CN105543258B

CN105543258B - 一种类志贺邻单胞菌噬菌体裂解酶的制备方法及其抗菌应用

Info

Publication number: CN105543258B
Application number: CN201610016576.6A
Authority: CN
Inventors: 杨洪江; 何洋; 荆兆元
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2016-01-12
Filing date: 2016-01-12
Publication date: 2018-11-20
Anticipated expiration: 2036-01-12
Also published as: CN105543258A

Abstract

本发明涉及一种类志贺邻单胞菌噬菌体裂解酶的制备方法及其抗菌应用，其氨基酸序列为Seq ID NO.2，其能够制备抑制细菌污染或过度生长的药物，类志贺邻单胞菌噬菌体裂解酶作为杀菌剂来应用。该酶通过水解细菌细胞壁肽糖上糖与肽间的酰胺键或肽内氨基酸残基间的连键最终使宿主细胞裂解。裂解酶不仅特异性作用于宿主，且作用时间短，作用谱较噬菌体广。裂解酶具有高效、特异且不产生抗性等特点，目前在食品及医药行业已有成功应用的报道。

Description

一种类志贺邻单胞菌噬菌体裂解酶的制备方法及其抗菌应用

技术领域

本发明设计属于生物工程领域，特别涉及一种类志贺邻单胞菌噬菌体裂解酶(Endolysin)及其作为杀菌活性成分在医疗卫生、食品加工、卫生制品中中的应用。

背景技术

噬菌体是侵染细菌等原核细胞型微生物的病毒。主要由核酸和蛋白质组成。噬菌体的遗传物质是核酸，蛋白质构成噬菌体的衣壳。噬菌体的结构简单、体积小，可以通过细菌滤器，是一种严格寄生于活细胞的非细胞微生物。噬菌体通过利用宿主细菌的原料合成自身的蛋白及核酸，在宿主细胞体内组装，裂解细胞、释放子代噬菌体。

随着人们生活水平的日益提高,人们对洗手液的需求不再是仅仅的清洁作用，而还需要洗手液具有杀菌、抑菌以及护肤的功效，现在市面上出现了不少的杀菌洗手液，但其杀菌成分安全性不高，用含低毒性的洗手液清洗手后，当手直接接触食物，杀菌成分会对人们身体造成一定的伤害，故其安全性不高，另外一些洗手液的安全性虽然高，但功能不齐全，制备方法复杂，成本高，一般的消费者不能接受。授权公告号CN 101766543B的发明专利一种含二氧化氯的消毒洗手液，其杀菌剂为二氧化氯。二氧化氯虽然杀菌效果好，但具有强烈刺激性，接触后主要引起眼和呼吸道刺激，吸入高浓度可发生肺水肿，可致死。专利CN101475879B一种杀菌护肤洗手液以对氯间二甲苯酚为杀菌剂，同样存在有刺激性和毒性较强的缺点。为了克服化学杀菌剂的缺点，专利CN 101966134B一种杀菌护肤洗手液及其制备方法公开了一中采用尼泊金酯作为杀菌剂的洗手液，但尼泊金酯在水中溶解度极低，产品均一性和稳定性差。发明专利CN 102600053B中草药-无机抗菌剂复合杀菌洗手液及其制备采用艾叶、青蒿、黄芩、石榴皮、甘草的水提物为复合中草药抗菌剂，配以无机抗菌剂纳米氧化银使用，但制作复杂，抗菌力低，为了防止腐败变质还需高压灭菌。所以，市场上非常需要一种去污能力好，杀菌力强，安全可靠的洗手液。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种类志贺邻单胞菌噬菌体裂解酶的制备方法及其抗菌应用，本发明提供的噬菌体裂解酶作为杀菌剂，其具有安全无毒、水溶性好、抑菌谱广等优点。

本发明实现目的的技术方案如下：

一种类志贺邻单胞菌噬菌体裂解酶的编码基因，其核苷酸序列为Seq ID NO.1。

一种类志贺邻单胞菌噬菌体裂解酶，其氨基酸序列为Seq ID NO.2。

类志贺邻单胞菌噬菌体裂解酶在制备制备防治细菌感染药物、医疗卫生用品、食品加工添加剂、卫生制品中的应用。

一种含有类志贺邻单胞菌噬菌体裂解酶的编码基因的工程菌，所述原核细胞表达载体为pQE30，所述的裂解酶基因被插入到pQE30的KpnI和HindIII酶切位点之间，所述的工程菌为E.coli M15/pREP4/pQE30-gp2。

而且，工程菌的培养条件为：培养温度为37℃，所述诱导表达所用的诱导剂为异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，诱导浓度为0.5mmol/L，诱导表达的温度为16℃。

一种含有噬菌体裂解酶的洗手液，组分及重量百分比如下：甘油1～5％，乙酰化羊毛脂1～3％，表面活性剂8～30％，噬菌体裂解酶0.001～0.0001％，pH调节剂0～3％，香精0.01～0.03％，其余为去离子水。

本发明的优点和积极效果是：

本专利采用基因工程菌株发酵生产的噬菌体裂解酶作为杀菌剂，其具有安全无毒、水溶性好、抑菌谱广等优点。裂解酶是在感染宿主晚期由噬菌体表达的一类肽聚糖水解酶，该酶通过水解细菌细胞壁肽糖上糖与肽间的酰胺键或肽内氨基酸残基间的连键最终使宿主细胞裂解。裂解酶不仅特异性作用于宿主，且作用时间短，作用谱较噬菌体广。裂解酶具有高效、特异且不产生抗性等特点，目前在食品及医药行业已有成功应用的报道。

附图说明

图1裂解酶基因gp2的表达质粒的构建和鉴定；泳道1：pQE30载体BamHI酶切，泳道2：重组质粒pQE30-gp2BamHI与HindIII双酶切验证，M：5Kb DNA ladder；

图2裂解酶Gp2诱导表达的鉴定；泳道1：未诱导HeL1的总蛋白，泳道2：0.5mmol/LIPTG诱导4h后，HeL1的总蛋白，泳道3：超声后沉淀，泳道4：超声后上清，泳道5：纯化后的裂解酶Gp2；

图3裂解酶Gp2对铜绿假单胞菌原生质体的裂解活性；

图4裂解酶Gp2对游离的铜绿假单胞菌的裂解活性。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明方法。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

实施例1

噬菌体基因组的提取

(一)粗制噬菌体颗粒

(1)宿主菌的制备：从固体培养基上挑取类志贺邻单胞菌(PlesiomonasShigelloides.)^[1]单个菌落，接种于5mL LB液体培养基中，37℃振荡培养6-8h。

(2)噬菌体纯培养液的制备：挑取单个噬菌斑，接种于5mL对数期宿主菌培养液中，37℃振荡培养4-6h，而后将裂解液于10000rpm离心10min，上清液即为噬菌体纯培养液。

(3)噬菌体粗制颗粒的制备：将类志贺邻单胞菌过夜培养物转接到100mL液体LB培养基中，接种量为1％，扩增培养至对数期(OD₆₀₀约0.4)，加入5mL类志贺邻单胞菌噬菌体纯培养液，37℃振荡培养6-8h后得到噬菌体裂解液。向裂解液中加入DNase I和RNase A至终浓度为5μg/mL，混匀后37℃静置1h。而后加入NaCl至终浓度为0.1mol/L，混匀溶解后冰浴1h，12000rpm离心20min。将上清液转到另一离心管中后，加入PEG6000至终浓度为10％(w/v)，充分振荡溶解后于4℃静置过夜，12000rpm离心20min，弃上清。用500μL TM(0.05mol/LTris-HCl pH 7.5，0.2％MgSO₄·7H₂O)溶液将沉淀重悬，并用等体积的氯仿反复抽提一次，12000rpm离心10min，以除去重悬液中的PEG6000，最终得到噬菌体颗粒的粗提物。

(二)噬菌体基因组DNA的制备

(1)在纯化的噬菌体颗粒中加入DNase I和RNaseA，终浓度为1μg/mL，37℃静置1h，以降解残留的宿主菌的DNA或RNA；

(2)然后加入1mol/L EDTA(pH8.0)至终浓度50mmol/L，终止DNase I及RNase A活性；

(3)加蛋白酶K至终浓度为50μg/mL，加SDS至终浓度为0.5％，混匀，56℃l h，消化蛋白质；

(4)加入等体积苯酚：氯仿：异戊醇(25∶24∶1)混匀，12000rpm离心10min，收集上清；

(5)步骤4重复3次；收集上清，等体积氯仿，混匀，12000rpm，10min，收集上清；

(6)加入1/10体积3mol/L NaAc及2倍体积预冷的95％乙醇，混匀，12000rpm，10min，沉淀DNA；

(7)加70％乙醇(500μL)于沉淀中，并将盖紧的离心管颠倒数次，12000rpm离心5min，回收DNA。

(8)去掉上清液，除去管壁上的酒精液滴，将开口的离心管室温干燥10min，而后用双蒸水重悬DNA。

实施例2

裂解酶基因gp2的克隆、表达载体的构建

(1)根据gp2基因编码的序列设计一对特异性引物：

gp2F：5’-CGG GGTACCATG CAA CCA TCG CGA GCG TG-3’，见Seq ID NO.3；gp2R：5’-CCC AAGCTTCTG GCG GCG GTG GAT TTT TG-3’，见Seq ID NO.4；以噬菌体基因组DNA为模板用上述引物扩增gp2基因，1％琼脂糖电泳，鉴定扩增片段的大小。

(2)将PCR产物直接用限制性内切酶KpnI和HindIII进行双酶切，37℃水浴2h，1％琼脂糖电泳，胶回收试剂盒将片段纯化回收，并将片段与之前用KpnI和HindIII双酶切且纯化的pQE30载体于16℃连接过夜，次日转化大肠杆菌M15/pREP4感受态。将转化的混合物加入适量的LB培养基，37℃孵育20min。之后将混合物涂布于含有氨苄青霉素(100μg/ml)和卡那霉素(25μg/ml)的LB平板，37℃培养过夜；

(3)阳性克隆菌的鉴定挑取阳性克隆菌接种于含卡那霉素(25μg/mL)和氨苄青霉素(100μg/mL)的LB液体培养基中，37℃培养过夜后，碱裂法提取质粒，用KpnI和BamHI进行酶切鉴定，同时用BamHI单酶切的pQE30空质粒作为对照。将鉴定正确的质粒命名为pQE30-gp2,含有阳性重组质粒的菌命名为HeL1。

结果如图1所示，重组质粒pQE30-gp2用BamHI进行酶切后，分别在3.7kb和0.8kb处出现pET28a(+)载体带和gp2基因带，大小与预期相符，表明构建正确。

实施例3

裂解酶gp2蛋白的诱导表达及纯化

将含有重组质粒的菌HeL1接种到含氨苄青霉素(100μg/mL)和卡那霉素(25μg/mL)的LB培养液中，37℃振荡过夜培养；次日，按1∶100比例转接至100mL LB培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀值约为0.6时，加入IPTG至终浓度0.5mmol/L，16℃诱导16h。收集菌体，超声波破碎细胞，4℃，10000rpm/min离心10min，收集上清，并将上清经0.22μm滤膜过滤，SDS-PAGE分析裂解上清中的蛋白表达情况。将过滤的裂解上清用His亲和层析镍柱(GE Healthcare，Sweden)纯化，具体按试剂盒说明步骤进行，获得蛋白命名为裂解酶Gp2。

SDS-PAGE分析结果如图2所示，含有重组质粒的工程菌HeL1经IPTG诱导后，其上清中在约18kD的位置有诱导蛋白条带，与预期大小相符，从而表明，重组菌HeL1构建正确，且表达的裂解酶蛋白产物Gp2为可溶性蛋白。

实施例4

裂解酶Gp2裂解铜绿假单胞菌原生质体

(1)铜绿假单胞菌原生质体的制备

过夜培养的铜绿假单胞菌PAK转接到250mL LB培养基中，培养至OD₆₀₀＝0.6，培养物4℃，4000×g，离心15min，收集菌体。菌体被氯仿饱和的0.05mol/L Tris缓冲液重悬，室温下轻柔振荡45min。4000×g，4℃，离心15min，弃上清收集原生质体。原生质体用10mmol/L的磷酸盐缓冲液洗涤并重悬，最终将原生质体重悬至OD₆₀₀＝0.6-1.0。

(2)原生质体的裂解

终浓度为1μg/mL的裂解酶与原生质体混合加入到细胞培养板中，在室温条件下，使用全波长酶标仪测定每个样品中的吸光度OD₆₀₀，并使用10mmol/L磷酸盐缓冲液作对照。吸光度OD₆₀₀下降速率比阴性对照快，说明原生质体被裂解。

结果：裂解酶Gp2可以在1μg/ml的浓度条件下高效降解铜绿假单胞菌PAK的原生质体，当反应进行1h左右时，50％的PAK的原生质体被降解。

实施例5

裂解酶Gp2裂解游离的铜绿假单胞菌细胞

过夜培养的铜绿假单胞菌PAK转接到250mL LB培养基中，培养至OD₆₀₀＝0.6，4000×g，离心15min，收集菌体。菌体被10mmol/L的磷酸盐缓冲液洗涤并重悬，最终将原生质体重悬至OD₆₀₀＝0.6-1.0。终浓度为1μg/mL的裂解酶与游离的PAK细胞在细胞培养板中混合，在室温条件下，使用全波长酶标仪测定每个样品中的吸光度OD₆₀₀，并使用10mmol/L磷酸盐缓冲液作对照。吸光度OD₆₀₀下降速率比阴性对照快，说明游离细胞被裂解。

结果：裂解酶Gp2可以在1μg/ml的浓度条件下高效降解铜绿假单胞菌PAK，当反应进行1h左右时，50％的PAK的原生质体被降解。

实施例6

裂解酶Gp2作为洗手液的活性成分的杀菌活性

按洗手液重量百分比计各组分含量：

向去离子水中加入甘油、乙酰化羊毛脂、月桂酰胺丙基甜菜碱，加热至55～60℃，搅拌均匀，冷却至室温，用柠檬酸调pH至8～9，然后添加生物杀菌剂噬菌体裂解酶、香精，搅拌，脱气，分装。

表1生物杀菌洗手液(1％稀释液)1小时杀菌效果

菌株	铜绿假单胞菌	枯草芽孢杆菌	地衣芽孢杆菌	蕈状芽孢杆菌
					杀菌率(％)	99.98	90.00	50.00	50.00

除了实施例6以外，本发明还提供以下洗手液配方，配方中含有噬菌体裂解酶，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌均有杀灭作用；各组分的质量百分比为：甘油1～5％，乙酰化羊毛脂1～3％，表面活性剂8～30％，噬菌体裂解酶0.001～0.0001％，pH调节剂0～3％，香精0.01～0.03％，其余为去离子水；所述表面活性剂为十二烷基硫酸钠、十二烷基肌氨酸钠、十二烷基硫酸铵、脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠、脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸铵、椰油酰胺丙基二甲胺乙内酯、月桂酰胺丙基甜菜碱、椰油酰胺丙基氧化胺、Triton X-100、吐温80、吐温20、十四烷基三甲基氯化铵、十烷基三甲基溴化铵中的一种或几种混合。

所述的杀菌洗手液的制备方法为：向去离子水中加入甘油、乙酰化羊毛脂、表面活性剂，加热至55～60℃，搅拌均匀并溶解，冷却至室温，用pH调节剂氢氧化钠或碳酸钠调pH至8～9，然后添加生物杀菌剂噬菌体裂解酶、香精，搅拌，脱气，分装。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明的精神和范围前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进落入要求保护的本发明范围内。

Claims

1.一种类志贺邻单胞菌噬菌体裂解酶的编码基因，其特征在于：其核苷酸序列为SeqID NO.1。

2.一种类志贺邻单胞菌噬菌体裂解酶，其特征在于：其氨基酸序列为Seq ID NO.2。

3.一种含有如权利要求2所述的噬菌体裂解酶的洗手液，其特征在于：组分及重量百分比如下：甘油1～5％，乙酰化羊毛脂1～3％，表面活性剂8～30％，噬菌体裂解酶0.001～0.0001％，pH调节剂0～3％，香精0.01～0.03％，其余为去离子水。