CN111239353A - 一种人源柠檬酸转运蛋白抑制剂化合物的筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种人源柠檬酸转运蛋白抑制剂化合物的筛选方法。利用能够稳定表达人源柠檬酸转运蛋白的细胞系，通过碳‑14同位素标记的柠檬酸同位素摄取检测方法，或通过基于高通量串联质谱的检测方法，实现对人源柠檬酸转运蛋白抑制剂化合物的筛选。与现有技术相比，本发明方法可用来对化合物库进行高通量筛选，从而得到人源柠檬酸转运蛋白的阳性抑制剂化合物，为下一步的化合物结构改造及药物发现奠定了基础。本发明可以对大规模的化合物库进行高通量筛选并获得能够抑制柠檬酸转运蛋白作用、具有成为糖尿病等疾病治疗药物的潜力的化合物。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种人源柠檬酸转运蛋白抑制剂化合物的筛选方法，以及以人源柠檬酸转运蛋白为靶点的高通量筛选模型及其应用。
背景技术
柠檬酸转运蛋白(NaCT)是由哺乳动物Indy基因编码的质膜转运体蛋白，属于溶质转运蛋白家族13(SLC13)的成员。NaCT主要在代谢活跃的组织中表达量较高，其功能为转运三羧酸循环的中间体，并与其中的柠檬酸的亲和力最高。研究表明柠檬酸转运蛋白NaCT表达水平的降低会延长果蝇和线虫寿命，同源蛋白在小鼠体内表达量下降所引起的代谢和生理方面的变化与热量限制的效果十分一致。柠檬酸转运蛋白基因敲除小鼠也表现出葡萄糖代谢和线粒体生物发生的方面的变化，并且保护其免受高热量饮食的影响。这些数据支持了柠檬酸转运蛋白作为代谢调节者的角色，这暗示柠檬酸转运蛋白可以用于治疗饮食和年龄相关性疾病，如II型糖尿病和肥胖症，从而成为在糖尿病及肥胖的药物研发中备受关注的新型靶点。
高通量药物筛选是指以分子水平，细胞水平或微组织水平的实验方法为基础，以高密度微孔板(96孔，384孔，1536孔或3456孔)形式作为实验工具载体，在短时间内对数百万的样品进行检测，以半自动化或自动化操作系统执行试验过程，通过快速灵敏的检测仪器对实验结果的数据采集，通过计算机程序软件分析处理大量的实验数据，并通过相应的数据库运营维护来支持整体系运转的技术体系。经典的高通量筛选系统一般包括以下部分：筛选模型，化合物样品库，自动化操作系统，高灵敏度的检测系统和数据库管理系统。
分子水平和细胞水平是最常用的筛选模型，通过分子水平和细胞水平的检测可以观察药物与分子靶点的相互作用，从而能够直接认识药物的基本作用机制。其中，基于细胞水平的筛选模型主要使用细胞作为观察对象，观察被筛样品对细胞的作用，通过细胞的不同反应来观察化合物的作用。
发明内容
本发明提供一种以人源柠檬酸转运蛋白为靶点的高通量筛选模型及其构建方法与应用。本发明利用表达人源柠檬酸转运蛋白的稳转细胞系，通过同位素摄取法或基于串联质谱的检测方法构建人源柠檬酸转运蛋白抑制剂的高通量药物筛选模型。本发明的筛选模型以人源柠檬酸转运蛋白为靶点，可用于对现有化合物样品库进行筛选，找到具有新颖结构的针对柠檬酸转运蛋白的抑制剂，从而为未来新型的糖尿病及肥胖病药物的发现奠定基础。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明首先提供一种人源柠檬酸转运蛋白抑制剂化合物的筛选方法，其特征在于，利用能够稳定表达人源柠檬酸转运蛋白(NaCT)的细胞系，通过碳-14同位素标记的柠檬酸同位素摄取检测方法，或通过基于高通量串联质谱的检测方法，实现对人源柠檬酸转运蛋白抑制剂化合物的筛选。
在本发明的一个实施方式中，所述能够稳定表达人源柠檬酸转运蛋白(NaCT)的细胞系所属母细胞系选自HEK293、HEK293T、HEK293FT或CHO-K1。
在本发明的一个实施方式中，所述能够稳定表达人源柠檬酸转运蛋白(NaCT)的细胞系采用以下方法获得：
A、基因合成人源柠檬酸转运蛋白基因DNA序列，参考序列为NM_177550.3(humanSLC13A5 cDNA)的蛋白编码序列(CDS)，在其CDS起始密码子前加上KOZAK序列，再在序列两端加上限制性酶切位点；
B、通过PCR扩增上述DNA序列，并回收PCR产物；
C、对上述PCR产物进行酶切，并定向连接至含有抗性标记的真核表达质粒载体上；
D、用上述载体转化大肠杆菌，并用选择性培养基筛选出阳性单克隆，扩增阳性单克隆并提取质粒；
E、用上述真核表达质粒载体转染母细胞，转染培养24小时后用含有相应真核抗生素的培养基培养并筛选阳性单克隆，从而获得能够稳定表达人源柠檬酸转运蛋白的细胞系。
在本发明的一个实施方式中，碳-14同位素标记的柠檬酸同位素摄取检测方法，包括以下步骤：
A、在细胞培养瓶或培养皿中传代培养细胞；
B、用细胞培养液配制单细胞悬液，以细胞计数仪计数并调整细胞密度为5×105个/毫升至1×106个/毫升；
C、转移上述密度的细胞悬液到384孔细胞实验板中，每孔加入20微升，使得每孔有10000-20000个细胞；
D、将上述384孔细胞实验板放入二氧化碳细胞培养箱，37摄氏度培养16-24小时，使各孔中的细胞汇合率达到90％-100％；
E、弃掉实验板里的细胞培养液，加入20微升含有所需检测浓度的待测化合物的实验缓冲液，在37摄氏度培养箱中孵育15-30分钟；
F、每孔加入20微升含有20微摩尔/升碳-14同位素标记的柠檬酸的实验缓冲液，在37摄氏度培养箱中孵育30-60分钟；
G、使用读板仪对上述384孔实验板各孔读数；
H、实验结果以均数±标准差(Mean±SD)表示，样本均数的两两比较，采用t检验，P<0.05表示有统计学意义上的显著差异(*表示P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)，采用软件GraphPad Prism5计算IC50及作图，IC50采用四因素回归方式计算，公式如下：Y＝Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((LogIC50-X)*HillSlope))。
在本发明的一个实施方式中，基于高通量串联质谱的检测方法，包括以下步骤：
A、在细胞培养瓶或培养皿中传代培养细胞；
B、用细胞培养液配制单细胞悬液，以细胞计数仪计数并调整细胞密度，按照10000-20000个细胞/孔铺入96孔细胞实验板中；
C、将上述96孔细胞实验板放入二氧化碳细胞培养箱，37摄氏度培养16-24小时；
D、弃掉96孔细胞实验板里的细胞培养液，加入10微升含有所需检测浓度的待测化合物的实验缓冲液，在37摄氏度培养箱中孵育10-20分钟；
E、每孔加入10微升含有10微摩尔/升带有氘原子标记的柠檬酸和10毫摩尔/升氯化锂的实验缓冲液，在37摄氏度培养箱中孵育180-300分钟；
F、弃掉96孔细胞实验板里的实验缓冲液，用PBS洗涤4-5次后放入-80摄氏度冰箱，反复融冻5-10次，直至细胞全部脱落；
G、向96孔细胞实验板各孔加入150微升90％乙腈，震荡20分钟后以4000转/分钟离心20分钟；将样品按照适当比例稀释后，取100微升在高通量串联质谱仪上检测；
H、实验结果以均数±标准差(Mean±SD)表示，样本均数的两两比较，采用t检验，P<0.05表示有统计学意义上的显著差异(*表示P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)，采用软件GraphPad Prism计算IC50及作图，IC50采用四因素回归方式计算，公式如下：Y＝Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((LogIC50-X)*HillSlope))。
在本发明的一个实施方式中，碳-14同位素标记的柠檬酸同位素摄取检测方法或基于高通量串联质谱的检测方法中，步骤A中，获得的细胞可以在用胰酶消化成单细胞并用细胞培养液悬浮后直接用于实验；或用细胞冻存液悬浮细胞，并于液氮中冻存，待需要时再解冻用于实验；
所述细胞冻存液的配制方法为，9份体积胎牛血清(FBS)加入1份体积的二甲基亚砜(DMSO)，混合均匀。
在本发明的一个实施方式中，碳-14同位素标记的柠檬酸同位素摄取检测方法或基于高通量串联质谱的检测方法中，所述实验缓冲液，其配制方法为，取14.2毫升5摩尔/升氯化钠溶液，2.5毫升1摩尔/升氯化钾溶液，500微升1摩尔/升磷酸氢二钾溶液，600微升1摩尔/升硫酸镁溶液，750微升1摩尔/升氯化钾溶液，4.5毫升557毫摩尔/升葡萄糖溶液，12.5毫升1摩尔/升HEPES溶液，加入去离子蒸馏水450毫升，用1摩尔/升氢氧化钠溶液调节pH值至7.3，再用去离子蒸馏水定容至500毫升。
在本发明的一个实施方式中，基于高通量串联质谱的检测方法中，所述带有氘原子标记的柠檬酸带有4个氘原子，为柠檬酸-2,2,4,4-d4。
本发明还提供一种能够稳定表达人源柠檬酸转运蛋白(NaCT)的细胞系，所述细胞系采用以下方法获得：
A、基因合成人源柠檬酸转运蛋白基因DNA序列，参考序列为NM_177550.3(humanSLC13A5 cDNA)的蛋白编码序列(CDS)，在其CDS起始密码子前加上KOZAK序列，再在序列两端加上限制性酶切位点；
B、通过PCR扩增上述DNA序列，并回收PCR产物；
C、对上述PCR产物进行酶切，并定向连接至含有抗性标记的真核表达质粒载体上；
D、用上述载体转化大肠杆菌，并用选择性培养基筛选出阳性单克隆，扩增阳性单克隆并提取质粒；
E、用上述真核表达质粒载体转染母细胞，转染培养24小时后用含有相应真核抗生素的培养基培养并筛选阳性单克隆，从而获得能够稳定表达人源柠檬酸转运蛋白的细胞系；
所述细胞系用于构建以人源柠檬酸转运蛋白为靶点的高通量筛选模型。
本发明还提供一种人源柠檬酸转运蛋白为靶点的高通量筛选模型，其所用的细胞系为上述能够稳定表达人源柠檬酸转运蛋白的细胞系；所述高通量筛选模型使用同位素摄取法或基于高通量串联质谱的检测方法用于快速筛选出对柠檬酸转运蛋白功能有抑制作用的化合物。
与现有技术相比，本发明建立了两种基于稳转细胞系的高通量药物筛选模型，一种使用了同位素摄取检测法，另一种使用了基于高通量串联质谱的检测法，两者均可用来对化合物库进行高通量筛选，从而得到人源柠檬酸转运蛋白的阳性抑制剂化合物，为下一步的化合物结构改造及药物发现奠定了基础。
附图说明
图1：人源柠檬酸转运蛋白真核表达载体图谱；
图2：同位素摄取实验中DIDS对柠檬酸转运蛋白转运功能的抑制结果；
图3：柠檬酸-2,2,4,4-d4结构示意；
图4：串联质谱法检测DIDS对柠檬酸转运蛋白转运功能的抑制结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1可稳定表达人源柠檬酸转运蛋白的细胞系的构建方法
1)基因合成人源柠檬酸转运蛋白基因DNA序列，参考序列为NM_177550.3(humanSLC13A5 cDNA)的蛋白编码序列(CDS)，在其CDS起始密码子前加上KOZAK序列，再在序列两端加上限制性酶切位点NheI(5’-GCTAGC)和XhoI(3’-CTCGAG)；
2)通过PCR扩增上述DNA序列，并回收PCR产物；之后PCR产物进行酶切，并定向连接至pcDNA3.1(+)(Invitrogen公司)载体上；
3)用上述载体转化大肠杆菌：取一支100微升的大肠杆菌感受态细胞置于冰水浴上，加入连接好的载体DNA(<10微升)，轻轻混匀后在冰水浴中放置30分钟；之后于42摄氏度水浴中热激90秒，再快速转移至冰水浴中；加入900微升LB培养基，37摄氏度摇床培养90分钟；取50微升转化的大肠杆菌涂布于含100微克/毫升氨苄的LB平板上，37摄氏度倒置培养过夜；在10毫升细菌培养管中加入5毫升预热的含100微克/毫升氨苄的LB培养基，然后用无菌移液器10微升枪头挑取菌落，在LB培养基中吹吸数次；将所挑取的克隆在37摄氏度摇床培养过夜；取2毫升菌液制成甘油保存菌于零下80摄氏度保存，剩余部分则用来提取质粒DNA；对质粒进行酶切鉴定，并测序比对，确认重组载体构建成功(参考图1)。
4)将人源柠檬酸转运蛋白真核表达质粒转染入HEK293细胞中，转染后培养24h，将细胞消化处理，按照1:20、1:30、1:40比例，接种到100mm细胞培养皿，放置于5％二氧化碳细胞培养箱，37摄氏度培养。隔天加入选择抗生素G418，终浓度900微克/毫升，每3-4天更换一次筛选培养基，筛选培养约两周时间后挑选克隆。将挑选到的克隆在96孔板里用胰酶消化打散，等待在96孔板里细胞汇合率约80％时，通过胰酶消化后将细胞转至24孔板中进行扩大培养。当细胞在24孔板里面汇合率约在80％左右的时候将细胞消化，铺到96孔同位素摄取实验板上，通过同位素摄取实验挑选信号较高的细胞克隆，并对其进行扩大培养用于后续实验。
5)通过qPCR以及western-blot分别验证上述挑选的细胞克隆的柠檬酸转运蛋白的表达；通过扩大及传代培养，进一步考察细胞柠檬酸转运蛋白表达功能的稳定性。结果表明，所选择的克隆经过25代约3个月的传代后，其柠檬酸转运蛋白的表达水平并没有明显的变化，其对碳-14同位素标记的柠檬酸的转运也没有明显变化，证明了该表达柠檬酸转运蛋白的克隆细胞系的稳定性。
实施例2同位素摄取实验及基于串联质谱法的检测实验中实验缓冲液的配制方法
取14.2毫升5摩尔/升氯化钠溶液，2.5毫升1摩尔/升氯化钾溶液，500微升1摩尔/升磷酸氢二钾溶液，600微升1摩尔/升硫酸镁溶液，750微升1摩尔/升氯化钾溶液，4.5毫升557毫摩尔/升葡萄糖溶液，12.5毫升1摩尔/升HEPES溶液，加入去离子蒸馏水450毫升，用1摩尔/升氢氧化钠溶液调节pH值至7.3，再用去离子蒸馏水定容至500毫升。
实施例3同位素摄取实验
1)待100mm培养皿上的HEK293/hNaCT细胞汇合率达到80％后，用胰酶对培养皿上的细胞进行消化，以细胞培养液洗脱后收集细胞至15毫升离心管中，离心并弃上清；加入2毫升细胞培养液重新悬浮细胞，吹打均匀后取10微升在细胞计数仪上计数，根据计数结果继续用细胞培养液调整细胞密度至5×105个/毫升；
2)使用Multidrop移液工作站转移上述密度的细胞悬液到384孔细胞实验板中，每孔加入20微升，使得每孔有10000个细胞；将384孔细胞实验板放入二氧化碳细胞培养箱，37摄氏度培养24小时；
3)弃掉实验板里的细胞培养液，加入20微升含有所需检测浓度的化合物的实验缓冲液，在37摄氏度培养箱中孵育15分钟；
4)每孔加入20微升含有20微摩尔/升碳-14同位素标记的柠檬酸的实验缓冲液，在37摄氏度培养箱中孵育60分钟；
5)使用Microbeta读板仪对上述实验板各孔读数；用软件GraphPad Prism计算受测化合物在该同位素摄取实验中的半数抑制浓度(IC50)(参考图2)。
本实施例中，使用的待测化合物为DIDS，DIDS为一种抑制剂，学名为4,4’-二异硫氰基-2,2’-芪二磺酸酯。
实施例4基于高通量串联质谱的柠檬酸转运蛋白抑制剂检测实验
1)待100mm培养皿上的HEK293/hNaCT细胞汇合率达到80％后，用胰酶对培养皿上的细胞进行消化，以细胞培养液洗脱后收集细胞至15毫升离心管中，离心并弃上清；加入2毫升细胞培养液重新悬浮细胞，吹打均匀后取10微升在细胞计数仪上计数，根据计数结果继续用细胞培养液调整细胞密度至2.5×105个/毫升；
2)使用Multidrop移液工作站转移上述密度的细胞悬液到96孔细胞实验板中，每孔加入40微升，使得每孔有10000个细胞；将96孔细胞实验板放入二氧化碳细胞培养箱，37摄氏度培养24小时；
3)弃掉96孔细胞实验板里的细胞培养液，加入10微升含有所需检测浓度的待测化合物的实验缓冲液，在37摄氏度培养箱中孵育10分钟；之后，每孔再加入10微升含有10微摩尔/升带有氘原子标记的柠檬酸(柠檬酸-2,2,4,4-d4)(参考图3)以及10毫摩尔/升氯化锂的实验缓冲液，在37摄氏度培养箱中孵育240分钟；
4)弃掉96孔细胞实验板里的实验缓冲液，用PBS洗涤4-5次后放入零下80摄氏度冰箱，反复融冻5-10次，直至细胞全部脱落；
5)向96孔细胞实验板各孔加入150微升90％乙腈，震荡20分钟后以4000转/分钟离心20分钟；将样品按照1:10，1:20，1:50，1:100的比例稀释后，取100微升在高通量串联质谱仪上检测，而后选择合适的检测浓度进行后续实验；
6)采用软件GraphPad Prism计算受测化合物在该检测实验中的半数抑制浓度(IC50)(参考图4)。
本实施例中，使用的待测化合物为DIDS，DIDS为一种抑制剂，学名为4,4’-二异硫氰基-2,2’-芪二磺酸酯。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种人源柠檬酸转运蛋白抑制剂化合物的筛选方法，其特征在于，利用能够稳定表达人源柠檬酸转运蛋白的细胞系，通过碳-14同位素标记的柠檬酸同位素摄取检测方法，或通过基于高通量串联质谱的检测方法，实现对人源柠檬酸转运蛋白抑制剂化合物的筛选。
2.根据权利要求1所述人源柠檬酸转运蛋白抑制剂化合物的筛选方法，其特征在于，所述能够稳定表达人源柠檬酸转运蛋白的细胞系所属母细胞系选自HEK293、HEK293T、HEK293FT或CHO-K1。
3.根据权利要求1所述人源柠檬酸转运蛋白抑制剂化合物的筛选方法，其特征在于，所述能够稳定表达人源柠檬酸转运蛋白的细胞系采用以下方法获得：
A、基因合成人源柠檬酸转运蛋白基因DNA序列，参考序列为NM_177550.3(humanSLC13A5 cDNA)的蛋白编码序列，在其CDS起始密码子前加上KOZAK序列，再在序列两端加上限制性酶切位点；
B、通过PCR扩增上述DNA序列，并回收PCR产物；
C、对上述PCR产物进行酶切，并定向连接至含有抗性标记的真核表达质粒载体上；
D、用上述载体转化大肠杆菌，并用选择性培养基筛选出阳性单克隆，扩增阳性单克隆并提取质粒；
E、用上述真核表达质粒载体转染母细胞，转染培养24小时后用含有相应真核抗生素的培养基培养并筛选阳性单克隆，从而获得能够稳定表达人源柠檬酸转运蛋白的细胞系。
4.根据权利要求1所述人源柠檬酸转运蛋白抑制剂化合物的筛选方法，其特征在于，碳-14同位素标记的柠檬酸同位素摄取检测方法，包括以下步骤：
A、传代培养细胞；
B、用细胞培养液配制单细胞悬液，调整细胞密度为5×105个/毫升至1×106个/毫升；
C、转移上述密度的细胞悬液到细胞实验板中，每孔加入20微升，使得每孔有10000-20000个细胞；
D、将上述细胞实验板放入二氧化碳细胞培养箱，37摄氏度培养16-24小时，使各孔中的细胞汇合率达到90％-100％；
E、弃掉实验板里的细胞培养液，加入20微升含有所需检测浓度的待测化合物的实验缓冲液，在37摄氏度培养箱中孵育15-30分钟；
F、每孔加入20微升含有20微摩尔/升碳-14同位素标记的柠檬酸的实验缓冲液，在37摄氏度培养箱中孵育30-60分钟；
G、使用读板仪对上述实验板各孔读数；
H、实验结果以均数±标准差表示，样本均数的两两比较，采用t检验，P<0.05表示有统计学意义上的显著差异，采用软件GraphPad Prism5计算IC50及作图，IC50采用四因素回归方式计算，公式如下：Y＝Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((LogIC50-X)*HillSlope))。
5.根据权利要求1所述人源柠檬酸转运蛋白抑制剂化合物的筛选方法，其特征在于，基于高通量串联质谱的检测方法，包括以下步骤：
A、传代培养细胞；
B、用细胞培养液配制单细胞悬液，调整细胞密度，按照10000-20000个细胞/孔铺入细胞实验板中；
C、将上述细胞实验板放入二氧化碳细胞培养箱，37摄氏度培养16-24小时；
D、弃掉细胞实验板里的细胞培养液，加入10微升含有所需检测浓度的待测化合物的实验缓冲液，在37摄氏度培养箱中孵育10-20分钟；
E、每孔加入10微升含有10微摩尔/升带有氘原子标记的柠檬酸和10毫摩尔/升氯化锂的实验缓冲液，在37摄氏度培养箱中孵育180-300分钟；
F、弃掉细胞实验板里的实验缓冲液，用PBS洗涤4-5次后，反复融冻5-10次，直至细胞全部脱落；
G、向细胞实验板各孔加入150微升90％乙腈，震荡20分钟后离心；将样品稀释后，在高通量串联质谱仪上检测；
H、实验结果以均数±标准差表示，样本均数的两两比较，采用t检验，P<0.05表示有统计学意义上的显著差异，采用软件GraphPad Prism计算IC50及作图，IC50采用四因素回归方式计算，公式如下：Y＝Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((LogIC50-X)*HillSlope))。
6.根据权利要求4或5所述人源柠檬酸转运蛋白抑制剂化合物的筛选方法，其特征在于，步骤A中，获得的细胞在用胰酶消化成单细胞并用细胞培养液悬浮后直接用于实验；或用细胞冻存液悬浮细胞，并于液氮中冻存，待需要时再解冻用于实验；
所述细胞冻存液的配制方法为，9份体积胎牛血清加入1份体积的二甲基亚砜，混合均匀。
7.根据权利要求4或5所述人源柠檬酸转运蛋白抑制剂化合物的筛选方法，其特征在于，所述实验缓冲液，其配制方法为，取14.2毫升5摩尔/升氯化钠溶液，2.5毫升1摩尔/升氯化钾溶液，500微升1摩尔/升磷酸氢二钾溶液，600微升1摩尔/升硫酸镁溶液，750微升1摩尔/升氯化钾溶液，4.5毫升557毫摩尔/升葡萄糖溶液，12.5毫升1摩尔/升HEPES溶液，加入去离子蒸馏水450毫升，用1摩尔/升氢氧化钠溶液调节pH值至7.3，再用去离子蒸馏水定容至500毫升。
8.根据权利要求5所述人源柠檬酸转运蛋白抑制剂化合物的筛选方法，其特征在于，所述带有氘原子标记的柠檬酸带有4个氘原子，为柠檬酸-2,2,4,4-d4。
9.一种能够稳定表达人源柠檬酸转运蛋白的细胞系，其特征在于，所述细胞系采用以下方法获得：
A、基因合成人源柠檬酸转运蛋白基因DNA序列，参考序列为NM_177550.3(humanSLC13A5 cDNA)的蛋白编码序列，在其CDS起始密码子前加上KOZAK序列，再在序列两端加上限制性酶切位点；
B、通过PCR扩增上述DNA序列，并回收PCR产物；
C、对上述PCR产物进行酶切，并定向连接至含有抗性标记的真核表达质粒载体上；
D、用上述载体转化大肠杆菌，并用选择性培养基筛选出阳性单克隆，扩增阳性单克隆并提取质粒；
E、用上述真核表达质粒载体转染母细胞，转染培养24小时后用含有相应真核抗生素的培养基培养并筛选阳性单克隆，从而获得能够稳定表达人源柠檬酸转运蛋白的细胞系；
所述细胞系用于构建以人源柠檬酸转运蛋白为靶点的高通量筛选模型。
10.一种人源柠檬酸转运蛋白为靶点的高通量筛选模型，其特征在于，其所用的细胞系为如权利要求9所述能够稳定表达人源柠檬酸转运蛋白的细胞系；所述高通量筛选模型使用同位素摄取法或基于高通量串联质谱的检测方法用于快速筛选出对柠檬酸转运蛋白功能有抑制作用的化合物。
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| CN118027202B (zh) * | 2024-03-14 | 2024-08-13 | 恺佧生物科技(上海)有限公司 | 结合slc13a5膜蛋白的抗体 |
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Application publication date: 20200605 |
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