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CN105524936B - 一种突变的海藻糖合酶及其表达基因与应用 - Google Patents

一种突变的海藻糖合酶及其表达基因与应用 Download PDF

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CN105524936B CN201610073828.9A CN201610073828A CN105524936B CN 105524936 B CN105524936 B CN 105524936B CN 201610073828 A CN201610073828 A CN 201610073828A CN 105524936 B CN105524936 B CN 105524936B
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Abstract

本发明涉及一种突变的海藻糖合酶及其表达基因与应用。突变的海藻糖合酶的表达基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。突变的海藻糖合酶，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明首次根据(Pseudomonas stutzeri)Qlu3预测的三维结构为基础，对其活性中心进行关键氨基酸的定点突变，获得了海藻糖合酶的突变体蛋白，该突变的海藻糖合酶制备方法简便，产量大，纯度高，热稳定性好，较野生型海藻糖合酶，突变体的海藻糖转化率提高了4.5％，副产物葡萄糖的生成量降低了69.4％。

Description

一种突变的海藻糖合酶及其表达基因与应用
技术领域
本发明涉及一种突变的海藻糖合酶及其表达基因与应用，属于基因工程技术领域。
背景技术
海藻糖是一种十分安全可靠的非还原性双糖，费雷德里克率先应用核磁共振技术对其化学结构进行了探究，有2个吡喃型葡萄糖单体通过1,1糖苷键连结而成的双糖。十九世纪上半叶由威格斯从一种黑麦的麦角菌中把海藻糖第一次提取获得，并且已经证实了海藻糖对多种生物活性物质具有非特异性保护作用。又因为其耐干旱、抗低温、抗严寒等特性，被很多人称为“生命之糖”。海藻糖能使生物体忍受高温、高寒、高渗透压及干燥失水等恶劣的环境条件，原因是它能够产生一种膜附着在细胞表面，较好地维持蛋白分子不发生变性，进而使得动植物生命特性得以存在。这一独特的功能特性，使得海藻糖除了可以作为蛋白质药物、酶、疫苗和其他生物制品的优良活性保护剂以外，还是保持细胞活性、保湿类化妆品的重要成分，更可作为防止食品劣化、保持食品新鲜风味、提升食品品质的独特食品配料。因此海藻糖可广泛的应用到医药、化妆品业以及食品行业，具有诱人的开发应用前景和巨大的经济效益。
鉴于海藻糖广泛而重要的应用价值，寻找海藻糖高效方便、低成本生产方法的研究被广泛重视。目前海藻糖的生产方法主要有酵母提取法、发酵法、酶合成法。其中酶法生产海藻糖具有较高的特异性和快速温和等特点，已经成为研发海藻糖工业化生产的热点并作为短期可见效的可行性途径之一。
海藻糖合酶(Trehalose synthase,TreS)是一种分子内葡糖苷转移酶，它只需要一步反应就可以将麦芽糖的α-1,4糖苷键转化为α-1,1糖苷键生成海藻糖。该酶反应流程短，易调控，不需要消耗高能物质，不需要磷酸盐共存，只需要一种酶一步反应就能获得海藻糖，因此海藻糖合酶转化法是适宜工业化生产海藻糖的方法，有着良好的应用前景，受到广泛的关注。到目前为止，国内外有报道的能够产海藻糖合酶的微生物已经超过15种。不同微生物来源的海藻糖合酶的催化效率、酶学性质各有不同，但其在反应过程中均伴有副产物的产生，有的高达20％，一般为5％-10％左右，这对下游产物的分离纯化带来了难度，同时提高了海藻糖的生产成本。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种突变的海藻糖合酶及其表达基因与应用。该突变的海藻糖合酶副产物葡萄糖的生成量降低，海藻糖的转化率提高。该海藻糖合酶由来源于施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri Qlu3)的海藻糖合酶经定点突变A309E获得。
本发明技术方案如下：
一种突变的海藻糖合酶的表达基因，核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
一种突变的海藻糖合酶，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明所述海藻糖合酶是通过Quick change定点突变的方法对关键氨基酸309位的丙氨酸突变为谷氨酸，然后转入大肠杆菌进行高效表达后，利用镍柱亲和层析，离子交换层析，分子筛等一系列纯化手段，最终获得高纯度的海藻糖合酶突变体蛋白。上述重组蛋白反应2h即可达到最大转化率，海藻糖转化率即可达到74.7％，副产物仅为1.1％。上述重组蛋白在50℃金属浴中放置30min海藻糖转化率依然可以达到51.2％。上述重组蛋白最适反应温度为35℃。上述重组蛋白最适反应pH为7.0-8.0。
一种插入上述突变的海藻糖合酶的表达基因的重组载体。
一种转基因细胞系，含有上述重组载体。
上述突变的海藻糖合酶的表达基因、重组载体或转基因细胞系在制备海藻糖合酶中的应用。
上述突变的海藻糖合酶在制备海藻糖中的应用。
本发明所述的海藻糖合酶，由施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)Qlu3中获得，具体方法为：对商品化的pET-15b载体的多克隆位点进行改造，删除掉多余的酶切位点，保留BamHI,XhoI,EcolI,HindIII酶切位点，并在其中加入了Prescission酶切位点，获得pGLO1载体。将该基因连接到pGLO1载体上构建成质粒，然后利用Quick change定点突变的方法对关键氨基酸309位的丙氨酸(A)突变谷氨酸(E)，并转化到大肠杆菌BL21DE(3)中进行原核表达。然后通过镍柱亲和层析，Source-Q离子交换层析，Superdex-200分子筛层析的方法分离获得高纯度的突变体海藻糖合酶。
有益效果
本发明首次根据(Pseudomonas stutzeri)Qlu3预测的三维结构为基础，对其活性中心进行关键氨基酸的定点突变，获得了海藻糖合酶的突变体蛋白，该突变的海藻糖合酶制备方法简便，产量大，纯度高，热稳定性好，并且海藻糖转化率由野生型的71.5％提高到74.7％，副产物由野生型的3.6％降低至1.1％，较野生型海藻糖合酶，突变体的海藻糖转化率提高了4.5％，副产物葡萄糖的生成量降低了69.4％。可以降低海藻糖与葡萄糖的分离成本，为海藻糖的工业化生产奠定了基础；也为其他相似蛋白提高转化率提供了可行性方法。
附图说明
图1是PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳结果照片；
图中：M、Marker，T为TreS-pET-15b的目的条带；
图2为镍柱纯化后海藻糖合酶SDS-PAGE电泳结果图片；
图中，ce：破碎后全菌液，s：高速离心后上清，elu：镍柱洗脱后蛋白；
图3为通过高效液相测定的葡萄糖、麦芽糖和海藻糖的标样峰状结果图；
图4为通过高效液相测定反应结束后葡萄糖、海藻糖和麦芽糖的峰状结果图；
图5A为纯化后海藻糖合酶酶活最适反应温度曲线图；
图5B纯化后海藻糖合酶酶活温度稳定曲线图；
图6A为纯化后海藻糖合酶最适反应pH曲线图；
图6B纯化后海藻糖合酶pH稳定曲线图；
图7A为纯化后海藻糖合酶与突变体反应时间对海藻糖转化率影响的曲线图；
图中：TreS为野生型海藻糖合酶，TreSA309E为突变的海藻糖合酶；
图7B为纯化后海藻糖合酶与突变体反应时间对葡萄糖转化率影响的曲线图；
图中：TreS为野生型海藻糖合酶，TreSA309E为突变的海藻糖合酶。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。
实施例1：克隆得到突变的海藻糖合酶基因。
依据NCBI上公开的施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)海藻糖合酶全长核苷酸序列设计突变点处的引物，引物序列如下：
上游引物：GTGGCCCTCCGACCAttcGGTGCC
下游引物：CGTGCCGAGGGCACCgaaTGGTCG
以构建好的tres-pGLO1质粒为模板，利用上述引物进行PCR扩增，PCR反应体系如下：
上述PCR反应按照如下程序进行：
98℃预变性3min；98℃变性10s，58℃退火30s，72℃延伸4min，25个循环；72℃终延伸10min。
PCR结束后通过1wt％的琼脂糖凝胶电泳分析片段长短。
实施例2：将突变的海藻糖合酶基因转化到表达宿主中，获得阳性表达菌株。
PCR产物经DpnI内切酶酶切反应，酶切反应体系如下：
PCR产物的酶切体系：
充分混匀后离心数秒，将管壁液滴收到管底，37℃连接反应30min。
重组质粒的转化
(1)感受态细胞的制备
①挑取大肠杆菌BL21(DE3)(购自上海前尘生物科技有限公司)单菌落(或挑取保存菌种)接种至10ml液体LB培养基中，37℃，210rpm过夜培养；
②取5ml菌液接种于500ml LB培养基中，37℃，210rpm，摇70-80min至OD600达到0.375；
③将菌液放置于冰水混合物上10min，同时预冷50ml离心管；
④将菌液转移到离心管中，4℃，3700rpm，10min收集菌体，弃上清；
⑤每个离心管中加入大约10ml冰预冷的激活缓冲液(0.1M CaCl2)，用灭过菌的5ml枪尖打散沉淀，然后再向每个管中加大约30ml冰预冷的激活缓冲液，颠倒混匀，冰上静置20min；
⑥4℃，3700rpm，离心10min；弃上清，将残液倒净，按500ml菌液12ml冰预冷储存buffer(0.1M CaCl2，体积百分比15％甘油)的量，将沉淀打散，(分次转移，然后吹吸打散)。
⑦将感受态细胞分装到冰预冷的灭菌EP中，每管100微升，置于冰上(0℃)30min。
⑧感受态-80℃冻存，制得感受态细胞BL21(DE3)。
注意：整个过程尽量让细胞处于低温，所用的枪尖，离心管，EP管和buffer等均要灭菌，整个过程都在超净台里操作，感受态细胞做完后要test其效率和是否染菌。
(2)连接产物转化
①将15μL连接产物加入100μL新鲜制备的感受态细胞BL21DE(3)中，轻轻混匀，冰浴30min。
②42℃热激90s，然后迅速置于冰浴中冷却3min。
③加入200μL LB液体培养基，37℃，180rpm/min振荡培养60min，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因；
④取上述菌液200μL，涂布于带有抗性的LB固体培养基(氨苄青霉素100mg/L)。
⑤待菌液被吸干后，倒置平板于37℃培养12～16h。
LB液体培养基组分如下：
5g酵母粉，10g蛋白胨，10g NaCl，加水至1L，121℃高压灭菌20min备用。
LB固体培养基组分如下：
5g酵母粉，10g蛋白胨，10g NaCl，2％琼脂粉，加水至1L，121℃高压灭菌20min备用。
阳性克隆的鉴定
(1)菌落PCR鉴定
挑取单菌落，37℃振荡培养6～8h，吸取1μL菌液，按照15μLPCR反应体系，进行PCR鉴定。若为阳性克隆，通过琼脂糖凝胶电泳可检测到一条目的条带，如图1所示。
(2)蛋白表达及可溶性鉴定
将菌落PCR鉴定剩余菌液中加入终浓度为0.2mM的IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)，诱导表达1h，12000rpm/min,离心1min，弃上清，收集菌体。加入2倍上样缓冲液，用枪尖悬起沉淀，95℃变性10min。若为阳性克隆，通过SDS-PAGE可检测到有蛋白过表达。
(3)DNA测序
将用以上两种方法鉴定后的阳性克隆，经测序序列正确，得到的阳性克隆中所插入的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
实施例3：发酵培养阳性表达菌株，分离纯化突变的海藻糖合酶重组蛋白
种子培养：以常规方法挑取实施例2制得的阳性克隆置于5mL的含有100μg/L氨苄青霉素的LB液体培养基中，在37℃振荡培养5-6h；
菌体扩大培养：将种子接入1L含有100mg氨苄青霉素的液体培养基中，37℃振荡培养至菌浓OD600为1.0时，降温至16℃；1小时后加入终浓度为0.2mM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，过夜诱导表达。
收集菌体：4200rpm，4℃离心15min，弃去上清，收获菌体；加入重悬溶液(25mMTris-HCl,pH8.0，200mM NaCl)，振荡沉淀菌体细胞；加入蛋白酶抑制剂PMSF(Phenylmethylsulfonyl fluoride，苯甲酸磺酰氟)至终浓度为2mM。
超声破碎菌体细胞：超声3s，间隔6s，500W，工作60次。
超速离心：超声之后的细胞破碎液在14000rpm，4℃条件下离心45min，收集上清液，进行下一步的分离纯化。
Ni-NTA亲和层析：将收集的含有可溶性蛋白的上清液体倒入再生好的镍柱中；上清液流净后，以wash buffer(25mM Tris-HCl，pH8.0，100mMNaCl，15mM咪唑)冲洗10个柱体积，除去非特异性吸附的蛋白；最后使用elution buffer(25mM Tris-HCl，pH8.0，100mMNaCl，250mM咪唑)将目的蛋白洗脱下来，用干净预冷烧杯收集；使用SDS-PAGE电泳检测蛋白是否可溶，可溶的蛋白是否能够与Ni-NTA结合，是否能够被洗脱下来，及蛋白的浓度，结果如图2所示。
阴离子交换层析纯化(Source-Q)：将Ni-NTA亲和层析系脱下的可溶性蛋白用溶液A(25mM Tris-HCl,pH8.0)稀释3～4倍，然后上样到已使用溶液A平衡好的离子交换柱SourceQ上，使用溶液A与溶液B(25mM Tris-HCl，pH8.0，1M NaCl)进行线性梯度洗脱。观察280nm的吸光值(A280)变化情况，收集各个出峰位置附近的收集管，并进行SDS-PAGE电泳，以便得到目的蛋白质。
分子筛纯化：根据离子交换柱蛋白质峰的形状，有无“肩膀”及是否对称、尖锐来判断蛋白质在离子交换柱上的性状。对于性状好的蛋白质进行超滤浓缩至2mL，上样到已经用溶液C(25mM Tris-HCl，pH8.0，100mM NaCl)平衡好的凝胶过滤层析柱Superdex-200上，流速为0.4mL/min。收集蛋白峰并进行SDS-PAGE电泳，检测蛋白质的纯度及性状。经测序，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，即为突变的海藻糖合酶。
实施例4：突变的海藻糖合酶的酶活测定方法
在反应体系中加入150mM麦芽糖，20mM Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液pH7.0，1μM实施例3制得的突变的海藻糖合，在37℃下反应2h。通过高压液相的方法测定海藻糖的转化率，测定过程中采用氨基柱；柱温为40℃流动相采用乙腈与水的混合溶液，二者体积比为3:1；流速为1mL/min；检测器为示差检测器；检测时间为25min。标准品检测结果见图3按照如下公式计算转化率：
根据图4所示的高效液相结果中麦芽糖峰面积，海藻糖峰面积及葡萄糖峰面积利用软件拟合得到曲线，计算三者的质量，其中m3为转化为海藻糖的质量，m2为转化为葡萄糖的质量，m1为剩余麦芽糖的质量。
实施例5：突变的海藻糖合酶的生化性质测定
最适反应温度的测定：
将酶液稀释合适的倍数后，于20℃，25℃，30℃，35℃，40℃，45℃，50℃，55℃，60℃中反应2h，利用高压液相的方法测定海藻糖合酶的转化率。结果如图5A所示。海藻糖合酶重组蛋白的最适反应温度为35℃。
温度稳定性的测定：
将酶液稀释一定的倍数后，于20℃，25℃，30℃，35℃，40℃，45℃，45℃，50℃,55℃，60℃中保温30min，加入底物麦芽糖，然后反应2h,测定海藻糖转化率。结果见如图5B所示。海藻糖合酶在50℃金属浴中放置30min依然保持70％的酶活。
最适反应pH值的测定：
用pH5.0,5.5,6.0,6.5,7.0,7.5,8.0,8.5,9.0,9.5,10,0.10.5,11。一系列的磷酸盐缓冲液稀释重组海藻糖合酶突变体。然后置于35℃反应2h，测定酶活。结果见如图6A所示。
pH稳定性的测定：
将酶液稀释一定的倍数后，用pH5.0,5.5,6.0,6.5,7.0,7.5,8.0,8.5,9.0,9.5,10,0.10.5,11一系列的磷酸盐缓冲液稀释重组海藻糖合酶突变体。35℃中保温30min，加入底物麦芽糖，然后反应2h,测定海藻糖转化率。结果见如图6B所示。海藻糖合酶突变体在pH7.0-8.0期间酶活保持95％以上。
实施例6：突变的海藻糖合酶的最佳反应时间测定
反应体系为150mM麦芽糖，20mM Na2HPO4-NaH2PO4pH7.2，1μM海藻糖合酶突变体重组蛋白，在37℃下反应，在5min，20min，40min，1h，2h，3h，4h不同时间进行取样，然后使用HPLC进行检测，检测方法同实施例4。通过计算得到转化率。海藻糖合酶突变体反应进行海藻糖转化率即可达到74.7％，葡萄糖转化率为1.1％。如图7所示。
对比实验
由于海藻糖合酶突变体使海藻糖合酶的转化率提高，副产物降低。将突变前后的海藻糖合酶酶液稀释合适倍数后，在37℃下反应，在5min，20min，40min，1h，2h，3h，4h不同时间进行取样，然后使用HPLC进行检测，检测方法同实施例4。通过计算得到转化率。该 海藻糖合酶蛋白制备方法简便，产量大，纯度高；实验验证其热稳定性好，并且海藻糖转化率由野生型的71.5％提高到74.7％，结果如图7A所示；并且副产物由野生型的葡萄糖转化率3.6％降低至1.1％，如图7B所示。较突变前海藻糖合酶，突变体的海藻糖转化率提高了4.5％，而副产物葡萄糖的产量降低了69.4％。可以降低海藻糖与葡萄糖的分离成本，为海藻糖的工业化生产奠定了基础；也为其他相似蛋白提高转化率提供了可行性方法。

Claims (7)

1.一种突变的海藻糖合酶的表达基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种突变的海藻糖合酶，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.一种重组载体，表达载体中插入了权利要求1所述的表达基因。
4.如权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述表达载体为pET-15b。
5.一种转基因细胞系，含有权利要求3所述的重组载体。
6.权利要求1所述突变的海藻糖合酶的表达基因、权利要求3所述的重组载体或权利要求5所述的转基因细胞系在制备海藻糖合酶中的应用。
7.权利要求2所述的突变的海藻糖合酶在制备海藻糖中的应用。
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