CN105431739A - 使用其中进行了调控使赖氨酰-tRNA合成酶被表达或不被表达的细胞或球状聚集的细胞的培养筛选癌症转移抑制剂的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于通过分析三维胶原蛋白凝胶环境中培养的癌细胞系中的赖氨酰-tRNA合成酶(KRS)的活性来筛选癌转移抑制剂的方法，以及涉及一种用于监测癌细胞从聚集的癌细胞的播散和癌细胞的上皮-间充质转化、迁移、浸润和转移的方法。具体而言，证实了在使用包括HCT116细胞系的各种结肠直肠癌细胞构建其中已进行了调控使KRS被表达或不被表达的细胞系或球状聚集的细胞系，然后在二维环境中培养的情况下，抑制KRS表达的细胞系中诱导了不完全上皮-间充质转化表型(不完全ECM表型)，且KRS表达的抑制抑制了细胞-细胞外基质(ECM)粘附和细胞-ECM信号传导活性。另外，证实了在所构建的球状体细胞系是在液态环境或三维胶原蛋白凝胶培养环境中培养的情况下，KRS表达的抑制将细胞诱导为间充质细胞，但未能达到细胞-细胞粘附的分解；抑制了细胞-ECM粘附和相关的信号传导活性，引起对细胞从三维胶原蛋白凝胶培养环境中培养的球状体细胞播散的抑制；以及未能通过细胞微环境中存在的TGFβ1诱导细胞播散。因此，本发明可以用作一种用于筛选癌转移抑制剂的方法和一种用于监测癌细胞的迁移、浸润和转移的方法，并且作为在药物研发要求的临床前测试时能创造低成本、高效率附加值的筛选方法之一是有用的。
Description
发明的背景
1.技术领域
本发明涉及一种用于通过对三维胶原蛋白凝胶环境中培养的其中进行了调控使赖氨酰-tRNA合成酶被表达或不被表达的细胞系或球状聚集的细胞系分析癌细胞中的细胞-细胞粘附、细胞-细胞外基质(ECM)粘附、细胞粘附信号传导的激活以及癌细胞播散来筛选(screening)癌转移抑制剂的方法，以及涉及一种用于监测癌细胞的迁移、浸润和转移的方法。
2.相关技术的说明
已知90％的癌症死亡是由于转移。当癌细胞通过血液流动和其他因素迁移进入特定器官时转移开始。迁移的癌细胞在新地方通过相互作用再次生长。大部分癌症在形成器官壁的上皮细胞中发展。上皮细胞表达参与细胞粘附和迁移的这类蛋白，如FAK、Src、桩蛋白(paxillin)和ERK。当调控这类蛋白的激活和表达时，也可以调控各种相关的功能，诸如细胞-细胞粘附、细胞-细胞外基质(ECM)粘附、迁移和浸润(Petrie和Yamada,2012；WehrleHaller,2012)。当细胞-细胞粘附播散时，所提及的蛋白参与上皮细胞转化为高度能动性间充质细胞，引起对上皮-间充质转化(epithelialtomesenchymaltransition，EMT)的诱导(Bolos等，2010)。这种EMT不仅在胚胎发展中起到重要作用，而且可通过破坏组织引起由纤维化和癌症代表的疾病。纤维化减少了负责正常功能的薄壁细胞，并引起胶原蛋白的积累，导致组织功能丧失。推测所转化的细胞形态、骨架结构、胶原蛋白生成以及迁移是纤维化的原因(Kalluri和Neilson,2003)。在癌症中也观察到这种EMT现象。通过EMT从聚集的癌细胞播散高度能动性的癌细胞，经血流或淋巴系统行进到达癌细胞生长以再次形成肿瘤的新目的地。即，特点是极化上皮细胞(polarizedepithelialcell)转化为能动性细胞的EMT在癌分化和其恶性进展中起重要作用(Meng和Wu,2012)。同时，根据关于循环肿瘤细胞(CTC)转移细胞的异质性的最近报道，已证实保留了远端转移位点处上皮类型类特征的不完全EMT表型细胞的集落对于转移是有利的(Thiery和Lim,2013；Yu等,2013)。
各种组织细胞根据其独特的微环境保留其特征。因而，如果这种微环境失去了其对细胞的控制，细胞将具有显示退化、异常分化、不可控增殖等故障，导致疾病如癌症的发展(Sansone和Bromberg,2011)。癌症患者中转移和治疗效果的差异原因，除癌细胞本身外，还有包围肿瘤的微环境的影响。
转移过程中，转移癌细胞的各种功能包括细胞迁移和浸润受到包围细胞的微环境的影响。在微环境中，分泌各种生长因子或细胞因子如TGFβ1和TNFα，为肿瘤细胞生长、迁移和浸润制造了最佳环境。由于肿瘤微环境可以调控分化和各种功能，包括细胞增殖、存活、迁移以及浸润，因而必须在将微环境应用于癌症研究或临床治疗之前充分了解这种微环境(Friedl等,2012)。如今，抗癌剂主要集中于癌细胞本身的增殖或细胞信号传导的变化，表明不可以用这些药物来调节由包围肿瘤细胞的微环境的变化而造成的癌症发展和进展，这意味着不能从根本上控制癌症发展和转移。因此，可以经通过分析和研究癌细胞和周围的细胞环境之间的有机网络公开细胞功能特别是粘附、EMT、迁移以及浸润的分子机制来提供抑制转移的新抗癌策略(Friedl等,2012)。
二维环境中的体外细胞培养指常规塑料瓶中或皿上的细胞培养，以观察扁平细胞。为了复制体内环境，已试图用三维细胞培养来弥补显示人工细胞形态的二维培养的缺点(Nyga等,2011)。与体外二维环境中的不同，在体内细胞常常显示略长形态。因而，体外三维细胞培养可以是细胞培养中的良好替代，以研究真实细胞形态和功能以及进一步地，细胞和微环境之间的相互作用(Aref等,2013)。必须证实与癌症转移相关的细胞功能，包括粘附、EMT、迁移和浸润，是如何通过细胞和周围的三维微环境的相互作用来调控的，这将有助于开发转移抑制剂。
氨酰-tRNA合成酶将tRNA与细胞中对应的氨基酸结合，并将所得氨酰-tRNA转移至用于蛋白合成的延伸因子(elongationfactor)核糖体中。氨酰-tRNA合成酶与氨基酸和tRNA的结合特异性是对保留蛋白合成的准确性非常关键的因素。形成氨酰-tRNA合成酶的组分之一赖氨酰-tRNA合成酶(KRS)形成作用为分子储库(molecularreservoir)的巨分子复合物，以调控一些哺乳动物中组成氨酰-tRNA合成酶的蛋白质的各种功能。人赖氨酰-tRNA合成酶含有参与RNA和其他蛋白质之间的相互作用的独特的N端延伸位点(elongationsite)，并且可以促进结肠直肠癌细胞的转移功能，表明赖氨酰-tRNA合成酶在转移中起重要作用(Kim等,2012,FASEBJ.26(10):4142-59)。
因此，本发明人分析了三维环境中培养的癌细胞中的赖氨酰-tRNA合成酶(KRS)的功能，并因而试图开发一种用于筛选转移抑制剂的方法。在这种努力的过程中，发明人使用结肠直肠癌细胞系HCT116制备了其中已进行调控使KRS被表达或不被表达的球状聚集的细胞系。然后，发明人观察了细胞外基质涂覆的二维环境或由细胞外基质包围的三维细胞培养环境或液态(含水的，aqueous)三维环境的培养条件中的细胞系。结果证实了KRS表达被抑制的细胞系中诱导了不完全上皮-间充质转化表型(不完全ECM表型)，并因此抑制了细胞-ECM粘附和相关的信号传导活性。当在三维培养环境中培养球状聚集的细胞系时，KRS表达的抑制抑制了播散，但诱导了间充质细胞，但未能达到对细胞-细胞粘附的分解；抑制了细胞-ECM粘附和其相关的ERK激活；抑制了信号传导活性如桩蛋白表达和磷酸化，导致对细胞播散进入微环境的抑制。本发明人还证实了这种KRS依赖型癌细胞播散与癌症浸润边缘的KRS和ERK/桩蛋白分布/积累一致，如结肠直肠癌患者的染色癌组织中观察到的，从而完成本发明。
发明概要
本发明的一个目的是提供一种用于筛选转移抑制剂的方法。
本发明的另一个目的是提供一种用于监测癌细胞从聚集的癌细胞的播散，癌细胞的上皮-间充质转化、迁移、浸润和转移，以及相关信号传导因子的表达和活性的方法。
为了实现上述目的，本发明提供了一种用于筛选转移抑制剂的方法，该方法包括以下步骤：
1)在三维环境中或在由细胞外基质包围的环境中培养其中进行调控使赖氨酰-tRNA合成酶(KRS)被表达或不被表达的癌细胞系或聚集的癌细胞；
2)用步骤1)的癌细胞系或聚集的癌细胞处理样品；
3)分析步骤2)的癌细胞系或聚集的癌细胞中的KRS的活性；以及
4)选择步骤3)中已确定能抑制KRS活性的样品。
本发明还提供了一种用于监测癌细胞从聚集的癌细胞的播散、癌细胞的上皮-间充质转化、迁移、浸润和转移，以及相关信号传导因子的表达和活性的方法，该方法包括以下步骤：
1)在三维环境中或在由细胞外基质包围的环境中培养其中进行调控使赖氨酰-tRNA合成酶(KRS)被表达或不被表达的癌细胞系或聚集的癌细胞；
2)分析步骤1)的癌细胞系或聚集的癌细胞中的KRS的活性；以及
3)基于步骤2)分析的KRS活性来分析癌细胞系或聚集的癌细胞的转移水平。
有益效果
本发明可以用作一种用于筛选转移抑制剂的方法或一种用于监测癌细胞从聚集的细胞的播散、癌细胞的上皮-间充质转化、迁移、浸润和转移，以及相关信号传导因子的表达和活性的方法，上述方法通过分析三维环境中或由细胞外基质包围的环境中培养的癌细胞系中的赖氨酰-tRNA合成酶(KRS)依赖型细胞-细胞粘附、细胞-细胞外基质(ECM)粘附、细胞粘附信号传导活性以及细胞播散来进行。本发明也可以用作在药物开发要求的临床前测试时能创造低成本、高效率附加值的筛选方法之一。
附图的简要说明
参照附图最充分地理解本发明的优选实施方式的应用，其中：
图1A是说明三维环境中的细胞培养的示意图，其中在3D环境中培养通过悬滴培养获得的球状聚集的细胞。
图1B是说明通过悬滴培养获得的培养的球状聚集的细胞与二维环境中培养的细胞形态的比较的图。
图1C是说明通过悬滴培养方法培养的球状聚集的细胞中E-钙粘蛋白(E-cadherin)表达随时间增加的图。
图1D是说明在光学显微镜下观察的3D胶原蛋白凝胶环境中培养的球状聚集的细胞的形态的图。
图1E是说明通过用由shRNA抑制赖氨酰-tRNA合成酶(KRS)转染的细胞系进行悬滴培养获得的球状聚集的细胞中KRS的表达的图。
空白(Mock)：对照，以及
0-3、2-1、2-2、5-3：其中KRS表达已被抑制的细胞系克隆。
图1F是说明通过悬滴培养培养的球状聚集的细胞中的上皮-间充质转化(EMT)相关的标记mRNA的表达的图。
P：HCT116亲本细胞、对照、
2-1、2-2、2-3、5-4：其中KRS表达已被抑制的细胞系克隆，以及
KRSWT：KRS过表达细胞系。
图1G是说明通过悬滴培养培养的球状聚集的细胞中的EMT相关的标记蛋白的表达的图。
空白(Mock)：对照，以及
shKRS：其中KRS表达已被抑制的细胞系克隆。
图2A是说明在补充有血清的二维(2D)细胞培养条件中正常培养的细胞中的KRS依赖型EMT标记蛋白的表达的图。
P：对照，
2-1、2-2、2-3、5-4：其中KRS表达已被抑制的细胞系克隆，以及
WT：KRS过表达细胞系。
图2B是说明在补充有10％的血清的二维(2D)细胞培养条件中正常培养的细胞中的EMT相关标记蛋白的表达的图，其未处理或用TNFα或TGFβ1处理。
亲本：对照，
shKRS2-1：其中KRS表达已被抑制的细胞系克隆2-1，以及
KRSWT：KRS过表达细胞系。
图2C是说明通过调控补充有10％血清的二维环境中正常培养的细胞中的KRS表达来抑制E-钙粘蛋白和β-连环蛋白表达的图。
亲本：对照，
shKRS：其中KRS表达已被抑制的细胞系克隆体，以及
KRSWT：KRS过表达细胞系。
图2D是说明在相差显微镜下观察的在贴附在补充有10％血清的正常二维(2D)环境中的培养板上的集落中生长的细胞的形态的图。
KRS-阴性：其中KRS表达已被抑制的细胞系，以及
KRS-阳性：HCT116亲本细胞或KRS过表达细胞系。
图3是说明具有2％血清的二维环境中层粘连蛋白涂覆的皿或盖玻片上细胞培养的结果的图，该2％血清低于正常浓度，以使血清中生长因子的影响最小化。
图3A是说明其中KRS表达被抑制的细胞系(shKRS2-1、shKRS5-4)中，Src、ERK和桩蛋白的细胞粘附介导的磷酸化显著降低，但FAK的磷酸化没有变化的图。
图3B是说明表达KRS的亲本细胞和过表达KRS的细胞系中ERK的磷酸化水平高，但其中KRS表达被抑制的那些细胞系中ERK的磷酸化水平显著低的图。
图3C是说明表达KRS的亲本细胞系或过表达KRS的细胞系中桩蛋白的高磷酸化水平和其中KRS表达被抑制的细胞系中桩蛋白的显著低的磷酸化水平的图。
图3D是说明根据HCT116细胞中KRS的抑制，细胞形态或伸展(spreading)没有太大差异的图。
图3E是说明免疫荧光检测的结果的图，其中表达KRS的亲本细胞系中或过表达KRS的细胞系中ERK的磷酸化水平高，但当用YH16899(KimDG等,NatChemBiol.2014Jan；10(1):29-34)即KRS抑制剂处理细胞系时，ERK的磷酸化水平显著降低。
图3F是说明免疫荧光检测的结果的图，其中表达KRS的亲本细胞系中或过表达KRS的细胞系中Tyr118的磷酸化水平高，但当用YH16899(KimDG等,NatChemBiol.2014Jan；10(1):29-34)即KRS抑制剂处理细胞系时，磷酸化水平显著降低。
图3G是说明与用YH16899处理的表达KRS的亲本细胞中或过表达KRS的细胞系中的与FAKTyr397磷酸化有关的细胞形态或伸展没有大的差异的图。
图4A是说明根据补充有10％血清的正常二维环境中培养的细胞中的KRS表达的调控来抑制FAK和ERK磷酸化的图。
P：对照，
2-1、5-4：其中KRS表达已被抑制的细胞系克隆，以及
myc-KRSWT：myc-KRS过表达细胞系。
图4B是说明根据补充有10％血清的正常二维环境中培养的细胞中的KRS表达的调控来抑制s-Src和桩蛋白磷酸化的图。
P：对照，以及
2-1、5-4：其中KRS已被抑制表达的细胞系克隆。
图4C是说明在二维环境中或在悬浮液中的纤连蛋白(纤维连接蛋白，fibronectin)涂覆的培养皿中培养2小时的细胞中的FAK和ERK的磷酸化的图，其中对KRS的表达进行调控。
S：悬浮液，
FN：在纤连蛋白涂覆的培养皿中培养，
P：对照，
2-1、5-4：其中KRS表达已被抑制的细胞系克隆，以及
myc-KRSWT：KRS过表达细胞系。
图4D是说明通过观察在二维环境的纤连蛋白涂覆的培养皿中培养2小时的其中KRS表达被抑制的细胞系中酪氨酸397磷酸化FAK来确定的粘着斑(焦点粘连，focaladhesion)的抑制的图。
P：对照，
2-1、5-4：其中KRS表达已被抑制的细胞系克隆，以及
myc-KRSWT：myc-KRS过表达细胞系。
图5是说明将其中已进行调控使KRS被表达或不被表达的球状聚集的细胞系在三维胶原蛋白凝胶环境中培养3-24小时时观察到的细胞外基质(ECM)粘附相关的信号传导活性的变化的图。
亲本：对照，
2-1、2-2、2-3、5-4：其中KRS表达已被抑制的细胞系克隆，以及
KRSWT：KRS过表达细胞系。
图6A是说明对在三维胶原蛋白凝胶环境中培养的正常表达KRS的HCT116细胞中和其中KRS表达被抑制的球状聚集的细胞系(shKRS2-1,shKRS5-4)中的p-ERK进行免疫染色后在共聚焦显微镜下观察到的ERK磷酸化的图。
图6B是说明对在三维胶原蛋白凝胶环境中培养的正常表达KRS的HCT116细胞中和其中KRS表达被抑制的球状聚集的细胞系(shKRS2-1)中的桩蛋白进行免疫染色后在共聚焦显微镜下观察到的桩蛋白的图。
图6C是说明对在用对照DMSO(二甲亚砜)或YH16899即KRS抑制剂处理并在三维胶原蛋白凝胶环境中培养的其中KRS正常表达的球状聚集的细胞系(HCT116)中的p-ERK进行免疫染色后在共聚焦显微镜下观察到的ERK的磷酸化水平的图。
图6D是说明对在用对照DMSO(二甲亚砜)或U0126即MEK/ERK激酶的选择性抑制剂处理并在三维胶原蛋白凝胶环境中培养的其中KRS正常表达的球状聚集的细胞系(HCT116)中的桩蛋白进行免疫染色后在共聚焦显微镜下观察到的桩蛋白的表达水平的图。
图7A是说明根据ERK抑制剂对三维胶原蛋白凝胶环境中培养的球状聚集的HCT116亲本细胞的处理，细胞-ECM粘附相关的信号传导活性的变化的图。
U0126：ERK抑制剂。
图7B是说明根据ERK抑制剂对三维胶原蛋白凝胶环境中培养的球状聚集的HCT116亲本细胞的处理，细胞-细胞粘附相关的基因mRNA表达的变化的图。
U0126：ERK抑制剂。
图8A是说明在三维胶原蛋白凝胶环境中培养的球状聚集的细胞中EMT相关的蛋白的变化的图。
P：对照，
2-1、2-2：其中KRS表达已被抑制的细胞系克隆，以及
KRSWT：KRS过表达细胞系。
图8B是说明在三维胶原蛋白凝胶环境中培养5天的球状聚集的细胞中snail1表达的变化的图。
亲本：对照，以及
shKRS2-1、shKRS2-2：其中KRS表达已被抑制的细胞系克隆。
图8C是说明在三维胶原蛋白凝胶环境中培养3天的球状聚集的细胞中E-钙粘蛋白表达的抑制的图。
亲本：对照，
shKRS：其中KRS表达已被抑制的细胞系克隆，以及
KRSWT：KRS过表达细胞系。
图9A是说明在三维胶原蛋白凝胶环境中培养的表达KRS的亲本细胞中或过表达KRS的细胞系中CK14(上皮性标记细胞因子14)的表达高，并在从球状体(白箭头)边缘播散的那些细胞中被正常诱导，而在其中KRS被抑制的细胞中和从球状体播散的那些细胞中CK14的表达低的图。
图9B是说明在三维胶原蛋白凝胶环境中培养的表达KRS的亲本细胞中或过表达KRS的细胞系中CK14(上皮性标记细胞因子14)的表达高，并在从球状体(白箭头)边缘播散的那些细胞中被正常诱导，而一般当用MEK/ERK抑制剂U1026或KRS抑制剂YH16899处理细胞(即使细胞表达KRS)时，或在从球状体播散的细胞中，CK14的表达低的图。
图10A是说明当KRS表达被抑制，未观察到细胞从在三维胶原蛋白凝胶环境中培养的球状聚集的细胞播散的图。
亲本：对照，
2-1、2-2、2-3、5-4：其中KRS表达已被抑制的细胞系克隆，以及
KRSWT：KRS过表达细胞系。
图10B是说明在三维胶原蛋白凝胶环境中培养的球状聚集的细胞中TGFβ1蛋白的表达水平的图。
亲本：对照，
2-1、2-2、2-3、5-4：其中KRS表达已被抑制的细胞系克隆，以及
KRSWT：KRS过表达细胞系。
图11A是说明细胞从根据TNFα处理的三维胶原蛋白凝胶环境中培养的球状聚集的细胞播散的图。
亲本：对照，
shKRS：其中KRS表达已被抑制的细胞系，以及
KRSWT：KRS过表达细胞系。
图11B是说明细胞从根据TGFβ1处理的三维胶原蛋白凝胶环境中培养的球状聚集的细胞播散的图。
亲本：对照，
shKRS：其中KRS表达已被抑制的细胞系，以及
KRSWT：KRS过表达细胞系。
图12是说明用TGFβ和ERK抑制剂处理聚集的细胞时，细胞从在三维胶原蛋白凝胶环境中培养的球状聚集的细胞的播散受抑制的图。
U0126：ERK抑制剂。
图13A是说明在用EKAR(基于荧光共振能量转移(FRET)的ERK活性指示剂，Harvey等,2008PNAS105:19264-19269)转染HCT116亲本细胞、其中KRS表达被抑制的细胞系以及过表达KRS的细胞系后，通过使用FRET技术对那些细胞中的ERK活性的测量的图。通过红色呈现高ERK磷酸化，并通过蓝色呈现低磷酸化。
图13B是说明通过FRET技术测量的分别用EKAR转染的HCT116亲本细胞(亲本，P)、其中KRS表达被抑制的细胞系(shKRS2-1和shKRS5-4)以及过表达KRS的细胞系的ERK活性的统计结果的图。
图14是说明分别用pCMV-空白(M)、pCMV-桩蛋白(桩蛋白)(Px)和pCMV-ERK1/2(Ek)瞬时转染的HCT116亲本细胞(亲本，P)、其中KRS表达被抑制的细胞系(shKRS2-1和shKRS5-4)以及过表达KRS的细胞系(KRSWT)中的桩蛋白表达和Tyr118磷酸化的图。
图15A是说明在10％血清的存在下对正常二维条件中的过表达myc-KRS的HCT116细胞系进行免疫共沉淀后研究的整合素(integrin)α6、整合素β1、KRS以及p67LR(p67层粘连蛋白受体)的结合活性以及根据YH16899(YH)处理的任何变化的图。
图15B是说明在2％血清的存在下对正常二维条件中层粘连蛋白涂覆的(10mg/ml)板中的过表达myc-KRS的HCT116细胞系进行免疫共沉淀后研究的整合素α6、整合素β1、KRS以及p67LR(p67层粘连蛋白受体)的结合活性以及根据YH16899(YH)处理的任何变化的图。
图16A是说明KRS依赖性地激活与称为下游转录因子的c-Jun(而不是Elk-1)的磷酸化相关的ERK的图，这通过使用在三维胶原蛋白凝胶环境中培养的球状聚集的细胞研究。
图16B是说明用于比较位于桩蛋白启动子区中的c-Jun和Elk-1的结合位点和其非结合位点的图。
图16C是说明在用DMSO(对照)或YH16899处理的三维胶原蛋白凝胶环境中培养为球状体的HCT116亲本细胞和其中通过使用c-Jun抗体抑制KRS表达的shKRS2-1的ChIP(染色质免疫沉淀)分析的结果的图。在该图中，c-Jun结合位点示出在对照中。
图16D是说明在用DMSO(对照)或U1026或YH16899处理的三维胶原蛋白凝胶环境中培养为球状体的HCT116亲本细胞和其中通过使用Elk-1抗体抑制KRS表达的shKRS2-1的ChIP分析的结果的图。
图17A是说明根据对结肠直肠癌细胞系SW620中KRS表达的抑制对细胞从三维胶原蛋白凝胶中的球状体的播散的抑制的图。
图17B是说明用KRS抑制剂YH16899处理的结肠直肠癌细胞系SW620中ERK磷酸化降低以及桩蛋白表达和磷酸化都降低的图。
图18A是说明用ERK抑制剂U0126处理细胞系时，三维胶原蛋白凝胶中HCT116细胞系中粘着斑相关的分子如桩蛋白的表达和磷酸化降低以及上皮标记物的表达增加的图。
图18B是说明用KRS抑制剂YGH16899处理细胞系时，三维胶原蛋白凝胶中HCT116细胞系中，除了ERK磷酸化之外，粘着斑相关的分子如桩蛋白的表达和磷酸化降低以及上皮标记物的表达也降低的图。
图19A是说明信号传导的研究结果的图，其中将用整合素α6抑制抗体预处理的细胞在层粘连蛋白涂覆的2D环境中培养2小时，然后测量ERK活性。结果，ERK活性降低，表明FAK和ERK在信号传导中没有相互作用。
图19B是说明FAK磷酸化和ERK活性的研究结果的图，其中用消除了Ad-HA-R454FAK激酶活性的Ad-HA对照腺病毒或死亡形式(deadform)的腺病毒感染HCT116亲本细胞，或用Ad-HA对照病毒、Ad-HAΔN(1-100)FAK或Ad-HA-FAKWT病毒感染其中KRS表达被抑制的细胞系，然后研究FAK磷酸化和ERK活性。结果，证实FAK和ERK活性彼此不相关。
图19C是说明使用时差显微镜(time-lapsemicroscope)对细胞播散的观察结果的图，其中用消除了Ad-HA-R454FAK激酶活性的Ad-HA对照病毒或死亡形式的腺病毒感染HCT116亲本细胞，或用Ad-HA对照病毒、Ad-HAΔN(1-100)FAK或Ad-HA-FAKWT病毒感染其中KRS表达被抑制的细胞系(shKRS2-1)，然后制备上述各细胞系的球状体。在时差显微镜下观察三维胶原蛋白凝胶中各细胞系的球状体，结果即使当在其中过表达FAK时，其中KRS表达被抑制的细胞系中未诱导细胞从球状体的播散。
图19D是说明使用时差显微镜对细胞播散的观察结果的图，其中用消除了Ad-HA-R454FAK激酶活性的Ad-HA对照病毒或死亡形式的腺病毒感染HCT116亲本细胞，或用Ad-HA对照病毒、Ad-HAΔN(1-100)FAK或Ad-HA-FAKWT病毒感染其中KRS表达被抑制的细胞系(shKRS5-4)，然后制备上述各细胞系的球状体。在时差显微镜下观察三维胶原蛋白凝胶中各细胞系的球状体，结果即使当在其中过表达FAK时，其中KRS表达被抑制的细胞系中未诱导细胞从球状体的播散。
图19E是说明其中表达了活性突变体形式L37AFAK的细胞系中ERK活性未被FAK活性的影响的图。
图20A是说明通过用pCMV-空白、pCMV-桩蛋白或pCMV-ERK1/2转染其中KRS表达被抑制的细胞系而建立的稳定细胞系中相关因子的表达的图。
图20B是说明使用时差显微镜对细胞播散的28小时观察结果的图，以研究从通过用pCMV-空白、pCMV-桩蛋白或pCMV-ERK1/2转染其中KRS表达被抑制的细胞系而构建的稳定细胞系获得的三维胶原蛋白凝胶环境中细胞从球状体的播散。
图21A是说明通过免疫印迹法(Westernblotting)研究的人类结肠肿瘤组织包括临床诊断的结肠直肠癌组织中桩蛋白、p-ERK、E-钙粘蛋白和KRS的表达的相关性的图。
图21B是说明通过免疫组织化学染色研究的人类结肠肿瘤组织包括临床诊断为II和III级的那些组织中这类蛋白如桩蛋白、p-ERK和KRS的相关性的图。
具体实施方式
下文中，详细地描述了本发明。
本发明提供了一种用于筛选转移抑制剂的方法，该方法包括以下步骤：
1)在三维环境中或在由细胞外基质包围的环境中培养其中进行调控使赖氨酰-tRNA合成酶(KRS)被表达或不被表达的癌细胞系或聚集的癌细胞；
2)用步骤1)的癌细胞系或聚集的癌细胞处理样品；
3)分析步骤2)的癌细胞系或聚集的癌细胞中的KRS的活性；以及
4)选择步骤3)中已确定会抑制KRS活性的样品。
步骤1)中，所述三维环境是液态环境或胶原蛋白包围的环境，但并不总限于此，并可以使用本领域中技术人员已知的1型胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白或天然水凝胶如基质胶(matrigel)或透明质酸。也可以将它们以不同的比例结合。所述胶原蛋白的浓度优选是1-5mg/ml，更优选为2-4mg/ml，以及最优选为2-2.5mg/ml。所述胶原蛋白优选被制备为中性的，但并不总限于此。三维环境中培养的癌细胞系指由通过含水溶液中悬滴培养而培养的由细胞外基质包围的球状聚集的细胞系，但并不总限于此。
步骤1)中的癌症优选是转移性癌症或转移诱导性癌症，其优选选自由乳腺癌、肝癌、胃癌、结肠癌、骨癌、肺癌、胰腺癌、头/颈癌、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、食管癌、小肠肿瘤、肛门癌、结肠癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、阴户癌、何杰金氏病、前列腺癌、膀胱癌、肾癌、输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌和中枢神经系统肿瘤组成的组。在本发明的一个优选实施方式中，优选选择结肠直肠癌，但并不总限于此。
步骤2)中的样品优选选自由肽、蛋白质、抗体、抗体片段、非肽化合物、活性化合物、发酵产物、细胞提取物、植物提取物、动物组织提取物和血浆组成的组，但并不总限于此。
步骤3)中的KRS活性指癌细胞中的活性，所述活性优选选自由癌细胞的细胞-细胞粘附、细胞-细胞外基质(ECM)粘附、细胞分散(scattering)、伤口愈合、改变细胞粘附信号传导因子的活性、c-Jun/桩蛋白启动子结合和细胞从球状体的播散组成的组，但并不总限于此。本文中，细胞-细胞粘附优选诱导上皮标记物如ZO-1、封闭蛋白(occludin)、CK14、β-连环蛋白(β-链蛋白，β-catenin)或E-钙粘蛋白，或间充质标记物如纤连蛋白、twist蛋白、波形蛋白、α-SMA(平滑肌肌动蛋白)、snail-1蛋白、Slug蛋白或N-钙粘蛋白的表达或表达位置的变化。而且，所述细胞-细胞外基质粘附优选诱导细胞-细胞外基质粘附强度、细胞伸展、粘着斑和其破坏、肌动蛋白重建以及磷酸化的FAK、c-Src、ERK、c-Jun或桩蛋白的表达或表达位置的变化。细胞粘附信号传导活性诱导FAK、c-Src、ERK、c-Jun或桩蛋白的表达或磷酸化的降低或变化，或诱导整合素α6轭合(结合，conjugation)的变化，但并不总限于此。
步骤3)中为了分析KRS活性，根据本发明的优选实施方式，一种方法可以选自由免疫印迹法、实时PCR、免疫共沉淀、ChIP(染色质免疫沉淀)、FRET、免疫荧光检测和免疫组织化学组成的组，但并不总限于此，可以使用本领域中技术人员熟知的任何方法。
本发明还提供了一种用于监测癌细胞从癌细胞系或聚集的癌细胞的播散、癌细胞的上皮-间充质转化、迁移、浸润和转移，以及相关信号传导因子的表达或活性的方法，该方法包括以下步骤：
1)在三维环境中或在由细胞外基质包围的环境中培养其中进行调控使赖氨酰-tRNA合成酶(KRS)被表达或不被表达的癌细胞系或聚集的癌细胞；
2)分析步骤1)的癌细胞系或聚集的癌细胞中的KRS的活性；以及
3)基于步骤2)分析的KRS活性来分析癌细胞系或聚集的癌细胞的转移水平。
步骤1)中，所述三维环境是液态环境或胶原蛋白包围的环境，但并不总限于此，并可以使用本领域中技术人员已知的1型胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白或天然水凝胶如基质胶或透明质酸。也可以将它们以不同的比例结合。所述胶原蛋白的浓度优选是1-5mg/ml，更优选为2-4mg/ml，以及最优选为2-2.5mg/ml。所述胶原蛋白优选被制备为中性的，但并不总限于此。三维环境中培养的癌细胞系指由通过含水溶液中悬滴培养而培养的由细胞外基质包围的球状聚集的细胞系，但并不总限于此。
步骤1)中的癌症优选是转移性癌症或转移诱导性癌症，其优选选自由乳腺癌、肝癌、胃癌、结肠癌、骨癌、肺癌、胰腺癌、头/颈癌、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、食管癌、小肠肿瘤、肛门癌、结肠癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、阴户癌、何杰金氏病、前列腺癌、膀胱癌、肾癌、输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌和中枢神经系统肿瘤组成的组。在本发明的一个优选实施方式中，优选选择结肠直肠癌，但并不总限于此。
步骤2)中的KRS活性指癌细胞中的活性，所述活性优选选自由癌细胞的细胞-细胞粘附、细胞-细胞外基质(ECM)粘附、细胞分散、伤口愈合、改变细胞粘附信号传导因子的活性、c-Jun/桩蛋白启动子结合和细胞从球状体的播散组成的组，但并不总限于此。本文中，细胞-细胞粘附优选诱导上皮标记物如ZO-1、封闭蛋白、CK14、β-连环蛋白或E-钙粘蛋白，或间充质标记物如纤连蛋白、twist蛋白、波形蛋白、α-SMA(平滑肌肌动蛋白)、snail-1蛋白、Slug蛋白或N-钙粘蛋白的表达或表达的位置的变化。而且，所述细胞-细胞外基质粘附优选诱导细胞-细胞外基质粘附强度、细胞伸展、粘着斑和其破坏、肌动蛋白重建以及磷酸化的FAK、c-Src、ERK、c-Jun或桩蛋白的表达或表达位置的变化。细胞粘附信号传导活性诱导FAK、c-Src、ERK、c-Jun或桩蛋白的表达或磷酸化的降低或变化，或诱导整合素α6轭合的变化，但并不总限于此。
步骤2)中为了分析KRS活性，根据本发明的优选实施方式，一种方法可以选自由免疫印迹法、实时PCR、免疫共沉淀、ChIP(染色质免疫沉淀)、FRET、免疫荧光检测和免疫组织化学组成的组中，但并不总限于此，可以使用本领域中技术人员熟知的任何方法。
在本发明的一个优选实施方式中，确定二维环境中培养的球状聚集的细胞中的E-钙粘蛋白的表达(参见图1B)随培养时间增加(参见图1C)。为了确定赖氨酰-tRNA合成酶(KRS)的影响，构建并测试了KRS敲除或过表达细胞系(参见图1E)。也研究了三维环境中培养的所构建KRS敲除细胞系中的上皮-间充质转化(ETM)标记基因mRNA表达。结果，其中上皮标记物E-钙粘蛋白表达减少，但间充质标记物波形蛋白、N-钙粘蛋白以及TwistmRNA显著增加(参见图1E)。
在补充有10％血清的正常二维环境中培养的HCT116亲本细胞和过表达KRS的细胞系中上皮标记物的表达比间充质标记物的表达高，而其中KRS表达被抑制的细胞系(2-1、2-1、2-3和5-4)中上皮标记物的表达比间充质标记物的表达低(参见图2A)。
为了研究其中KRS表达被抑制的细胞系中周围微环境因子的影响，用TNFα或TGFβ1处理该细胞系。结果，确定上皮标记蛋白封闭蛋白的表达增加，而间充质标记物纤连蛋白的表达降低(参见图2B)。
在其中KRS表达被抑制的细胞系中，E-钙粘蛋白和β-连环蛋白的表达被抑制(参见图2C)，但细胞-细胞粘附没有显著变化(参见图2D)。因此，确定KRS表达的抑制引起上皮标记物表达的抑制、间充质标记物表达的增加、集落形成以及在没有分散的情况下生长(参见图2C和2D)，以及部分上皮-间充质转化(EMT)的诱导。
在层粘连蛋白预涂覆的培养皿和盖玻片中重铺板(replating)HCT116亲本细胞、其中KRS表达被抑制的细胞系(shKRS2-1、shKRS5-4)和过表达KRS的细胞系(Myc-KRS-WT)后，用YH16899处理(参见图3A、3E、3F和3G)或不处理(参见图3A、3B、3C和3D)细胞，接着进行检验。结果，证实KRS表达与FAK磷酸化不相关，但与pERK和桩蛋白的表达和磷酸化相关(参见图3A)，并且相应地，pERK(参见图3B和3E)和Tyr118影响磷酸化的桩蛋白位置上发生的粘着斑(参见图3C和3F)，但不改变FAKTyr397的磷酸化和细胞形态(参见图3D和3G)。
研究了其中KRS表达被抑制的细胞系中细胞-细胞外基质(ECM)粘附有关的信号传导的活性。结果，FAK、ERK、c-Src和桩蛋白的活性显著降低(参见图4A和4B)，并因此抑制粘着斑的形成(参见图4D)。
还确定三维胶原蛋白凝胶环境(参见图5)中培养的其中KRS表达被抑制的球状聚集的细胞系(参见图1D)中ERK和桩蛋白的表达和活性被抑制。将HCT116亲本细胞、KRS敲除细胞系(shKRS2-1,shKRS5-4)以及用U0126和YH16899处理的HCT亲本细胞在三维胶原蛋白凝胶中培养一天，接着免疫染色以研究ERK的磷酸化和桩蛋白的表达。结果，确定KRS敲除的细胞系或用KRS抑制剂处理的细胞系中ERK磷酸化(图6A和6C)和桩蛋白的表达(图6B和6D)显著被抑制。
当用ERK抑制剂处理KRS表达HCT116亲本细胞时，FAK、桩蛋白和E-钙粘蛋白的表达和活性显著降低(参见图7A)。也研究了信号传导激活剂的mRNA水平。结果，确定通过ERK抑制剂显著降低了E-钙粘蛋白的表达(参见图7B)。
在三维胶原蛋白凝胶环境中培养的表达KRS的球状聚集的细胞系中，下调上皮标记蛋白，但上调间充质标记蛋白(参见图8A和B)，而且细胞粘附也不分散(参见图8C)。对三维胶原蛋白凝胶环境中培养一天的所有HCT116亲本细胞、KRS敲除细胞系(shKRS2-1)、KRS过表达细胞系(myc-KRSWT)以及用U0126和YH16899处理的细胞系进行免疫染色，以测量上皮标记细胞角蛋白14(CK14)的表达。结果，确定从KRS表达球状体(箭头)播散的那些细胞中CK14的表达高，但与亲本细胞或myc-KRSWT细胞系相比，KRS敲除细胞系或用KRS抑制剂处理的细胞系中CK14的表达显著被抑制(图9)。当在相同培养条件中培养细胞时，观察到可表达KRS的细胞中细胞从聚集的细胞播散是时间依赖性的，表明确定了其中有细胞迁移和浸润(参见图10A)。
在三维胶原蛋白凝胶环境中培养的表达KRS的球状聚集的细胞系中，TFGβ1表达时间依赖性地增加(参见图10B)。当用TNFα处理上述条件下培养的细胞系时，不管KRS表达怎样，都观察到细胞迁移和浸润(参见图11A)。然而，当用TGFβ1处理细胞系时，观察到细胞从KRS表达细胞系的聚集的细胞的播散，但在KRS敲除细胞系中未观察到(参见图11B)。在三维胶原蛋白凝胶环境中培养的表达KRS的球状聚集的细胞系中，ERK抑制剂处理未引起细胞迁移和播散(参见图12)。
用ERK生物传感器转染HCT116细胞，接着通过FRET研究胞内ERK活性。结果，ERK磷酸化在KRS敲除细胞系中被抑制，但在KRS过表达细胞系中增加(图13A和13B)。
分别用pCMV-空白(M)、pCMV-桩蛋白(桩蛋白)(Px)和pCMV-ERK1/2(Ek)将其中KRS表达被抑制的细胞系瞬时转染48小时，接着进行免疫印迹法。结果，在其中KRS表达被抑制的细胞系中，ERK1/2的表达引起桩蛋白表达和Tyr118磷酸化的增加。即，KRS敲除细胞中桩蛋白的表达和磷酸化的抑制是由于ERK活性的降低(图14)。
对在具有10％血清的正常二维条件(图15A)中或在具有2％血清的层粘连蛋白(10mg/ml)涂覆的板(图15B)中对myc-KRS过表达HCT116细胞系进行免疫共沉淀。结果，确定整合素α6、整合素β1和p67LR连接在一起。同时，整合素α6和整合素β1仅在正常细胞粘附条件中轭合。当用YH16899(YH)处理细胞时，连接非常弱。在无粘附信号的悬浮液中观察到KRS和p67LR之间的轭合作用，但通过YH16899的处理被抑制。
用三维胶原蛋白凝胶环境中培养的球状体进行ChIP(染色质免疫沉淀)。结果，确定KRS，而不是JNK或p38，依赖性地激活的ERK通过下游转录因子c-Jun调控桩蛋白的转录(图16A、16B、16C和16D)。
当各种结肠直肠癌细胞系(图17A)中KRS表达被抑制或用KRS抑制剂YH16899处理细胞系(图17B)时，HCT116细胞中的典型现象如三维胶原蛋白凝胶中细胞从球状体播散(图17A)和ERK磷酸化以及桩蛋白的表达和磷酸化都被抑制(图17B)。
而且，用ERK抑制剂U1026和KRS抑制剂YH16899处理HCT116细胞系。结果，E-钙粘蛋白和β-连环蛋白的表达、粘着斑相关的分子和上皮标记物降低，同时ERK磷酸化以及桩蛋白表达和磷酸化也被抑制(图18A和18B)。
也确定从三维胶原蛋白凝胶中培养的KRS表达亲本细胞的球状体播散不是由于FAK激活或FAKTyr925磷酸化介导的ERK激活(图19A、19B、19C、19D和19E)。
分别用pCMV-空白、pCMV-桩蛋白和pCMV-ERK1/2转染HCT116KRS敲除细胞系，以构建稳定细胞系，接着进行免疫印迹法以研究那些分子的表达和磷酸化(图20A)。获得分布在三维胶原蛋白凝胶中的细胞系的球状体，然后在时差显微镜下观察。结果，三维胶原蛋白凝胶中的KRS敲除HCT116细胞系中桩蛋白和ERK1/2的活性恢复，表明涉及播散的主要信号传导活性恢复，导致观察到播散(图20B)。
用从人类结肠肿瘤组织，包括诊断为II级和III级癌症的临床组织，获得的提取物或组织的桩蛋白、p-ERK和KRS进行免疫印迹法(图21A)或免疫组织化学染色(图21B)。结果，浸润性癌边缘中确定其相关性。
因此，本发明人证实了对涉及三维或细胞外基质包围的环境中培养的结肠直肠癌细胞系中细胞-细胞粘附、细胞-细胞外基质(ECM)粘附、细胞粘附信号传导活性以及细胞播散的活性因子的表达和活性的分析可以有效地用于筛选转移抑制剂的方法和监测细胞迁移、浸润和转移的方法。
本发明的实践和目前优选的实施方式是说明性的，如以下实施例所示出的。
然而，要理解在考虑本文公开内容的情况下，本领域技术人员可在本发明的精神和范围内进行修改和改进。
实施例1：球状体细胞中E-钙粘蛋白表达的增加
<1-1>球状体细胞的培养
将人类结肠直肠癌细胞系HT116(美国模式培养物保藏所(美国菌种保藏中心或美国模式菌种收集中心，AmericanTypeCultureCollection)，美国)在37℃培养箱中培养两天，然后通过用胰蛋白酶/EDTA处理收集细胞。通过离心沉淀所收集的细胞，向该细胞中加入10ml补充有FBS的RPMI-1640。使用血细胞计数器测量细胞数量。将10ml补充有FBS的RPMI-1640分布在培养皿中，向该培养皿中按3×105的密度加入上述细胞。在37℃培养箱中使用Perfecta3D悬滴培养板(3DBiomatrix公司，美国)通过悬滴培养法培养细胞，以获得球状聚集的细胞。
结果，如图1B中所示，二维环境中培养的那些细胞的形态是粘附在皿底(floor)上的扁平形状，且当通过悬滴培养来培养细胞时，这些细胞形成球状聚集的细胞(图1B)。
<1-2>球状聚集的细胞中E-钙粘蛋白表达的增加
为了研究通过实施例<1-1>的方法获得的球状聚集的细胞中E-钙粘蛋白的表达，进行免疫印迹法。
具体而言，对球状聚集的细胞以100rpm进行快速离心(spin-down)，以将其聚集在一起，向其中加入100μl补充有1％SDS、Na3O4V和蛋白酶抑制剂混合物(cocktail)(GenDepot公司，美国)的裂解缓冲液(50mMTris-HCl,pH7.4、1％NP-40、0.25％脱氧胆酸钠、150mMNaCl、1mMEDTA)，然后于4℃下反应至少1小时。收集细胞，然后于4℃下以13000rpm离心30分钟。将上清液转移到新的微量离心管中，接着使用BCA试剂(ThermoScientifics公司，美国)进行蛋白定量。向定量的样品中加入4×样品缓冲液(100％甘油4ml、Tris-HCl,pH6.8,2.4ml、SDS0.8g、溴酚蓝4mg、β-巯基乙醇0.4ml、H2O3.1ml(总共10ml))，使其在100℃下煮沸5分钟。对样品进行12％SDS-PAGE电泳。将电泳产物转移至ProtranTM硝酸纤维素膜(Whatman)上，然后用5％脱脂奶对该膜预处理1小时。预处理后，用PBS(130mMNaCl、13mMNa2HPO4、3.5mMNaH2PO4,pH7.4)洗涤该膜两次，接着于4℃下与E-钙粘蛋白(SantaCruzBiotech公司，美国)和α-微管蛋白(Sigma公司，美国)的一级抗体反应15小时。第二天，诱导与二级抗体的反应，接着使用ECL(Pierce公司，美国)在x射线膜上发展。
结果，如图1C中所示，球状聚集的细胞中E-钙粘蛋白的表达随培养时间增加(图1C)。
实施例2：其中赖氨酰-tRNA合成酶(KRS)表达被抑制的球状聚集的细胞系中的上皮-间充质转化
<2-1>其中KRS表达被过表达或被抑制的球状聚集的细胞系的构建
由通过实施例<1-1>的方法获得的球状聚集的细胞构建其中KRS表达被过表达或被抑制的球状聚集的细胞系。
具体而言，通过用赖氨酰-tRNA合成酶shRNA质粒DNA(Sigma公司，美国)转染细胞来构建其中KRS表达被抑制的细胞系。这时，所述KRS是智人赖氨酰-tRNA合成酶(转录变异体1，mRNA序列：NM_001130089.1)。该KRS包括1219bp长外显子1-15。在所购买的KRSshRNA质粒DNA中，shKRS-0(SEQ.ID.NO:1)靶向KRS的1581-1604bp(外显子12)，shKRS-1(SEQ.ID.NO:2)靶向437-459bp(外显子3-4)，shKRS-2(SEQ.ID.NO:3)靶向911-933bp(外显子7)，以及shKRS-5(SEQ.ID.NO:4)靶向1071-1092bp(外显子8)。本文中使用的shRNA的序列在表1中示出。TRC1.5-pLK0.1-puro用作表达载体。通过使用嘌呤霉素进行选择以建立稳定的细胞系。都显示出KRS抑制效果的ShKRS-0、shKRS-2和shKRS-5正靶向形成二聚体以起到使赖氨酸与对应tRNA核糖体3'OH连接的桥接作用的II类核心域，以有助于顺畅(smooth)蛋白合成。
[表1]
| shKRS | 序列(5'→3') | SEQ.ID.NO |
| shKRS-0 | CCGGCCTGGAAGTGACTTGCATCAACTCGAGTTGATGCAAGTCACTTCCAGGTTTTTG | 1 |
| shKRS-1 | CCGGCGTGGACCCAAATCAATACTACTCGAGTAGTATTGATTTGGGTCCACGTTTTTG | 2 |
| shKRS-2 | CCGGCCAGAGATACTTGGACTTGATCTCGAGATCAAGTCCAAGTATCTCTGGTTTTTG | 3 |
| shKRS-5 | CCGGGCCTTTCATCACTTATCACAACTCGAGTTGTGATAAGTGATGAAAGGCTTTTTG | 4 |
为了KRS过表达细胞系的构建，克隆myc标记的KRS序列(Kim等，FASEBJ.2012Oct；26(10):4142-59)。在用250μg/ml的G418处理的细胞中引入克隆的pcDNA-Myc-KRS表达载体，导致myc标记的KRS过表达细胞系的构建。
因此，通过使用shKRS-2和shKRS-5shRNA构建KRS敲除细胞系，其中使用shKRS-2建立的三种克隆命名为2-1、2-2和2-3，使用shKRS-5获得的克隆命名为5-4。
<2-2>所建立的球状聚集的细胞系中KRS表达的抑制
进行免疫印迹法以研究通过实施例<2-1>的方法构建的KRS敲除细胞系的球状聚集的细胞中KRS表达是否被抑制。具体而言，通过与实施例<1-2>中描述的相同的方式使用KRS(Abcam公司，大不列颠)和α-微管蛋白(Sigma公司，美国)的一级抗体进行免疫印迹法。
结果，如图1E中所示，确定用shKRS处理的球状聚集的细胞系中KRS表达被抑制。
<2-3>球状聚集的KRS敲除细胞系中的上皮-间充质转化(EMT)相关的标记基因mRNA表达
进行反转录PCR以研究通过实施例<2-2>的方法确定的KRS敲除细胞系中EMT相关的标记基因mRNA的表达水平。
具体而言，通过使用TRizol(Invitrogen公司，美国)从通过实施例<2-1>的方法建立的细胞系提取mRNA，接着使用微量分光光度计(nanodrop)(ThermoScientific公司，美国)定量。通过使用AmfirivertcDNASynthesisMasterMix(GenDePot公司，美国)将定量的mRNA合成为cDNA。通过使用ThermoScientificDreamTaqGreenPCRMasterMix(ThermoScientific公司，美国)和作为引物的β-肌动蛋白进行PCR。通过使用β-肌动蛋白测量各样品的量。通过使用表2中列出的引物将EMT标记mRNA定量。
[表2]
结果，如图1F中所示，与正常HCTT116细胞系和KRS过表达细胞系中的表达水平相比，显著下调KRS敲除细胞系中上皮标记E-钙粘蛋白mRNA。相反，显著上调上皮标记物波形蛋白、N-钙粘蛋白和twistmRNA(图1E)。
<2-4>球状聚集的KRS敲除细胞系中的上皮-间充质转化(EMT)相关的标记基因蛋白表达
进行免疫印迹法以研究通过实施例<2-2>的方法确定的KRS敲除细胞系中EMT相关的标记基因蛋白的表达水平。这时，使用E-钙粘蛋白(SantaCruzBiotech公司，美国)、波形蛋白(Sigma公司，美国)、KRS(Abcam公司，大不列颠)和α-微管蛋白(Sigma公司，美国)的一级抗体。
结果，如图1G中所示，确定KRS敲除细胞系中E-钙粘蛋白的表达显著降低，但其中波形蛋白的表达增加(图1G)。因此，表明KRS表达的抑制会引起部分EMT，并相应地降低细胞-细胞粘附，由此也会影响细胞迁移和浸润。
实施例3：通过抑制二维培养环境中的KRS表达诱导不完全EMT表型
<3-1>通过抑制二维培养环境中的KRS表达降低细胞-细胞粘附或EMT相关的蛋白表达
进行免疫印迹法以研究在有10％血清的二维环境中的100mm细胞培养皿中培养的HCT116细胞中细胞-细胞粘附或EMT相关的蛋白表达。
具体而言，用PBS洗涤在有10％血清的二维环境中培养的细胞系两次，接着于4℃下在200μl的补充有SDS、Na3O4V和蛋白酶抑制剂混合物(GenDepot公司，美国)的裂解缓冲液(50mMTris-HCl,pH7.4、1％NP-40、0.25％脱氧胆酸钠、150mMNaCl、1mMEDTA)中反应15分钟。收集细胞，并于4℃下以13000×g离心30分钟。将上清液转移到新的微量离心管中，接着使用BCA试剂(ThermoScientifics公司，美国)进行蛋白定量。向定量的样品中加入4×样品缓冲液(100％甘油4ml、Tris-HCl，pH6.8,2.4ml、SDS0.8g、溴酚蓝4mg、β-巯基乙醇0.4ml、H2O3.1ml(总共10ml))，使其在100℃下煮沸5分钟。通过与实施例<1-2>中描述的相同的方式用ZO-1(Zymed公司，美国)、β-连环蛋白(SantaCruz公司，美国)和E-钙粘蛋白的一级抗体处理制备的样品。
结果，确定与正常HCT116和KRS过表达细胞系相比，KRS敲除细胞系中可以是测量细胞-细胞粘附的指标的上皮标记蛋白ZO-1(Zymed公司)、β-连环蛋白(SantaCruz公司)和E-钙粘蛋白(SantaCruz公司)的表达都降低。相反，KRS敲除细胞系中间充质标记蛋白波形蛋白(Sigma公司)、N-钙粘蛋白(BDSciences公司)、twist1蛋白(Abcam公司)、snail1蛋白(Cellsignaling公司)和纤连蛋白(DAKO公司)都增加。整合素α6(Chemicon公司)、整合素β1(SantaCruz公司)、整合素β4(SantaCruz公司)、p67层粘连蛋白受体(Abcam公司)和层粘连蛋白(Abcam公司)的表达水平都没有变化，并与平常一致，尽管有KRS表达的调控(图2A)。
<3-2>KRS抑制对二维培养环境中周围微环境因子的影响
为了随时间流逝观察二维培养环境中的周围微环境因子，用这类细胞因子如TNFα和TGFβ另外处理补充有10％FBS的培养液，接着通过如实施例<3-1>中描述的相同方式研究可以是细胞-细胞粘附的指标的上皮标记蛋白的表达。
结果，如图2B中所示，通过正常HCT116和KRS过表达细胞系中TNFα处理，蛋白的表达没有变化。然而，当此处TGFβ1处理时，下调涉及细胞-细胞粘附的封闭蛋白或ZO-1，但上调间充质标记蛋白、纤连蛋白。同时，当用TGFβ1处理KRS敲除细胞系时，上调上皮标记蛋白如封闭蛋白，但下调纤连蛋白(图2B)。
因此，确定KRS表达参与细胞中的EMT。精确地，在微环境因子如TGFβ1的支持下，KRS似乎积极参与细胞迁移和浸润。
<3-3>通过二维培养环境中的KRS抑制导致的E-钙粘蛋白抑制和细胞-细胞粘附
通过实施例<3-1>中描述的相同的方式进行免疫荧光检测确定通过抑制KRS表达抑制了E-钙粘蛋白表达。
具体而言，通过用胰蛋白酶/EDTA处理消化(detach)在37℃CO2培养箱中培养两天的HCT116细胞。使用血细胞计数器计数细胞数量。然后，将细胞以1×106细胞/孔的密度分布在配有盖玻片的6孔板中。将细胞在37℃CO2培养箱中培养一天。在4％的甲醛中固定细胞30分钟，然后用30mM甘氨酸处理10分钟。用0.5％曲通X-100(tritonX-100)对细胞进行透化5分钟，接着用2％BSA预处理1小时。于4℃下用FITC标记的E-钙粘蛋白一级抗体(BioLegend公司，美国)处理细胞16-18小时。最后，用用于染色细胞核的DAPI(4',6-双脒-2-苯基吲哚，蓝色)溶液处理细胞，引起DAPI染色。一完成染色，即将附着有染色的细胞的盖玻片置于载玻片上，接着封固。在荧光显微镜(Olympus公司，日本)下观察染色的细胞。
结果，如图2C中所示，正常HCT116细胞和KRS过表达细胞系中的细胞粘附区中观察到E-钙粘蛋白的正常表达，而当KRS表达被抑制时，细胞粘附区中E-钙粘蛋白表达被抑制。然而，细胞-细胞结合或粘附未被影响。使用β-连环蛋白即用于确定细胞-细胞粘附的另一种标记物的测试显示一致的结果(图2C)。如图2D中所示，将KRS敲除细胞系(shKRS2-1,shKRS5-4)与KRS表达HCT116亲本细胞和KRS过表达细胞系(Myc-KRS-WT)进行比较。结果，与EMT(上皮-间充质转化)标记蛋白表达的模式不同，shKRS2-1和shKRS5-4中的细胞-细胞接触没有变化，并因此，细胞正常形成集落(图2D)。尽管二维环境中EMT标记蛋白表达已改变，板上生长的那些细胞的形态和形状没有变化，表明KRS表达未引起完全EMT，但导致不完全EMT。
实施例4：对层粘连蛋白(10μg/ml)预涂覆的二维培养环境中的其中已进行调控使KRS被表达或不被表达的细胞系中的细胞粘附信号传导因子的研究
据以前报道，KRS已从细胞质移入细胞质膜后，KRS涉及与细胞迁移层粘连蛋白剂量依赖性相关的信号传导活性(KimDG等，FASEBJ.2012Oct；26(10):4142-59)。因此，为了研究KRS表达和细胞-ECM粘附之间的相关性，发明人制备了细胞悬浮液，混合1小时，然后将其再分布至层粘连蛋白涂覆的培养皿上。通过测量与粘着斑如FAK、Src、桩蛋白和ERK有关的那些蛋白的表达和磷酸化来研究KRS介导的细胞粘附相关的信号传导活性。
具体而言，从培养皿分离HCT116亲本细胞、KRS敲除细胞系和KRS过表达细胞系，接着离心以从培养液分离细胞。其后，已使用用补充有2％FBS(用以获得健康细胞，同时最小化血清的作用)和1％BSA的无血清RPMI1640培养基制备的重铺缓冲液作为培养基。通过使用血细胞计数器计算细胞数量，然后额外向其中加入重铺缓冲液以使细胞密度为0.2×106个细胞或2×106个细胞，接着分布在e管中。用重铺缓冲液装管将总体积调节为1ml。将已用YH16899处理的HCT116亲本细胞与重铺缓冲液混合(最终浓度：10μM)。于37℃下将悬浮液摇晃1小时。已预涂覆有层粘连蛋白(10μg/ml)过夜的培养皿和盖玻片用PBS洗涤两次，向其中加入重铺缓冲液，于37℃下静置。将细胞混合1小时用于免疫荧光检测。精确地，将细胞以0.2×106细胞/孔的密度分布在含层粘连蛋白涂覆的盖玻片的6孔板中，并以2×106细胞的密度分布在为免疫印迹法准备的层粘连蛋白涂覆的60mm的皿中，接着在37℃培养箱中培养2小时。将用于免疫荧光检测的样品用PBS洗涤两次，接着在4％甲醛中固定15分钟。然后，用30mM甘氨酸处理细胞10分钟，接着用0.5％曲通X-100透化5分钟。然后，用3％BSA进行封闭1小时。于4℃下用未标记的p-ERK(Cellsignaling公司)、p-Tyr118-桩蛋白(SantaCruzBiotech公司)或p-Tyr397-FAK(Abcam公司)抗体对其处理16-18小时，并于室温下用二级抗体对其处理2小时。使用鬼笔环肽(phalloidin)进行肌动蛋白染色后，用DAPI(4',6-双脒-2-苯基吲哚，蓝色)对其处理用于细胞核染色。将用于免疫印迹法的样品用PBS洗涤两次，然后通过用裂解缓冲液(50mMTris-HCl,pH7.4、1％NP-40、0.25％脱氧胆酸钠、150mMNaCl、1mMEDTA)对其处理提取蛋白。将蛋白定量，然后对制备的样品进行免疫印迹法。
结果，与KRS表达亲本细胞系和KRS过表达细胞系(Myc-KRS-WT)相比，KRS敲除细胞系(shKRS2-1,shKRS5-4)中根据细胞粘附的Src、ERK和桩蛋白的磷酸化显著降低。然而，FAK的磷酸化没有变化(图3A)。因此确定在没有被FAK介导的情况下，认为取决于KRS的ERK和桩蛋白的磷酸化通过KRS信号传导活性而被诱导。用粘着斑相关的蛋白如p-ERK和桩蛋白进行免疫染色。结果，ERK和桩蛋白的磷酸化水平在KRS表达亲本细胞和KRS过表达细胞系中高，但在KRS敲除细胞系中降低，这与免疫印迹法的结果一致(图3B和3C)。当用10μM的YH16899即抑制KRS和层粘连蛋白受体之间的轭合的抑制剂处理细胞(KimDG等，NatChemBiol.2014Jan；10(1):29-34.)时，与未用抑制剂处理的对照相比，用抑制剂处理的KRS表达亲本细胞和KRS过表达细胞系中Scr、ERK和桩蛋白的磷酸化水平降低(图3A)。使用p-ERK和桩蛋白的免疫荧光检测的结果也是一致的(图3E和图3F)。上述结果证实KRS在细胞-ECM粘附相关的信号传导因子活性中起重要作用。然而，用KRS抑制剂或YH16899处理HCT116未引起Tyr397磷酸化的任何变化(图3B)，同样细胞形态或伸展也没有多大差异(图3D和3G)。
实施例5：对二维培养环境中通过抑制KRS抑制来抑制细胞-细胞外基质(ECM)粘附相关的信号传导活性的研究
进行免疫印迹法以研究在二维培养环境中通过与实施例<2-1>中描述的相同方式建立的细胞系中的细胞-ECM粘附和粘附相关的信号传导活性。将细胞再分布在特定ECM预涂覆的培养容器(无血清)中，用于研究细胞-ECM粘附信号传导活性。在两个小时内，确定细胞粘附相关的信号传导因子活性。这时，通过本领域中技术人员熟知的常规方法进行信号传导活性的研究(Juliano等，2001)。
具体而言，这时，使用pY397FAK(Abcam公司，大不列颠)、pY577FAK(SantaCruz公司，美国)、pY861FAK(SantaCruz公司，美国)、pY925FAK(SantaCruz公司，美国)、FAK(SantaCruz公司，美国)、p-ERK(cellsignaling公司，美国)、ERK(cellsignaling公司，美国)、KRS(Abcam公司，大不列颠)、pY416c-Src(cellsignaling公司，美国)、c-Src(SantaCruz公司，美国)、pY118桩蛋白(SantaCruz公司，美国)、桩蛋白(BDTransductionLaboratories公司，美国)以及α-微管蛋白(Sigma公司，美国)的一级抗体。
将补充有1％BSA的无血清培养液中的KRS表达HCT116亲本细胞系、KRS敲除细胞系(shKRS2-1和shKRS5-4)和KRS过表达细胞系再分布在纤连蛋白(10μg/ml)预涂覆的培养皿中。两小时后，获得细胞提取物，接着通过与实施例<1-2>中描述的相同方式进行免疫印迹法。
结果，如图4A中所示，KRS表达HCT116亲本细胞系和KRS过表达细胞系中观察到FAK和ERK的磷酸化，但KRS敲除细胞系中FAK和ERK的磷酸化显著降低(图4A)。如图4B中所示，与HCT116亲本细胞系相比，KRS敲除细胞系中c-Src和桩蛋白的磷酸化显著降低，且具体而言，桩蛋白表达的抑制更显著(图4B)。如图4C中所示，与KRS表达亲本细胞系和KRS过表达细胞系相比，KRS敲除细胞系中FAK的磷酸化仅略微降低，但ERK的磷酸化显著降低(图4C)。上述结果表明KRS在细胞-ECM粘附相关的信号传导因子活性中起重要作用。
实施例6：通过抑制二维培养环境中的KRS表达来抑制粘着斑
进行免疫荧光检测，以研究细胞-ECM粘附介导的粘着斑形成是否依赖于KRS表达。
具体而言，将补充有1％BSA的无血清培养液中的KRS表达HCT116亲本细胞系、KRS敲除细胞系(shKRS2-1和shKRS5-4)和KRS过表达细胞系再分布在层粘连蛋白(10μg/ml)或纤连蛋白(10μg/ml)预涂覆的盖玻片中。两小时后，通过与实施例<3-3>中描述的相同方式进行免疫荧光检测。这时，使用Tyr397磷酸化的FAK一级抗体(pY397FAK)和DAPI将细胞核染色。
结果，如图3D中所示，富含pY397FAK的粘着斑在纤连蛋白涂覆的二维培养环境中的HCT116亲本细胞系和KRS过表达细胞系中充分发展，而KRS敲除细胞系中的pY397FAK并没有很好地染色为斑点，从而相信粘着斑被显著抑制(图4D)。上述结果表明KRS在细胞-ECM粘附中起重要作用。然而，在已用对于KRS起作用来说是必需的层粘连蛋白预处理的二维环境中，其中KRS表达被抑制或用KRS抑制剂处理的细胞中的pERK和p-Tyr118桩蛋白斑点减少。同时，通过KRS表达或经KRS抑制剂处理，Tyr397磷酸化的FAK的位置和相关的细胞形态没有差异。因此，确定KRS表达在包括ERK和桩蛋白的细胞-细胞外基质(ECM)粘附信号传导中起重要作用。
实施例7：通过抑制三维胶原蛋白凝胶环境中培养的球状聚集的细胞中的KRS表达抑制ERK和桩蛋白的表达和活性
<7-1>三维胶原蛋白凝胶环境中HCT116细胞的培养
为了在三维胶原凝胶环境中培养球状聚集的细胞，将10×再生缓冲液(2.2g碳酸氢钠、4.8gHEPES(100ml))、10×RPMI培养基、I型胶原蛋白(BDBioscience公司，美国)、2N的NaOH和无血清的RPMI-1640完全混合，生成含I型胶原蛋白的溶液(最终浓度：2.0-2.5mg/ml)。在冰上完成所有过程，以防止胶原蛋白凝固。将制备的溶液装载在与共焦显微镜培养体系或PDMS(聚二甲硅氧烷)配套的磁性4孔室(LiveCellInstrument公司，韩国)中，孔直径为10mm。这时，将不含细胞的胶原蛋白溶液在孔底板上薄薄地铺开，以形成胶原蛋白底层，向该底层加入细胞和胶原蛋白混合液，接着在37℃培养箱中固化30分钟。将HCT116细胞培养2天，直到形成球状聚集的细胞，使用细胞筛(SPL公司，韩国)过滤以除去大小大于70μm的那些聚集的细胞。因此，收集已通过70μm孔的那些球状聚集的细胞，并用无血清RPMI1640洗涤两次。然后，通过离心沉淀细胞。除去培养基后，将胶原蛋白溶液加入剩余的细胞中，完全混合。将混合液按80-150μl倾倒至PDMS、培养容器或48孔板的各孔中，接着在37℃培养箱中固化30分钟。当混合液完全固化时，向其中加入补充有FBS的RPMI-1640。
结果，如图1D中所示，球状聚集的细胞系随时间长得越来越大，在光学显微镜下观察为暗色，表明细胞系增殖(图1D)。
<7-2>：通过抑制三维胶原蛋白凝胶环境中的KRS表达来抑制ERK和桩蛋白的表达和活性
确定了与细胞-细胞外基质粘附相关的KRS在二维环境中培养的HCT116细胞系中的重要性。这时，还确定了通过抑制KRS表达，FAK、ERK、桩蛋白和c-Src的磷酸化以及桩蛋白的表达显著降低。本发明人进行免疫印迹法以研究三维胶原蛋白凝胶环境中的球状聚集的细胞中是否观察到相同的模式。
具体而言，本文中使用通过与实施例<2-1>中描述的相同方式建立的细胞系。通过与实施例<7-1>中描述的相同方式培养KRS表达HCT116亲本细胞系、KRS敲除细胞系(shKRS2-1、shKRS2-2、shKRS2-3和shKRS5-4)和KRS过表达细胞系。这时，将细胞系置于三维胶原蛋白凝胶环境中。3-4小时后，从其获得样品。精确地，使用可去掉的黄色枪头(tipped-offyellowtip)拾取含有在48孔板中培养的细胞的胶原蛋白凝胶和培养基，并将其收集在1.7ml微量离心管中。于4℃下以5000×g离心1分钟。除去上清液，并将剩下的小颗粒(pellet)用冷PBS洗涤两次，接着也以相同的速度离心1分钟。向小颗粒中加入100μl的含1％SDS、Na3O4V和蛋白酶抑制剂混合物(GenDepot公司，美国)的裂解缓冲液，接着于4℃下反应至少1小时。于4℃下以13000×g离心30分钟。将上清液转移到新的微量离心管中。向上清液中加入4×样品缓冲液，于100℃下煮沸5分钟，导致样品的制备。通过与实施例<1-2>中描述的相同方式进行后续流程。这时，使用pY397FAK、pY577FAK、FAK、pY416c-Src、p-ERK、ERK、桩蛋白、KRS和α-微管蛋白的一级抗体。
结果，如图5中所示，与表达KRS的细胞系相比，三维胶原蛋白凝胶环境中培养的KRS敲除细胞系中FAK的磷酸化未特别地减少，相反，三维胶原蛋白凝胶环境中该磷酸化随培养时间增加，表明三维胶原蛋白凝胶环境中FAK磷酸化与KRS表达不相关。然而，三维胶原蛋白凝胶环境中的KRS敲除细胞系中ERK的磷酸化和桩蛋白的表达显著被抑制。在二维环境中培养的KRS过表达细胞系中，ERK磷酸化甚至在悬浮液条件中显著增加，表明KRS表达与ERK的磷酸化和激活以及桩蛋白表达密切相关。
实施例8：对KRS表达抑制、ETK激活抑制或KRS功能抑制对三维(3D)胶原蛋白凝胶环境中的ERK活性以及桩蛋白表达和激活的负面影响的研究
为了研究三维胶原蛋白凝胶环境中培养的细胞中是否观察到粘着斑相关的蛋白表达模式的KRS依赖性变化，对在三维胶原蛋白凝胶环境中培养的正常HCT116细胞、KRS敲除细胞系(shKRS2-1、shKRS5-4)和用MEK/ERK选择性抑制剂U0126和KRS抑制剂YH16899处理的细胞系进行免疫染色1天，以测量ERK磷酸化和桩蛋白表达，接着在共焦显微镜下观察。
具体而言，将I型胶原蛋白分布在PDMS中，不进行处理(图6A和图6B)或用U0126(50mM)或YH16899(50mM)处理一天(图6C和图6D)。使含有培养的细胞的胶原蛋白凝胶在4％的甲醛中固定30分钟，接着用30mM甘氨酸处理30分钟。通过使用0.5％曲通X-100诱导透化30分钟，接着用3％BSA溶液封闭2小时。于4℃下用未标记的p-ERK(cellsignaling公司)和桩蛋白(BDbioscience公司)抗体对其处理至少16-18小时，接着于室温下用二级抗体处理至少4小时。最后，用DAPI(4',6-双脒-2-苯基吲哚)溶液对其处理，以将细胞核染色。在共焦显微镜下观察染色的细胞。
由于p-ERK免疫染色，在正常HCT116球状细胞中的细胞核内部和周围区域中观察到染色的斑点(图6A和6C)。还确定了桩蛋白染色强阳性，从而在粘着斑区域中观察到桩蛋白斑点(图6B和6D)。然而，确定了在KRS敲除细胞系和用U0126和YH16899处理的细胞系的球状体中，ERK磷酸化水平非常低(图6A和6C)，并且桩蛋白免疫染色水平显著降低(图6B和6D)。上述结果表明细胞从三维胶原蛋白凝胶环境中培养的HCT116的球状体的KRS依赖性播散与ERK活性和桩蛋白表达密切相关。
实施例9：根据三维胶原蛋白凝胶环境中培养的球状聚集的细胞中的KRS表达的信号传导激活剂的表达模式
<9-1>根据三维胶原蛋白凝胶环境中培养的球状聚集的细胞中的KRS表达的信号传导激活剂的蛋白水平
由于早期确定了KRS在与二维培养环境中的HCT116中的细胞-ECM粘附有关的ERK磷酸化以及桩蛋白表达和激活中起重要作用，本发明人通过免疫印迹法进一步研究了与三维胶原蛋白凝胶环境中表达KRS的HCT116亲本细胞中细胞-ECM粘附有关的ERK活性。
具体而言，用浓度为50或100μM的ERK抑制剂U0126处理三维胶原蛋白凝胶环境中培养为球状聚集的细胞的HCT116亲本细胞，接着培养24小时。收集全细胞提取物，接着通过与实施例<7-2>中描述的相同方式进行免疫印迹法。这时，使用pY397FAK、FAK、p-ERK、ERK、pY118桩蛋白、桩蛋白、E-钙粘蛋白、β-连环蛋白、KRS、α-微管蛋白、pAkt1/2/3和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的一级抗体。
结果，如图7A中所示，当三维胶原蛋白凝胶环境中培养的HCT116亲本细胞中ERK被抑制时，细胞-ECM粘附相关的信号传导因子FAK和桩蛋白的磷酸化同时降低，并且特别地，桩蛋白的表达显著降低。E-钙粘蛋白的表达也降低(图7A)。上述结果与通过抑制KRS表达诱导的结果一致。即，确定了HCT116亲本细胞中ERK的磷酸化与桩蛋白表达和磷酸化密切相关，并且也确定了KRS在细胞-ECM粘附中起重要作用。
<9-2>根据三维胶原蛋白凝胶环境中培养的球状聚集的细胞中的KRS表达的信号传导激活剂的mRNA水平
进行实时PCR，以根据如实施例<9-1>中所示的三维胶原蛋白凝胶环境中培养的球状聚集的细胞中KRS的表达，研究信号传导激活剂之一，E-钙粘蛋白的mRNA水平。
具体而言，不用U0126(U0126为浓度为50或100μM的ERK抑制剂)处理或用U0126处理三维胶原蛋白凝胶环境中培养的HCT116亲本细胞，接着培养24小时。然后，通过与实施例<2-3>中描述的相同方式进行实时PCR。这时，本文中使用的引物是表2中列出的hEcad-5(SEQ.ID.NO:5)和hEcad-3(SEQ.ID.NO:6)。
结果，如图7B中所示，与未用ERK抑制剂处理的对照相比，E-钙粘蛋白mRNA的表达水平显著降低(图7B)。
因此，确定了KRS依赖性ERK和桩蛋白磷酸化和桩蛋白表达都与三维环境中培养的HCT116亲本细胞中的细胞-ECM粘附和细胞-细胞粘附密切相关。
实施例10：通过三维胶原蛋白凝胶环境中培养的球状聚集的细胞中的KRS表达抑制细胞-ECM粘附
在三维胶原蛋白凝胶环境中将表达KRS的HCT116亲本细胞培养为球状聚集的细胞。然后，进行免疫荧光检测以研究由HCT116亲本细胞分泌的然后保留在微环境中的细胞因子是否会影响上述培养的细胞的形态和浸润。
具体而言，将胶原蛋白加入PDMS中。不处理或用浓度为50μM的ERK抑制剂U0126处理HCT116亲本细胞一天，或培养KRS敲除细胞系。在KRS敲除细胞系培养的情况下，于室温下使含有细胞的胶原蛋白凝胶在4％多聚甲醛中固定30分钟，然后用30mM甘氨酸处理15分钟。然后，通过使用1％曲通X-100在室温下诱导透化30分钟，接着用3％BSA溶液预处理2小时。于4℃下用FITC标记的E-钙粘蛋白抗体对其处理16-18小时。用DAPI溶液对其处理以将细胞核染色。在共焦显微镜下观察染色的细胞。
结果，如图8C中所示，与HCT116亲本细胞系和KRS过表达细胞系相比，KRS敲除细胞系中E-钙粘蛋白的表达显著降低，并且甚至更难观察到细胞-细胞边缘(cell-cellborder)中E-钙粘蛋白的表达。然而，HCT116亲本细胞系和KRS过表达细胞系中球状细胞之间的粘附未分解，并仍形成聚集细胞的实心球(图8C)。上述结果表明KRS表达甚至在三维胶原蛋白凝胶环境中可调控细胞-细胞粘附，并且也影响EMT，尽管效果不完全，以及可调控上皮/间充质细胞形态的二元性(duality)。
实施例11：三维胶原蛋白凝胶环境中上皮标记细胞角蛋白14(CK14)和KRS表达细胞的播散之间的相关性
在三维胶原蛋白凝胶环境中，细胞的播散是KRS表达依赖性的，且KRS敲除细胞系中涉及细胞-细胞接触的上皮标记物的表达降低。然而在KRS敲除细胞系中，二维培养环境中未观察到细胞分散，且三维胶原蛋白凝胶环境中未观察到播散。因此，为了确定三维胶原蛋白凝胶环境中细胞从KRS敲除细胞系的球状聚集的细胞的播散是否是由于上皮标记物的表达，将该细胞系在三维胶原蛋白凝胶环境中培养24小时。当观察到播散时，进行CK14染色，并在共焦显微镜下观察细胞。
具体而言，将含有细胞的胶原蛋白凝胶分布在PDMS中，不进行处理(图9A)或用U0126(50mM)或YH16899(50mM)处理一天(图9B)。使含有培养的细胞的胶原蛋白凝胶在4％多聚甲醛中固定30分钟，然后用30mM甘氨酸处理30分钟。然后，通过使用0.5％曲通X-100诱导透化30分钟，接着用3％BSA溶液封闭2小时。于4℃下用未标记的CK14抗体对其处理16-18小时。还于室温下用二级抗体对其处理至少4小时。进行鬼笔环肽染色以将F-肌动蛋白染色，并用DAPI(4',6-双脒-2-苯基吲哚；蓝色)溶液对其处理以将细胞核染色。在共焦显微镜下观察染色的细胞。
结果，在其中观察到播散的KRS表达细胞中，在那些播散的细胞中CK14表达是特有的(图9A和9B)。然而，在其中播散被抑制的条件中，如在KRS抑制或尽管有KRS表达但用U1026或YH16899处理的条件中，CK14表达一般非常低，且在从球状体播散的那些细胞中几乎难以观察到(图9A和9B)。因此，确定了KRS表达的抑制引起了上皮标记物的下调、抑制的细胞分散，并因此诱导了不完全EMT(上皮-间充质转化)。即，KRS敲除细胞系中播散是不完全的，表明KRS依赖性播散仅在上皮标记物的存在下是完全的。
实施例12：KRS表达对三维胶原蛋白凝胶环境中培养的球状聚集的细胞中的细胞形态、迁移和浸润的影响
为了研究KRS依赖性EMT相关蛋白表达对三维胶原蛋白凝胶环境中培养的球状聚集的细胞中的细胞形态、迁移和浸润的影响，在时差显微镜下观察细胞。
具体而言，将2.5mg/ml的含细胞的胶原蛋白装入在用于时差显微镜的培养体系的磁性4孔室(LiveCellInstrument公司，韩国)中，并使胶原蛋白在37℃培养箱中硬化30分钟。当胶原蛋白完全固化时，向其中加入补充有10％FBS的RPMI-1640。将含有三维胶原蛋白凝胶的磁性室和其对应适配器(adaptor)置于时差显微镜上，接着设置多位置。然后，在37℃5％CO2培养箱中观察含三维胶原蛋白凝胶的室。每6小时向其中加入培养基，以使胶原蛋白不会变干。这时，保持焦点不变很重要。
结果，如图10A中所示，随着时间，一些细胞从HCT116亲本细胞系和KRS表达细胞系中的主细胞群(mass)播散，表明存在如细胞迁移和浸润至周围区域的这种活性。同时，KRS敲除细胞系中主细胞群变得更大，但未观察到细胞的播散。图10A示出了每6小时和在第24小时(1:00:00)以及第28小时(1:04:00)时的细胞形态、迁移和浸润的变化的观察结果(图10A)。
实施例13：通过三维胶原蛋白凝胶环境中培养的球状聚集的细胞中的KRS表达增加TGFβ1表达
为了研究实施例12的结果是否是由于细胞微环境中存在的细胞因子的自分泌影响，通过与实施例<6-2>中描述的相同方式进行免疫印迹法，以测量TGFβ1即最具代表性的多功能和EMT诱导细胞因子的表达(Katsuno等，2013,CurrOpinOncol,25:76-84)。
结果，如图10B中所示，TGFβ1的表达水平在HCT116亲本细胞和KRS过表达细胞系中随时间显著增加，但在KRS敲除细胞系中随时间变得被抑制，即使早期TGFβ1的表达水平高(图10B)。
因此，KRS敲除细胞系中TGFβ1未被影响，表明TGFβ1不引起细胞的额外播散。即，尽管其是不完全的，EMT相关因子仍可以通过抑制KRS表达来调控，因为该因子具有类似间充质细胞的特性。
实施例14：细胞从三维胶原蛋白凝胶环境中球状聚集的细胞的KRS表达依赖性播散
确定了二维培养环境和三维培养环境中培养的细胞系中包围细胞的微环境对细胞功能的影响(图2和10)。因此，通过使用时差显微镜研究当三维胶原蛋白凝胶环境中培养的球状聚集的细胞用细胞因子如TNFα和TGFβ1处理36小时时，细胞从球状体的播散是否依赖于KRS表达。
结果，如图11A中所示，当用TNFα处理球状聚集的细胞时，所有HCT116亲本细胞、KRS过表达细胞系和KRS敲除细胞系中浸润性突出的形成增加，并且也观察到细胞从细胞群的播散以及相应地细胞迁移(图11A)。即，确定了TNFα介导的浸润性突出形成和细胞的播散是KRS依赖性的。然而，推测这种细胞因子如TGFβ1在细胞的播散中起重要作用(图10B)。因此，用TGFβ1处理球状聚集的细胞。如图11B中所示，当用TGFβ1处理细胞时，HCT116亲本细胞和KRS过表达细胞系中未观察到浸润性突出的形成，但观察到细胞从球状体细胞的播散。同时，当用TGFβ1处理KRS敲除细胞系时，细胞迁移显著降低，且也未观察到细胞的播散(图11B)。
研究了EMT相关蛋白的表达水平，该蛋白包括显示出通过KRS表达下调的上皮标记物。结果，TGFβ1的处理引起了细胞-细胞连接中上皮标记蛋白如ZO-1和封闭蛋白的增加，但引起纤连蛋白表达的降低，表明通过微环境中的TGFβ1，KRS敲除细胞系中EMT被抑制。即，当KRS表达被抑制时，细胞转变为不完全间充质细胞(图2和8)，并因此微环境因子如引起EMT的细胞因子TGFβ1(Katsuno等，2013,CurrOpinOncol,25:76-84)不再影响细胞播散、细胞迁移和细胞浸润。
实施例15：通过三维胶原蛋白凝胶环境中培养的球状聚集的细胞中的ERK抑制而抑制细胞的播散
如实施例14的结果所确定的，当用TGFβ1处理HCT16亲本细胞时，观察到细胞从球状聚集的细胞的播散和其迁移。当用TGFβ1处理KRS敲除细胞系时，未观察到细胞的播散。同时，与KRS表达细胞系相比，KRS敲除细胞系中ERK的活性显著降低(图5)。当用细胞外信号调节激酶(ERK)抑制剂U0126处理HCT116亲本细胞时，推测对细胞的播散和迁移是负面影响。为了证实上述内容，用50μM的ERK抑制剂U0126处理细胞系，接着通过对球状聚集的细胞的实时活体成像观察细胞播散和迁移。
结果，如图12所示，当用ERK抑制剂处理时，未诱导细胞的播散和迁移(图12)。因而，细胞从HCT116细胞的球状体的播散取决于ERK的活性。
因此，确定了癌细胞从三维胶原蛋白凝胶环境中的HCT116亲本细胞群的播散由KRS依赖性ERK活性以及桩蛋白表达和活性来调控。
实施例16：通过FRET技术测量KRS依赖性ERK活性
免疫印迹法和免疫染色是用于研究ERK的信号和活性的常规方法。然而，这些方法有通过拍照能观察到仅一部分细胞事件的缺点。因此，在本发明中，发明人试图通过FRET基础传感器(FRET-basicsensor)观察活细胞中的细胞内ERK信号。精确地，基于ERK活性传感器EKAR(细胞外信号调节激酶活性受体)随着增加的FRET信号，通过ERK磷酸化引起构象变化的原则，本发明人观察细胞内CFP-YFP比例，以最终测量ERK活性(Harvey等,2008,ProcNatlAcadSciUSA.2008Dec9；105(49):19264-9)。
具体而言，用EKAR(细胞外信号调节激酶活性受体，Harvey等，2008,ProcNatlAcadSciUSA.2008Dec9；105(49):19264-9)转染HCT116亲本细胞、KRS敲除细胞系和KRS过表达细胞系48小时。为了在二维条件中观察，将细胞分布在通用培养皿中，并且24小时后，将细胞再分布(在2％血清的存在下)在层粘连蛋白涂覆的皿中。两小时后，通过使用FRET(荧光共振能量转移)显微镜测量ERK活性。通过使用NikonTi-E倒置显微镜(装有PFS、CoolSNAPHQ照相机(RoperScientific公司，特伦顿，新泽西州)、激发和发射滤镜轮)(4×4复合模式(biningmode)，200-ms曝光)获得FRET图像。所有系统通过使用MetaMorhp软件来操作。由细胞内FRET探针双发射比例(CFP/FRET)获得的图像表现为伪彩色图像，该伪彩色图像可通过使用由MetMorph软件提供的显示(IMD)模式根据FRET/CFP比例分为8级。
结果，确定了通过KRS改变ERK磷酸化，其中高ERK磷酸化信号表现为红色，而低信号表现为蓝色(伪彩色)(图13A)。从结果的统计分析可确定，KRS过表达细胞系中观察到最高的ERK活性，然后按此顺序是HCT116亲本细胞和KRS敲除细胞系(图13B)。从FRET信号强度的观察还可确定，KRS表达与ERK活性密切相关。
实施例17：用ERK转染的KRS敲除细胞系中桩蛋白表达和信号传导活性的变化
如前文中所描述的，KRS表达亲本细胞和KRS过表达细胞系中诱导了ERK和桩蛋白激活，伴有细胞从三维环境中的球状体细胞的播散。然而，KRS敲除细胞系中未诱导ERK和桩蛋白激活，也没有细胞的播散。因此，进一步研究了通过KRS敲除细胞系中人为强迫的ERK或桩蛋白过表达是否诱导了细胞从三维环境中球状体细胞的播散。
具体而言，通过根据制造商的协议使用lipofectamine2000(LifeTechnology公司，格兰德岛，纽约，美国)用ERK或桩蛋白基因转染KRS敲除细胞系。48小时后，将细胞在三维胶原凝胶中培养1天，然后获得细胞提取物，接着进行免疫印迹法。
结果，当在KRS敲除细胞系shKRS2-1和shKRS5-4中表达ERK(Ek)时，诱导了ERK激活，并增加了桩蛋白表达和Tyr118磷酸化。然而，FAK活性没有变化(图14)。
实施例18：KRS-p67层粘连蛋白受体轭合物和KRS-整合素α6β1轭合物的形成
整合素α6β1与细胞外ECM分子层粘连蛋白相互作用，并也已知会与膜上存在的层粘连蛋白受体结合(Canfield,S.M.和Khakoo,A.Y.1999,JImmunol163,3430-3440)。整合素是直接涉及细胞内粘附信号的蛋白，其也已知会调控ERK活性(Lee,J.W.和Juliano,R,2004,MolCells17,188-202)。为了研究诱导细胞内ERK活性、整合素α6β1和p67LR的KRS之间的相互作用，用Myc标记的KRS表达细胞系进行免疫共沉淀。具体而言，为了研究层粘连蛋白的作用，从已重铺并在层粘连蛋白涂覆的皿中培养的细胞制备细胞提取物，接着进行免疫共沉淀。
精确地，从补充有10％血清(为了获得健康的细胞，同时将血清的影响最小化)的培养基中正常培养的细胞获得总细胞提取物和从已重铺并在补充有2％血清的层粘连蛋白涂覆(10μg/ml)的皿中培养2小时的细胞获得的其他总细胞提取物中分别添加抗Myc抗体，接着于4℃下反应至少18小时。于4℃下取出管，向其中加入蛋白A和G(1:1V/V)涂覆的琼脂糖珠(sepharosebeads)，接着在4℃下反应4小时。用RIPA缓冲液洗涤所述珠，接着在2×SDS-PAGE样品缓冲液中煮沸5分钟。对所制备的免疫共沉淀的样品进行免疫印迹法，并确定与标记的因子的轭合。
结果，确定了myc-KRS和整合素α6、整合素β1和p67LR之间的相互作用。然而，当用KRS抑制剂YH16899(KimDG等，NatChemBiol.2014Jan；10(1):29-34.)对其处理时，抑制了该相互作用。为了研究所述相互作用中层粘连蛋白的作用，将细胞提取物再分布在仅补充有2％FBS的层粘连蛋白涂覆的皿中，接着进行免疫共沉淀。结果，确定了myc-KRS和整合素α6、整合素β1和p67LR之间的相互作用。另外，在粘附信号被抑制的情况下，甚至在抑制中确定了KRS和p67LR之间的相互作用(图15A和15B)。然而，KRS和整合素α6和整合素β1之间的相互作用在未检测到粘附信号的情况下的悬浮液中未观察到，且仅在检测到粘附信号的情况下的悬浮液中有观察到(图15A和15B)。总之，细胞粘附信号传导中涉及的KRS和整合素α6β1之间的相互作用可通过YH16899处理被抑制，表明了KRS/p67LR/整合素α6β1的相互作用在细胞粘附信号传导活性的激活中起重要作用，且这时YH16899可影响该相互作用。
实施例19：通过对三维胶原蛋白凝胶环境中培养的细胞进行ChIP(染色质免疫沉淀)确定，通过激活的ERK调控的桩蛋白表达
如实施例17中所示，当分别用pCMV-空白、pCMV-桩蛋白和pCMV-ERK1/2瞬时转染KRS敲除细胞系shKRS2-1时和当用ERK1/2处理KRS敲除细胞系时，桩蛋白表达增加。因此，在HCT116细胞系中桩蛋白表达会由ERK的活性调控的假设下，进行ChIP(染色质免疫沉淀)以研究桩蛋白表达是否由称为ERK下游因子的转录因子Elk-1和c-Jun调控。
具体而言，对三维胶原蛋白凝胶环境中培养的KRS敲除细胞系进行免疫印迹法，以研究ERK下游转录因子Elk-1或c-Jun的磷酸化(或激活)和其中JNK或p38的磷酸化。结果，确定了KRS介导的ERK激活引起了c-Jun激活。使用ChIP-ITExpressEnzymatic(Activemotif公司)试剂盒(BMS)通过声波降解法对用DMSO处理的三维胶原蛋白凝胶中球状培养的HCT116细胞(对照)、用YH16899处理的样品和由KRS敲除细胞系shKRS2-1获得的样品进行染色质碎裂(Chromatinfragmentation)。留下一部分产物作为输入，并于4℃下使剩余染色质与c-Jun(cellsignalingTechnology公司)或Elk-1(SantaCruzBiotech.Inc.公司)抗体在试剂盒提供的蛋白G磁珠的存在下反应至少18小时。一完成抗体反应，即用试剂盒中包含的ChIP缓冲液1和2洗涤该磁珠。染色质洗脱后，诱导反相交联。这时，用ChIp缓冲液2和5MNaCl处理输入DNA。ChIp和输入DNA样品于95℃下互相反应15分钟。用蛋白酶K消化后，通过用蛋白酶K终止液处理而终止该消化。使用表3中列出的对应引物对获得的DNA进行PCR。
[表3]
结果，如图16A中所示，KRS表达不参与JNK和p38激活。在ERK下游转录因子如Elk-1或c-Jun之中，KRS依赖性ERK活性与c-Jun激活和表达相关。因此，KRS表达细胞系中ERK激活会引起c-Jun激活。
还使用c-Jun抗体对三维胶原蛋白凝胶环境中培养的球状聚集的细胞进行ChIP。在对照中，c-Jun不与非特异性区域结合，但与特定结合序列中的桩蛋白启动子结合(图16B)。然而，与桩蛋白启动子结合的这种c-Jun通过YH16899的处理而被抑制(图16C)。从上述观察确定，ERK下游因子磷酸化的c-Jun可以通过与桩蛋白启动子结合而影响桩蛋白的转录。当用YH16899处理时，c-Jun不会与桩蛋白启动子结合，表明了通过YH16899的处理而降低桩蛋白表达和磷酸化。本发明人推测桩蛋白的转录通过称为ERK下游因子的Elk-1来调控，但Elk-1抗体未结合至桩蛋白启动子，通过使用Elk-1抗体的ChIP而确定(图16D)。
结果，确定了三维胶原蛋白凝胶环境中培养为球状聚集的细胞的HCT116细胞中桩蛋白转录可通过由ERK控制的转录因子c-Jun调控。由作用是抑制KRS和层粘连受体之间的轭合的YH16899的处理引起的桩蛋白表达和磷酸化的降低是由于该现象，其中c-Jun不能结合至桩蛋白启动子，因为KRS/整合素α6β1/p67LR相互作用不完全，从而未诱发ERK激活。三维胶原蛋白凝胶环境中培养为球状聚集的细胞的HCT116细胞中参与桩蛋白表达的ERK依赖性调控的是Elk-1，而不是c-Jun。
实施例20：其他结肠直肠癌细胞系中的KRS表达依赖性播散和YH16899引起的ERK磷酸化以及桩蛋白表达和磷酸化的抑制
为了研究其他结肠直肠癌细胞系中是否观察到HCT116细胞系中细胞从球状体细胞的KRS表达依赖性播散或通过YH16899处理的ERK磷酸化以及桩蛋白表达和磷酸化的降低，进行以下实验。用shKRS稳定地转染各种结肠直肠癌细胞系(SW620、HCT15、SNU977、KM12SM和SNU-C5)，以抑制KRS表达(克隆#2和#5)。然后，在时差显微镜下观察播散(图17A)或在YH16899的处理后研究信号传导活性(图17B)。
具体而言，将结肠直肠癌细胞系SW620、HCT15、SNU977、KM12SM和SNU-C5(韩国细胞系银行(KoreanCellLineBank)，癌症研究所，首尔国立大学)分布在三维胶原蛋白凝胶环境中作为球状体，接着时差成像6小时后，或接着在补充有10％血清的二维环境中正常培养2天。然后，向其中加入裂解缓冲液(50mMTris-HCl,pH7.4、1％NP-40、0.25％脱氧胆酸钠、150mMNaCl、1mMEDTA)，接着裂解以获得细胞裂解物。将获得的细胞裂解物中的蛋白定量，接着用标记的因子进行免疫印迹法。
结果，与HCT116细胞系中的相同，在结肠直肠癌细胞系SW620中观察到细胞从三维球状体细胞的播散。然而，在KRS敲除细胞系(#2、#5)和用U0126或YH16899处理的SW620亲本细胞中未观察到该播散(图17A)。当用YH16899处理各种结肠直肠癌细胞系时，在不诱发细胞凋亡的情况下实现FAK、ERK和桩蛋白的磷酸化的降低以及E-钙粘蛋白和桩蛋白的表达的抑制(图17B)。因此，各种结肠直肠癌细胞系之中由YH16899引起的抑制不仅是在一些特定细胞系中观察到的特定现象，而是各种结肠直肠癌细胞系之中相当普遍的现象。因此，确定了YH16899是可抑制各种结肠直肠癌细胞系的通用抑制剂。
实施例21：HCT116细胞系中通过YH16899抑制ERK磷酸化以及桩蛋白表达和磷酸化
HCT116中观察到的播散在ERK激活以及桩蛋白表达和激活中起重要作用。基于此，根据三维胶原蛋白凝胶中ERK抑制剂U0126(图18A)和KRS抑制剂YH16899(图18B)的处理进一步研究了粘着斑分子和上皮标记物的表达。
具体而言，三维胶原蛋白凝胶环境中培养的HCT116亲本细胞用浓度为50和100μM的U0126或浓度为50和100μM的YH16899处理一天。将SDS、Na3O4V和蛋白酶抑制剂混合物(GenDepot公司)加到裂解缓冲液中，接着于4℃下反应至少1小时。于4℃下以13000rpm离心30分钟。将上清液转移到新的微量离心管中。向其中加入4×SDS-PAGE样品缓冲液，接着于100℃下煮沸5分钟。使用α-微管蛋白抗体(Sigma公司)通过免疫印迹法将提取物定量。还通过免疫印迹法测量其他蛋白表达和磷酸化。
结果，各粘着斑分子如FAK、ERK和桩蛋白的磷酸化被抑制，且还降低了上皮标记物E-钙粘蛋白和β-连环蛋白的表达(图18A和18B)。因此，确定了通过U0126或YH16899的处理抑制ERK和桩蛋白的表达和激活会引起对三维胶原蛋白凝胶中HCT116亲本细胞的播散的抑制。
实施例22：整合素α6在KRS表达HCT116亲本细胞中的细胞粘附依赖性ERK激活中起重要作用。
上述实施例中确定了HCT116亲本细胞中的ERK激活与KRS、p67LR和整合素α6β1的相互作用密切相关(图15)，但与FAK不相关(图5)。因此，本发明人试图研究细胞粘附依赖性FAK激活(Tyr397磷酸化后由c-Src介导的Tyr925磷酸化所引起的ERK激活：LeeJW和JulianoR.MoleculesandCells.2004Apr30；17(2):188-202)是否会引起ERK激活。即，当通过整合素α6与对应抗体轭合从而干扰与细胞外基质轭合来抑制ERK激活时，研究了FAK的Tyr397和Tyr925的磷酸化之间的相互作用。
具体而言，在2％血清的存在下，将HCT116亲本细胞重铺于层粘连蛋白预涂覆的培养皿中作为悬浮液。这时，使细胞提前与正常IgG(免疫球蛋白，抗体对照)或整合素α6抗体反应1小时，接着进行重铺。重铺2-24小时后，制备细胞提取物，接着进行免疫印迹法。
结果，约24小时后，根据层粘连蛋白涂覆的皿中二维环境中培养的HCT116细胞中的细胞粘附诱导了ERK激活和桩蛋白磷酸化，但当用整合素α6预处理细胞时，该ERK激活和桩蛋白磷酸化被抑制。然而，FAK磷酸化不受影响，并保持像通常一样正常(图19A)。上述结果表明了整合素α6在KRS依赖性ERK激活中起重要作用，但不需要FAK磷酸化作为介导。因此，确定了ERK激活、桩蛋白表达和激活以及进一步的细胞从三维胶原蛋白凝胶中的球状体细胞的播散既不与FAK激活相关，也不与Tyr925磷酸化相关。
实施例23：KRS敲除细胞系中激活的FAK或WTFAK的过表达确定不与ERK和桩蛋白表达以及三维胶原蛋白凝胶中的播散不相关
如上述实施例中所描述的，HCT116细胞中观察到的播散与ERK激活和ERK激活依赖性桩蛋白表达和激活相关。因此，本发明人试图研究细胞粘附依赖性FAK激活(Tyr397磷酸化后由c-Src介导的Tyr925磷酸化引起的ERK激活：LeeJW和JulianoR.MoleculesandCells.2004Apr30；17(2):188-202)是否会引起ERK激活和诱导KRS表达依赖性播散。
具体而言，用其中消除了Ad-HA-R454FAK激酶活性的Ad-HA-对照病毒或死亡形式的腺病毒感染HCT116亲本细胞，或用Ad-HA-对照病毒、Ad-HAΔN(1-100)FAK(激活的FAK；LimST等,MolecularCell2008Jan18；29(1):9-22)或Ad-HA-FAKWT(野生型)病毒感染KRS敲除细胞系，接着进行免疫印迹法以测量所述分子的表达和磷酸化(图19B)。获得分布在三维胶原蛋白凝胶中的球状聚集的细胞，接着在时差显微镜下观察。
结果，确定了尽管在KRS表达亲本细胞中表达了非活性(激酶活性被敲除)R454FAK突变体，与用对照病毒感染的亲本细胞一样，其中顺利诱导了细胞从球状体细胞的播散。同时，尽管KRS敲除HCT116细胞系中过表达了活性FAK或野生型FAK，被抑制的播散不能恢复(图19C和19D)。在其中激活的突变体L37AFAK(Jung等，JCellSci.2012Dec15；125(Pt24):5960-73)被表达的HCT116shKRS细胞系中，FAK激活未引起ERK激活(图19E)。
实施例24：用pCMV-空白、pCMV-桩蛋白或pCMV-ERK1/2转染的或用桩蛋白和ERK共转染的KRS敲除细胞系中ERK和桩蛋白表达和信号传导活性的不完全改善以及对三维胶原蛋白凝胶中播散的研究
如上述实施例中所描述的，HCT116细胞系中观察到的播散与ERK激活以及桩蛋白表达和激活密切相关。因此，为了研究细胞从三维胶原蛋白凝胶中的球状体细胞的播散是否可通过恢复KRS敲除细胞系中ERK表达以及桩蛋白的表达和活性来诱导，进行以下实验。首先通过用桩蛋白(Pax克隆)或ERK(ERK克隆)单独处理或用桩蛋白和ERK一起处理KRS敲除细胞系来制备稳定细胞系。进行免疫印迹法以挑选显示优良的ERK和桩蛋白活性的那些克隆(图20A)。培养所挑选的克隆以形成球状体。将球状聚集的细胞分布在三维胶原蛋白凝胶中，其中在时差显微镜下观察细胞的播散28小时。
具体而言，分别用pCMV-空白、pCMV-桩蛋白和pCV-ERK1/2转染KRS敲除细胞系以建立稳定细胞系。通过免疫印迹法确定标记的因子(图20A)。挑选显示成功表达转染分子的那些细胞来形成球状体。将球状聚集的细胞分布在三维胶原蛋白凝胶中，其中在时差显微镜下观察细胞的播散28小时(图20B)。
结果，KRS敲除HCT116细胞系在三维胶原蛋白凝胶中显示了桩蛋白或ERK1/2活性或它们两者，确定了播散(图20B)。具体而言，当用ERK1/2处理KRS敲除细胞系时，桩蛋白表达增加(图20A)。因此，预期HCT116细胞系中桩蛋白表达可通过ERK来调控。确定了根据KRS表达的抑制而抑制播散是由于ERK和桩蛋白活性的抑制。
实施例25：人类结肠肿瘤组织中KRS、桩蛋白和ERK表达之间的相关性
进行免疫印迹法和免疫组织化学染色以研究韩国人结肠癌患者组织和对应正常组织中KRS、桩蛋白和ERK表达之间的相关性。
具体而言，用从包括诊断为II级和III级癌症的临床组织的人类结肠肿瘤组织获得的组织提取物或组织进行免疫印迹法(图21A)和免疫组织化学染色(图21B)，以研究桩蛋白、p-ERK和KRS。结果，确定了其浸润性癌细胞边缘中的阳性相互作用。免疫组织化学是用于将细胞或组织中的抗原可视化的方法。在真正的癌组织中，观察到各种细胞类型。因此，可以通过免疫组织化学测量特定细胞类型或组织中的各种抗原表达位点和水平来理解各种蛋白表达位点和水平以及其中的相互作用。
通过DAB染色测量人类结肠肿瘤组织中的桩蛋白、p-ERK和KRS的表达，以测量人类结肠肿瘤组织中各蛋白的阳性位点和阳性反应。据观察，II级和III级结肠癌症患者组织样品中的相同区域中KRS表达和桩蛋白表达高。p-ERK的阳性区域与KRS和桩蛋白的阳性区域也是一致的(图21A和21B)。因此，如之前所描述的，临床结肠癌组织中的KRS、pERK和桩蛋白表达区都与浸润性癌细胞边缘正相关，因此表明了KRS依赖性ERK活性以及桩蛋白表达和活性在KRS介导的转移中起重要作用。因而相信，癌症转移可以通过在癌症早期抑制这类因子而被抑制，并且，三维胶原蛋白凝胶中的播散分析系统可以对癌症转移抑制剂的研发非常有帮助。
Claims (17)
1.一种用于筛选癌转移抑制剂的方法，所述方法包括以下步骤：
1)在三维环境中或在由细胞外基质包围的环境中培养其中进行调控使赖氨酰-tRNA合成酶(KRS)被表达或不被表达的癌细胞系或聚集的癌细胞；
2)用步骤1)的所述癌细胞系或所述聚集的癌细胞处理样品；
3)分析步骤2)的所述癌细胞系或所述聚集的癌细胞中的KRS的活性；以及
4)选择步骤3)中已确定能抑制KRS活性的所述样品。
2.根据权利要求1所述的用于筛选癌转移抑制剂的方法，其中，步骤1)中的所述三维环境是液态环境或胶原蛋白包围的环境。
3.根据权利要求1所述的用于筛选癌转移抑制剂的方法，其中，步骤1)的所述癌细胞系或聚集的癌细胞是转移性癌或转移诱导性癌。
4.根据权利要求3所述的用于筛选癌转移抑制剂的方法，其中，所述转移性癌优选选自由结肠直肠癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、结肠癌、骨癌、肺癌、胰腺癌、头/颈癌、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、食管癌、小肠肿瘤、肛门癌、结肠癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、阴户癌、何杰金氏病、前列腺癌、膀胱癌、肾癌、输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌和中枢神经系统肿瘤组成的组。
5.根据权利要求1所述的用于筛选癌转移抑制剂的方法，其中，步骤2)的所述样品优选选自由肽、蛋白质、非肽化合物、抗体、抗体片段、活性化合物、发酵产物、细胞提取物、植物提取物、动物组织提取物和血浆组成的组。
6.根据权利要求1所述的用于筛选癌转移抑制剂的方法，其中，步骤3)中的所述KRS活性是癌细胞中的活性，所述活性优选选自由癌细胞的细胞-细胞粘附、细胞-细胞外基质(ECM)粘附、细胞分散、伤口愈合、改变细胞粘附信号传导因子的活性、c-Jun/桩蛋白启动子结合，和细胞从球状体细胞的播散组成的组。
7.根据权利要求6所述的用于筛选癌转移抑制剂的方法，其中，所述细胞-细胞粘附诱导上皮标记物或间充质标记物的表达或表达位置的变化或细胞分散，所述上皮标记物选自由ZO-1、封闭蛋白、CK14、β-连环蛋白或E-钙粘蛋白组成的组，所述间充质标记物选自由纤连蛋白、twist蛋白、波形蛋白、α-SMA(平滑肌肌动蛋白)、snail-1蛋白、Slug蛋白或N-钙粘蛋白组成的组。
8.根据权利要求6所述的用于筛选癌转移抑制剂的方法，其中，所述细胞-细胞外基质粘附诱导细胞-细胞外基质粘附强度、细胞伸展、粘着斑和其破坏、肌动蛋白重建以及磷酸化的FAK、c-Src、ERK或桩蛋白的表达或表达位置的变化。
9.根据权利要求6所述的用于筛选癌转移抑制剂的方法，其中，所述细胞粘附信号传导活性诱导FAK、c-Src、ERK、c-Jun或桩蛋白的表达或磷酸化的降低或变化，或诱导整合素α6轭合的变化。
10.根据权利要求1所述的用于筛选癌转移抑制剂的方法，其中，步骤3)中分析所述KRS的活性通过选自由免疫印迹法、实时PCR、免疫共沉淀、ChIP(染色质免疫沉淀)、FRET、免疫荧光检测以及免疫组织化学组成的组中的方法来进行。
11.一种用于监测癌细胞从癌细胞系或聚集的癌细胞的播散、癌细胞的上皮-间充质转化、迁移、浸润和转移，以及相关信号传导因子的表达和活性的方法，所述方法包括以下步骤：
1)在三维环境中或在由细胞外基质包围的环境中培养其中进行调控使赖氨酰-tRNA合成酶(KRS)被表达或不被表达的癌细胞系或聚集的癌细胞；
2)分析步骤1)的所述癌细胞系或所述聚集的癌细胞中的KRS的活性；以及
3)基于步骤2)分析的KRS活性来分析所述癌细胞系或所述聚集的癌细胞的转移水平。
12.根据权利要求11所述的用于监测癌细胞的播散的方法，其中，步骤1)中的所述三维环境是液态环境或胶原蛋白包围的环境。
13.根据权利要求11所述的用于监测癌细胞的播散的方法，其中，步骤1)的所述癌细胞系或聚集的癌细胞是转移性癌或转移诱导性癌。
14.根据权利要求11所述的用于监测癌细胞的播散的方法，其中，步骤2)中的所述KRS活性是癌细胞中的活性，所述活性优选选自由癌细胞的细胞-细胞粘附、细胞-细胞外基质(ECM)粘附、细胞分散、伤口愈合、改变细胞粘附信号传导因子的活性、c-Jun/桩蛋白启动子结合和细胞从球状体细胞的播散组成的组。
15.根据权利要求14所述的用于监测癌细胞的播散的方法，其中，所述细胞-细胞粘附诱导上皮标记物或间充质标记物的表达或表达位置的变化或细胞分散，所述上皮标记物选自由ZO-1、封闭蛋白、CK14、β-连环蛋白或E-钙粘蛋白组成的组，所述间充质标记物选自由纤连蛋白、twist蛋白、波形蛋白、α-SMA(平滑肌肌动蛋白)、snail-1蛋白、Slug蛋白或N-钙粘蛋白组成的组。
16.根据权利要求14所述的用于监测癌细胞的播散的方法，其中，所述细胞-细胞外基质粘附诱导细胞-细胞外基质粘附强度、细胞伸展、粘着斑和其破坏、肌动蛋白重建以及磷酸化的FAK、c-Src、ERK或桩蛋白的表达或表达位置的变化。
17.根据权利要求14所述的用于监测癌细胞的播散的方法，其中，所述细胞粘附信号传导活性诱导FAK、c-Src、ERK、c-Jun或桩蛋白的表达或磷酸化的降低或变化，或诱导整合素α6轭合的变化。
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