CN105445458A - 鉴别鸭坦布苏病毒感染动物和灭活苗免疫动物的elisa检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鉴别鸭坦布苏病毒感染动物和灭活苗免疫动物的ELISA检测试剂盒及其检测方法，属于检测试剂盒领域。本发明的试剂盒包括：鸭坦布苏病毒E重组蛋白包被酶标板、NS1重组蛋白包被酶标板、标准阳性对照血清、标准阴性对照血清、兔抗鸭酶标二抗、样品稀释液、浓缩洗液、TMB底物显色液和终止液。可对动物血清中的坦布苏病毒感染情况进行早期诊断，可做到早发现、早防控。同时使用E-ELISA和NS1-ELISA检测方法进行血清学调查，即可区别野毒感染动物和灭活疫苗免疫动物，根据血清学调查结果制定相应的防控策略，通过淘汰或诊治，逐步减少野毒感染动物数量，达到最终净化该病的目的。
Description
技术领域
本发明涉及检测试剂盒领域，特别涉及一种鉴别鸭坦布苏病毒感染动物和灭活苗免疫动物的ELISA检测试剂盒。
背景技术
自2010年4月份以来，我国浙江、福建、广东、广西、江苏、江西、安徽、河南、河北、山东和北京等地相继暴发一种新鸭病，中东部地区的大部分鸭场均出现。该病主要导致产蛋严重下降，且传播迅速、涉及范围广，发病前期为持续高热，发病后期出现一定比例的神经症状，表现为瘫痪、翻滚、站立不稳及共济失调。该病病程约为1-2个月，耐过种鸭群可逐渐恢复产蛋，淘汰率一般为10%-30%，给全国养鸭业造成了严重的经济损失。
经过各地专家学者研究发现，从发病鸭体组织分离出一种新型黄病毒，根据地域命名原则命名为BYD（BaiYangDian）病毒。2011年中国畜牧兽医学会第一届水禽疫病防控研讨会上，将该病统一命名为“鸭坦布苏病毒”，是一种新型鸭黄病毒。
自然条件下，该病毒可感染除番鸭外的所有品种产蛋鸭（如绍兴鸭、山麻鸭、缙云麻鸭、金定鸭等）、肉种鸭（如樱桃谷鸭和北京鸭）及野鸭等。从单场来看，一旦染病，全场产蛋期种鸭几无幸免，且发病时间迅速，多在3～7d内波及全群。病毒核酸为不分节段的感染性的单股正链RNA，全长约10990核苷酸，包含单个开放阅读框（ORF）、5'非编码区（UTR）和3'非编码区（UTR）。基因组结构顺序依次是5’-UTR-Cv-Ci-PrM-M-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-UTR-3’。
E蛋白是主要抗原蛋白，具有良好的免疫原性，具有血凝活性，可激发机体产生中和抗体和免疫应答，对抵抗病毒感染和增殖具有重要意义。是未来疫苗研究和诊断抗原的首选。NS1蛋白是病毒感染过程的主要免疫原，高度保守，是唯一能够在感染细胞中产生的非结构蛋白，能够诱导细胞免疫和体液免疫，可用于出现临床症状之前病毒感染早期的血清学诊断。
该病近年来在我国大部分省、市、自治区均有流行，给养禽业造成很大的经济损失。国内外用于坦布苏病毒病血清学检测方法主要有中和试验和ELISA，中和试验由于操作繁琐、时间冗长，给及时的诊断和预防检测带来不便。而ELISA方法具有特异性强、敏感性高、操作简便、快速准确等优点，更适合短时间内检测大批量的血清样品，适用范围更广。现有间接ELISA检测方法，有的以全病毒作为抗原包被酶标板，此方法具有潜在散毒的危险，同时成本高；有的仅以E蛋白作为抗原包被酶标板，这种方法不能区别动物是野毒感染还是灭活疫苗免疫带毒，同时也不利于及时了解鸭群感染情况，无法对野毒感染早期的动物进行诊断防控。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明提供了一种可以区分野毒感染还是灭活疫苗免疫带毒，同时可以对动物进行早期诊断防控的鉴别鸭坦布苏病毒感染动物和灭活苗免疫动物的ELISA检测试剂盒。
本发明的技术方案为：
一种鉴别鸭坦布苏病毒感染动物和灭活苗免疫动物的ELISA检测试剂盒，包括：鸭坦布苏病毒E重组蛋白包被酶标板、NS1重组蛋白包被酶标板、标准阳性对照血清、标准阴性对照血清、兔抗鸭酶标二抗、样品稀释液、浓缩洗液、TMB底物显色液和终止液。
作为优选，所述鸭坦布苏病毒E重组蛋白包被酶标板通过用在原核表达系统中重组表达的鸭坦布苏病毒E蛋白包被ELISA板制得；所述NS1重组蛋白包被酶标板通过用在原核表达系统中重组表达的鸭坦布苏病毒NS1蛋白包被ELISA板制得。
作为优选，所述标准阳性对照血清为鸭坦布苏病毒灭活疫苗免疫若干次SPF鸭后分离得到的鸭血清。
进一步地，所述标准阴性对照血清为未感染鸭坦布苏病毒的鸭血清。
作为优选，所述兔抗鸭酶标二抗为HRP标记的兔抗鸭二抗。
所述鉴别鸭坦布苏病毒感染动物和灭活苗免疫动物的ELISA检测试剂盒的检测方法，包括步骤：
1）将待测鸭血清样品、标准阳性对照血清和标准阴性对照血清分别加入所述鸭坦布苏病毒E重组蛋白包被酶标板和NS1重组蛋白包被酶标板的独立孔中，37℃反应1-3h后，4℃过夜；
2）将每孔洗涤后，分别加入所述兔抗鸭酶标二抗，37℃反应0.5-2h；
3）将每孔洗涤后，分别加入TMB底物显色液进行显色反应；
4）加入终止液，终止显色反应，在酶标仪上读数；
5）判断：E-ELISA待测样品OD值大于等于0.348时，待测样品为阳性，否则为阴性；NS1-ELISA待测样品OD值大于等于0.416时，待测样品为阳性，否则为阴性；若E-ELISA检测阳性而NS1-ELISA检测阴性，明待测血清样品为灭活疫苗免疫动物血清；若E-ELISA检测阴性而NS1-ELISA检测阳性，待测血清样品为临床症状出现前的早期感染动物血清；若E-ELISA和NS1-ELISA检测均阳性，待测血清样品为野毒自然感染动物血清；若E-ELISA和NS1-ELISA检测均阴性，待测血清样品没有感染坦布苏病毒。
本发明制备的E-ELISA检测试剂盒用于鸭坦布苏病毒感染后的抗体检测，检测的样品为鸭血清。NS1-ELISA检测试剂盒用于出现临床症状前的早期感染的血清抗体检测，同时使用E-ELISA和NS1-ELISA检测试剂盒用于野毒感染动物和灭活疫苗免疫动物的区别检测。
将自行分离的鸭坦布苏病毒La株，感染Vero（非洲绿猴肾，病毒培养常用细胞）细胞，待病变后收获细胞毒保存备用。从细胞毒提取病毒核酸RNA，反转录后获得cDNA，利用特异性引物（引物序列见表1）扩增分别得到E基因片段和NS1基因片段，经过双酶切方法，将其分别克隆至相应的原核表达载体中，在原核宿主细胞中进行表达并纯化，得到重组E蛋白和重组NS1蛋白。经过定量后可作为抗原包被ELISA板。
为便于纯化，经原核表达的重组E蛋白和重组NS1蛋白的N末端均带有His标签，可用镍柱进行纯化。
利用鸭坦布苏病毒重组E蛋白和重组NS1蛋白包被ELISA板可以按照本领域的常规方法进行。
重组E蛋白包被的ELISA板可以按照以下过程操作得到：
用包被液(pH9.6)将已纯化的重组E蛋白稀释为1.2μg/mL，将混合液加入到96孔酶标板中，100μL/孔，37℃2h后置于4℃过夜；倾尽96孔板中液体，利用PBST(pH7.4)洗涤，250μL/孔，每次5m，洗3次；倾尽96孔板中的液体，加入封闭液，250μL/孔，置于4℃封闭过夜；倾尽96孔板中的液体，加入PBST(pH7.4)，250μL/孔，洗3次，每次5m。倾尽96孔板中的液体，将板置于37℃，干燥2h，放入有干燥剂塑料袋中，-20°保存备用。
重组NS1蛋白包被的ELISA板可以按照以下过程操作得到：
用包被液(pH9.6)将已纯化的重组NS1蛋白稀释为35μg/mL，将混合液加入到96孔酶标板中，100μL/孔，37℃2h后置于4℃过夜；倾尽96孔板中液体，利用PBST(pH7.4)洗涤，250μL/孔，每次5m，洗3次；倾尽96孔板中的液体，加入封闭液，250μL/孔，置于4℃封闭过夜；倾尽96孔板中的液体，加入PBST(pH7.4)，250μL/孔，洗3次，每次5m。倾尽96孔板中的液体，将板置于37℃，干燥2h，放入有干燥剂塑料袋中，-20°保存备用。
标准阴性对照血清为未感染坦布苏病毒的鸭血清，标准阳性对照血清为鸭坦布苏病毒灭活疫苗免疫5次SPF鸭后分离得到的鸭血清。
兔抗鸭酶标二抗可以商购得到，例如，可从EarthOX公司购买HRP标记的兔抗鸭二抗。
所述试剂盒中的样品稀释液，20×浓缩洗液，TMB底物显色液，终止液。其成分及配制方法如下：
1)样品稀释液：每个试剂盒装量1瓶，200mL/瓶；20×浓缩洗液：KH2PO44.8g，Na2HPO4-12H2O72.56g，NaCl160g，KCl4g，去离子水800mL，调pH值至7.4，添加去离子水至1L，在此溶液中添加5mLTween-20。使用时20×浓缩洗液按照1：19(V/V)稀释获得样品稀释液。
2)包被液（0.05mol/L碳酸盐缓冲液，pH值9.6）：每个试剂盒装量1瓶，250mL/瓶。Na2CO31.59g，NaHCO32.93g，加去离子水溶解至1L。
3)TMB底物显色液购自天根公司，每个试剂盒装量1瓶/盒50mL。
4)终止液：每个试剂盒装量1瓶，250mL/瓶；终止液的配制：2mol/L硫酸溶液(H2SO4)，浓硫酸溶液浓度为18mol/L，浓硫酸与去离子水按1：9配制。
5)封闭液的配制：脱脂奶粉5g，去离子水100mL。
6）组装：将鸭坦布苏病毒E重组蛋白包被酶标板、NS1重组蛋白包被酶标板与适量的标准阳性对照血清、标准阴性对照血清、兔抗鸭二抗、样品稀释液、20×浓缩洗液、TMB显色液、终止液及自封袋、使用说明书组装成试剂盒。
E蛋白是鸭坦布苏病毒的主要抗原，具有良好的免疫原性，可刺激产生对机体保护的中和抗体；NS1蛋白是病毒非结构蛋白，高度保守，是唯一能够在感染细胞中产生的非结构蛋白，能够诱导细胞免疫和体液免疫，可用于病毒感染早期的血清学诊断。由于针对NS1的抗体只在野毒感染宿主中存在，在灭活疫苗免疫的动物体内检测不到，所以可用来区分野毒感染动物和灭活疫苗免疫动物，从而对该病的防控及净化具有重要的指导意义。
通过对Genbank中登录的国内不同分离株的序列比较分析，设计E基因和NS1基因PCR引物，分别克隆至原核表达载体，对表达的蛋白进行纯化后，以其为包被抗原分别建立了检测鸭坦布苏病毒血清的E-ELISA和NS1-ELISA检测方法。
本发明的有益效果为：
1、建立的NS1-ELISA检测方法可对动物血清中的坦布苏病毒感染情况进行早期诊断，可做到早发现、早防控，避免更大规模的损失。
2、同时使用E-ELISA和NS1-ELISA检测方法进行血清学调查，即可区别野毒感染动物和灭活疫苗免疫动物，根据血清学调查结果制定相应的防控策略，通过淘汰或诊治，逐步减少野毒感染动物数量，达到最终净化该病的目的。
3、直接对鸭血清进行检测，无需病毒分离、核酸提取等操作，而且可高通量检测多份样品，2h出结果，省时省力，特异性强、灵敏度高。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1.E基因和NS1基因的PCR扩增电泳图谱；1：E基因；3：NS1基因；2和4：阴性对照；M：DL2000。
图2.重组E蛋白和NS1蛋白的SDS-PAGE；1-2：pET32a-NS1包涵体；3：pET32a（+）空载体；4：pET32a-NS1超声前；5：pET32a-NS1包涵体；6：pET32a-NS1超声后上清；7：pET30a-E超声后上清；8：pET30a-E包涵体；9：pET30a-E超声前；10：pET30a（+）空载体；11-12：pET30a-E包涵体；M:26616蛋白Marker。
图3.重组E蛋白和NS1蛋白的Westernblot分析；1：纯化的重组NS1蛋白；2：纯化的重组E蛋白；M，蛋白Marker。
具体实施方式
下述实施例中所用的试剂如无特别说明，均为市售分析纯级。
实施例1.坦布苏病毒E蛋白和NS1蛋白的原核表达与纯化
1)蛋白基因的获得：提取鸭坦布苏病毒细胞毒基因组总RNA，经E基因和NS1基因特异性引物进行RT-PCR扩增（见图1）。1％琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物，分别与原核表达载体pET30a和pET32a连接，经菌落PCR、双酶切和测序鉴定，获得重组质粒pET30a-E和pET32a-NS1。
表1.设计的E基因和NS1基因的引物序列
扩增得到的鸭坦布苏病毒E蛋白的编码核苷酸序列见SEQIDNo.1，扩增得到的鸭坦布苏病毒NS1蛋白的编码核苷酸序列见SEQIDNo.2。
2)重组蛋白的表达：将pET30a-E和pET32a-NS1以及空载体分别转化Roseeta（DE3）表达菌，挑取长势良好光滑的单个菌落接种于含有100mg/L卡那霉素、100mg/L氨苄青霉素的LB培养基中震摇培养，当OD600值约为0.6-1.0时，加IPTG至终浓度为0.5mmol/L，25℃诱导培养4h，收集菌体沉淀，超声波裂解后分别进行SDS-PAGE和WesternBlot分析。结果显示分子量为38kD和50kD的目的蛋白均存在。重组E蛋白的氨基酸序列见SEQIDNo.3，重组NS1蛋白的氨基酸序列见SEQIDNo.4。
3)重组蛋白的纯化：将大量制备的诱导菌液经超声裂解后，在4℃4000g离心10min后，收集沉淀，用8M尿素溶解后，用HisTrapTMHP(GEHealthcare)进行蛋白纯化(操作按说明书进行)。经Ni柱纯化后的重组蛋白经SDS-PAGE和WesternBlot进行纯度分析（见图2，图3），并经蛋白/核酸测定仪测重组蛋白浓度。
实施例2.重组E蛋白和NS1蛋白包被ELISA板
重组E蛋白包被的ELISA板可以按照以下过程操作得到：
用包被液(pH9.6)将已纯化的重组E蛋白稀释为1.2μg/mL，将混合液加入到96孔酶标板中，100μL/孔，37℃2h后置于4℃过夜；倾尽96孔板中液体，利用PBST(pH7.4)洗涤，250μL/孔，每次5m，洗3次；倾尽96孔板中的液体，加入封闭液，250μL/孔，置于4℃封闭过夜；倾尽96孔板中的液体，加入PBST(pH7.4)，250μL/孔，洗3次，每次5m。倾尽96孔板中的液体，将板置于37℃，干燥2h，放入有干燥剂塑料袋中，-20°保存备用。
重组NS1蛋白包被的ELISA板可以按照以下过程操作得到：
用包被液(pH9.6)将已纯化的重组NS1蛋白稀释为35μg/mL，将混合液加入到96孔酶标板中，100μL/孔，37℃2h后置于4℃过夜；倾尽96孔板中液体，利用PBST(pH7.4)洗涤，250μL/孔，每次5m，洗3次；倾尽96孔板中的液体，加入封闭液，250μL/孔，置于4℃封闭过夜；倾尽96孔板中的液体，加入PBST(pH7.4)，250μL/孔，洗3次，每次5m。倾尽96孔板中的液体，将板置于37℃，干燥2h，放入有干燥剂塑料袋中，-20°保存备用。
实施例3.E-ELISA和NS1-ELISA试剂盒的组装
1)按照每个试剂盒检测500个样次的量进行组装：
2)阳性对照：将阳性标准对照血清按按1:100稀释（PBST），1mL/瓶定量分装，置于-20℃保存，有效期12个月；
3)阴性对照：将阴性标准对照血清按按1:100稀释（PBST），1mL/瓶定量分装，置于-20℃保存，有效期12个月；
4)酶标二抗：EarthOX公司购买的HRP标记的兔抗鸭二抗，每个试剂盒50mL分装(1：2500，用PBST稀释)，4℃保存，有效期12个月。
5)其他试剂：按溶液体积定量分装，常温下保存，有效期12个月。
所述其他试剂的配制及具体用量如下：
a)样品稀释液：每个试剂盒装量1瓶/盒，200mL；20×浓缩洗液：KH2PO44.8g，Na2HPO4-12H2O72.56g，NaCl160g，KCl4g，去离子水800mL，调pH值至7.4，添加去离子水至1L，在此溶液中添加5mLTween-20。使用时按照1：19(V/V)稀释获得样品稀释液。
b)包被液（0.05mol/L碳酸盐缓冲液，pH值9.6）：每个试剂盒装量1瓶，250mL/瓶。Na2CO31.59g，NaHCO32.93g，加去离子水溶解至1L。
c)TMB底物显色液购自天根公司，每个试剂盒装量1瓶/盒，50mL。
d)终止液：每个试剂盒装量1瓶，250mL/瓶；终止液的配制：2mol/L硫酸溶液(H2SO4)，浓硫酸溶液浓度为18mol/L，浓硫酸与去离子水按1：9配制。
e)封闭液的配制：脱脂奶粉5g，去离子水100mL。
f)100mmol/LPBST(pH值7.4)的配制如下：0.26gKH2PO4，2.89gNa2HPO4-12H2O，8.71gNaCl，800ml去离子水，100μl硫柳汞，调PH值至7.4，添加无离子水至1L，在此溶液中添加5mLTween-20。
6)按照实施例2的包被方法用坦布苏病毒E蛋白和NS1蛋白包被的酶标板各5块。
7）组装：将鸭坦布苏病毒E重组蛋白包被酶标板、NS1重组蛋白包被酶标板、标准阳性对照血清、标准阴性对照血清、兔抗鸭酶标二抗、样品稀释液、20×浓缩洗液、TMB底物显色液和终止液，以及自封袋、使用说明书组装成试剂盒。
实施例4.E-ELISA和NS1-ELISA抗体检测试剂盒的检测规程
A.样品的稀释：取待检测的禽类血清样品，用样品稀释液稀释100倍。
B.分别加入100μL的标准阳性、阴性对照血清及100倍稀释的被检血清样品，每种血清样品三个重复孔。
C.盖上保鲜膜，37℃作用1h。
D.去膜，用200μL的1×洗液洗3遍，每次5m，并将ELISA板中的液体拍干。
E.在每个反应孔中加入100μL的酶标二抗(HRP标记的兔抗鸭二抗)。
F.盖上膜，37℃作用1h。
G.去膜，用200μL的1×洗液洗3遍，每次5m，并将ELISA板中的液体拍干。
H.在每个反应孔中加入100μL的TMB底物显色液，在黑暗处作用15min。
I.在每个反应孔中加入100μL的终止液。
J.5-10min内，将ELISA板放入酶标仪(FC，购自Thermo)中，在450nm下完成读数，并记录结果。
K.结果判定：每一样品三个孔的OD值应基本一致，若测定值差别较大，该酶标板测定无效。若阳性对照值OD低于或接近标准阴性对照OD值时，测定也无效。E-ELISA时，待测样品OD值大于等于0.348时，说明待测样品为阳性，否则为阴性；NS1-ELISA时，待测样品OD值大于等于0.416时，说明待测样品为阳性，否则为阴性。若E-ELISA检测阳性而NS1-ELISA检测阴性时，说明待测血清样品为灭活疫苗免疫动物血清，若E-ELISA检测阴性而NS1-ELISA检测阳性时，说明待测血清样品为临床症状出现前的早期感染动物血清，若E-ELISA和NS1-ELISA检测均阳性时，说明待测血清样品为野毒自然感染动物血清，若E-ELISA和NS1-ELISA检测均阴性时，说明待测血清样品没有感染坦布苏病毒。
例如，采集自某个鸭场临床血清139份，按照本发明的E-ELISA和NS1-ELISA的操作步骤进行检测，结果E-Elisa和NS1-ELISA同时检测阳性血清样品129份，为野毒自然感染动物血清；同时检测阴性血清样品7份，为未感染坦布苏病毒的动物血清；NS1-Elisa检测阳性而E-ELISA检测阴性的待测血清样品3份，为临床症状出现前的早期感染动物血清。
L.特异性检验：对禽细小病毒、禽流感病毒、新城疫病毒、禽呼肠孤病毒、I型鸭肝炎病毒、鸭瘟病毒阳性血清检测均呈阴性反应，说明本发明的试剂盒能够特异性检测鸭坦布苏病毒。
SEQIDNo.1
tactgctatgagccgaaagtgtcggacgtgacgacagaatccagatgcccaaccatggga60
gaggctcataatcccaaggcaacttatgctgaatacatatgcaaaaaagattttgtggac120
aggggttggggcaatggctgtggcttgtttggaaaggggagcatacagacatgtgccaag180
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gttgcagttttcatacatggttccacggaagcgagcacctaccacaattattcagcccag300
cagtcgctgaaacatgccgccagattcgttataacgcccaaaagtcccgtctacaccgct360
gagatggaggattatggtaccgtcacactcgaatgtgaaccccgatctggggttgacatg420
gggcaattctatgtctttaccatgaacacaaaaagctggcttgttaacagagactggttt480
catgatctcaacttaccatggacagggtcatcagcggggacgtggcaaaacaaagagtca540
ttgatagaatttgaggaggcccacgccaccaaacaatcagtggtggctttggcatcacaa600
gaaggagccctccatgcagcattggcgggagctattccagtgaagtactctggaagcaaa660
ttggaaatgacctcaggtcatcttaaatgcagggttaaaatgcagggtttgaagctgaaa720
ggaatgacctacccgatgtgtagtaatacattttccctagtgaagaatcctaccgacact780
gggcatggcactgtcgtggtggaattgtcttatgcaggtaccgatgggccctgtagagtt840
cccatatccatgtcggcagatctg864
SEQIDNo.2
atgtttgtcttcaacgatgttgaggcttggaaggataattataagtactatccatccaca60
ccaaggagacttgccaaagtcgtggcagaagctcatgaggctggaatttgtggcatacga120
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gaggtgaagtcatgcacatggccggaaacccacacactgtggagtgacagcgttgtggag660
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ggatataaggttcagagttccggaccgtgggatgagaaagagattgtaatagacttcgac780
tactgccctggaacaactgtcacagtaacgagctcgtgccgcgacagagggccttcagct840
aggacaacaacagcgagtgggaaactgataacagattggtgctgtaggtcttgcactacc900
ccaccactgagatttgttaca921
SEQIDNo.3
TyrCysTyrGluProLysValSerAspValThrThrGluSerArgCys
151015
ProThrMetGlyGluAlaHisAsnProLysAlaThrTyrAlaGluTyr
202530
IleCysLysLysAspPheValAspArgGlyTrpGlyAsnGlyCysGly
354045
LeuPheGlyLysGlySerIleGlnThrCysAlaLysPheAspCysThr
505560
LysLysAlaGluGlyArgIleValGlnLysGluAsnValGlnPheGlu
65707580
ValAlaValPheIleHisGlySerThrGluAlaSerThrTyrHisAsn
859095
TyrSerAlaGlnGlnSerLeuLysHisAlaAlaArgPheValIleThr
100105110
ProLysSerProValTyrThrAlaGluMetGluAspTyrGlyThrVal
115120125
ThrLeuGluCysGluProArgSerGlyValAspMetGlyGlnPheTyr
130135140
ValPheThrMetAsnThrLysSerTrpLeuValAsnArgAspTrpPhe
145150155160
HisAspLeuAsnLeuProTrpThrGlySerSerAlaGlyThrTrpGln
165170175
AsnLysGluSerLeuIleGluPheGluGluAlaHisAlaThrLysGln
180185190
SerValValAlaLeuAlaSerGlnGluGlyAlaLeuHisAlaAlaLeu
195200205
AlaGlyAlaIleProValLysTyrSerGlySerLysLeuGluMetThr
210215220
SerGlyHisLeuLysCysArgValLysMetGlnGlyLeuLysLeuLys
225230235240
GlyMetThrTyrProMetCysSerAsnThrPheSerLeuValLysAsn
245250255
ProThrAspThrGlyHisGlyThrValValValGluLeuSerTyrAla
260265270
GlyThrAspGlyProCysArgValProIleSerMetSerAlaAspLeu
275280285
SEQIDNo.4
MetPheValPheAsnAspValGluAlaTrpLysAspAsnTyrLysTyr
151015
TyrProSerThrProArgArgLeuAlaLysValValAlaGluAlaHis
202530
GluAlaGlyIleCysGlyIleArgSerValSerArgLeuGluHisAsn
354045
MetTrpValSerIleLysHisGluLeuAsnAlaIleLeuGluAspAsn
505560
AlaIleAspLeuThrValValValGluGluAsnProGlyArgTyrArg
65707580
LysThrAsnGlnArgLeuProAsnValAspGlyGluLeuMetTyrGly
859095
TrpLysLysTrpGlyLysSerIlePheSerSerProLysMetSerAsn
100105110
AsnThrPheValIleAspGlyProLysThrLysGluCysProAspGlu
115120125
ArgArgAlaTrpAsnSerMetLysIleGluAspPheGlyPheGlyVal
130135140
LeuSerThrLysValTrpMetGluMetArgThrGluAsnThrThrAsp
145150155160
CysAspThrAlaValMetGlyThrAlaIleLysGlyAsnArgAlaVal
165170175
HisSerAspLeuSerTyrTrpIleGluSerLysAsnAsnGlySerTrp
180185190
LysLeuGluArgAlaValLeuGlyGluValLysSerCysThrTrpPro
195200205
GluThrHisThrLeuTrpSerAspSerValValGluSerGluLeuIle
210215220
IleProLysThrLeuGlyGlyProLysSerHisHisAsnThrArgThr
225230235240
GlyTyrLysValGlnSerSerGlyProTrpAspGluLysGluIleVal
245250255
IleAspPheAspTyrCysProGlyThrThrValThrValThrSerSer
260265270
CysArgAspArgGlyProSerAlaArgThrThrThrAlaSerGlyLys
275280285
LeuIleThrAspTrpCysCysArgSerCysThrThrProProLeuArg
290295300
PheValThr
305
Claims (6)
1.一种鉴别鸭坦布苏病毒感染动物和灭活苗免疫动物的ELISA检测试剂盒，其特征在于，包括：鸭坦布苏病毒E重组蛋白包被酶标板、NS1重组蛋白包被酶标板、标准阳性对照血清、标准阴性对照血清、兔抗鸭酶标二抗、样品稀释液、浓缩洗液、TMB底物显色液和终止液。
2.如权利要求1所述鉴别鸭坦布苏病毒感染动物和灭活苗免疫动物的ELISA检测试剂盒，其特征在于：所述鸭坦布苏病毒E重组蛋白包被酶标板通过用在原核表达系统中重组表达的鸭坦布苏病毒E蛋白包被ELISA板制得；所述NS1重组蛋白包被酶标板通过用在原核表达系统中重组表达的鸭坦布苏病毒NS1蛋白包被ELISA板制得。
3.如权利要求1或2所述鉴别鸭坦布苏病毒感染动物和灭活苗免疫动物的ELISA检测试剂盒，其特征在于：所述标准阳性对照血清为鸭坦布苏病毒灭活疫苗免疫若干次SPF鸭后分离得到的鸭血清。
4.如权利要求3所述鉴别鸭坦布苏病毒感染动物和灭活苗免疫动物的ELISA检测试剂盒，其特征在于：所述标准阴性对照血清为未感染鸭坦布苏病毒的鸭血清。
5.如权利要求1所述鉴别鸭坦布苏病毒感染动物和灭活苗免疫动物的ELISA检测试剂盒，其特征在于：所述兔抗鸭酶标二抗为HRP标记的兔抗鸭二抗。
6.如权利要求1所述鉴别鸭坦布苏病毒感染动物和灭活苗免疫动物的ELISA检测试剂盒的检测方法，其特征在于，包括步骤：
1）将待测鸭血清样品、标准阳性对照血清和标准阴性对照血清分别加入所述鸭坦布苏病毒E重组蛋白包被酶标板和NS1重组蛋白包被酶标板的独立孔中，37℃反应1-3h后，4℃过夜；
2）将每孔洗涤后，分别加入所述兔抗鸭酶标二抗，37℃反应0.5-2h；
3）将每孔洗涤后，分别加入TMB底物显色液进行显色反应；
4）加入终止液，终止显色反应，在酶标仪上读数；
5）判断：E-ELISA待测样品OD值大于等于0.348时，待测样品为阳性，否则为阴性；NS1-ELISA待测样品OD值大于等于0.416时，待测样品为阳性，否则为阴性；若E-ELISA检测阳性而NS1-ELISA检测阴性，明待测血清样品为灭活疫苗免疫动物血清；若E-ELISA检测阴性而NS1-ELISA检测阳性，待测血清样品为临床症状出现前的早期感染动物血清；若E-ELISA和NS1-ELISA检测均阳性，待测血清样品为野毒自然感染动物血清；若E-ELISA和NS1-ELISA检测均阴性，待测血清样品没有感染坦布苏病毒。
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