CN105396144B - 在肿瘤中差异表达的基因产物及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及鉴定具有与肿瘤相关性表达的基因产物和编码其的核酸。本发明涉及治疗和诊断疾病的方法，所述具有与肿瘤相关性表达的基因产物在所述疾病中异常表达。本发明还涉及具有与肿瘤相关性表达的蛋白质、多肽和肽以及编码其的核酸。

Description

在肿瘤中差异表达的基因产物及其用途

本申请是发明名称为“在肿瘤中差异表达的基因产物及其用途”的中国专利申请03807493.1的分案申请。

技术领域

尽管有经典治疗方法的充分使用，癌症仍然是导致死亡的原因之一。更新的治疗概念的目标在于通过使用重组肿瘤疫苗和其它特异性方法如抗体疗法将患者自身的免疫系统纳入治疗整体概念中。这种策略的成功先决条件是患者的免疫系统识别肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原或表位，所述患者的免疫系统的效应物作用将被干预性地增强。肿瘤细胞在生物学上具有与其非恶性的起源细胞本质上的差异。这些差异是由肿瘤发展过程中所获得的遗传改变而引起的，此外也导致在癌细胞中形成质和量上改变的分子结构。被患有肿瘤的宿主的特异性免疫系统识别的该类肿瘤相关结构是指肿瘤相关抗原。肿瘤相关抗原的特异性识别包括细胞机制和体液机制，所述机制是两种功能上互联的单位：CD4⁺和CD8⁺T淋巴细胞分别识别在MHC(主要组织相容性复合物＝组织相容性抗原)II类或I类分子上呈递的加工的抗原，而B淋巴细胞产生直接与未加工的抗原结合的循环抗体分子。肿瘤相关抗原可能的临床治疗上的重要性由如下事实产生，即免疫系统对癌细胞上抗原的识别导致细胞毒性效应子机制的开始，并能在存在辅助T细胞的情况下杀灭癌细胞(Pardoll，Nat.Med.4：525－31，1998)。因此，肿瘤免疫学的中心目标是在分子上阐明这些结构。这些抗原的分子特性在很长时间里都是难以解释的。只有在适宜的克隆技术发展之后，系统性从肿瘤cDNA表达文库中筛选肿瘤相关抗原才成为可能，其中通过分析细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的靶结构(van der Bruggen et al.，Science 254：1643－7，1991)或通过使用循环自身抗体(Sahin et al.，Curr.opin.Immunol.9：709－16，1997)作为探针的方法进行筛选。为实现该目标，从新鲜肿瘤组织中制备cDNA表达文库并在适宜的系统中重组表达为蛋白质。将分离自患者的免疫效应物即具有肿瘤特异性溶解模式的CTL克隆或循环自身抗体用于克隆各抗原。

背景技术

近年来，通过这些方法已经在多种肿瘤形成中阐明了多种抗原。此处，癌/睾丸抗原(CTA)类型具有很高的意义。CTA和编码其的基因(癌/睾丸基因或CTG)由其特征性表达模式而得以阐明[Tureci et al，Mol Med Today.3：342－9，1997]。在除睾丸和生殖细胞外的正常组织中未发现它们，但它们在系列人类恶性肿瘤中表达，而且它们不具有肿瘤类型特异性，但在来源非常不同的肿瘤体中具有不同的频率(Chen&Old，Cancer J.Sci.Am.5：16－7，1999)。在健康对照中也没有发现抗CTA的血清反应，而仅在肿瘤患者发现所述血清反应。特别是由于其组织分布，该类抗原对于免疫治疗方案具有特别的价值并已在目前的临床患者研究中进行检测(Marchand et al.，Int.J.Cancer 80：219－30，1999；Knuth et al.，Cancer Chemother.Pharmacol.46：S 46－51，2000)。

然而，用于鉴定抗原的上述经典方法使用来自通常已患有晚期癌的患者的免疫效应物(循环自身抗体或CTL克隆)作为探针。一系列数据显示出：肿瘤能导致例如T细胞的耐受和无反应性，那些能导致有效免疫识别的特异性就在疾病病程期间从免疫效应物库中丢失。目前的患者研究尚未给出关于迄今发现和使用的肿瘤相关抗原的真实作用的任何可靠证据。因此，不能排除引起自体免疫应答的蛋白质是错误的靶结构。

发明内容

本发明的目的是提供用于癌症诊断和治疗的靶结构。

根据本发明，该目的通过权利要求的主题内容而实现。

根据本发明，实施用于鉴定和提供与肿瘤相关性表达的抗原和编码其的核酸的策略。该策略基于如下事实，即事实上通常在成体组织中沉默的睾丸和由此生殖细胞特异性基因在肿瘤细胞中以异位和禁止模式被再次活化。首先，数据挖掘(Datamining)给出与所有已知睾丸特异性基因的尽可能完整的列表，随后其可通过使用特异性RT－PCR的表达分析而评估其在肿瘤中的异常活化。数据挖掘是一种鉴定肿瘤相关基因的已知方法。然而，在传统策略中，通常从肿瘤组织文库中电子去除正常组织文库的转录子，其中假定剩余的基因是肿瘤特异性的(Schmitt et al.，Nucleic Acids Res.27：4251－60，1999；Vasmatziset al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.95：300－4，1998.Scheurle et al.，Cancer Res.60：4037－43，2000)。

然而，本发明的概念(其已被证明更为成功)是基于将数据挖掘用于电子提取全部睾丸特异性基因和然后评估所述基因在肿瘤中的异位表达。

因此本发明一个方面涉及鉴定在肿瘤中差异表达的基因的策略。所述策略将公开序列文库的数据挖掘(“in silico”)与随后评估性实验室试验(“wet bench”)研究进行联合。

根据本发明，基于两个不同生物信息学文本的联合策略能够鉴定癌/睾丸(CT)基因类型的新成员。这些迄今已经被分类为具有纯粹的睾丸特异性、生殖细胞特异性或精子特异性。这些基因在肿瘤细胞中被异常激活的发现使其被赋予了具有功能性含意的基本上新的特性。根据本发明，这些肿瘤相关基因及其和由其编码的基因产物不依赖免疫原性作用而被鉴定和提供。

根据本发明鉴定的肿瘤相关抗原含有由一种核酸编码的氨基酸序列，所述核酸选自(a)包括选自SEQ ID NO：1－5、19－21、29、31－33、37、39、40、54－57、62、63、70、74、85－88、其部分或其衍生物的核酸序列的核酸，(b)在严谨条件下与(a)的核酸杂交的核酸，(c)关于(a)或(b)的核酸的简并核酸，和(d)与(a)、(b)或(c)的核酸互补的核酸。在一个优选的实施方案中，根据本发明鉴定的肿瘤相关抗原含有由选自SEQ ID NO：1－5、19－21、29、31－33、37、39、40、54－57、62、63、70、74、85－88的核酸所编码的氨基酸序列。在另一优选的实施方案中，根据本发明鉴定的肿瘤相关抗原包括选自SEQ ID NO：6－13、14－18、22－24、30、34－36、38、41、58－61、64、65、71、75、80－84、89－100、其部分或其衍生物的氨基酸序列。

本发明一般涉及将根据本发明鉴定的肿瘤相关抗原或其部分、其编码核酸或定向抗所述编码核酸的核酸或者定向抗根据本发明鉴定的肿瘤相关抗原或其部分的抗体用于治疗和诊断的用途。该用途可涉及这些抗原、功能性片段、核酸、抗体等中的单个以及多个的组合，在一个实施方案中，还联合其它用于诊断、治疗和过程控制的肿瘤相关基因和抗原。

治疗和/或诊断所针对的优选疾病是其中选择性表达或异常表达一个或多个根据本发明鉴定的肿瘤相关抗原的疾病。

本发明还涉及与肿瘤细胞相关性表达的并由已知基因的改变性剪接(剪接变体)或由使用选择性开放阅读框而改变的翻译来制备的核酸和基因产物。所述核酸包括根据序列表(SEQ ID NO：2－5，20，21，31－33，54－57，85－88)的序列。而且，所述基因产物包括根据序列表(SEQ ID NO：7－13、23、24、34－36、58－61、89－100)的序列。本发明的剪接变体可根据本发明用作肿瘤性疾病的诊断靶位和治疗靶位。

可使用非常不同的机理制备剪接变体，例如

－使用可变转录起始位点

－使用附加外显子

－完全或不完全剪切掉单个或多个外显子，

－通过突变(缺失或新供体/受体序列的生成)改变的剪接调节序列，

－内含子序列的不完全去除。

基因的改变的剪接会导致改变的转录本序列(剪接变体)。剪接变体的改变的序列区的翻译会导致改变的蛋白质，该蛋白质在结构和功能上与原始蛋白质明显不同。肿瘤相关剪接变体可生成肿瘤相关转录本和肿瘤相关蛋白质/抗原。这些可用作检测肿瘤细胞和肿瘤治疗性靶向的分子标记物。肿瘤细胞的检测，例如在血液、血清、骨髓、唾液、支气管灌洗液、身体分泌物和活检组织中，可根据本发明例如在核酸提取后通过采用剪接变体特异性寡核苷酸的PCR扩增进行实施。根据本发明，所有序列依赖性检测系统均适用于检测。除PCR外，这些检测系统是例如基因芯片/微阵列系统，Northern印迹、RNase保护测定(RDA)等。所有检测系统的相同之处在于检测基于与至少一个剪接变体特异性核酸序列的特异性杂交。然而，还可根据本发明通过识别由所述剪接变体编码的特异性表位的抗体检测肿瘤细胞。所述抗体可通过用具有对所述剪接变体特异性的肽进行免疫来制备。表位与优选在健康细胞中形成的基因产物的变体明显不同的氨基酸特别适用于免疫。此处用抗体对肿瘤细胞的检测可在分离自患者的样品上或用静脉内施用的抗体进行成像而进行实施。除可用于诊断外，含有新或改变的表位的剪接变体是免疫治疗的令人感兴趣的靶位。本发明的表位可用于靶向治疗上有效的单克隆抗体或T淋巴细胞。在被动免疫治疗中，在此继承性地转移识别剪接变体特异性表位的抗体或T淋巴细胞。如在其它抗原的情况下，还可通过采用标准技术(动物免疫、用于分离重组抗体的淘洗策略)并使用包括这些表位的多肽来制备抗体。或者，可将编码包含所述表位的寡肽或多肽的核酸用于免疫。用于体外或体内产生表位特异性T淋巴细胞的多种技术是已知的并已经详细描述于例如(Kessler JH，et al.2001，Sahin et al.，1997)中，并同样是基于使用包含剪接变体特异性表位的寡肽或多肽或者编码所述寡肽或多肽的核酸。包含剪接变体特异性表位的寡肽或多肽或者编码所述多肽的核酸还可用作活性免疫治疗(疫苗接种，疫苗治疗)中的药物有效物质。

一方面，本发明涉及这样的药物组合物，其含有识别根据本发明鉴定的肿瘤相关抗原并优选地对于表达或异常表达根据本发明鉴定的肿瘤相关抗原的细胞具有选择性的试剂。在特定实施方案中，所述试剂可诱导细胞死亡、降低细胞生长、破坏细胞膜或分泌细胞因子，并优选具有肿瘤－抑制活性。在一个实施方案中，所述试剂是选择性与编码肿瘤相关抗原的核酸杂交的反义核酸。在另一个实施方案中，所述试剂是与肿瘤相关抗原选择性结合的抗体，特别是与肿瘤相关抗原选择性结合的补体激活的抗体。在另一个实施方案中，所述试剂包括多个试剂，其中每一试剂选择性识别不同的肿瘤相关抗原，所述肿瘤相关抗原中至少一种是根据本发明鉴定的肿瘤相关抗原。识别无须直接与抑制所述抗原的活性或表达相伴随。在本发明的该方面中，选择性限于肿瘤的抗原优选作为用于恢复该特异性位点上的效应机理的标记物。在一个优选的实施方案中，所述试剂是识别HLA的上所述抗原并溶解用此方法标记的细胞的细胞毒性T淋巴细胞。在另一个实施方案中，所述试剂是与肿瘤相关抗原选择性结合并由此恢复对所述细胞的天然或人工效应机理的抗体。在另一个实施方案中，所述试剂是能增强其它特异性识别所述抗原的细胞的效应物作用的T辅助淋巴细胞。

一方面，本发明涉及包含能够抑制根据本发明鉴定的肿瘤相关抗原的表达或活性的试剂的药物组合物。在一个优选的实施方案中，所述试剂是与编码肿瘤相关抗原的核酸选择性杂交的反义核酸。在另一个实施方案中，所述试剂是与肿瘤相关抗原选择性结合的抗体。在另一个实施方案中，所述试剂包括多个试剂，其中每一试剂选择性抑制不同的肿瘤相关抗原，所述肿瘤相关抗原中至少一种是根据本发明鉴定的肿瘤相关抗原。

本发明还涉及含有这样的试剂的药物组合物，即所述试剂在使用时能选择性增加HLA分子和来自根据本发明鉴定的肿瘤相关抗原的肽表位间的复合物的量。在一个实施方案中，所述试剂包括一个或多个组分，该组分选自(i)肿瘤相关抗原或其部分，(ii)编码所述肿瘤相关抗原或其部分的核酸，(iii)表达所述肿瘤相关抗原或其部分的宿主细胞，和(iv)分离得到的来自所述肿瘤相关抗原的肽表位和MHC分子间的复合物。在一个实施方案中，所述试剂包括多个试剂，其中每一试剂选择性增加MHC分子和不同肿瘤相关抗原的肽表位间的复合物的量，这些肿瘤相关抗原中至少一种是根据本发明鉴定的肿瘤相关抗原。

本发明还涉及包括一个或多个组分的药物组合物，所述组分选自(i)根据本发明鉴定的肿瘤相关抗原或其部分，(ii)编码根据本发明鉴定的肿瘤相关抗原或其部分的核酸，(iii)与根据本发明鉴定的肿瘤相关抗原或其部分结合的抗体，(iv)与编码根据本发明鉴定的肿瘤相关抗原的核酸特异性杂交的反义核酸，(v)表达根据本发明鉴定的肿瘤相关抗原或其部分的宿主细胞，和(vi)分离得到的根据本发明鉴定的肿瘤相关抗原或其部分与HLA分子间的复合物。

编码根据本发明鉴定的肿瘤相关抗原或其部分的核酸在药物组合物中可存在表达载体中并功能性地连于启动子。

存在于本发明的药物组合物中的宿主细胞可分泌肿瘤相关抗原或其部分，在表面表达肿瘤相关抗原，或其部分或者还可表达与所述肿瘤相关抗原或其部分结合的HLA分子。在一个实施方案中，宿主细胞内源性表达HLA分子。在另一个实施方案中，宿主细胞以重组方式表达HLA分子和/或肿瘤相关抗原或其部分。所述宿主细胞优选是非增殖性的。在一个优选的实施方案中，宿主细胞是抗原递呈细胞，特别是树突细胞、单核细胞或巨噬细胞。

存在于本发明的药物组合物中的抗体可以是单克隆抗体。在其它实施方案中，抗体是嵌合抗体或人源化抗体，天然抗体的片段或合成抗体，其均可由组合技术制备。所述抗体可与治疗上或诊断上有效的试剂偶联。

存在于本发明的药物组合物中的反义核酸可含有6－50、特别是10－30、15－30和20－30个连续核苷酸的序列，这些核苷酸来自编码根据本发明鉴定的肿瘤相关抗原的核酸

在其它实施方案中，由本发明的药物组合物或直接提供或经由核酸表达提供的肿瘤相关抗原或其部分与细胞表面上的MHC分子结合，所述结合优选地导致细胞溶解反应和/或诱导细胞因子释放。

本发明的药物组合物可包括药物学上可接受的载体和/或佐剂。佐剂可选自皂甙、GM－CSF、CpG核苷酸、RNA、细胞因子或趋化因子。本发明的药物组合物优选用于治疗特征是选择性表达或异常表达肿瘤相关抗原的疾病。在一个优选的实施方案中，所述疾病是癌症。

本发明还涉及治疗或诊断疾病的方法，所述疾病的特征在于表达或异常表达一个或多个肿瘤相关抗原。在一个实施方案中，所述治疗包括施用本发明的药物组合物。

一方面，本发明涉及诊断特征是表达或异常表达根据本发明鉴定的肿瘤相关抗原的疾病的方法。该方法包括(i)检测编码肿瘤相关抗原的核酸或其部分，和/或(ii)检测所述肿瘤相关抗原或其部分，和/或(iii)检测针对肿瘤相关抗原或其部分的抗体，和/或(iv)在分离自患者的生物样品中检测具有对所述肿瘤相关抗原或其部分的特异性的细胞毒性T淋巴细胞或辅助T淋巴细胞。在特定实施方案中，检测包括(i)将生物样品与试剂接触，所述试剂特异性地与所述编码肿瘤相关抗原的核酸或其部分、与所述肿瘤相关抗原或其部分、与所述抗体或者与具有对所述肿瘤相关抗原或其部分特异性的细胞毒性T淋巴细胞或辅助T淋巴细胞结合，和(ii)检测所述试剂和所述核酸或其部分、所述肿瘤相关抗原或其部分、所述抗体或者所述细胞毒性T淋巴细胞或辅助T淋巴细胞间的复合物的形成。在一个实施方案中，所述疾病的特征在于表达或异常表达多个不同的肿瘤相关抗原，且检测包括检测多个编码所述多个不同的肿瘤相关抗原或其部分的核酸，检测多个不同的肿瘤相关抗原或其部分，检测多个与所述多个不同的肿瘤相关抗原或其部分结合的抗体，或者检测多个具有对所述多个不同肿瘤相关抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞或辅助T淋巴细胞。在另一个实施方案中，将分离自患者的生物样品与可比较的正常生物样品进行比较。

另一方面，本发明涉及一种确定特征是表达或异常表达根据本发明鉴定的肿瘤相关抗原的疾病的消退、进行或发病的方法，所述方法包括监测来自患有所述疾病或疑为患有所述疾病的患者的样品中选自下列的一个或多个参数：(i)编码肿瘤相关抗原的核酸或其部分的量，(ii)肿瘤相关抗原或其部分的量，(iii)与肿瘤相关抗原或其部分结合的抗体的量，和(iv)具有对所述肿瘤相关抗原或其部分和MHC分子间复合物特异性的细胞毒性T细胞或辅助T细胞的量。所述方法优选地包括在第一个样品中于第一时间点和在另一样品中于第二时间点测定所述参数，其中通过比较所述两个样品确定疾病的进程。在特定实施方案中，所述疾病的特征在于表达或异常表达多个不同的肿瘤相关抗原且监测包括监测(i)编码所述多个不同肿瘤相关抗原的多个核酸或其部分的量，和/或(ii)所述多个不同肿瘤相关抗原或其部分的量，和/或(iii)多个与所述多个不同肿瘤相关抗原或其部分结合的抗体的量，和/或(iv)多个具有对所述多个不同的肿瘤相关抗原或其部分和MHC分子间的复合物特异性的细胞毒性T细胞或辅助T细胞的量。

根据本发明，检测核酸或其部分或者监测核酸或其部分的量可使用与所述核酸或其所述部分特异性杂交的多核苷酸探针来实施，或者通过选择性扩增所述核酸或其所述部分来实施。在一个实施方案中，所述多核苷酸探针含有来自所述核酸的6－50特别是10－30、15－30和20－30个连续核苷酸的序列。

在特定实施方案中，要检测的所述肿瘤相关抗原或其部分存在于细胞内或存在于细胞表面上。根据本发明，可以使用与所述肿瘤相关抗原或其部分特异性结合的抗体实施检测肿瘤相关抗原或其部分或者监测肿瘤相关抗原或其部分的量。

在其它实施方案中，要检测的所述肿瘤相关抗原或其部分存在于与MHC分子特别是HLA分子的复合物中。

根据本发明，可以使用与所述抗体特异性结合的蛋白质或肽实施检测抗体或监测抗体的量。

根据本发明，细胞毒性T细胞或辅助T细胞的检测或监测具有对抗原或其部分和MHC分子间复合物特异性的细胞毒性T细胞或辅助T细胞的量可使用呈递所述抗原或其部分和MHC分子间复合物的细胞来实施。

用于检测或监测的多核苷酸探针、抗体、蛋白质或肽或者细胞优选用可检测的方式进行标记。在特定实施方案中，可检测的标记物为放射性标记物或酶标记物。T淋巴细胞还可以通过检测其增殖、其细胞因子生成和其由MHC和肿瘤相关抗原或其部分的复合物的特异性刺激所触发的细胞毒性活性而进行检测。T淋巴细胞的检测还可以通过重组MHC分子或多个MHC分子的复合物来进行，这些MHC分子加载了来自一个或多个肿瘤相关抗原的各个免疫原性片段，并通过与特异性T细胞受体的接触而鉴定特异性T淋巴细胞。

另一方面，本发明涉及治疗、诊断或监测疾病的方法，所述疾病的特征是表达或异常表达根据本发明鉴定的肿瘤相关抗原，所述方法包括施用与所述肿瘤相关抗原或其部分结合并与治疗剂或诊断剂偶联的抗体。所述抗体可以是单克隆抗体。在其它实施方案中，所述抗体是嵌合抗体或人源化抗体或天然抗体的片段。

本发明还涉及治疗患有特征是表达或异常表达根据本发明鉴定的肿瘤相关抗原的疾病的患者的方法，所述方法包括(i)从所述患者中分离含有免疫反应细胞的样品，(ii)在适于生成抗所述肿瘤相关抗原或其部分的细胞毒性T细胞条件下将所述样品与表达所述肿瘤相关抗原或其部分的宿主细胞接触，和(iii)将细胞毒性T细胞以适于溶解表达肿瘤相关抗原或其部分的细胞的量导入患者。本发明同样涉及克隆抗所述肿瘤相关抗原的细胞毒性T细胞的T细胞受体。所述受体可转移至其它T细胞，该T细胞由此获得所需特异性，并如可在(iii)时导入患者。

在一个实施方案中，所述宿主细胞内源性表达HLA分子。在另一个实施方案中，所述宿主细胞重组性表达HLA分子和/或所述肿瘤相关抗原或其部分。所述宿主细胞优选具有非增殖性。在一个优选的实施方案中，宿主细胞是抗原递呈细胞，特别是树突细胞、单核细胞或巨噬细胞。

另一方面，本发明涉及治疗患有特征是表达或异常表达肿瘤相关抗原的疾病的患者的方法，所述方法包括(i)鉴定编码根据本发明鉴定的肿瘤相关抗原且由与所述疾病相关的细胞表达的核酸，(ii)用所述核酸或其部分转染宿主细胞，(iii)培养转染的宿主细胞从而表达所述核酸(其在获得高转染率时为非必须的)，和(iv)将所述宿主细胞或其提取物以适于提高对与所述疾病相关的患者细胞的免疫反应的量导入所述患者。该方法还包括鉴定呈递所述肿瘤相关抗原或其部分的MHC分子，此处所述宿主细胞表达经鉴定的MHC分子并呈递所述肿瘤相关抗原或其部分。所述免疫反应可包括B细胞反应或T细胞反应。而且，T细胞反应可包括生成具有与呈递肿瘤相关抗原或其部分的所述宿主细胞或表达所述肿瘤相关抗原或其部分的患者细胞的特异性的细胞毒性T细胞和/或辅助T细胞。

本发明还涉及治疗特征是表达或异常表达根据本发明鉴定的肿瘤相关抗原的疾病的方法，所述方法包括(i)鉴定来自表达异常量肿瘤相关抗原的患者的细胞，(ii)分离所述细胞的样品，(iii)培养所述细胞，和(iv)将所述细胞以适于引发对所述细胞的免疫反应的量导入患者。

优选地，根据本发明所使用的宿主细胞具有非增殖性或被赋予非增殖性。特征是表达或异常表达肿瘤相关抗原的疾病特别是癌症。

本发明还涉及一种核酸，所述核酸选自(a)包括选自SEQ ID NO：2－5、20－21、31－33、39、54－57、62、63、85－88、其部分或其衍生物的核酸序列的核酸，(b)在严谨条件下与(a)的核酸杂交的核酸，(c)(a)或(b)的核酸的简并核酸，和(d)与(a)、(b)或(c)的核酸互补的核酸。本发明还涉及一种核酸，所述核酸编码包括选自SEQ ID NO：7－13、14－18、23－24、34－36、58－61、64、65、89－100、其部分或其衍生物的氨基酸序列的蛋白质或多肽。

另一方面，本发明涉及本发明的核酸的启动子序列。这些序列可优选在表达载体中功能性地连接于另外的基因，由此确保在适宜细胞中选择性表达所述基因。

另一方面，本发明涉及包括本发明的核酸的重组核酸分子，特别是DNA或RNA分子。

本发明还涉及含有本发明的核酸或包括本发明的核酸的重组核酸分子的宿主细胞。

所述宿主细胞还可以含有编码HLA分子的核酸。在一个实施方案中，所述宿主细胞内源性表达HLA分子。在另一个实施方案中，所述宿主细胞重组表达HLA分子和/或本发明的核酸或其部分。优选地，所述宿主细胞具有非增殖性。在一个优选的实施方案中，所述宿主细胞是抗原递呈细胞，特别是树突细胞、单核细胞或巨噬细胞。

在另一个实施方案中，本发明涉及寡核苷酸，该寡核苷酸与根据本发明鉴定的核酸杂交，并可用作基因探针或作为“反义”分子。以寡核苷酸引物或感受态样品形式存在的核酸分子与根据本发明鉴定的核酸或其部分杂交，其可用于测定与所述根据本发明鉴定的核酸同源的核酸。PCR扩增、Southern和Northern杂交可用于测定同源核酸。杂交可在低严谨条件、更优选地在严谨条件和最优选地在高严谨条件下实施。根据本发明，术语“严谨条件”是指能够允许多核苷酸间特异性杂交的条件。

另一方面，本发明涉及由核酸编码的蛋白质或多肽，所述核酸选自(a)包括选自SEQ ID NO：2－5、20－21、31－33、39、54－57、62、63、85－88、其部分或其衍生物的核酸序列的核酸，(b)在严谨条件下与(a)的核酸杂交的核酸，(c)(a)或(b)的核酸的简并核酸，和(d)与(a)、(b)或(c)的核酸互补的核酸。在一个优选的实施方案中，本发明涉及包括选自SEQ ID NO：7－13、14－18、23－24、34－36、58－61、64、65、89－100、其部分或其衍生物的氨基酸序列的蛋白质或多肽。

另一方面，本发明涉及根据本发明鉴定的肿瘤相关抗原的免疫原性片段。所述片段优选与人HLA受体或与人抗体结合。本发明的片段优选包括至少6特别是至少8、至少10、至少12、至少15、至少20、至少30或至少50个氨基酸的序列。

另一方面，本发明涉及与根据本发明鉴定的肿瘤相关抗原或其部分结合的试剂。在一个优选的实施方案中，所述试剂是抗体。在其它实施方案中，所述抗体是嵌合抗体、人源化抗体或用组合技术制备的抗体或抗体片段。而且，本发明涉及与(i)根据本发明鉴定的肿瘤相关抗原或其部分和(ii)结合根据本发明鉴定的肿瘤相关抗原或其部分的MHC分子所组成的复合物选择性结合的抗体，所述抗体不单独与(i)或(ii)结合。本发明的抗体可以是单克隆抗体。在其它实施方案中，所述抗体是嵌合抗体或人源化抗体或天然抗体的片段。

本发明还涉及一种与根据本发明鉴定的肿瘤相关抗原或者其部分结合的本发明的试剂或者本发明的抗体和治疗剂或诊断剂之间的偶联物。在一个实施方案中，所述治疗剂或诊断剂是毒素。

另一方面，本发明涉及检测根据本发明鉴定的肿瘤相关抗原的表达或异常表达的试剂盒，所述试剂盒包括用于检测(i)编码肿瘤相关抗原的核酸或其部分，(ii)肿瘤相关抗原或其部分，(iii)与肿瘤相关抗原或其部分结合的抗体，和/或(iv)具有对肿瘤相关抗原或其部分和MHC分子间复合物特异性的T细胞的试剂。在一个实施方案中，用于检测所述核酸或其部分的所述试剂是用于选择性扩增所述核酸的核酸分子，其包括，特别是所述核酸的6－50特别是10－30、15－30和20－30个连续核苷酸的序列。

发明详述

根据本发明描述了这样的基因，即其在肿瘤细胞中选择性或异常表达且为肿瘤相关抗原。

根据本发明，这些基因或其衍生物优选是用于治疗方法的靶结构。在概念上，所述治疗方法的目的在于抑制选择性表达的肿瘤相关基因产物的活性。如果所述异常的各选择性表达在功能上对于肿瘤发病机理具有重要性以及如果其抑制与相应细胞的选择性损伤相伴随，则其是有用的。其它治疗思想将肿瘤相关抗原作为能恢复具有对肿瘤细胞潜在选择性细胞损伤的效应机理的标记。此处，所述靶分子自身的功能与其在肿瘤形成中的作用是完全无关的。

核酸的“衍生物”根据本发明是指在所述核酸中存在单个或多个核苷酸置换、缺失和/或添加。而且，术语“衍生物”还包括在核苷酸碱基、在糖上或在磷酸上的核酸化学衍生化。术语“衍生物”还包括含有非天然存在的核苷酸和核苷酸类似物的核酸。

根据本发明，核酸优选是脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。根据本发明的核酸包括基因组DNA、cDNA、mRNA、重组制备的和化学合成的分子。根据本发明，核酸可以单链或双链和线性或共价环状闭合分子存在。

根据本发明所述的核酸优选是已被分离的。根据本发明的术语“分离的核酸”是指核酸是(i)体外扩增的，例如通过多聚酶链式反应(PCR)，(ii)通过克隆重组制备的，(iii)纯化的，例如通过剪切和凝胶电泳分离，或(iv)合成的，例如通过化学合成。分离的核酸是随时可用于重组DNA技术操作的核酸。

如果两个序列能够彼此杂交并形成稳定双链体，那么这一种核酸与另一核酸互补的，杂交优选在适于多核苷酸间的特异性杂交的条件(严谨条件)下进行。严谨条件描述于，例如，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，J.Sambrook et al.，Editors，2ndEdition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，1989，或Current Protocols in Molecular Biology，F.M.Ausubel et al.，Editors，JohnWiley&Sons，Inc.，New York，严谨条件是指，例如，65℃下在杂交缓冲液(3.5×SSC，0.02％Ficoll，0.02％聚乙烯吡咯烷酮，0.02％牛血清白蛋白，2.5mM NaH₂PO₄(pH 7)，0.5％SDS，2mM EDTA)中杂交。SSC是0.15M氯化钠/0.15M柠檬酸钠，pH 7。杂交后，将已经转移了DNA的膜在例如2×SSC中于室温，然后在0.1－0.5×SSC/0.1×SDS于直至68℃的温度下漂洗。

根据本发明，互补核酸含有至少40％特别是至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％和优选至少95％、至少98或至少99％的核苷酸同一性。

根据本发明，编码肿瘤相关抗原的核酸可单独或与其它核酸特别是异源核酸联合存在。在优选的实施方案中，核酸功能性地连接于与所述核酸同源或异源的表达控制序列或调节序列。如果编码序列和调节序列彼此共价连接，从而编码序列的表达和转录处于调节序列的控制或影响之下，那么称它们为“功能性地”彼此连接。如果所述编码序列将被翻译为功能蛋白质，则在调节序列和编码序列的功能性连接时所述调节序列的诱导导致所述编码序列的转录，而不会导致骗码序列中的移码或编码序列不能翻译成蛋白质或肽。

根据本发明术语“表达控制序列”或“调节序列”包括启动子、增强子和其它能够调节基因表达的控制元件。在本发明特定实施方案中，该表达控制序列可被调节。调节序列的准确结构可由于物种或细胞类型不同而变化，但一般包括在转录和翻译的起始中涉及的5’非转录和5’非翻译序列，如TATA区、加帽序列、CAAT序列等。特别地，5’非转录调节序列包括含有用于功能性连接基因的转录控制的启动子序列的启动子区。调节序列还可以包括增强子序列或上游激活子序列。

因此，在一方面，本说明书所述肿瘤相关抗原可与任何表达控制序列和启动子联合。然而在其它方面，根据本发明，本说明书所述肿瘤相关基因产物的启动子可与其它基因联合。这使得这些启动子的选择活性将得以使用。

根据本发明，核酸还可以存在于与另一核酸的组合中，所述另一核酸编码能控制从宿主细胞中分泌所述核酸所编码的蛋白质或多肽的多肽。根据本发明，核酸还可以存在于与另一核酸的组合中，所述另一核酸编码能使所编码的蛋白质或多肽锚定于宿主细胞的细胞膜上或区室化至所述细胞的特定细胞器中的多肽。

在一个优选的实施方案中，根据本发明，重组DNA分子是载体，并视情况使用启动子，所述启动子能控制核酸例如编码本发明的肿瘤相关抗原的核酸的表达。此处使用的术语“载体”具有其一般的含义，其包括任何用于核酸而能将所述核酸例如导入原核和/或真核细胞并视情况整合入基因组中的媒介载体。该类载体优选在所述细胞中复制和/或表达。媒介载体可适于用在，例如电穿孔、微粒轰击、脂质体施用、农杆菌辅助的转化或通过DNA或RNA病毒的插入。载体包括质粒、噬菌粒或病毒基因组。

编码根据本发明鉴定的肿瘤相关抗原的核酸可用于宿主细胞的转染。此处核酸是指重组DNA和RNA。可通过DNA模板的体外转录制备重组RNA。而且，其可通过在使用前稳定化序列、加帽和多腺苷酸化而得以修饰的。根据本发明，术语“宿主细胞”涉及可用外源核酸转化或转染的任何细胞。根据本发明，术语“宿主细胞”包括原核细胞(例如大肠杆菌)或真核细胞(例如树突细胞、B细胞、CHO细胞、COS细胞、K562细胞、酵母细胞和昆虫细胞)。哺乳动物细胞如来自人、小鼠、仓鼠、猪、山羊、灵长类的细胞是特别优选的。细胞可来自多样的组织类型和包括原代细胞和细胞系。具体实例包括角质化细胞、外周血白细胞、骨髓的干细胞和胚胎干细胞。在其它实施方案中，宿主细胞是抗原递呈细胞，特别是树突细胞、单核细胞或巨噬细胞。核酸可以以单拷贝或多拷贝的形式存在于宿主细胞，而在一个实施方案中，在宿主细胞中表达。

根据本发明，术语“表达”以其最一般的意义使用，并包括RNA的生成或RNA和蛋白质的生成。其还包括核酸的部分表达。而且，表达可以是瞬时或稳定实施的。哺乳动物细胞中优选的表达系统包括pcDNA3.1和pRc/CMV(Invitrogen，Carlsbad，CA)，其包含选择性标记物如给予G418抗性的基因(由此能够选择稳定转染的细胞系)和巨细胞病毒(CMV)的增强子－启动子序列。

在本发明的HLA分子呈递肿瘤相关抗原或其部分的情况中，表达载体还可包括编码所述HLA分子的核酸序列。编码HLA分子的核酸序列可与编码肿瘤相关抗原或其部分的核酸存在于同一载体上，或者两个核酸可存在于不同的表达载体上。在后面的情况中，可将该两个表达载体共转染至细胞中。如果宿主细胞既不表达肿瘤相关抗原或其部分也不表达HLA分子，则将编码其的两个核酸转染至细胞中的相同表达载体或者不同表达载体上。如果所述细胞已经表达HLA分子，则可仅将编码肿瘤相关抗原或其部分的核酸序列转染至细胞中。

本发明还包括扩增编码肿瘤相关抗原的核酸的试剂盒。所述试剂盒包括，例如，与编码肿瘤相关抗原的核酸杂交的一对扩增引物。该引物优选包括所述核酸的6－50特别是10－30，15－30和20－30个连续核苷酸的序列，且是非重叠的，这是为了避免形成引物二聚体。引物之一将与编码肿瘤相关抗原的核酸的一条链杂交，而另一引物将以能够扩增编码肿瘤相关抗原的核酸的排列方式与互补链杂交。

“反义”分子或“反义”核酸可用于调节特别是降低核酸的表达。术语“反义分子”或“反义核酸”根据本发明是指寡核苷酸，所述寡核苷酸是寡核糖核苷酸、寡脱氧核糖核苷酸、修饰的寡核糖核苷酸或修饰的寡脱氧核糖核苷酸，并且其在生理条件下与包括特定基因的DNA或与所述基因的mRNA杂交，从而抑制所述基因的转录和/或所述mRNA的翻译。根据本发明，“反义分子”还包括含有与其天然启动子反向的核酸或其部分的构建体。核酸或其部分的反义转录本可与天然存在的描述酶的mRNA形成双链体并由此阻止mRNA的累积或mRNA翻译为有活性的酶。另一个可能性是使用核酶从而灭活核酸。反义寡核苷酸根据本发明优选含有靶核酸的6－50特别是10－30、15－30和20－30个连续核苷酸的序列，并优选与靶核酸或其部分完全互补。

在优选的实施方案中，反义寡核苷酸与N－末端或5’上游位点如翻译起始位点、转录起始位点或启动位点杂交。在其它实施方案中，反义寡核苷酸与3’端非翻译区或mRNA剪接位点杂交。

在一个实施方案中，本发明的寡核苷酸由核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或其组合构成。其中一个核苷酸的5’末端和另一核苷酸的3’末端通过磷酸二酯键彼此连接。这些寡核苷酸可以用常规方法合成或经重组制备。

在优选的实施方案中，本发明的寡核苷酸是“修饰的”寡核苷酸。此处，为了增加例如其稳定性或治疗效果，寡核苷酸可用不减弱其结合靶位能力的非常不同的方式和方法进行修饰。根据本发明，术语“修饰的寡核苷酸”是指其中(i)其至少两个核苷酸通过合成的核苷内键(即非磷酸二酯键的核苷内键)彼此连接和/或(ii)通常不存在于核酸中的化学基团与所述寡核苷酸共价相连的寡核苷酸。优选的合成的核苷内键是硫代磷酸酯、烷基磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸酯、烷基硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、乙酰胺(Acetamidate)、羧甲基酯和肽。

术语“修饰的寡核苷酸”还包括含有共价修饰的碱基和/或糖的寡核苷酸。“修饰的寡核苷酸”包括，例如含有与除3’位羟基和5’位磷酸基外的低分子量有机基团共价结合的糖残基的寡核苷酸。修饰的寡核苷酸可包括，例如2’－O－烷基化核糖残基或替代核糖的其它糖，如阿拉伯糖。

优选地，分离根据本发明所述的蛋白质和多肽。术语“分离的蛋白质”或“分离的多肽”是指分离自其天然环境的蛋白质或多肽的。分离的蛋白质或多肽可处于基本上纯化的状态。术语“基本上纯化的”是指蛋白质或多肽基本上不含在天然或体内与其伴随的其它物质。

所述蛋白质和多肽例如可用于抗体制备，和在免疫学实验或诊断实验中使用，或者可用作治疗剂。根据本发明所述的蛋白质和多肽可分离自生物样品如组织或细胞匀浆，并还可在多样的原核或真核表达系统中重组表达。

按照本发明的意思，蛋白质或多肽或者氨基酸序列的“衍生物”包括氨基酸插入变体、氨基酸缺失变体和/或氨基酸替换变体。

氨基酸插入变体包括氨基末端和/或羧基末端融合和在特定氨基酸序列中单个或多个氨基酸的插入。在氨基酸序列变体含有插入的情况下，一个或多个氨基酸残基被插入至氨基酸序列的特定位点，虽然具有对所得产物进行适宜筛选的随机插入也是可行的。氨基酸缺失变体的特征在于从序列中除去一个或多个氨基酸。氨基酸替换变体的特征在于在序列中除去至少一个残基并在其位置插入另一残基。修饰优选位于同源蛋白质或多肽间非保守的氨基酸序列中的位置上。优选用其他具有相似特性如疏水性、亲水性、负电性、支链量等的氨基酸来替代氨基酸(保守性替换)。保守性替换，例如涉及一个氨基酸与下列和欲替换的氨基酸分为一组的另一氨基酸互换：

1.小脂肪族、非极性或微极性残基：Ala，Ser，Thr(Pro，Gly)

2.带负电的残基及其酰胺：Asn，Asp，Glu，Gln

3.带正电的残基：His，Arg，Lys

4.大脂肪族、非极性残基：Met，Leu，Ile，Val(Cys)

5.大芳香族残基：Phe，Tyr，Trp。

上面将三个残基用括号标出，这是由于它们在蛋白质构造中的特殊作用。Gly是唯一没有支链的残基，因此其可以赋予链以弹性。Pro具有特殊的几何学结构，其能很强地约束链。Cys可形成二硫键。

上述氨基酸变体可通过已知的肽合成技术例如通过“固相合成”(Merrifield，1964)和相似方法或者通过重组DNA操作法而很容易地制备。将替换突变导入含有已知或部分已知序列的DNA的预定位点中的技术是众所周知的，例如包括M13诱变。用于制备含有替换、插入或缺失的蛋白质的DNA序列操作已经详细描述于例如Sambrook et al.(1989)。

根据本发明，蛋白质或多肽的“衍生物”还包括与酶相关的任何分子，如糖、脂质和/或蛋白质或多肽的单个或多个替换、缺失和/或添加。术语“衍生物”还延伸至所述蛋白质或多肽的全部功能性化学等价物。

根据本发明，肿瘤相关抗原的部分或片段具有来源多肽的功能特性。所述功能特性包括与抗体相互作用、与其它多肽或蛋白质相互作用、选择性结合核酸和酶活性。一个重要的特性是与HLA形成复合物并视情况产生免疫应答的能力。该免疫应答可基于刺激细胞毒性T细胞或辅助T细胞。本发明的肿瘤相关抗原的部分或片段优选包括所述肿瘤相关抗原的至少6特别是至少8、至少10、至少12、至少15、至少20、至少30或至少50个连续氨基酸的序列。

编码肿瘤相关抗原的核酸的部分或片段根据本发明涉及至少编码肿瘤相关抗原和/或编码所述肿瘤相关抗原的部分或片段(如上述)的核酸的部分。

编码肿瘤相关抗原的基因的分离和鉴定还能诊断特征是表达一个或多个肿瘤相关抗原的疾病。这些方法包括测定一个或多个编码肿瘤相关抗原的核酸，和/或测定所编码的肿瘤相关抗原和/或来源于其的肽。所述核酸可采用包括通过多聚酶链式反应或与标记探针杂交的常规方法进行测定。肿瘤相关抗原或来源于其的肽可通过筛选与识别与所述抗原和/或所述肽有关的患者抗血清进行测定。其还可以通过筛选具有相应肿瘤相关抗原特异性的患者T细胞进行测定。

本发明还能使与本文所描述的肿瘤相关抗原结合的蛋白质得以分离，所述蛋白质包括所述肿瘤相关抗原的抗体和细胞结合配偶体。

根据本发明，特定实施方案包括提供源自肿瘤相关抗原的“显型失活”多肽。显型失活多肽是无活性的蛋白质变体，其通过与细胞器相互作用而抑制活性蛋白质与细胞器的相互作用中的活性蛋白质或与活性蛋白质竞争，由此降低所述活性蛋白质的作用。例如，与配体结合但不能产生任何对于配体结合响应的信号的显型失活受体能降低所述配体的生物学效应。同样地，通常与靶蛋白质相互作用但不会磷酸化靶蛋白质的显型失活的无催化活性激酶能降低作为对细胞信号响应的所述靶蛋白质的磷酸化作用。同样地，与基因控制区中启动子位点结合但不增加所述基因转录的显型失活转录因子可通过占据了启动子结合位点而不增加转录从而降低正常转录因子的作用。

显型失活多肽在细胞中表达的结果会导致活性蛋白质功能降低。本领域技术人员可通过例如传统诱变方法制备蛋白质显型失活变体并评估该变体多肽的显型失活效应。

本发明还包括例如与肿瘤相关抗原结合的多肽的物质。所述结合物质可用于例如检测肿瘤相关抗原和肿瘤相关抗原与其结合配偶体的复合物的筛选实验以及所述肿瘤相关抗原以及纯化其与其结合配偶体的复合物。所述结合物还可用于抑制肿瘤相关抗原的活性，例如通过结合该抗原。

因此，本发明包括结合物质，例如能选择性结合肿瘤相关抗原的抗体或抗体片段。抗体包括用常规方法制备的多克隆抗体和单克隆抗体。

已知，仅抗体分子的小部分(互补位)参与该抗体与其表位的结合(参照Clark，W.R.(1986)，The Experimental Foundations of Modern Immunology，Wiley&Sons，Inc.，New York；Roitt，I.(1991)，Essential Immunology，7th Edition，Blackwell ScientificPublications，Oxford)。pFc’和Fc区是例如补体级联反应的效应子但并不参与抗原结合。pFc’区被酶解去除的或者以无pFc’区制备的抗体称为F(ab’)₂片段，其带有完整抗体的两个抗原结合位点。同样地，其Fc区被酶解去除的或者以无Fc区制备的抗体称为Fab片段，其含有完整抗体分子的一个抗原结合位点。此外，包括抗体的共价结合的轻链和抗体的重链部分的Fab片段称为Fd。Fd片段是抗体特异性的主要决定簇(单Fd片段可与直至十个不同的轻链相关，而不改变抗体的特异性)，且当分离时，Fd片段保留了结合表位的能力。

直接与抗原表位相互作用的，互补性决定区(CDR)和保持互补位三级结构的框架区(FR)位于抗体的抗原结合部中。重链的Fd片段和IgG免疫球蛋白的轻链都包含各由三个互补性决定区(CDR1～CDR3)隔开的四个框架区(FR1～FR4)。CDR，特别是CDR3区更特别是重链的CDR3区绝大多数是造成抗体特异性的原因。

已知哺乳动物抗体的非CDR区可被具有相同或其他特异性的抗体的相似区所替换，同时保留对原始抗体的表位的特异性。这使得可能形成所谓的“人源化”抗体，在该抗体中非人CDR与人FR和/或Fc/pFc’区共价连接以制备功能性抗体。

例如，WO 92/04381中公开了人源化鼠RSV抗体的制备和用途，所述抗体中至少部分鼠FR区被人源的FR区替换。该类抗体包括具有抗原结合能力的完整抗体的片段抗体，其通常称为“嵌合”抗体。

本发明还提供了抗体的F(ab’)₂、Fab、Fv和Fd片段，其中Fc和/或FR和/或CDR1和/或CDR2和/或轻链－CDR3区已被同源人或非人序列替换的嵌合抗体，其中FR和/或CDR1和/或CDR2和/或轻链－CDR3区已被同源人或非人序列替换的嵌合F(ab’)₂片段抗体，其中FR和/或CDR1和/或CDR2和/或轻链－CDR3区已被同源人或非人序列替换的嵌合Fab片段抗体，和其中FR和/或CDR1和/或CDR2区已被同源人或非人序列替换的嵌合Fd片段抗体。本发明还包括所谓的“单链”抗体。

本发明还包括与肿瘤相关抗原特异性结合的多肽。例如通过以固定形式在溶液中简单制备的或作为噬菌体展示文库制备的简并的肽文库可提供这样的多肽结合物质。同样能够用一个或多个氨基酸制备肽组合文库。还可以制备肽和非肽性合成残基的文库。

噬菌体展示在鉴定本发明的结合肽中是特别有效的。就此而论，例如，制备呈递长度为4～约80个氨基酸残基的插入序列的噬菌体文库(例如采用M13、fd或lambda噬菌体)。然后选择带有与肿瘤相关抗原结合的插入序列的噬菌体。该方法可通过再选择与肿瘤相关抗原结合的噬菌体的多个循环而进行重复。重复操作导致带有特定序列的噬菌体的浓缩。可实施DNA序列分析以便鉴定所表达的多肽的序列。与肿瘤相关抗原结合的序列的最小线性部分可被确定。酵母“双杂交系统”也可用于鉴定结合肿瘤相关抗原的多肽。根据本发明所述的肿瘤相关抗原或其片段可用于筛选肽文库，包括噬菌体呈现文库，以鉴定和选择肿瘤相关抗原的肽结合配偶体。这样的分子例如可用于筛选实验、纯化方法，用于干扰肿瘤相关抗原的功能以及用于其它本领域技术人员已知的目的。

上述抗体和其它结合分子可用于，例如，鉴定表达肿瘤相关抗原的组织。抗体还可以与特异性诊断物偶连以便显示表达肿瘤相关抗原的细胞和组织。其还可以与治疗上有效的物质偶连。诊断剂非限制性地包括硫酸钡、碘西他酸、碘番酸、碘泊酸钙、泛影酸钠、泛影酸葡甲胺、甲泛葡胺、丁碘苄丁酸钠，和放射诊断剂包括正电子发射体如氟－18和碳－11，γ发射体如碘－123、锝－99m、碘－131和铟－111、用于核磁共振的核素如氟和钆。根据本发明，术语“治疗上有效的物质”是指按需选择性导向表达一个或多个肿瘤相关抗原的细胞的任何治疗性分子，包括抗癌剂、放射性碘标记的化合物、毒素、细胞稳定药或细胞溶解药等，抗癌剂包括例如氨鲁米特、硫唑嘌呤、硫酸博来霉素、白消安、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、顺铂、环磷酰胺、环孢菌素A、阿糖胞苷、达卡巴素、更生霉素、daunorubin、阿霉素、紫杉醇、依托泊苷、氟尿嘧啶、干扰素－α、环己亚硝脲、巯嘌呤、甲氨蝶呤、米托坦、盐酸丙卡巴肼、硫鸟嘌呤、硫酸长春碱和硫酸长春新碱。其它抗癌剂被公开于例如Goodman和Gilman，“ThePharmacological Basis of Therapeutics”，8th Edition，1990，McGraw－Hill，Inc.，特别是52章中(抗癌剂(Paul Calabresi和Bruce A.Chabner)。毒素可以是蛋白质如美州商陆抗病毒蛋白质，霍乱毒素、百日咳毒素、篦麻毒素、白树毒素、相思豆毒素、白喉外毒素或假单胞菌外毒素。毒素残基还可以是释放高能量的放射性核素如钴－60。

根据本发明术语“患者”是指人类，非人类灵长类或其它动物，特别是哺乳动物如奶牛、马、猪、绵羊、山羊、狗、猫或啮齿动物如小鼠和大鼠。在特别优选的实施方案中，患者是人类。

根据本发明，术语“疾病”是指表达或异常表达肿瘤相关抗原的任何病理状态。“异常表达”根据本发明是指与健康个体状态相比表达改变，优选是增加。表达增加是指增加至少10％左右，特别是至少20％、至少50％或至少100％。在一个实施方案中，所述肿瘤相关抗原仅在患病个体的组织中表达，而在健康个体中的表达受抑制。所述疾病的一个实例是癌症，特别是精原细胞瘤、黑素瘤、畸胎瘤、神经胶质瘤、结肠直肠癌、乳癌、前列腺癌、子宫癌、卵巢癌和肺癌。

根据本发明，生物样品可以是组织样品和/或细胞样品，并可采用常规方法如通过组织活检，包括钻取活组织检查以及通过取血、支气管抽取液、尿、粪便或其它体液的方法获得，而用于本文描述的多种方法中。

根据本发明，术语“免疫反应细胞”是指能用适宜刺激将其成熟为免疫细胞(如B细胞，辅助T细胞，或细胞毒性T细胞)的细胞。免疫反应细胞包括CD34⁺造血干细胞，未成熟的和成熟的T细胞和未成熟的和成熟的B细胞。如果需要生成识别肿瘤相关抗原的细胞毒性或辅助T细胞，则在适于生成、分化和/或选择细胞毒性T细胞和辅助T细胞的条件下将该免疫反应细胞与表达肿瘤相关抗原的细胞接触。当暴露于抗原时，T细胞前体细胞分化为细胞毒性T细胞，这与免疫系统的克隆选择相似。

某些治疗方法的基础是患者免疫系统的反应，所述反应导致抗原呈递细胞如呈递一个或多个肿瘤相关抗原的癌细胞的溶解。就此而论，例如将具有对肿瘤相关抗原和MHC分子的复合物特异性的自体细胞毒性T淋巴细胞施用于患有细胞异常的患者。所述细胞毒性T淋巴细胞的体外制备方法是已知。WO－A－9633265中已经公开了T细胞分化方法的实例。通常，从所述患者提取含有细胞如血细胞的样品，然后将该细胞与呈递所述复合物并能导致细胞毒性T淋巴细胞增殖的细胞(例如树突细胞)相接触。所述靶细胞可以是转染的细胞如CoS细胞。这些转染的细胞在其表面呈递所需复合物，并在与细胞毒性T淋巴细胞接触时刺激后者的增殖。然后将克隆延展的自体细胞毒性T淋巴细胞施用于所述患者。

在另一选择抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞的方法中，将MHC I类分子/肽复合物的荧光四聚物用于检测细胞毒性T淋巴细胞的特异性克隆(Altman et al.，Science 274：94－96，1996；Dunbar et al.，Curr.Biol.8：413－416，1998)。可溶性MHC I类分子在存在β2微球蛋白和与所述I类分子结合的肽抗原的情况下在体外折叠。纯化该MHC/肽复合物，然后用生物素标记。通过将所述生物素化肽－MHC复合物与标记的抗生物素蛋白(例如藻红蛋白)以4:1的摩尔比率混合而形成四聚物。然后将四聚物与细胞毒性T淋巴细胞如外周血或淋巴结接触。该四聚物与能识别肽抗原/MHC I类复合物的细胞毒性T淋巴细胞结合。与所述四聚物结合的细胞可通过用于分离反应性细胞毒性T淋巴细胞的荧光控制的细胞分选进行分选。然后可将所述分离的细胞毒性T淋巴细胞在体外增殖。

在称为继承性转移的治疗方法中(Greenberg，J.Immunol.136(5)：1917，1986；Riddel et al.，Science 257：238，1992；Lynch et al.，Eur.J.Immunol.21：1403－1410，1991；Kast et al.，Cell59：603－614，1989)，将呈递所需复合物的细胞(例如树突细胞)与将治疗的患者的细胞毒性T淋巴细胞组合，导致特异性细胞毒性T淋巴细胞的增殖。然后将增殖的细胞毒性T淋巴细胞施用于具有特征为呈递所述特异性复合物的特定异常细胞的细胞异常的患者。然后该细胞毒性T淋巴细胞溶解异常细胞，由此实现所需疗效。

通常，在患者的T细胞库中，仅具有对该类特异性复合物低亲和力的T细胞可得以增殖，因为那些具有高亲和力的细胞由于耐受性的形成而被去除。此处一个选择性方法可以是T细胞受体自身的转移。同样地，为此将呈递所述所需复合物的细胞(例如树突细胞)与健康个体的细胞毒性T淋巴细胞组合。如果供体迄今没有与特异性复合物机接触，这导致具有高亲和力的特异性细胞毒性T淋巴细胞的增殖。克隆这些增殖的特异性T淋巴细胞的高亲和力T细胞受体，然后将其通过基因转移例如使用逆病毒载体而任意转导至其他患者的T细胞。然后采用这些遗传改变的T淋巴细胞实施继承性转移(Stanislawski et al.，NatImmunol.2：962－70，2001；Kessels et al.，Nat Immunol.2：957－61，2001)。

上述治疗方面始于如下事实：至少一些患者的异常细胞呈递肿瘤相关抗原和HLA分子的复合物。所述细胞可按本身已知的方法鉴定。呈递所述复合物的细胞一经鉴定，则可将它们与来自所述患者的包含细胞毒性T淋巴细胞的样品组合。如果所述细胞毒性T淋巴细胞溶解呈递所述复合物的细胞，即可推测呈递了肿瘤相关抗原。

根据本发明可采用的治疗形式不仅是继承性转移。细胞毒性T淋巴细胞实质上还可按本身已知的方法在体外生成。一种方法使用表达所述复合物的非增殖性的细胞。此处使用的细胞是那些通常表达所述复合物的细胞，如受辐射的肿瘤细胞或用对于所述复合物(即抗原肽和呈递的HLA分子)的呈递所需的一个或两个基因转染的细胞。可使用多种细胞类型。而且，可以使用带有一个或两个目标基因的载体。特别优选的是病毒载体或细菌载体。例如，编码肿瘤相关抗原或其部分的核酸可功能性连接于控制所述肿瘤相关抗原或其片段在特定组织或细胞类型中的表达的启动子和增强子序列。可将所述核酸装配入表达载体。表达载体可以是可插入外源性核酸的无修饰的染色体外核酸、质粒或病毒基因组。还可将编码肿瘤相关抗原的核酸插入逆转录病毒基因组，由此使得所述核酸整合至靶组织或靶细胞的基因组中。在这些系统中，微生物如痘苗病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒、逆转录病毒或腺病毒载体携带目标基因并事实上“感染”宿主细胞。另一优选的形式是以重组RNA的形式导入肿瘤相关抗原。它们可通过例如脂质体转移或通过电穿孔导入细胞中。得到的细胞呈递目标复合物并被自身细胞毒性T淋巴细胞识别，该细胞然后增殖。

肿瘤相关抗原或其片段与佐剂的组合可获得相似效果，以便能使在体内整合至抗原递呈细胞。所述肿瘤相关抗原或其片段表现为蛋白质、DNA(例如在载体内)或RNA。处理所述肿瘤相关抗原以便生成HLA分子的肽配偶体，而其片段可无须进一步的处理而被呈递。如果这些能结合HLA分子，则后者是特殊情况。完全抗原在体内由树突细胞进行处理的施用方式是优选的，因为其还能产生有效免疫反应所需的辅助T细胞反应(Ossendorp et al.，Immunol Lett.74：75－9，2000；Ossendorp et al.，J.Exp.Med.187：693－702，1998)。通常，可通过例如皮内注射将有效量的肿瘤相关抗原施用于患者。此外，注射还可通过结内注射至淋巴结(Maloy et al.，Proc Natl Acad Sci USA 98：3299－303，2001)。还可以与促进摄入至树突细胞的试剂组合实施。体内优选的肿瘤相关抗原包括与多个癌症患者的异源癌抗血清或T细胞反应的抗原。此外，特别令人感兴趣的是那些先前对其不存在自身免疫应答的肿瘤相关抗原。可以可检测的方式诱导能溶解肿瘤的抗这些肿瘤相关抗原的免疫应答(Keogh et al.，J.Immunol.167：787－96，2001；Appella et al.，Biomed Pept ProteinsNucleic Acids 1：177－84，1995；Wentworth et al.，Mol Immunol.32：603－12，1995)。

根据本发明所描述的药物组合物还可用作用于免疫接种的疫苗。根据本发明，术语“免疫接种”或“接种疫苗”是指针对抗原的免疫反应的增加或激活。通过使用肿瘤相关抗原或其编码核酸能将动物模型用于检测对癌的免疫效果。例如，可将人类癌细胞导入小鼠中从而生成肿瘤，然后施用编码肿瘤相关抗原的一个或多个核酸。对癌细胞的效果(例如肿瘤大小的减小)可作为检测核酸免疫效力而进行检测。

作为用于免疫的组合物的部分，将一个或多个肿瘤相关抗原或其刺激性片段与一个或多个佐剂一起施用以诱导免疫应答或增加免疫应答。佐剂是一种掺入所述抗原或与后者一起施用并能增强免疫应答的物质。佐剂可通过提供抗原库(细胞外或巨噬细胞内)、激活巨噬细胞和刺激特定的淋巴细胞而增强免疫反应。佐剂是已知的，并以非限制性的方式包括单磷酰脂A(MPL，SmithKline Beecham)、皂苷如QS21(SmithKline Beecham)、DQS21(SmithKline Beecham；WO 96/33739)、QS7、QS17、QS18和QS－L1(So et al.，Mol.Cells 7：178－186，1997)、不完全弗氏佐剂、完全弗氏佐剂、维生素E、montanide、明矾、CpG寡核苷酸(参照Kreig et al.，Nature 374：546－9，1995)和用生物可降解的油如鲨烯和/或生育酚制备的多种油包水乳液。优选地，将所述肽以与DQS21/MPL混合物的形式施用。DQS21与MPL的比率一般为约1:10～10:1，优选约1:5～5:1而特别是约1:1。在施用于人时，疫苗制剂通常包含约1μg～约100μg的DQS21和MPL。

刺激患者免疫反应的其它物质也是可以施用的。例如，由于其对淋巴细胞的调节活性，在疫苗接种中使用细胞因子是可行的。所述细胞因子包括，例如显示出增加疫苗的保护性效果的白介素－12(IL－12)(参照Science 268：1432－1434，1995)，GM－CSF和IL－18。

能增强免疫应答并因此可用于疫苗接种的化合物数量很多。所述化合物包括以蛋白质或核酸形式提供的共刺激分子。所述共刺激分子的实例是在树突细胞(DC)上表达的并与T细胞上表达的CD28分子相互作用的B7－1和B7－2(分别CD80或CD86)。该相互作用提供了对抗原/MHC/TCR－刺激的(信号1)T细胞的共刺激(信号2)，由此增强了所述T细胞的增殖和效应子作用。B7还与T细胞上的CTLA4(CD152)相互作用，关于CTLA4和B7配体的研究证实了B7－CTLA4相互作用能增强抗肿瘤免疫性和CTL的增殖(Zheng，P.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(11)：6284－6289(1998))。

B7通常不在肿瘤细胞上表达，因此这些不是对于T细胞的有效的抗原递呈细胞(APC)。诱导B7表达将能使肿瘤细胞更有效地刺激细胞毒性T淋巴细胞的增殖和效应子作用。通过B7/IL－6/IL－12联合的共刺激揭示了在T细胞群中IFN－γ和Th1－细胞因子分布的诱导，这导致进一步增强T细胞活性(Gajewski et al.，J.Immunol.154：5637－5648(1995))。

细胞毒性T淋巴细胞的完全激活和完全效应子功能需要通过所述辅助T细胞上的CD40配体和由树突细胞表达的CD40分子间的相互作用的辅助T细胞的参与(Ridge et al.，Nature 393：474(1998)，Bennett et al.，Nature 393：478(1998)，etal.，Nature 393：480(1998))。该共刺激信号的机制可能涉及通过树突细胞(抗原呈递细胞)的B7和相关IL-6/IL12的生成的增加。因此CD40－CD40L相互作用补充了信号1(抗原/MHC－TCR)和信号2(B7－CD28)的相互作用。

抗－CD40抗体用于刺激树突细胞的用途预期能直接增强对通常处于炎性应答范围之外或非专一性抗原递呈细胞(肿瘤细胞)呈递的肿瘤抗原的响应。在这些情况下，T辅助和B7－共刺激信号未被提供。该机制可用于和基于抗原刺激的树突细胞的治疗有关的情况，或在已知的TRA前体细胞中尚未确定T辅助表位的情况。

本发明还提供了核酸，多肽或肽的施用方法。多肽和肽可采用本身已知的方式施用。在一个实施方案中，采用体外施用核酸，即通过从患者分离细胞，对所述细胞进行遗传学改变以便掺入肿瘤相关抗原，然后将改变的细胞再导入至该患者。其一般包括在体外将基因的功能性拷贝导入患者的细胞中和再将遗传学改变的细胞导入患者。基因的功能性拷贝处于能使该基因在遗传学改变的细胞中表达的调控元件的功能控制下。转染和转导方法是本领域技术人员已知的。本发明还提供了通过使用载体如病毒和靶受控脂质体而在体内施用核酸的方法。

在一个优选的实施方案中，用于施用编码肿瘤相关抗原的核酸的病毒载体选自腺病毒、腺伴随病毒、痘病毒，包括痘苗病毒和减毒痘病毒、塞姆利基森林病毒、逆转录病毒、辛德比斯病毒和Ty病毒样颗粒。腺病毒和逆转录病毒是特别优选的。所述逆转录病毒通常是复制缺陷型的(即它们不能产生感染性颗粒)。

可使用多种方法将核酸根据本发明在体外或体内导入细胞。该类方法包括核酸CaPO₄沉淀物的转染、与DEAE的转染相关的核酸的传染、上述含有目标核酸的病毒的转染或感染、脂质体介导的转染等。在特定实施方案中，优选的是将所述核酸导入特定细胞。在所述实施方案中，用于将核酸施用于细胞的载体(例如逆转录病毒或脂质体)可含有结合的靶控制分子。例如，分子如具有对靶细胞上的表面膜蛋白质特异性的抗体或针对靶细胞上受体的配体可被掺入或附于核酸载体。优选的抗体包括与肿瘤相关抗原选择性结合的抗体。如果需要通过脂质体施用核酸，可将与内吞作用相关的表面膜蛋白质结合的蛋白质掺入脂质体配剂中，以便获得靶位控制和/或摄取。所述蛋白质包括衣壳蛋白或其具有对特定细胞类型特异性的片段、抗被摄入的蛋白质的抗体，定位细胞内位点的蛋白质等。

本发明的治疗组合物可以药物学上适用的制剂进行施用。所述制剂通常含有药物学上适用浓度的盐、缓冲物质、防腐剂、载体、补充性免疫增强剂如佐剂、CpG和细胞因子，和视情况含有其它治疗有效物质。

本发明的治疗有效物质可通过任何常规途径，包括通过注射或输注的方法进行施用。可采用例如口服、静脉内、腹膜内、肌内、皮下或经皮肤的方式进行施用。优选地，抗体可通过肺气雾剂的方法进行治疗施用。反义核酸优选通过缓慢静脉注射的方法进行施用。

本发明的组合物以有效剂量施用。“有效剂量”是指单独或与另外剂量一同获得预期反应或预期效果的量。在治疗特征是表达一个或多个肿瘤相关抗原的特定疾病和特定症状的情况下，所需反应涉及抑制所述疾病的病程。其包括减慢疾病的进展，特别是，阻断疾病的进展。在治疗疾病或症状中的所需反应还可以是延缓或阻止所述疾病或所述症状的发病。

本发明的组合物的有效剂量取决于要治疗的症状、疾病的严重程度、患者的个体参数(包括年龄、生理条件、身体大小和体重)、治疗持续时间、伴随治疗的类型(如果存在)、特异性的施药途径和相似因素。

本发明的药物组合物优选是无菌的，并且包含有效剂量的治疗活性物质以产生所需反应或所需效应。

本发明的组合物的施用剂量可依赖于多种参数如施用方式、患者状况，施用所需周期等。在施用起始剂量对患者的反应不足的情况下，可使用更高的剂量(或通过其他的、更局部化的施用途径获得的效用更高的剂量)。

通常，制备和施用剂量为1ng～1mg，优选10ng～100μg的肿瘤相关抗原，用以治疗或者产生或增加免疫应答。如果需要施用编码肿瘤相关抗原的核酸(DNA和RNA)，制备和施用的剂量为1ng～0.1mg。

本发明的药物组合物通常以药物学上适用的量和以药物学上适用的组合物进行施用。术语“药物学上适合的”是指不与药物组合物的活性成分的作用发生相互作用的无毒物质。该类制剂通常可含有盐、缓冲物质、防腐剂、载体，和视情况含有其它治疗上有效的化合物。当在药物中使用时，所述盐应是药物学上适宜的。然而，非药物学上适用的盐也可用于制备其药物学上适用的盐，这也包括于本发明中。该类药理学和药物学上适用的盐包括以非限制性方式从下列酸制备的盐：盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、马来酸、乙酸、水杨酸、柠檬酸、甲酸、丙二酸、琥珀酸等。药物学上适用的盐还可以制备为碱金属盐或碱土金属盐，如钠盐、钾盐或钙盐。

本发明的药物组合物可包括药物学上可接受的载体。根据本发明，术语“药物学上适用的载体”是指适用于施用给人类的一个或多个相容性的固体或液体填充料、稀释剂或包封物。术语“载体”是指具有天然或合成性质的有机或无机成分，活性成分在其中进行联合从而利于施用。本发明的药物组合物的组分通常不发生基本上会减弱所需的药物学功效的相互作用。

本发明的药物组合物可包含适用的缓冲物如乙酸盐、柠檬酸盐、硼酸盐和磷酸盐。

所述药物组合物视情况还可包含适用的防腐剂如氯化苯甲烃铵(Benzalkoniumchlorid)、三氯甲基叔丁醇、对羟基苯甲酸酯和乙基汞硫代水杨酸钠。

所述药物组合物通常以统一剂型提供并可用实际已知的方法制备。本发明的药物组合物可以是如下剂型，例如胶囊、片剂、锭剂、混悬剂、糖浆剂、酏剂或乳液剂型。

适用于胃肠外给药的组合物通常含有有效物质的无菌水性或非水性制剂，其优选是与受者血液等渗的。适用的载体和溶剂的实例是林格液和等渗氯化钠溶液。另外，通常将无菌的、不挥发的油用作溶液或悬浮介质。

下述附图和实施例用于详细地描述本发明，它们仅用于例证的目的而并非意在限制。根据说明书和实施例，本领域技术人员可获得同样包括于本发明的其它实施方案。

附图说明：

图1：图解说明eCT的克隆。该策略包括在数据库中鉴定候补基因(GOI＝“目标基因”)并通过RT－PCR的方法检测所述基因。

图2：LDH C的剪接。选择性剪接结果导致外显子3(SEQ ID NO：2)、两个外显子3和4(SEQ ID NO：3)、外显子3、6和7(SEQ ID NO：4)或外显子7(SEQ ID NO：5)的缺失。ORF＝开放阅读框架，aa＝氨基酸。

图3：可能的LDH－C蛋白质的比对。SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10是原型蛋白质(SEQ ID NO：6)的截断部分。SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13的蛋白质序列为另外改变的，并仅包含肿瘤特异性表位(以粗体字显示)。催化中心用方框显示。

图4：采用实时PCR在多种组织中定量LDH C。在除睾丸以外的正常组织中未检测到转录本，但在肿瘤中检测到显著性表达水平。

图5：TPTE变体的外显子组合物。根据本发明，鉴定在睾丸组织和肿瘤中表达且具有移码和由此改变的序列区的剪接变体(SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：54、SEQID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57)。

图6：可能的TPTE蛋白质的比对。选择性剪接结果导致所编码的蛋白质的改变，基本上保留阅读框。用粗体字显示推定的跨膜区，催化区用方框显示。

图7：TSBP变体在核苷酸水平的比对。根据本发明发现的TSBP变体的核苷酸序列(SEQ ID NO：31，SEQ ID NO：32，SEQ ID NO：33)中与已知序列(NM_006781，SEQ ID NO：29)的差异用粗体字显示。

图8：TSBP变体在蛋白质水平的比对。在由本发明发现的TSBP变体(SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36)所编码的蛋白质中，移码导致与前述蛋白质(SEQ ID NO：30，NM_006781)的实质性差异，并用粗体字显示。

图9：MS4A12的RT－PCR。所检测的组织中仅在睾丸、结肠和结肠直肠癌(结肠癌)中检测到表达。在所示6个肝组织样品的其一中，MS4A12检测阳性，因为该样品已经发生结肠癌转移浸润。稍后的实验也证实了结肠癌转移中的明显表达。

图10：BRCO1的RT－PCR。与在正常乳腺组织中的表达相比，BRCO1在乳腺肿瘤中明显过表达。

图11：MORC、TPX1、LDHC、SGY－1的RT－PCR。多种正常组织的研究显示表达仅存在于睾丸中(1皮肤，2小肠，3结肠，4肝，5肺，6胃，7乳腺，8肾，9卵巢，10前列腺，11甲状腺，12白细胞，13胸腺，14阴性对照，15睾丸)。肿瘤的研究(1－17肺肿瘤，18－29黑素瘤，30阴性对照，31睾丸)显示在所述肿瘤中的各eCT以不同频率的异位表达。

图12：LDHC在MCF－7乳癌细胞系中的线粒体定位。用LDHC表达质粒瞬时转染MCF－7细胞。用LDHC特异性抗体检测抗原，其显示出明显的与线粒体呼吸链酶细胞色素C氧化酶的共区域化。

图13：TPTE的预测拓扑学和在MCF－7细胞的细胞表面上的亚细胞定位

左侧的图描述了4个推测的TPTE跨膜区(箭头)。用TPTE表达质粒瞬时转染MCF－7细胞。采用TPTE特异性抗体检测抗原并显示出与位于细胞表面上的MHC I分子的明显的共区域化。

图14：MS4A12在细胞膜上的定位。

用GFP－标记的MS4A12构建体瞬时转染肿瘤细胞，其在共聚焦免疫荧光显微技术中显示出与质膜标记物的完全共区域化。

具体实施方式

材料和方法

术语“in silico”、“电子的”和“虚拟克隆”仅指使用基于数据库的方法，其还可用于模拟实验室实验方法。

除非另有描述，全部其它术语和表述均使用能被本领域技术人员理解的含义。所述技术和方法用本身已知的方法实施，并已经描述于例如Sambrook et al.，MolecularCloning：A Laboratory Manual，2nd Edition(1989)Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.。包括使用试剂盒和试剂的全部方法按厂商的说明实施。

用于确定eCT(电子克隆的癌/睾丸基因)的基于数据挖掘的策略

将两个名为GenBank关键词检索和cDNAxProfiler的in silico策略进行组合(图.1)。使用NCBI的ENTREZ检索和返回系统(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez)，对被评述为在睾丸组织中特异性表达的候补基因实施GenBank检索(Wheeler et al.，NucleicAcids Research 28：10－14，2000)。

实施关键词为“睾丸特异性基因”、“精子特异性基因”、“精原细胞特异性基因”的查询，从数据库中提取候补基因(GOI，目标基因)。通过对生物体使用“人类”和对分子类型使用“mRNA”进行限制，从而将所述检索仅限于这些数据库的完整信息的部分。

所发现的GOI的列表通过确定相同序列的不同名称从而消除冗余来进行调整。

由关键词检索获得的全部候补基因再次通过“电子Northern”(eNorthen)法研究其组织分布。eNorthern基于将GOI序列对于EST(已表达序列标志)数据库进行比对(Adamset al.，Science 252：1651，1991)(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)。每个与输入的GOI同源而出现的EST的组织来源可被确定，并以这种方式通过将全部EST相加而生成GOI组织分布的初步评估。仅对与来自除胎盘和胎儿外的非睾丸正常组织的EST不同源的那些GOI实施进一步的试验。该评估还能考虑到了公开领域中存在的被错误评述的cDNA文库(Scheurle et al.，Cancer Res.60：4037－4043，2000)(www.fau.edu/cmbb/publications/cancergenes6.htm)。

所使用第二个数据挖掘方法是NCBI的癌症基因组剖析计划(Cancer GenomeAnatomy Project)的cDNA xProfiler(http://cgap.nci.nih.gov/Tissues/xProfiler)(Hillier et al.，Genome Research 6：807－828，1996；Pennisi，Science 276：1023－1024，1997)。所述方法能使存在于数据库中的转录组库通过逻辑运算符进行彼此关联。我们定义了将从睾丸中制备的所有表达文库分配至其中的A库，其中排除了混合文库。将从除睾丸、卵巢或胎儿组织以外的正常组织中制备的全部cDNA文库分配至B库。通常，不依赖于基本制备方法而独立使用全部cDNA文库，但仅承认那些大小>1000的。采用BUT NOT运算符从A库中在数字上减去B库。采用该方法建立的GOI组液用于eNOrthern研究，并通过文献检索加以确认。

该联合的数据挖掘包括公开领域中的全部约13,000全长基因，并从这些基因中预测出总数是140的具有潜在睾丸特异性表达的基因。在这些基因中存在25个先前已知的CT基因类基因，这证实了我们的策略的功效。

通过特异性RT－PCR首先在正常组织中评估所有其它基因。所有已被证实在非睾丸正常组织中表达的GOI被认为是假阳性，并从进一步的研究中排除。余下的基因在最多样的肿瘤组织的大平板上进行试验。下述抗原在此被证实在肿瘤细胞中异位激活。

提取RNA，制备聚d(T)引物启动的cDNA和RT－PCR分析

使用异硫氰酸胍作为促溶剂从自然组织材料中提取总RNA(Chomczynski&Sacchi，Anal.Biochem.162：156－9，1987)。在用酸性苯酚提取并用异丙醇沉淀后，将所述RNA溶解于DEPC处理的水中。

采用Superscript II(Invitrogen)并根据厂商说明在20μl反应混合物中使用2－4μg总RNA实施第一链cDNA合成。所使用的引物是dT(18)寡核苷酸。通过在30个循环PCR中p53的扩增来检测cDNA的完整性和质量(有义CGTGAGCGCTTCGAGATGTTCCG，反义CCTAACCAGCTGCCCAACTGTAG，杂交温度为67℃)。

从多种正常组织和肿瘤体中制备第一链cDNA库在30μl反应混合物中扩增0.5μl这些cDNA用于表达研究，其中使用GOI特异性引物(如下)和1U HotStarTaq DNA聚合酶(Qiagen)。每个反应混合液包含0.3mM dNTP，0.3M各引物和3μl 10×反应缓冲液。

选择引物以便使其位于两个不同的外显子中，并通过用非逆转录的DNA作为模板进行检测来证实消除了由污染性基因组DNA所带来地干扰，所述污染性基因组DNA是假阳性结果的原因。在95℃保持15分钟以激活HotStarTaq DNA聚合酶后，实施35个PCR循环(94℃1分钟，各自特定的杂交温度1分钟，72℃2分钟和72℃最终延长6分钟)。

将20μl该反应物在用溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶上分离并进行分析。

将下列引物用于相应抗原在所述杂交温度的表达分析。

LDH－C(67℃)

有义TGCCGTAGGCATGGCTTGTGC，反义CAACATCTGAGACACCATTCC

TPTE(64℃)

有义TGGATGTCACTCTCATCCTTG，反义CCATAGTTCCTGTTCTATCTG

TSBP(63℃)

有义TCTAGCACTGTCTCGATCAAG，反义TGTCCTCTTGGTACATCTGAC

MS4A12(66℃)

有义CTGTGTCAGCATCCAAGGAGC，反义TTCACCTTTGCCAGCATGTAG

BRCO1(60℃)

有义CTTGCTCTGAGTCATCAGATG，反义CACAGAATATGAGCCATACAG

TPX1(65℃)

有义TTTTGTCTATGGTGTAGGACC，反义GGAATGGCAATGATGTTACAG

制备随机六碱基引物启动的cDNA和定量实时PCR

采用实时PCR的方法定量LDHC表达。

采用ABI PRISM序列检测系统(PE Biosystems，USA)的定量实时PCR的原理是利用Taq DNA聚合酶的5’－3’外切酶活性并通过荧光报告染料的释放而直接且特异性地检测PCR产物。除有义和反义引物外，所述PCR采用与PCR产物序列杂交的双荧光标记的探针(TaqMan探针)。该探针的5’用报告染料(例如FAM)标记而在3’用淬灭染料(例如TAMRA)标记。如果探针是完整的，报告染料向淬灭染料的空间接近抑制报告染料荧光的发射。如果探针与PCR产物在PCR过程中杂交，所述探针被TaqDNA聚合酶的5’－3’外切酶活性剪切从而去除了对报告染料荧光的抑制。报告染料荧光的增加作为靶扩增的结果而在每个PCR循环后检测并用于定量。靶基因的表达进行绝对定量，或相对于在进行试验的组织中稳定表达的对照基因的表达进行定量。将所述样品作为所谓的“管家”基因而标准化为18s RNA后，采用ΔΔ－Ct法(PE Biosystems，USA)计算LDHC表达。该反应在双份混合液中进行并成双测定。使用高容量cDMA库试剂合(PE Biosystems，USA)和6碱基引物并根据厂商说明合成cDNA。在各情况中，将5μl稀释的cDNA用于总体积为25μl的PCR：有义引物(GGTGTCACTTCTGTGCCTTCCT)300nM；反义引物(CGGCACCAGTTCCAACAATAG)300nM；TaqMan探针(CAAAGGTTCTCCAAATGT)250nM；有义引物18s RNA 50nM；反义引物18s RNA 50nM；18s RNA样品250nM；12.5μlTaqMan Universal PCR Master Mix；初始变性95℃(10分钟)；95℃(15秒)；60℃(1分钟)；40个循环。通过超出外显子1和外显子2的范围之外的128bp产物的扩增而将所述全部LDHC剪接变体均包括于定量中。

克隆和序列分析

采用普通方法克隆全长基因或基因片段。通过采用校正聚合酶pfu(Stratagene)扩增相应抗原以确定所述序列。在PCR结束后，用HotStarTaq DNA聚合酶的方法将腺苷连接至扩增子的末端以便按照厂商说明将片段克隆至TOPO－TA载体。采用商业测序。采用一般预测程序和算法分析序列。

实施例1：新肿瘤抗原LDH C的鉴定

LDH C(SEQ ID NO：1)和其翻译产物(SEQ ID NO：6)已被描述为乳酸脱氢酶家族的睾丸特异性同工酶。在GenBank中以登录号NM_017448公开了该序列。该酶形成分子量为140kDa的同源四聚体(Goldberg，E.et al.，Contraception 64(2)：93－8，2001；Cooker etal.，Biol.Reprod.48(6)：1309－19，1993；Gupta，G.S.，Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.34(6)：361－85，1999)。

采用RT－PCR试验进行表达分析，其中使用引物对(5’－TGCCGTAGGCATGGCTTGTGC－3’,5’－CAACATCTGAGACACCATTCC－3’)，所述引物对不会交叉扩增相关的和遍在表达的同工酶LDH A和LDH B,且以先前被描述为具有睾丸特异性的LDH C原型序列NM_017448为基础，RT－PCR证实了根据本发明在全部受试的正常组织中无表达，而证明了在于肿瘤的情况下获取的体细胞中消除了该抗原的严谨的转录抑制；参照表1。正如关于CT基因的经典描述，LDH C在很多肿瘤体中表达。

表1.LDHC在肿瘤中的表达

组织	测试总数	阳性数	％
				黑素瘤	16	7	44
乳癌	20	7	35
				结肠直肠肿瘤	20	3	15
前列腺癌	8	3	38
				支气管癌	17	8	47
肾细胞癌	7	4	57
				卵巢癌	7	3	43
甲状腺癌	4	1	25
				宫颈癌	6	5	83
黑素瘤细胞系	8	5	63
				支气管癌细胞系	6	2	33

采用上述PCR引物，扩增产物的预期大小是824bp。然而，根据本发明，在肿瘤中观察到多个额外条带的扩增，而在睾丸中则未观测到。由于这表示存在着选择性剪接变体，故采用LDH－C特异性引物(5’－TAGCGCCTCAACTGTCGTTGG－3’，5’－CAACATCTGAGACACCATTCC－3’)扩增完整开放阅读框，并对独立全长克隆进行测序。所述LDHC序列的原型ORF(SEQ ID NO：1)和染色体11上的基因组序列的比对分析证实其它剪接变体(SEQ ID NO：2－5)。选择性剪接结果导致外显子3(SEQ ID NO：2)、两个外显子3和4(SEQ IDNO：3)、外显子3、6和7(SEQ ID NO：4)或外显子7(SEQ ID NO：5)的缺失(参照图.2)。

这些新剪接变体仅在肿瘤中产生，而不在睾丸中产生。选择性剪接引起阅读框的改变，从而导致编码SEQ ID NO：7－13中所示氨基酸序列的新的可能ORF(SEQ ID NO：7的ORF：SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的59－214位核苷酸；SEQ ID NO：8的ORF：SEQ ID NO：2的289－939位核苷酸；SEQ ID NO：9的ORF：SEQ ID NO：3的59－196位核苷酸；SEQ ID NO：10的ORF：SEQ ID NO：3的535－765位核苷酸；SEQ ID NO：11的ORF：SEQ ID NO：4的289－618位核苷酸；SEQ ID NO：12的ORF：SEQ ID NO：4的497－697位核苷酸；SEQ ID NO：13的ORF：SEQ IDNO：5的59－784位核苷酸)(图.2，3)。除过早终止外，使用选择性起始密码子也是可行的，因此所编码的蛋白质可能同时在N－末端和C－末端被截断。

SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10显示了原型蛋白质的截断部分，SEQ ID NO：7、SEQID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13的蛋白质序列也被改变，并仅包含肿瘤特异性表位(图.3中粗体字显示)。能导致肿瘤特异性表位的肽区如下述(由移码形成的严格的肿瘤特异性部分用下划线标出)：

SEQ ID NO：14：GAVGMACAISILLKITVYLQTPE(来自SEQ ID NO：7)

SEQ ID NO：15：GAVGMACAISILLKWIF(来自SEQ ID NO：9)

SEQ ID NO：16：GWIIGEHGDSSGIIWNKRRTLSQYPLCLGAEWCLRCCEN(来自SEQ ID NO：11)

SEQ ID NO：17：MVGLLENMVILVGLYGIKEELFL(来自SEQ ID NO：12)

SEQ ID NO：18：EHWKNIHKQVIQRDYME(来自SEQ ID NO：13)

这些区可潜在地包含能被T淋巴细胞在MHC I或MHC II分子上所识别并导致严格的肿瘤特异性反应的表位。

并非所有预测的蛋白质都具有用于丙酮酸至乳酸的NADH依赖性代谢的催化性乳酸脱氢酶结构域，所述代谢是无氧糖酵解的最后一步。该结构域(图.3中用方框标出)应对于作为乳酸脱氢酶的酶功能是必需的。进一步的分析，例如采用算法如TMpred和pSORT(Nakai&Kanehisa，1992)，预测了推定蛋白质的不同亚细胞定位。

根据本发明，表达水平通过使用特异性引物－样品组的实时PCR进行定量。扩增子存在于外显子1和外显子2间的连接处并由此检测全部变体(SEQ ID NO：1－5)。这些试验也未在除睾丸外的正常组织中检测到任何转录本。它们证实了在肿瘤中显著的表达水平(图.4)。

根据本发明通过从最远N－末端区MSTVKEQLIEKLIEDDENSQ(SEQ ID NO：80)选择肽而制备LDHC特异性多克隆抗体。借助于该肽在兔子中制备LDHC特异性抗体。对蛋白质表达的后续试验证实了LDHC在睾丸和多种肿瘤中的选择性表达。另外，按照本发明的免疫组织化学试验揭示了LDHC和细胞色素C氧化酶在线粒体中的显著的共区域化。这显示出LDHC在肿瘤的呼吸链中发挥重要作用。

实施例2：新肿瘤抗原TPTE的鉴定

TPTE转录本序列(SEQ ID NO：19)和其翻译产物序列(SEQ ID NO：22)已公开于GenBank中，其登录号为NM_013315(Walker，S.M.et al.，Biochem.J.360(Pt 2)：277－83，2001；Guipponi M.et al.，Hum.Genet.107(2)：127－31，2000；Chen H.et al.，Hum.Genet.105(5)：399－409，1999)。TPTE已被描述为编码可能的跨膜酪氨酸磷酸酶的基因，其睾丸特异性表达位于染色体21、13、15、22和Y的着丝粒周围区域(Chen，H.et al.，Hum.Genet.105：399－409，1999)。按照本发明的对比研究还揭示了染色体3和7上的同源基因组序列。

根据本发明，根据TPTE序列(SEQ ID NO：19)制备PCR引物(5’－TGGATGTCACTCTCATCCTTG－3’和5’－CCATAGTTCCTGTTCTATCTG－3’)并用于多种人类组织中的RT－PCR分析(95℃15分钟；94℃1分钟；63℃1分钟；72℃1分钟；35个循环)。正常组织中表达的发现仅限于睾丸中。如对其它eCT所述，根据本发明TPTE变体显示出在多种肿瘤组织中被异位激活；参照表2。根据本发明，鉴定了在睾丸组织和肿瘤中表达的且具有移码并因此具有改变的序列区的其它TPTE剪接变体(SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：54、SEQID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57)(图.5)。

表2.TPTE在肿瘤中的表达

组织	测试总数	阳性数	％
				黑素瘤	18	9	50
乳癌	20	4	20
				结肠直肠肿瘤	20	0	0
前列腺癌	8	3	38
				支气管癌	23	9	39
肾细胞癌	7	0	0
				卵巢癌	7	2	29
甲状腺癌	4	0	0
				宫颈癌	6	1	17
黑素瘤细胞系	8	4	50
				支气管癌细胞系	6	2	33
乳癌细胞系	5	4	80

TPTE基因组序列包括24个外显子(登录号NT_029430)。SEQ ID NO：19中所描述的转录本包括所有这些外显子。SEQ ID NO：20中所描述的剪接变体通过剪除外显子7制备。SEQ ID NO：21中所描述的剪接变体显示了外显子15下游内含子的部分掺入。如变体SEQ IDNO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57所示，还可能选择性地剪接掉外显子18、19、20和21。

这些选择性剪接结果导致所编码蛋白质的改变，而基本上保留了阅读框(图.6)。例如，由SEQ ID NO：20中所述序列编码的翻译产物(SEQ ID NO：23)与SEQ ID NO：22中所述序列相比缺失了13个氨基酸。由SEQ ID NO：21中所述序列编码的翻译产物(SEQ ID NO：24)在分子中心区含有额外的插入并由此与其它变体存在14个氨基酸左右的不同。

变体SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57的翻译产物即蛋白质SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61同样被改变。

对于功能区域的预测的分析显示了对于SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ IDNO：24、SEQ ID NO：58、SED ID NO：60存在而对于SEQ ID NO：59，SEQ ID NO：61不存在酪氨酸磷酸酶结构域。对所有变体，预测了3－4个跨膜区(图.6)。

采用特异性抗体对TPTE抗原表达的分析证实了在睾丸和多种肿瘤中的选择性表达。共区域化实验还揭示了根据本发明TPTE与I类免疫球蛋白一起位于肿瘤细胞表面。以前，TPTE仅被描述为高尔基体－相关蛋白质。由于TPTE在肿瘤细胞表面的表达，该肿瘤抗原根据本发明适于作为用于形成诊断性和治疗性单克隆抗体的重要的靶位。由于预测的TPTE的膜拓扑学，故根据本发明胞外暴露区特别适于本目的。根据本发明，其包括肽FTDSKLYIPLEYRS(SEQ ID NO：81)和FDIKLLRNIPRWT(SEQ ID NO：82)。另外，TPTE显示出促进肿瘤细胞的迁移。为实现该目的，用“Boyden chamber”迁移试验对在真核启动子的控制下用TPTE转染的肿瘤细胞和对照细胞进行研究，以便确定它们是否表现出定向迁移。此处TPTE转染的细胞根据本发明在4个独立试验中显著地(3倍)增加了迁移。这些功能性数据显示出TPTE在肿瘤转移中发挥重要作用。因此，根据本发明抑制肿瘤细胞中内源TPTE活性的方法，例如通过采用表达载体或逆转录病毒而使用反义RNA、不同的RNA干扰(RNAi)方法以及通过使用小分子，可导致转移的降低，因此在治疗上具有非常重要的意义。最近对酪氨酸磷酸酶PTEN建立了肿瘤中磷酸酶活性和转移的增加和转移灶形成的增加间的因果关系(Iijima和Devreotes，Cell 109：599－610，2002)。

实施例3：新肿瘤抗原TSBP的鉴定

根据本发明使用的电子克隆方法生成TSBP(SEQ ID NO：29)和来源于其的蛋白质(SEQ ID NO：30)。该基因先前被描述为是睾丸特异性调节的(登录号NM_006781)。该基因被预测为编码碱性蛋白质并位于染色体6上靠近编码MHC复合物的序列(C6Orf10)的位置(Stammers M.et al.，Immunogenetics 51(4－5)：373－82，2000)。根据本发明，前述序列是不正确的。本发明的序列明显不同于已知序列。根据本发明，克隆3个不同的剪接变体。图7中描述了根据本发明发现的TSBP变体的核苷酸序列(SEQ ID NO：31，SEQ ID NO：32，SEQID NO：33)与已知序列(NM_006781，SEQ ID NO：29)的差异(差异用粗体字显示)。其导致移码因此由根据本发明发现的TSBP变体所编码的蛋白质(SEQ ID NO：34，SEQ ID NO：35，SEQID NO：36)基本上不同于前述蛋白质(SEQ ID NO：30)(图.8)。

根据本发明，证实了该抗原在正常组织中是严格转录抑制的(PCR引物5’－TCTAGCACTGTCTCGATCAAG－3’和5’－TGTCCTCTTGGTACATCTGAC－3’)。然而，在所研究的25个正常组织中，除了睾丸外，TSBP还在正常淋巴结组织中表达。根据本发明，在肿瘤中还检测到TSBP的异位激活，因此其能够作为肿瘤标记物或肿瘤相关抗原(表3)。

虽然在原发肿瘤组织中发现TSBP表达，但在相应肿瘤体的永久细胞系中未发现表达。而且，所述基因直接与Notch 4相邻，所述Notch4在动脉中特异性表达并与血管形成相关。这些明显地提示所述基因可作为特异性内皮细胞地标记物。因此，TSBP可作为肿瘤内皮和新生血管靶向的潜在性标记物。

因此，所述TSBP启动子可克隆至另一需要在淋巴结中的选择性表达的基因产物。

采用特异性抗体的TSBP抗原表达的分析证实了所述蛋白质在睾丸和淋巴结中以及在黑素瘤和支气管癌中的选择性定位。另外，使用GFP标记的TSBP的免疫组织学研究揭示了显著的核周的积累。

表3.TSBP在肿瘤中的表达

组织	测试总数	阳性数	％
				黑素瘤	12	2	16
乳癌	15	0	－
				结肠直肠肿瘤	15	0	－
前列腺癌	8	0	－
				支气管癌	7	17	41
肾细胞癌	7	0	－
				卵巢癌	7	0	－
甲状腺癌	4	0	－
				宫颈癌	6	0	－
黑素瘤细胞系	8	0	－
				支气管癌细胞系	6	0	－

实施例4：新肿瘤抗原MS4A12的鉴定

MS4A12(SEQ ID NO：37，登录号NM_017716)和其翻译产物(SEQ ID NO：38)先前被描述为与B细胞特异性抗原CD20、造血细胞特异性蛋白质HTm4和高亲和性IgE受体的β链有关的多基因家族成员。所有家族成员的特征在于其至少四个潜在跨膜区以及C末端和N末端均是细胞质的(Liang Y.et al.，Immunogenetics 53(5)：357－68，2001；Liang Y.&Tedder，Genomics 72(2)：119－27，2001)。根据本发明，对MS4A12实施RT－PCR实验。根据公开的MS4A12序列(NM_017716)选择引物(有义：CTGTGTCAGCATCCAAGGAGC，反义：TTCACCTTTGCCAGCATG TAG)。在所检测的组织中，仅在睾丸、结肠(6/8)和结肠直肠癌(colon－Ca’s)(16/20)中以及在结肠转移灶(12/15)中检测到表达(图.9)。

结肠转移灶中的高生成率使得TSBP可作为有意义的诊断靶位和治疗靶位。根据本发明，包含蛋白质序列GVAGQDYWAVLSGKG(SEQ ID NO：83)的预测的细胞外区特别适于产生单克隆抗体和小化学抑制剂。根据本发明，在细胞膜上的MS4A12蛋白质的细胞内定位还通过使用质膜标记物而在共聚焦免疫荧光法中的荧光叠加得以证实。

表4.MS4A12在正常组织中和结肠直肠癌和转移中的表达

回肠	+
		结肠	+
肝	－
		肺	－
淋巴结	－
		胃	－
脾	－
		肾上腺	－
肾	－
		食管	－
卵巢	－
		直肠	+
睾丸	+
		胸腺	－
皮肤	－
		乳房	－
胰腺	－
		PBMC	－
PBMC act.	－
		前列腺	－
甲状腺	－
		输卵管	－
子宫	－
		大脑	－
小脑	－
		结肠直肠肿瘤	16/20
结肠直肠肿瘤转移	12/15

因此，MS4A12是正常结肠上皮的位于细胞膜的分化抗原，其还在结肠直肠肿瘤和转移中表达。

实施例5：新肿瘤抗原BRCO1的鉴定

先前没有关于BRCO1和其翻译产物的描述。本发明的数据挖掘方法生成EST(已表达序列标志)AI668620。实施采用特异性引物(有义：CTTGCTCTGAGTCATCAGATG，反义：CACAGAATATGAGCCATACAG)的RT－PCR研究用于表达分析。根据本发明，在睾丸组织中且还在正常乳腺中发现特异性表达(表5)。在所有其它组织中，该抗原在转录上受抑制。该现象同样在乳腺肿瘤发现(20/20)。与在正常乳腺组织中的表达相比，BRCO1在乳腺肿瘤中明显过表达(图.10)。

采用EST重叠群(掺入下述EST：AW137203、BF327792、BF327797、BE069044、BF330665)，通过电子全长克隆根据本发明克隆超过1500bp的该转录本(SEQ ID NO：39)。该序列绘图于染色体10p11－12。在该相同区中，在直接靠近的位置，乳腺分化抗厚NY－BR－1的基因在这之前已经被公开(NM_052997；Jager，D.et al.，Cancer Res.61(5)：2055－61，2001)。

表5.BRCO1在正常组织和乳腺肿瘤中的表达

回肠	－
		结肠	－
肝	－
		肺	－
淋巴结	－
		胃	－
脾	－
		肾上腺	－
肾	－
		食管	－
卵巢	－

直肠	－
		睾丸	+
胸腺	－
		皮肤	－
乳房	+
		胰腺	－
PBMC	－
		PBMC act.	－
前列腺	－
		甲状腺	－
输卵管	－
		子宫	－
大脑	－
		小脑	－
乳癌	++(20/20)

配对研究(乳癌和邻近正常组织)显示出与正常组织相比BRCO1在70％的乳癌中过表达。

因此，BRCO1是一种新的正常乳腺上皮的分化抗原，其在乳腺肿瘤中过表达。

实施例6：新肿瘤抗原TPX1的鉴定

TPX1的序列(登录号NM 003296；SEQ ID NO：40)和其翻译产物的序列(SEQ ID NO：41)是已知的。该抗原先前被描述为仅具有睾丸特异性，其是精子的外周纤维和顶体的元件。以前，将粘附分子在精子与支持细胞的附着中的作用归功于所述抗原(o’Bryan，M.K.etal.，Mol.Reprod.Dev.58(1)：116－25，2001；Maeda，T.et al.，Dev.Growth Differ.41(6)：715－22，1999)。本发明首次揭示了，TPX1在实体肿瘤中的异常表达(表6)。由于TPX1和嗜中性粒细胞特异性基质糖蛋白SGP 28间显著的氨基酸同源性(Kjeldsen et al.，FEBSLett380：246－259，1996)，含有肽SREVTTNAQR(SEQ ID NO：84)的TPX1特异性蛋白质序列根据本发明适于制备诊断性和治疗性分子。

表6.TPX1在肿瘤中的表达

组织	测试总数	阳性数	％
				黑素瘤	16	1	6
乳癌	20	3	15
				结肠直肠肿瘤	20	0	0
前列腺癌	8	3	37
				支气管癌	17	2	11
肾细胞癌	7	1	14
				卵巢癌	7	1	14
甲状腺癌	4	0	0
				宫颈癌	6	1	16
黑素瘤细胞系	8	2	25
				支气管癌细胞系	6	1	16

实施例7：新肿瘤基因产物BRCO2的鉴定

先前没有关于BROC2和其翻译产物的描述。本发明的方法生成EST(已表达序列标志)BE069341、BF330573和AA601511。实施采用特异性引物(有义：AGACATGGCTCAGATGTGCAG，反义：GGAAATTAGCAAGGCTCTCGC)的RT－PCR研究而用于表达分析。根据本发明，在睾丸组织中且还在正常乳腺中发现了特异性表达(表7)。在全部其它组织中，该基因产物在转录上受抑制。其同样在乳腺肿瘤中检测到。使用EST重叠群(掺入下述EST：BF330573、AL044891和AA601511)，通过电子全长克隆根据本发明克隆1300bp的该转录本(SEQ ID 62)。该序列绘图于染色体10p11－12。在该相同区中，在直接靠近的位置，乳腺分化基因产物NY－BR－1的基因在这之前已经被公开(NM 052997；Jager，D.et al.，Cancer Res.61(5)：2055－61，2001)，而实施例6中的上述BRCO1位于此处。更进一步的基因分析揭示出根据本发明SEQ IDNO：62所列的序列代表NY－BR－1基因的3’端非翻译区，这之前没有公开过该序列。

表7.BRCO2在正常组织和乳腺肿瘤中的表达

组织	表达
		睾丸	+
乳腺	+
		皮肤	－
肝	－
		前列腺	－
胸腺	－
		脑	－
肺	－
		淋巴结	－
脾	－
		肾上腺	－
卵巢	－
		白细胞	－
结肠	－
		食管	－
子宫	－
		骨骼肌	－
附睾	－
		膀胱	－
肾	－
		乳癌	+

BRCO2是一种正常乳腺上皮的新的分化基因产物，其还在乳腺肿瘤中表达。

实施例8：新肿瘤基因产物PCSC的鉴定

先前没有关于PCSC(SEQ ID NO：63)和其翻译产物的描述。本发明的数据挖掘方法生成EST(已表达序列标志)BF064073。实施使用特异性引物(有义：TCAGGTATTCCCTGCTCTTAC，反义：TGGGCAATTCTCTCAGGCTTG)的RT－PCR研究用于表达分析。根据本发明，在正常结肠和结肠癌中检测到特异性表达(表5)。在全部其它组织中，该基因产物在转录上受到抑制。PCSC编码两个推定的ORF(SEQ ID 64和SEQ ID 65)。SEQ ID 64的序列分析揭示了与CXC细胞因子的结构同源性。此外，克隆了4个选择性PCSC cDNA片段(SEQID NO：85－88)。在此，根据本发明，每个cDNA均包含3个编码SEQ ID NO：89－100中所示多肽的推定的ORF。

表8：PCSC在正常组织和结肠直肠癌中的表达

回肠	+
		结肠	+
肝	－
		肺	－
淋巴结	－
		胃	－
脾	－
		肾上腺	－
肾	－
		食管	－
卵巢	－
		直肠	+
睾丸	－
		胸腺	－
皮肤	－
		乳腺	－

胰腺	－
		PBMC	－
PBMC act.	－
		前列腺	－
甲状腺	－
		输卵管	－
子宫	－
		大脑	－
小脑	－
		结肠直肠肿瘤	19/20
结肠直肠肿瘤转移	15/15

故此，PCSC是正常结肠上皮的分化抗原，其也在结肠直肠肿瘤和全部所研究的结肠转移中表达。根据本发明，在全部结肠直肠转移灶中检测到PCSC的表达使得该肿瘤抗原成为用于转移性结肠肿瘤的预防和治疗的非常令人感兴趣的靶。

实施例9：新肿瘤抗原SGY－1的鉴定

SGY－1转录本的序列(SEQ ID NO：70)和其翻译产物的序列(SEQ ID NO：71)已公开于GenBank中，其登录号是AF177398(Krupnik et al.，Gene 238，301－313，1999)。Soggy－1先前被描述为能作为Wnt蛋白家族的抑制剂和拮抗剂的Dickkopf蛋白家族成员。而该Wnt蛋白质依次在胚胎发育中发挥重要功能。根据SGY－1的序列(SEQ ID NO：70)，根据本发明制备PCR引物(5’－CTCCTATCCATGATGCTGACG－3’和5’－CCTGAGGATGTACAGTAAGTG－3’)，并用于多种人类组织中的RT－PCR分析(95℃15分钟；94℃1分钟；63℃1分钟；72℃1分钟；35个循环)。显示为正常组织中的表达仅限于睾丸。如对其它eCT所述，根据本发明SGY－1显示出在多种肿瘤组织中被异位激活；参照表9。

表9.肿瘤中SGY－1的表达

组织	测试总数	阳性数	％
				黑素瘤	16	4	25
乳癌	20	4	20
				结肠直肠肿瘤	20	0	0
前列腺癌	8	1	13
				支气管癌	32	3	18
肾细胞癌	7	0	0
				卵巢癌	7	4	57
甲状腺癌	4	0	0
				宫颈癌	6	2	33
黑素瘤细胞系	8	2	25
				支气管癌细胞系	6	2	33
乳癌细胞系

实施例10：新肿瘤抗原MORC的鉴定

MORC转录本的序列(SEQ ID NO：74)和其翻译产物的序列(SEQ ID NO：75)已公开于GenBank中，其登录号为XM_037008(Inoue et al.，Hum Mol Genet.Jul；8(7)：1201－7，1999)。

MORC最先被描述为参与精子生成。小鼠系统中该蛋白质的突变导致生殖腺发育不全。

根据MORC的序列(SEQ ID NO：74)，根据本发明制备PCR引物(5’－CTGAGTATCAGCTACCATCAG－3’和5’－TCTGTAGTCCTTCACATATCG－3’)并用于多种人类组织中的RT－PCR分析(95℃15分钟；94℃1分钟；63℃1分钟；72℃1分钟；35个循环)。显示为正常组织中的表达仅限于睾丸。如对其它eCT所述，根据本发明MORC显示出在多种肿瘤组织中被异位激活：参照表10。

表10.肿瘤中MORC的表达

Claims (31)

1.一种检测肿瘤相关抗原TPTE的表达或异常表达的试剂盒，所述试剂盒包括用于下列检测的试剂

(i)检测编码所述肿瘤相关抗原TPTE的核酸或其部分，

(ii)检测所述肿瘤相关抗原TPTE或其部分，

(iii)检测与所述肿瘤相关抗原TPTE或其部分结合的抗体，和/或

(iv)检测对于所述肿瘤相关抗原TPTE或其部分和MHC分子间复合物特异性的T细胞，

所述肿瘤相关抗原TPTE具有由具有选自下组的核酸序列的核酸编码的序列：SEQ IDNO 20、21和54－57。

2.根据权利要求1的试剂盒，其中所述检测包括

(i)将生物样品与试剂接触，所述试剂特异性地与编码所述肿瘤相关抗原TPTE的核酸或其部分、与所述肿瘤相关抗原TPTE或其部分、与所述抗体或者与所述T细胞结合，和

(ii)检测所述试剂和所述核酸或其部分、所述肿瘤相关抗原或其部分、所述抗体或者所述T细胞之间复合物的形成。

3.根据权利要求1的试剂盒，其包含与所述核酸或其所述部分特异性杂交的多核苷酸探针，用以检测所述核酸或其部分。

4.根据权利要求3的试剂盒，其中所述多核苷酸探针包括来自编码所述肿瘤相关抗原TPTE的核酸的6－50个连续核苷酸的序列。

5.根据权利要求1的试剂盒，其中所述核酸或其部分通过选择性扩增所述核酸或其所述部分来进行检测。

6.根据权利要求1的试剂盒，其中待检测的所述肿瘤相关抗原TPTE或其部分处于与MHC分子的复合物中。

7.根据权利要求6的试剂盒，其中所述MHC分子是HLA分子。

8.根据权利要求1-2和6-7任一项的试剂盒，其包含与所述肿瘤相关抗原TPTE或其所述部分特异性结合的抗体，用以检测所述肿瘤相关抗原TPTE或其部分。

9.根据权利要求1或2的试剂盒，其包含与所述抗体特异性结合的蛋白质或肽，用以检测所述抗体。

10.根据权利要求3或4的试剂盒，其中所述多核苷酸探针以可检测的方式被标记。

11.根据权利要求8的试剂盒，其中所述抗体以可检测的方式被标记。

12.根据权利要求9的试剂盒，其中所述蛋白或肽以可检测的方式被标记。

13.根据权利要求10的试剂盒，其中所述可检测的标记物是放射性标记物或酶标记物。

14.根据权利要求11的试剂盒，其中所述可检测的标记物是放射性标记物或酶标记物。

15.根据权利要求12的试剂盒，其中所述可检测的标记物是放射性标记物或酶标记物。

16.根据权利要求8的试剂盒，其中所述抗体是单克隆抗体、嵌合抗体或人源化抗体或者抗体的片段。

17.与TPTE特异性结合的试剂，所述TPTE由具有选自下组的核酸序列的核酸编码：SEQID NO 20、21和54－57，其中所述试剂为抗体。

18.根据权利要求17的试剂，其中所述抗体是单克隆抗体、嵌合抗体或人源化抗体或者抗体的片段。

19.选择性结合下组复合物的抗体：

(i)TPTE或其部分，和

(ii)与所述TPTE或其所述部分结合的MHC分子的复合物，

其中所述抗体不与(i)或(ii)单独结合，且所述TPTE由具有选自下组的核酸序列的核酸编码：SEQ ID NO 20、21和54－57，

其中所述部分包含TPTE的至少6个连续氨基酸残基，并且所述部分对于TPTE是特异性的。

20.根据权利要求19的抗体，其中所述TPTE包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：23、24、58－61、81和82。

21.根据权利要求19或20的抗体，所述抗体是单克隆抗体、嵌合抗体或人源化抗体或者抗体的片段。

22.与

(i)肿瘤相关抗原TPTE或其部分，或

(ii)编码肿瘤相关抗原TPTE的核酸或其部分，

特异性结合的试剂在制造用于诊断或监测疾病的药物组合物中的用途，所述疾病的特征是在分离自患者的生物样品中表达或异常表达所述肿瘤相关抗原TPTE，

所述肿瘤相关抗原TPTE具有由具有选自下组的核酸序列的核酸编码的序列：SEQ IDNO 20、21和54－57。

23.根据权利要求22的用途，其中特异性结合编码肿瘤相关抗原TPTE的核酸或其部分的试剂是与所述核酸或其所述部分特异性杂交的多核苷酸探针。

24.根据权利要求22的用途，其中特异性结合肿瘤相关抗原TPTE或其部分的试剂是特异性结合所述肿瘤相关抗原TPTE或其所述部分的抗体。

25.根据权利要求24的用途，其中所述抗体是单克隆抗体、嵌合抗体或人源化抗体或者抗体的片段。

26.根据权利要求22至24任一项的用途，其中所述肿瘤相关抗原TPTE包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：23、24、58－61、81和82。

27.结合肿瘤相关抗原TPTE或其部分并与诊断试剂偶联的抗体在制造用于诊断或监测疾病的药物组合物中的用途，所述疾病的特征是表达或异常表达所述肿瘤相关抗原TPTE，

所述肿瘤相关抗原TPTE具有由具有选自下组的核酸序列的核酸编码的序列：SEQ IDNO 20、21和54－57。

28.根据权利要求27的用途，其中所述抗体是单克隆抗体、嵌合抗体或人源化抗体或者抗体的片段。

29.根据权利要求27或28的用途，其中所述肿瘤相关抗原TPTE包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：23、24、58－61、81和82。

30.结合TPTE或其部分并与诊断试剂偶联的抗体在制造用于诊断或监测转移性肿瘤的药物组合物中的用途，所述转移性肿瘤的特征是表达或异常表达TPTE，其中所述TPTE具有由具有选自下组的核酸序列的核酸编码的序列：SEQ ID NO 20、21和54－57。

31.根据权利要求30的用途，其中所述抗体是单克隆抗体、嵌合抗体或人源化抗体或者抗体的片段。