包括扩增发生易位的每条染色体的SNP位点的上述全部引物对。
本发明还提供了本发明的引物组合物在制备检测染色体罗氏易位的诊断试剂或试剂盒中的应用。
本发明的优越性主要有以下几点：
实用性：本发明可以解决目前常规方法无法解决的胚胎、胎儿或流产组织罗氏易位携带者检测问题。
简便性：本发明基于细胞染色体拷贝数分析结果和单体型分析不同细胞的染色体易位情况，不需要对细胞进行观察，可以快速地区分正常和易位携带胚胎。
通用性：本发明采用了多SNP进行分析，可用于不同配偶的胚胎移植前诊断、胎儿诊断或流产组织诊断。
高通量：基于高通量测序技术，本发明可以分析染色体的易位，通过在每个样品上加上不同的标签序列，可以一次地对大量样品进行分析。
成本低：随着测序技术的不断发展和测序成本的不断降低，本发明对染色体易位检测的成本也在不断下降。
高灵敏度：可用于3～-5个细胞的分析。因此除了流产组织、宫颈来源的滋养层细胞外，尤其适合于试管婴儿技术中胚胎移植前的检测。
特异性：选取千人基因组计划数据中染色体近着丝粒区域10Mb范围内CHB(北方汉人)和CHS(南方汉人)最小等位基因频率均大于0.2的高频突变位点，去除多聚核苷酸(polyN)和位点上下游50bp序列中GC含量>70％的多态性位点，并选择唯一比对到人类基因组的SNP突变位点作为目标区域。登陆https://www.ampliseq.com/网站提交目标位点和区域设计引物。这些引物具有很高的特异性。
准确性：根据易位染色体拷贝数的变化，及携带对应染色体的样本，可以推测易位的染色体中，各自的衍生染色体单体型，进而作相互验证，准确性更高。
附图说明
图1是本发明的检测染色体罗氏易位的方法的流程图。
图2是本发明的检测染色体罗氏易位的方法的胚胎易位染色体分析图。
图3是实施例1中的13号染色体家系单体型图。
图4是实施例1中的14号染色体家系单体型图。
图5是实施例2中的13号染色体家系单体型图。
图6是实施例2中的14号染色体家系单体型图。
具体实施方式
在本发明中，读段(reads)是指测序获得的序列片段。
在本发明中，单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。
在本发明中，单体型(Haplotype)是指位于一条染色体特定区域的一组相互关联，并倾向于以整体遗传给后代的单核苷酸多态的组合，又称单倍体型或单元型。
本发明中，胚胎基因组DNA的获取是当胚胎发育至囊胚期时取出外围滋养层细胞3～5个，运用全基因组扩增方法对细胞中基因组DNA进行富集。
在本发明中，目标区域DNA分子富集采用的是多重PCR扩增的方法。具体原理和方法请参见生厂商提供的说明书，将DNA分子富集为比较集中的一定大小的片段。在本发明的一个特定实施方案中，DNA片段大小在125～275bp的大小。
在本发明中，针对人类第13、14、15、21和22号染色体近端着丝粒附近区域高频突变SNP位点，分别设计57、58、74、75和80对序列特异性引物(引物序列及相应的SNP位点信息参见表1-5)。这些引物的特点为：(1)在目标染色体上序列唯一；(2)具有相同的退火温度。
本发明中，SNP位点由其所在染色体以及在该染色体上的位置(以hg19参考基因组序列为标准)来表示，例如，chr13:19602195表示该SNP位于hg19参考基因组序列第13号染色体第19602195位核苷酸。
表1第13号染色体近端着丝粒附近区域高频突变SNP位点及检测引物
表2第14号染色体近端着丝粒附近区域高频突变SNP位点及检测引物
表3第15号染色体近端着丝粒附近区域高频突变SNP位点及检测引物
表4第21号染色体近端着丝粒附近区域高频突变SNP位点及检测引物
表5第22号染色体近端着丝粒附近区域高频突变SNP位点及检测引物
在本发明中，所采用的测序方法可以为高通量测序方法。DNA片段长度分布在125～275bp之间。在本发明的一个特定实施方案中，测序平台为Ion Torrent PGM，得到DNA长度分布在125～275bp之间的DNA序列分子。
在本发明中，测序深度可以是300～3000×，即每条特异PCR扩增产物被测序300～3000次，例如在本发明的一个特定实施方案中，测序深度为1000，即该条特异PCR扩增产物被测序1000次。
本发明中，当待测的DNA分子来自多个受试样品时，每个样品可以被加上不同的标签序列(barcode)，以用于在测序过程中进行样品的区分(Micah Hamady,Jeffrey JWalker,J Kirk Harris et al.Error-correcting barcoded primers forpyrosequencing hundreds of samples in multiplex.Nature Methods,2008,5(3))，从而实现同时对多个样品进行测序。
本发明中，基因组参考序列可以来自公共数据库。例如，人类基因组序列可以是NCBI或者ucsc数据库中的人类基因组参考序列。
本发明中，序列比对可以通过任何一种序列比对程序，例如本领域技术人员可获得的Torrent Mapping Alignment Program(TMAP)和BWA(Burrow-Wheeler-Aligner)进行比对，将读段与参考基因组序列比对，得到读段在参考基因组上的位置。
本发明中，利用Torrent_Server_4.0_VM软件对PGM测序仪产生的原始数据去除接头序列，用Tmap软件比对到人类hg19参考基因组，最后分析单体型SNP覆盖倍数和基因型。
在本发明的一个特定实施方案中，检测方法包括以下步骤：
DNA提取及测序：按照MDA全基因组扩增法(Qiagen试剂盒)提取细胞DNA后，按照Ion AmpliSeqTMLibrary Kits 2.0标准建库流程进行建库。在这个过程中，胚胎MDA全基因组扩增通过目标区域多重PCR扩增为集中在125～275bp左右的DNA分子，两端加上测序所用接头，每个样品被加上不同的标签序列(barcode)，从而在一次测序得到的数据中可以使多个样品的数据区分开。
比对及统计：利用Torrent_Server_4.0_VM软件对PGM测序仪产生的原始数据去除接头序列，用Tmap软件比对到人类hg19参考基因组，最后分析单体型SNP覆盖倍数和基因型。
本发明用于对适用人群进行染色体罗氏易位胚胎移植前诊断，有利于提供遗传咨询和提供临床决策依据。本发明尤其适用于检测亲代双方一方为染色体罗氏易位携带者，另一方为正常核型，按照常规方法无法区分的正常胚胎和染色体罗氏易位携带者胚胎。
下面将对本发明实施例中的方案进行清楚完整的描述，但本发明并不受其限制，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，基于本发明的实施例，本领域技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围；同样地，实施例的附图仅仅是本发明一部分实施例的附图，本领域技术人员根据这些附图所获得的其他附图，也都属于本发明的保护范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1胚胎染色体罗氏易位的检测
一、材料
样本来源为8例胚胎囊胚期滋养层细胞全基因组扩增产物及父母外周血细胞DNA样本，父亲为13、14号染色体罗氏易位携带者，母亲染色体核型正常，胚胎染色体拷贝数分析结果如表6。
表6父母及胚胎染色体核型信息
二、方法
1、建库测序
按照Ion AmpliSeqTM Library Kits 2.0标准建库流程进行建库。使用表1和表2的引物进行多重PCR反应后，扩增产物的DNA分子两端加上测序所用的接头，在一定条件下使核酸分子成簇生长，然后在Ion Torrent PGM上测序，得到片段长度分布在125bp～275bp目标区域的DNA片段序列。
本实施例中，对于获自上述8例胚胎细胞的DNA样品及父母双方的全血DNA样本按照Ion Torrent官方公布的测序说明书进行操作。
2、数据分析
利用Torrent_Server_4.0_VM软件对PGM测序得到的原始数据去除接头序列，用Tmap软件比对到人类hg19参考基因组，去除低质量序列，统计目标位点的测序深度N，去除N小于100的位点，分析有效位点的所有序列方向和各碱基比例，将正反向序列数大于20％并且碱基比例大于10％的碱基类型定义为该位点的一种基因型(X，X＝{A,T,C,G})。
利用父母和胚胎的基因型推测个体的单体型，有效位点即对于构建家系单体型提供有效SNP信息的位点，一般为其中一方为杂合的位点。父母双方基因型为({X1X1}、{X2X2})、({X1X1}、{X1X1})的为无效位点，({X1X1}、{X1X2})为有效位点，({X1X2}、{X1X2})为可验证位点，根据有效位点和验证位点推断父母及各胚胎单体型，父本(LH)13、14号染色体单体型分别为Aa、Bb，母本(YT)13、14号染色体单体型分别为Cc、Dd。
三、结果分析
根据目标区域115个(13、14号染色体分别为57和58个)SNP位点建立家系单体型(结果如图3和图4)，根据家系单体型分析如表7所示。
表7家系单体型表
YT LH YT_1 YT_2 YT_3 YT_4 YT_5 YT_6 YT_7 YT_8
chr13 Cc Aa ac AC AC aC aC Ac AC Ac
chr14 Dd Bb bd BD BbD bd bd BD BD Bd
根据LH为易位携带者及3号胚胎为14号染色体重复的信息，可以推断3号胚胎带有的来自LH的13号染色体单体型(A型)为易位染色体单体型，进一步地，通过其他携带A型或a型的胚胎可以推测14号染色体中B型为易位染色体单体型。由此，可以判断1、4、5号胚胎携带13号染色体a型及14号染色体b型，为正常胚胎；2、6、7、8号胚胎携带13号染色体A型及14号染色体B型，为易位携带者胚胎。
实施例2胚胎染色体罗氏易位的检测
一、材料
样本来源为6例胚胎囊胚期滋养层细胞全基因组扩增产物及父母外周血细胞DNA样本，父亲为13、14号染色体罗氏易位携带者(JXD)，母亲染色体核型正常(HCC)，胚胎染色体拷贝数分析结果如表8。
表8父母及胚胎染色体核型信息
二、方法
1、建库测序
按照Ion AmpliSeqTM Library Kits 2.0标准建库流程进行建库。使用表1和表2的引物进行多重PCR反应后，扩增产物的DNA分子两端加上测序所用的接头，在一定条件下使核酸分子成簇生长，然后在Ion Torrent PGM上测序，得到片段长度分布在125bp～275bp目标区域的DNA片段序列。
本实施例中，对于获自上述6例胚胎细胞的DNA样品及父母双方的全血DNA按照IonTorrent官方公布的测序说明书进行操作。
2、数据分析
利用Torrent_Server_4.0_VM软件对PGM测序得到的原始数据去除接头序列，用Tmap软件比对到人类hg19参考基因组，去除低质量序列，统计目标位点的测序深度N，去除N小于100的位点，分析有效位点的所有序列方向和各碱基比例，将正反向序列数大于20％并且碱基比例大于10％的碱基类型定义为该位点的一种基因型(X，X＝{A,T,C,G})。
利用父母和胚胎的基因型推测个体的单体型，有效位点即对于构建家系单体型提供有效SNP信息的位点，一般为其中一方为杂合的位点。父母双方基因型为({X1X1}、{X2X2})、({X1X1}、{X1X1})的为无效位点，({X1X1}、{X1X2})为有效位点，({X1X2}、{X1X2})为可验证位点，根据有效位点和验证位点推断父母及各胚胎单体型，母本(HCC)13、14号染色体单体型分别为Cc、Dd，父本(JXD)13、14号染色体单体型分别为Aa、Bb。
三、结果分析
根据目标区域115个(13、14号染色体分别为57和58个)SNP位点建立家系单体型(结果如图1)，根据家系单体型分析如表9所示。
表9家系单体型表
HCC JXD HCC-1 HCC-2 HCC-3 HCC-4 HCC-5 HCC-6
chr13 Cc Aa AC C aC AC - ac
chr14 Dd Bb BD bD bD BD - bD
根据JXD为易位携带者及2号胚胎为13号染色体缺失的信息，可以推断2号胚胎带有的来自JXD的14号染色体单体型(b型)为正常染色体单体型，即14号染色体B型为易位染色体单体型，进一步地，通过其他携带B型或b型的胚胎可以推测13号染色体A型为易位染色体单体型。由此，可以判断1、4号胚胎携带14号染色体B型及13号染色体A型，为易位携带者胚胎；3、6号胚胎携带14号染色体b型及13号染色体a型，为正常胚胎；5号胚胎染色体拷贝数分析未检出结果，本次检测也没有得到任何有效序列。
本发明用于对适用人群进行胚胎染色体易位分析，有利于提供遗传咨询和提供临床决策依据，进行植入前诊断可有效防止患儿出生。
本发明适用人群可以是常规染色体核型分析染色体罗氏易位携带者。
本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其它各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。

Claims (31)

1.一种检测子代染色体罗氏易位的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)获取亲代双方和子代的DNA样本；
(2)从近端着丝粒染色体的着丝粒附近区域筛选高频突变SNP位点作为标记；
(3)检测子代DNA样本的染色体拷贝数；
(4)针对步骤(2)筛选的SNP位点，确定亲代双方和子代目标位点的基因型；
(5)基于亲代双方和子代的基因型及家系关系，分析亲代双方和子代的单体型；
(6)根据子代的染色体拷贝数检测结果、亲代双方携带染色体罗氏易位的核型、以及亲代双方和子代的单体型，分析子代的染色体罗氏易位情况；
其中，所述子代DNA样本为从流产组织提取的基因组DNA。
2.根据权利要求1的方法，其中，所述亲代DNA样本是从外周血样本中提取的父母基因组DNA。
3.根据权利要求1或2的方法，其用于检测人类染色体罗氏易位。
4.根据权利要求3的方法，其中，所述人类染色体罗氏易位是第13、14、15、21和22号染色体中任意两条染色体之间发生的易位。
5.根据权利要求3的方法，其中，步骤(2)中SNP位点的筛选标准为：
a.位点位于着丝粒附近10Mb区域内；
b.千人基因组数据库或者dbSNP数据库中收录；
c.SNP位点附近序列在人类基因组中不具有同源性。
6.根据权利要求5的方法，其中，选择目标人群中最小等位基因频率(MAF)大于0.2的SNP。
7.根据权利要求5的方法，其中，所述SNP位点选自以下SNP位点或其任意组合：chr13:19602195，chr13:19625370，chr13:19646283，chr13:19692745，chr13:19713634，chr13:19722801，chr13:19732341，chr13:19784913，chr13:19843135，chr13:19877547，chr13:19883672，chr13:19896927，chr13:19917509，chr13:20494558，chr13:20709214，chr13:20747500，chr13:20784332，chr13:20825315，chr13:20864572，chr13:20881859，chr13:20908501，chr13:20938952，chr13:20951425，chr13:20992333，chr13:21012562，chr13:21066214，chr13:21092894，chr13:21112935，chr13:21527671，chr13:21553971，chr13:21575458，chr13:21607760，chr13:21636136，chr13:21655335，chr13:21683681，chr13:21801501，chr13:22197910，chr13:22249975，chr13:22270788，chr13:22340074，chr13:22396664，chr13:22417688，chr13:22473749，chr13:22504691，chr13:22515844，chr13:22523279，chr13:22538311，chr13:22561684，chr13:22640820，chr13:22751654，chr13:22768476，chr13:22780737，chr13:22799808，chr13:22819627，chr13:22835073，chr13:22892864，chr13:22980146，chr14:19472367，chr14:20326905，chr14:20349694，chr14:20383719，chr14:20420387，chr14:20517369，chr14:20527044，chr14:20565487，chr14:20643775，chr14:20670979，chr14:20731036，chr14:20820537，chr14:20905141，chr14:20918598，chr14:21008574，chr14:21048774，chr14:21091127，chr14:21156472，chr14:21195967，chr14:21237137，chr14:21263166，chr14:21313819，chr14:21325985，chr14:21388266，chr14:21452591，chr14:21519915，chr14:21580671，chr14:21625262，chr14:21789092，chr14:21981923，chr14:22053817，chr14:22090208，chr14:22138437，chr14:22210067，chr14:22244363，chr14:22263821，chr14:22312275，chr14:22324460，chr14:22351977，chr14:22361282，chr14:22375208，chr14:22393124，chr14:22428984，chr14:22452496，chr14:22489611，chr14:22518909，chr14:22526966，chr14:22563283，chr14:22611651，chr14:22626948，chr14:22657897，chr14:22702039，chr14:22731529，chr14:22734948，chr14:22741160，chr14:22772663，chr14:22861948，chr14:22972955，chr15:20022190，chr15:20049922，chr15:20189367，chr15:20191854，chr15:20192138，chr15:20454253，chr15:20470948，chr15:20564500，chr15:20569241，chr15:20586537，chr15:20586966，chr15:20590656，chr15:20616721，chr15:20626721，chr15:20646773，chr15:20848359，chr15:20849625，chr15:20852181，chr15:20862156，chr15:20863958，chr15:21905797，chr15:21928397，chr15:21938184，chr15:21940649，chr15:22013203，chr15:22299435，chr15:22302182，chr15:22376163，chr15:22427155，chr15:22441959，chr15:22476195，chr15:22520388，chr15:22539952，chr15:22780065，chr15:22798800，chr15:22833272，chr15:22854479，chr15:22869870，chr15:22893990，chr15:22905599，chr15:22916637，chr15:22923869，chr15:22940961，chr15:22971662，chr15:23000363，chr15:23010627，chr15:23020535，chr15:23044004，chr15:23053813，chr15:23064687，chr15:23721906，chr15:23730971，chr15:23746510，chr15:23767135，chr15:23781336，chr15:23793989，chr15:23816231，chr15:23893430，chr15:23929209，chr15:24006330，chr15:24055535，chr15:24129894，chr15:24166516，chr15:24196094，chr15:24236177，chr15:24278723，chr15:24319610，chr15:24350583，chr15:24471640，chr15:24824114，chr15:24870875，chr15:24913763，chr15:24943341，chr15:24974072，chr21:14640496，chr21:14643423，chr21:14695894，chr21:14756515，chr21:14818516，chr21:14890028，chr21:15012159，chr21:15026905，chr21:15170049，chr21:15280687，chr21:15300595，chr21:15445542，chr21:15479041，chr21:15501432，chr21:15548748，chr21:15566056，chr21:15588845，chr21:15625530，chr21:15654618，chr21:15681452，chr21:15720558，chr21:15763305，chr21:15842397，chr21:15884516，chr21:15916232，chr21:15942816，chr21:15984234，chr21:16027704，chr21:16063848，chr21:16122140，chr21:16160041，chr21:16193235，chr21:16238898，chr21:16315932，chr21:16353639，chr21:16384555，chr21:16448591，chr21:16578538，chr21:16645724，chr21:16717265，chr21:16833315，chr21:16881542，chr21:17000938，chr21:17054831，chr21:17140290，chr21:17203891，chr21:17295288，chr21:17340912，chr21:17536247，chr21:17640426，chr21:17673255，chr21:17713264，chr21:17748703，chr21:17781159，chr21:17823782，chr21:18003355，chr21:18046650，chr21:18114449，chr21:18151760，chr21:18182817，chr21:18250262，chr21:18337678，chr21:18385770，chr21:18420873，chr21:18457287，chr21:18586049，chr21:18650837，chr21:18740886，chr21:18858018，chr21:18936951，chr21:19002939，chr21:19064396，chr21:19139888，chr21:19254923，chr21:19316600，chr22:16415691，chr22:16554800，chr22:16848067，chr22:16850056，chr22:16850858，chr22:16851557，chr22:16852464，chr22:16852792，chr22:16853453，chr22:16854397，chr22:16855647，chr22:16856500，chr22:16857432，chr22:16858287，chr22:16860547，chr22:16861742，chr22:16867995，chr22:17031697，chr22:17271213，chr22:17293257，chr22:17409957，chr22:17442318，chr22:17469090，chr22:17525677，chr22:17563259，chr22:17587785，chr22:17619511，chr22:17656792，chr22:17682387，chr22:17715164，chr22:17739757，chr22:17761489，chr22:17785311，chr22:17805528，chr22:17841251，chr22:17883346，chr22:17916190，chr22:17939998，chr22:17981144，chr22:18012297，chr22:18054406，chr22:18212058，chr22:18276198，chr22:18354015，chr22:18395978，chr22:18466951，chr22:18531582，chr22:18581715，chr22:18628321，chr22:18894617，chr22:18966077，chr22:19004846，chr22:19025459，chr22:19098323，chr22:19142652，chr22:19236590，chr22:19362714，chr22:19431588，chr22:19536367，chr22:19643965，chr22:19716983，chr22:19759532，chr22:19808057，chr22:19859087，chr22:19909387，chr22:19972494，chr22:20016622，chr22:20051573，chr22:20081918，chr22:20135421，chr22:20175034，chr22:20216874，chr22:20278637，chr22:20745699，chr22:20787955，chr22:20855585，chr22:20881195，chr22:20924097，chr22:20983921，chr22:21028224。
8.根据权利要求1和5-7中任一项的方法，其中，所述SNP位点包括来自发生易位的每条染色体的至少1个SNP位点。
9.根据权利要求8的方法，其中，所述SNP位点包括来自发生易位的每条染色体的至少10个SNP位点。
10.根据权利要求9的方法，其中，所述SNP位点包括来自发生易位的每条染色体的至少50个SNP位点。
11.根据权利要求7的方法，其中，所述SNP位点包括来自发生易位的每条染色体的权利要求7中限定的全部SNP位点。
12.根据权利要求1的方法，其中，步骤(3)中检测染色体拷贝数的方法和步骤(4)中确定样本基因型的方法独立地选自测序方法和芯片方法。
13.根据权利要求12的方法，其中，所述测序方法为高通量测序方法；所述的芯片方法为人全基因组SNP芯片。
14.根据权利要求13的方法，其中，所述测序方法为Ion Torrent PGM或IlluminaMiseq；所述的芯片方法为Illumina全基因组SNP芯片。
15.根据权利要求1的方法，其中，亲代双方一方为正常核型，另一方为罗氏易位携带者，子代中包括罗氏易位染色体三体或者单体的个体。
16.根据权利要求15的方法，其中，步骤(6)中的判断标准如下：
a.如果某一子代为染色体m三体，则其染色体n中来源于亲代罗氏易位携带者的单体型B为易位染色体单体型，相应地，来源于亲代罗氏易位携带者染色体n的另一种单体型b为正常染色体单体型；进一步地，通过观察其他子代的单体型，与染色体n单体型B连锁的来源于亲代罗氏易位携带者的染色体m单体型A也是易位染色体单体型，相应地，来源于亲代罗氏易位携带者染色体m的另一种单体型a为正常染色体单体型；由此，可以判断携带染色体m单体型A和染色体n单体型B的子代为易位携带者，携带染色体m单体型a和染色体n单体型b的子代为正常核型；
b.如果某一子代为染色体m单体，则其染色体n中来源于亲代罗氏易位携带者的单体型B为正常染色体单体型，相应地，来源于亲代罗氏易位携带者染色体n的另一种单体型b为易位染色体单体型；进一步地，通过观察其他子代的单体型，与染色体n单体型b连锁的来源于亲代罗氏易位携带者的染色体m单体型a也是易位染色体单体型，相应地，来源于亲代罗氏易位携带者染色体m的另一种单体型A为正常染色体单体型；由此，可以判断携带染色体m单体型A和染色体n单体型B的子代为正常核型，携带染色体m单体型a和染色体n单体型b的子代为易位携带者；
其中，染色体m和染色体n为亲代罗氏易位携带者基因组中发生罗氏易位的两条染色体，A和a为来源于亲代罗氏易位携带者染色体m的单体型，B和b为来源于亲代罗氏易位携带者染色体n的单体型。
17.一种用于检测人类染色体罗氏易位的引物组合物，其特征在于所述引物组合物能够扩增近端着丝粒染色体的着丝粒附近区域高频突变SNP位点的序列；其中，所述SNP位点的筛选标准为：
a.位点位于着丝粒附近10Mb区域内；
b.千人基因组数据库或者dbSNP数据库中收录；
c.SNP位点附近序列在人类基因组中不具有同源性。
18.根据权利要求17的引物组合物，其中，所述人类染色体罗氏易位是第13、14、15、21和22号染色体中任意两条染色体之间发生的易位。
19.根据权利要求17的引物组合物，其中，选择目标人群中最小等位基因频率(MAF)大于0.2的SNP。
20.根据权利要求18的引物组合物，其中，所述SNP位点选自以下SNP位点或其任意组合：chr13:19602195，chr13:19625370，chr13:19646283，chr13:19692745，chr13:19713634，chr13:19722801，chr13:19732341，chr13:19784913，chr13:19843135，chr13:19877547，chr13:19883672，chr13:19896927，chr13:19917509，chr13:20494558，chr13:20709214，chr13:20747500，chr13:20784332，chr13:20825315，chr13:20864572，chr13:20881859，chr13:20908501，chr13:20938952，chr13:20951425，chr13:20992333，chr13:21012562，chr13:21066214，chr13:21092894，chr13:21112935，chr13:21527671，chr13:21553971，chr13:21575458，chr13:21607760，chr13:21636136，chr13:21655335，chr13:21683681，chr13:21801501，chr13:22197910，chr13:22249975，chr13:22270788，chr13:22340074，chr13:22396664，chr13:22417688，chr13:22473749，chr13:22504691，chr13:22515844，chr13:22523279，chr13:22538311，chr13:22561684，chr13:22640820，chr13:22751654，chr13:22768476，chr13:22780737，chr13:22799808，chr13:22819627，chr13:22835073，chr13:22892864，chr13:22980146，chr14:19472367，chr14:20326905，chr14:20349694，chr14:20383719，chr14:20420387，chr14:20517369，chr14:20527044，chr14:20565487，chr14:20643775，chr14:20670979，chr14:20731036，chr14:20820537，chr14:20905141，chr14:20918598，chr14:21008574，chr14:21048774，chr14:21091127，chr14:21156472，chr14:21195967，chr14:21237137，chr14:21263166，chr14:21313819，chr14:21325985，chr14:21388266，chr14:21452591，chr14:21519915，chr14:21580671，chr14:21625262，chr14:21789092，chr14:21981923，chr14:22053817，chr14:22090208，chr14:22138437，chr14:22210067，chr14:22244363，chr14:22263821，chr14:22312275，chr14:22324460，chr14:22351977，chr14:22361282，chr14:22375208，chr14:22393124，chr14:22428984，chr14:22452496，chr14:22489611，chr14:22518909，chr14:22526966，chr14:22563283，chr14:22611651，chr14:22626948，chr14:22657897，chr14:22702039，chr14:22731529，chr14:22734948，chr14:22741160，chr14:22772663，chr14:22861948，chr14:22972955，chr15:20022190，chr15:20049922，chr15:20189367，chr15:20191854，chr15:20192138，chr15:20454253，chr15:20470948，chr15:20564500，chr15:20569241，chr15:20586537，chr15:20586966，chr15:20590656，chr15:20616721，chr15:20626721，chr15:20646773，chr15:20848359，chr15:20849625，chr15:20852181，chr15:20862156，chr15:20863958，chr15:21905797，chr15:21928397，chr15:21938184，chr15:21940649，chr15:22013203，chr15:22299435，chr15:22302182，chr15:22376163，chr15:22427155，chr15:22441959，chr15:22476195，chr15:22520388，chr15:22539952，chr15:22780065，chr15:22798800，chr15:22833272，chr15:22854479，chr15:22869870，chr15:22893990，chr15:22905599，chr15:22916637，chr15:22923869，chr15:22940961，chr15:22971662，chr15:23000363，chr15:23010627，chr15:23020535，chr15:23044004，chr15:23053813，chr15:23064687，chr15:23721906，chr15:23730971，chr15:23746510，chr15:23767135，chr15:23781336，chr15:23793989，chr15:23816231，chr15:23893430，chr15:23929209，chr15:24006330，chr15:24055535，chr15:24129894，chr15:24166516，chr15:24196094，chr15:24236177，chr15:24278723，chr15:24319610，chr15:24350583，chr15:24471640，chr15:24824114，chr15:24870875，chr15:24913763，chr15:24943341，chr15:24974072，chr21:14640496，chr21:14643423，chr21:14695894，chr21:14756515，chr21:14818516，chr21:14890028，chr21:15012159，chr21:15026905，chr21:15170049，chr21:15280687，chr21:15300595，chr21:15445542，chr21:15479041，chr21:15501432，chr21:15548748，chr21:15566056，chr21:15588845，chr21:15625530，chr21:15654618，chr21:15681452，chr21:15720558，chr21:15763305，chr21:15842397，chr21:15884516，chr21:15916232，chr21:15942816，chr21:15984234，chr21:16027704，chr21:16063848，chr21:16122140，chr21:16160041，chr21:16193235，chr21:16238898，chr21:16315932，chr21:16353639，chr21:16384555，chr21:16448591，chr21:16578538，chr21:16645724，chr21:16717265，chr21:16833315，chr21:16881542，chr21:17000938，chr21:17054831，chr21:17140290，chr21:17203891，chr21:17295288，chr21:17340912，chr21:17536247，chr21:17640426，chr21:17673255，chr21:17713264，chr21:17748703，chr21:17781159，chr21:17823782，chr21:18003355，chr21:18046650，chr21:18114449，chr21:18151760，chr21:18182817，chr21:18250262，chr21:18337678，chr21:18385770，chr21:18420873，chr21:18457287，chr21:18586049，chr21:18650837，chr21:18740886，chr21:18858018，chr21:18936951，chr21:19002939，chr21:19064396，chr21:19139888，chr21:19254923，chr21:19316600，chr22:16415691，chr22:16554800，chr22:16848067，chr22:16850056，chr22:16850858，chr22:16851557，chr22:16852464，chr22:16852792，chr22:16853453，chr22:16854397，chr22:16855647，chr22:16856500，chr22:16857432，chr22:16858287，chr22:16860547，chr22:16861742，chr22:16867995，chr22:17031697，chr22:17271213，chr22:17293257，chr22:17409957，chr22:17442318，chr22:17469090，chr22:17525677，chr22:17563259，chr22:17587785，chr22:17619511，chr22:17656792，chr22:17682387，chr22:17715164，chr22:17739757，chr22:17761489，chr22:17785311，chr22:17805528，chr22:17841251，chr22:17883346，chr22:17916190，chr22:17939998，chr22:17981144，chr22:18012297，chr22:18054406，chr22:18212058，chr22:18276198，chr22:18354015，chr22:18395978，chr22:18466951，chr22:18531582，chr22:18581715，chr22:18628321，chr22:18894617，chr22:18966077，chr22:19004846，chr22:19025459，chr22:19098323，chr22:19142652，chr22:19236590，chr22:19362714，chr22:19431588，chr22:19536367，chr22:19643965，chr22:19716983，chr22:19759532，chr22:19808057，chr22:19859087，chr22:19909387，chr22:19972494，chr22:20016622，chr22:20051573，chr22:20081918，chr22:20135421，chr22:20175034，chr22:20216874，chr22:20278637，chr22:20745699，chr22:20787955，chr22:20855585，chr22:20881195，chr22:20924097，chr22:20983921，chr22:21028224。
21.根据权利要求17-20中任一项的引物组合物，其中，所述SNP位点包括来自发生易位的每条染色体的至少1个SNP位点。
22.根据权利要求21的引物组合物，其中，所述SNP位点包括来自发生易位的每条染色体的至少10个SNP位点。
23.根据权利要求22的引物组合物，其中，所述SNP位点包括来自发生易位的每条染色体的至少50个SNP位点。
24.根据权利要求20的引物组合物，其中，所述SNP位点包括来自发生易位的每条染色体的权利要求20中限定的全部SNP位点。
25.根据权利要求20的引物组合物，其选自以下正向引物和反向引物组成的引物对，或其任意组合：
(1)扩增第13号染色体的SNP位点的引物选自以下引物对：正向引物序列SEQ ID NO:2n-1，反向引物序列SEQ ID NO:2n；其中，n为选自1-57的自然数；
(2)扩增第14号染色体的SNP位点的引物选自以下引物对：正向引物序列SEQ ID NO:2n-1，反向引物序列SEQ ID NO:2n；其中，n为选自58-115的自然数；
(3)扩增第15号染色体的SNP位点的引物选自以下引物对：正向引物序列SEQ ID NO:2n-1，反向引物序列SEQ ID NO:2n；其中，n为选自116-189的自然数；
(4)扩增第21号染色体的SNP位点的引物选自以下引物对：正向引物序列SEQ ID NO:2n-1，反向引物序列SEQ ID NO:2n；其中，n为选自190-264的自然数；
(5)扩增第22号染色体的SNP位点的引物选自以下引物对：正向引物序列SEQ ID NO:2n-1，反向引物序列SEQ ID NO:2n；其中，n为选自265-344的自然数。
26.根据权利要求25的引物组合物，其包括用于扩增发生易位的每条染色体的SNP位点的至少1对引物。
27.根据权利要求26的引物组合物，其包括用于扩增发生易位的每条染色体的SNP位点的至少10对引物。
28.根据权利要求27的引物组合物，其包括用于扩增发生易位的每条染色体的SNP位点的至少50对引物。
29.根据权利要求28的引物组合物，其包括用于扩增发生易位的每条染色体的SNP位点的权利要求25中限定的全部引物对。
30.根据权利要求17-29中任一项的引物组合物在制备检测染色体罗氏易位的诊断试剂中的应用。
31.根据权利要求17-29中任一项的引物组合物在制备检测染色体罗氏易位的试剂盒中的应用。
CN201610034367.4A 2016-01-19 2016-01-19 一种检测染色体罗氏易位的方法 Active CN105543372B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610034367.4A CN105543372B (zh) 2016-01-19 2016-01-19 一种检测染色体罗氏易位的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610034367.4A CN105543372B (zh) 2016-01-19 2016-01-19 一种检测染色体罗氏易位的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105543372A CN105543372A (zh) 2016-05-04
CN105543372B true CN105543372B (zh) 2017-04-19

Family

ID=55822929

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610034367.4A Active CN105543372B (zh) 2016-01-19 2016-01-19 一种检测染色体罗氏易位的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105543372B (zh)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11345948B2 (en) 2016-01-19 2022-05-31 Peking Jabrehoo Technology Co. Ltd Method for detecting chromosome Robertsonian translocation
CN106650310B (zh) * 2017-01-09 2019-01-29 上海集爱遗传与不育诊疗中心 一种鉴别染色体平衡易位携带胚胎和正常胚胎的方法
CN106834490B (zh) * 2017-03-02 2021-01-22 上海亿康医学检验所有限公司 一种鉴定胚胎平衡易位断裂点和平衡易位携带状态的方法
CN115375682B (zh) * 2022-10-24 2023-01-20 湖南自兴智慧医疗科技有限公司 一种染色体罗氏易位异常检测方法、系统及存储介质
CN116218976B (zh) * 2023-03-02 2025-03-25 广州奥测医学科技有限公司 一种检测人类胚胎染色体罗氏易位的引物组合以及方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0523276D0 (en) * 2005-11-15 2005-12-21 London Bridge Fertility Chromosomal analysis by molecular karyotyping
EP2473638B1 (en) * 2009-09-30 2017-08-09 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
US20130310262A1 (en) * 2012-05-21 2013-11-21 Ariosa Diagnostics, Inc. Noninvasive detection of robertsonian translocations
EP2978860B8 (en) * 2013-03-27 2019-12-11 BlueGnome Ltd Assessment of risk of aneuploidy
CN103923987A (zh) * 2014-04-01 2014-07-16 中山大学达安基因股份有限公司 一种基于高通量测序检测13、18、21三体综合征的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN105543372A (zh) 2016-05-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI640636B (zh) A method for simultaneously performing gene locus, chromosome and linkage analysis
KR101890466B1 (ko) 고도의 다중 ｐｃｒ 방법 및 조성물
CN103608818B (zh) 非侵入性产前倍性识别装置
JP6328934B2 (ja) 非侵襲性出生前親子鑑定法
US20140141981A1 (en) Highly multiplex pcr methods and compositions
CN114072527B (zh) 确定循环核酸的线性和环状形式
CN105543372B (zh) 一种检测染色体罗氏易位的方法
US20240401153A1 (en) Non-Invasive Detection Method for Screening for a Well-Developed Blastocyst
JP2016502849A (ja) 卵子提供による妊娠での胎児異数性の非侵襲的検出
JP2015522293A (ja) 多重化連続ライゲーションに基づく遺伝子変異体の検出
TW201317362A (zh) 一種檢測染色體拷貝數變異的方法
CN110541025A (zh) 杜氏肌营养不良基因缺陷的检测方法、引物组合物及试剂盒
EA038117B1 (ru) Мультиплексный параллельный анализ целевых геномных областей с целью неинвазивного пренатального тестирования
WO2015042980A1 (zh) 确定染色体预定区域中snp信息的方法、系统和计算机可读介质
Xing et al. Long‐read Oxford nanopore sequencing reveals a de novo case of complex chromosomal rearrangement involving chromosomes 2, 7, and 13
JP2014530629A (ja) 染色体の微細欠失及び微細重複を検出する方法
Ogur et al. Preimplantation genetic testing for structural rearrangements
CN116218976B (zh) 一种检测人类胚胎染色体罗氏易位的引物组合以及方法
WO2017124214A1 (zh) 一种检测染色体罗氏易位的方法
CN117925820B (zh) 一种用于胚胎植入前变异检测的方法
EP2847347A1 (en) Highly multiplex pcr methods and compositions
Fragouli et al. Genomics for Embryo Selection
CN111286533B (zh) Pah基因多重pcr引物及其应用
Xue et al. Chromosomal copy-number variation analysis of villous tissues using molecular karyotyping in early missed abortions
Zhang Method Development and Implementation of Low-Pass Genome Sequencing to Identify Structural Variants in Undiagnosed Diseases

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant