CN105343936A - 一种plcl三维多孔支架、plcl-col复合支架及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明适用于生物医学领域，提供了一种左旋乳酸-己内酯共聚物(PLCL)三维多孔支架、PLCL与胶原(PLCL-COL)复合支架及其制备方法。所述PLCL三维多孔支架的制备方法，采用低温沉积制造技术，具体包括以下步骤：通过CAD软件进行建模预处理、Aurora软件进行分层切片，并使用Cark软件设计PLCL三维多孔支架的打印参数；将PLCL溶于有机溶剂中制备PLCL匀浆液；待成型室温度降至-25～-35℃时，在成型平台涂抹所述有机溶剂，使用所述Cark软件设置造型参数后开始打印造型得到PLCL三维多孔支架预制件；将所述PLCL三维多孔支架预制件取出后进行冷冻干燥处理，得到PLCL三维多孔支架。

Description

一种PLCL三维多孔支架、PLCL-COL复合支架及其制备方法

技术领域

本发明属于生物医学领域，尤其涉及一种PLCL三维多孔支架、PLCL-COL复合支架及其制备方法。

背景技术

各种创伤、运动损伤、骨病等原因造成的关节软骨缺损临床较常见，由于软骨细胞分裂增殖能力相对较弱、缺乏营养血管等因素，关节软骨修复一直是临床面临的难题。软骨缺损经常导致关节退行性变，最终形成骨性关节炎，表现为关节活动疼痛、受限，影响人的生活质量。近年来出现的软骨组织工程有望解决这一问题。

支架作为软骨组织工程的三大核心之一，可临时作为细胞外基质(ECM)，提供种子细胞形成组织前赖以生存的支架环境，为细胞在体内外的增殖、分化、营养交换、新陈代谢及细胞外基质分泌等生理活动提供空间场所和支撑。目前生物支架材料为研究热点，根据生物材料的差异，可分为天然高分子材料，人工合成高分子材料和复合材料。天然高分子材料可从生物组织中提取获得，包括胶原、明胶、琼脂、纤维蛋白、壳聚糖、糖胺多糖(透明质酸、硫酸软骨素)等。天然高分子材料生物相容性良好，毒性较小，可在体内完全降解且降解产物易被人体吸收而不产生炎症反应；但其降解速率不可控，力学强度相对较弱。人工合成高分子材料包括无机合成材料和有机合成材料。无机合成材料包括磷酸三钙、纳米羟基磷灰石等陶瓷类材料，有机合成材料则以聚乳酸、聚羟基乙酸、聚己内酯和它们的共聚物为主。人工高分子材料一般具有良好的生物相容性，可控的降解速率，良好的力学性能及可塑性，但其亲水性不够、对细胞粘附性较差、酸性降解产物可引起炎症反应，并具有一定的免疫原性。复合材料，包括天然复合材料、人工复合材料、天然与人工复合材料，可弥补各自材料的不足，制造具备多种材料优点的复合材料，是支架研究的热点。人工合成高分子材料，生物相容性良好，降解速率可控，具有良好的力学性能及可塑性，但其亲水性不够，影响细胞的黏附。

左旋乳酸-己内酯共聚物(PLCL)作为一种合成高分子化合物，凭着良好的生物相容性和机械性能等优点，已应用于外科可吸收缝线、人造血管等领域。然而，由于传统的软骨支架制备方法(包括溶剂浇铸/粒子沥滤技术(盐析法)、相分离/冻干技术、水凝胶技术、气体发泡技术、静电纺丝技术等)不仅成型步骤繁琐、耗时长，支架孔径、孔隙率不可控，难以实现支架的个体化制作要求；而且得到的PLCL表面疏水性较强，细胞黏附性较差，限制其在软骨组织工程的应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种PLCL三维多孔支架的制备方法，旨在解决PLCL由于表面疏水性较强、细胞黏附性较差限制其在软骨组织工程中的应用、且不适于采用低温快速成型技术制备支架的问题。

本发明的另一目的在于提供一种PLCL三维多孔支架。

本发明的又一目的在于提供PLCL-COL复合支架的制备方法，已解决PLCL材料由于表面疏水性较强、细胞黏附性较差限制其在软骨组织工程中的应用、且不适于采用低温快速成型技术制备支架的的问题。

本发明的再一目的在于提供PLCL-COL复合支架。

本发明是这样实现的，一种PLCL三维多孔支架的制备方法，所述PLCL三维多孔支架采用低温沉积制造技术制备获得，具体包括以下步骤：

通过CAD软件进行建模预处理、Aurora软件进行分层切片，并使用Cark软件设计PLCL三维多孔支架的打印参数；

将PLCL溶于有机溶剂中制备PLCL匀浆液；

待成型室温度降至-25～-35℃时，在成型平台涂抹所述有机溶剂，使用所述Cark软件设置造型参数后开始打印造型得到PLCL三维多孔支架预制件；

将所述PLCL三维多孔支架预制件取出后进行冷冻干燥处理，得到PLCL三维多孔支架。

相应的，一种由上述方法制备获得的PLCL三维多孔支架。

以及，一种PLCL-COL复合支架的制备方法，包括以下步骤：

提供上述方法制备的PLCL三维多孔支架；

将所述PLCL三维多孔支架置于质量百分含量为0.1-0.3％的NaOH溶液中进行第一浸泡处理，取出后采用蒸馏水浸泡、漂洗，得到第一样品；

将所述第一样品置于胶原溶液中进行第二浸泡处理，取出后采用蒸馏水浸泡、漂洗，得到PLCL-COL复合支架预制件；

将所述PLCL-COL复合支架预制件进行冷冻干燥处理，制备得到PLCL-COL复合支架。

相应的，一种由上述方法制备获得的PLCL-COL复合支架。

本发明提供的PLCL三维多孔支架的制备方法，通过LDM技术打印实现，具有良好的三维立体结构和孔隙率，可望用于软骨组织工程中的理想支架。

本发明提供的PLCL-COL复合支架，通过对所述PLCL三维多孔支架进行NaOH处理、复合胶原，构建PLCL-COL复合支架用于软骨组织工程。首先，选用PLCL这种弹性、生物可降解材料更符合软骨的生物力学性能要求，并可通过加入两种原材料的比例调节支架的性能；其次，选用LDM技术打印三维多孔立体支架，实现支架孔径、孔隙率的可控，更符合支架材料的个体化和生物学制备；再次，通过NaOH改善支架的亲水性并复合胶原，更有利于细胞在支架的黏附、增殖等活动。由此得到的PLCL-COL复合支架，可明显改善支架的亲水性、细胞黏附及增殖活动，弥补了PLCL和COL各自性能不足、并发挥两种材料的优势，可望用于软骨组织工程中的理想支架。

附图说明

图1是本发明实施例提供的PLCL三维多孔支架结构示意图；

图2是本发明实施例提供的PLCL三维多孔支架、PLCL-COL复合支架、PLCL碱处理支架电镜扫描图；

图3是本发明实施例提供的PLCL三维多孔支架、PLCL-COL复合支架的应力-应变图；

图4是本发明实施例提供的PLCL三维多孔支架、COL、PLCL-COL复合支架红外检测图；

图5是本发明实施例提供的软骨细胞传代培养显微镜图；

图6是本发明实施例提供的甲苯胺蓝染色结果图；

图7是本发明实施例提供的胶原免疫荧光图；

图8是本发明实施例提供的RT-PCR检测各代软骨细胞基因表达结果图；

图9是本发明实施例提供的细胞增殖实验结果图。

具体实施方式

为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

左旋乳酸-己内酯共聚物(PLCL)，由左旋乳酸和己内酯聚合而成，具有良好的生物相容性和力学性能，可通过调节两者加料比例来控制其降解速率，降解受酸碱影响相对较小，已应用于外科可吸收缝线等领域，可望用于构建理想的软骨支架。PLCL生物相容性、力学性能良好，可塑性高，孔隙率高，降解速率可控，但亲水型较差。胶原蛋白，生物相容性、亲水性良好，抗原性低，但力学性能较差，降解速率不可控。支架制备工艺的不同直接影响着支架孔径和孔隙率，进而影响支架的力学性能和细胞在支架上的黏附、分化、增殖等活动。具有高孔隙率和相互连接孔隙的支架结构更有利于细胞的增殖，因而合适孔径和高孔隙率是支架的重要评估标准。随着制备技术的发展，软骨支架制备经历从传统制备到计算机辅助技术的过渡。不同支架的制备方法各有优劣，需根据不同的支架材料及修复目的合理的进行选择。

而当前计算机辅助设计(CAD)的快速成型(RP)技术能更好地解决上述问题。RP技术又称固体自由成型技术，采用离散/堆积成型原理，先用计算机设计出三维立体模型，再通过分层把三维模型变成多个二维平面，此为材料的离散过程；将分层数据处理，设计加工参数后，在计算机控制下以平面加工的形式有序、连续地加工每一层，最后“层叠层”地粘结叠加成三维立体模型，即材料的堆积过程。RP技术成型简便，支架孔径、孔隙率可控，更符合软骨支架的个体化制造和生产要求。RP技术主要两大类，即基于激光设备的快速成型工艺和基于喷射-挤出的快速成型工艺，包括选择性激光烧结(SLS)、立体光刻造型(SLA)、分层实体制造(LOM)，后者包括熔融沉积制造(FDM)、三维打印(3DP)、低温沉积制造(LDM)等。

有鉴于此，本发明实施例提供了一种PLCL三维多孔支架的制备方法，所述PLCL三维多孔支架采用低温沉积制造技术制备获得，具体包括以下步骤：

S01.通过CAD软件进行建模预处理、Aurora软件进行分层切片，并使用Cark软件设计PLCL三维多孔支架的打印参数；

S02.将PLCL溶于有机溶剂中制备PLCL匀浆液；

S03.待成型室温度降至-25～-35℃时，在成型平台涂抹所述有机溶剂，使用所述Cark软件设置造型参数后开始打印造型得到PLCL三维多孔支架预制件；

S04.将所述PLCL三维多孔支架预制件取出后进行冷冻干燥处理，得到PLCL三维多孔支架。

低温沉积制造(LDM)技术，又称低温快速成型技术，是计算机辅助下结合传统的相分离技术形成的新型工艺，由清华大学激光快速成型研究中心首先提出。支架大孔(100～500μm)可通过计算机控制喷头的扫描、挤出/喷出活动而实现，而微孔(10μm)则产生于溶剂在冷冻干燥过程中升华，从而产生微孔结构。与其他快速成型工艺一样，LDM技术可通过计算机辅助设计支架外观及孔径大小，避免传统成型工艺支架孔径(200μm以下)的限制，实现植入物的个体化制造。此外，低温下成型，避免其他RP技术(FDM、SLS等)在热相变过程对高分子材料的破坏，并可对非均质材料进行支架制备。相比基于激光设备的成型工艺，LDM操作简单，设备廉价，运行成本较低，因而在组织工程支架制备中具有广阔的前景。有鉴于此，本发明实施例采用低温沉积制造技术制备所述PLCL三维多孔支架。

上述步骤S01中，采用计算机辅助建模、分层及堆积。具体的，先通过所述CAD软件建模预处理，产生一个STL文件格式的模型；然后利用Aurora软件导入所述STL文件并对其进行分层切片，生成一个CLI文件；最后利用低温快速成型系统的Cark软件打开CLI文件，设计支架的打印参数并打印。

上述步骤S02中，为了获得分散均匀的PLCL支架，需要在配置支架材料的过程中尽量保持所述PLCL的均匀性。具体的，将PLCL溶于有机溶剂中后置入磁性搅拌子、并用塑料薄膜封口，于磁力搅拌器充分搅拌成匀浆溶液。作为优选实施例，所述有机溶剂为1，4-二氧六环。作为进一步优选实施例，所述PLCL匀浆液中，所述PLCL的重量百分含量为8-10％。

在配置所述PLCL匀浆液之前或配置同时，可进行机器组件的连接与准备。具体的，可依次连接料罐、送料管、喷头，将配置好的所述PLCL匀浆液倒入所述料罐内，进行冷却处理，准备成型。所述冷却处理可以采用冰箱制冷实现。

上述步骤S03中，在计算机辅助下将所述PLCL匀浆液低温沉积制造平台上。具体的，待成型室温度降至-25～-35℃，启动温控、数控，打开Cark软件并初始化系统，载入CLI后，平移CLI图形至理想的打印位置。通过控制面板调整喷头与载物平台间的距离(对高)，设置造型参数(扫描速度、喷头基础速度等)并开始造型。

作为优选实施例，在沉积所述PLCL匀浆液之前，还包括在成型平台涂抹一层配置所述所述PLCL匀浆液的有机溶剂。所述有机溶剂优选为1，4-二氧六环。

作为另一个优选实施例，所述造型参数设置为：支架规格为2.4×2.4×2.4cm³，成型温度-25～-35℃，喷嘴直径0.4mm，喷丝间距1.0mm，扫描速度15～30mm/s，喷头速度1.0～2.0mm/s。

本发明实施例中，在启动造型后，喷嘴按所述CLI文件设置的运动轨迹及所述造型参数在X、Y轴上进行扫描并挤压喷出匀浆，匀浆在成型室迅速凝固，随着喷头运动而实现二维层面的打印；当扫描到下一层，成型平台在Z轴上下降一定高度，喷嘴继续进行下一二维层面的打印；各个二位层面叠加形成一个三维多孔的支架。

上述步骤S04中，造型完毕后，将成型的所述PLCL三维多孔支架预制件从成型平台上取出后进行冷冻干燥处理，作为优选实施例，所述冷冻干燥处理采用冷冻干燥机进行真空干燥实现，干燥时间可根据实际情况控制。具体的，在所述冷冻干燥机在抽真空的状态下干燥48小时，干燥过程中，固化的所述有机溶剂如1，4-二氧六环升华，与支架发生气固相分离，以产生微孔及实现支架的常温保存。

进一步的，本发明实施例还可以对得到的所述PLCL三维多孔支架进行消毒处理，所述消毒方法具体优选为：将所述PLCL三维多孔支架置于75％酒精中浸泡消毒60min，然后使用冷冻干燥机干燥后无菌密闭，置于-20℃冰箱备用。

本发明实施例提供的PLCL三维多孔支架的制备方法，通过LDM技术打印实现，具有良好的三维立体结构和孔隙率，可望用于软骨组织工程中的理想支架。

相应的，本发明实施例还提供了一种由上述方法制备获得的PLCL三维多孔支架。

以及，本发明实施例提供了一种PLCL-COL复合支架的制备方法，包括以下步骤：

Q01.提供上述方法制备的PLCL三维多孔支架；

Q02.将所述PLCL三维多孔支架置于质量百分含量为0.1-0.3的NaOH溶液中进行第一浸泡处理，取出后采用蒸馏水浸泡、漂洗，得到第一样品；

Q03.将所述第一样品置于胶原溶液中进行第二浸泡处理，取出后采用蒸馏水浸泡、漂洗，得到PLCL-COL复合支架预制件；

Q04.将所述PLCL-COL复合支架预制件进行冷冻干燥处理，制备得到PLCL-COL复合支架。

本发明实施例中，所述PLCL-COL复合支架是左旋乳酸-己内酯共聚物(PLCL)与胶原(COL)的复合支架。具体的，上述步骤Q01中，所述PLCL三维多孔支架的制备方法如上所述，为了节约篇幅，此处不再赘述。

上述步骤Q02中，将所述PLCL三维多孔支架置于质量百分含量为0.1-0.3％的NaOH溶液中进行第一浸泡处理，可以提高下述胶原的吸收和提高细胞黏附。所述NaOH溶液优选为NaOH的乙醇溶液。作为具体实施例，取所述PLCL三维多孔支架，放置于0.2％NaOH乙醇溶液中10min，取出后蒸馏水浸泡、漂洗。

上述步骤Q03中，胶原蛋白，作为天然高分子，是细胞外基质的主要成分，可维持组织器官的形态与功能，具有良好的生物相容性和可降解性，可被应用到组织损伤修复中。

本发明实施例中，将所述第一样品置于胶原溶液中进行第二浸泡处理，其中，所述胶原溶液为I型或II型胶原的醋酸溶液，且所述胶原溶液的质量体积百分比为0.1-0.5％。作为具体实施例，将所述第一样品置于0.5％胶原溶液(0.5g胶原蛋白溶于100mL0.3％醋酸溶液)4小时，蒸馏水浸泡、漂洗多余的胶原溶液。

通过所述NaOH处理PCL支架并表面复合I型胶原发现NaOH可以增加聚合物表面的亲水性，提高I型胶原吸收和提高细胞黏附，而I型胶原表面覆盖可进一步增加细胞的黏附和增殖。

上述步骤Q04中，作为优选实施例，所述冷冻干燥处理采用冷冻干燥机进行真空干燥实现，干燥时间可根据实际情况控制。

进一步的，本发明实施例还可以对得到的所述PLCL-COL复合支架进行消毒处理，所述消毒方法具体优选为：将所述PLCL-COL复合支架置于75％酒精中浸泡消毒60min，然后使用冷冻干燥机干燥后无菌密闭，置于-20℃冰箱备用。

相应的，本发明实施例还提供了一种由上述方法制备获得的PLCL-COL复合支架。

本发明实施例提供的PLCL-COL复合支架，通过对所述PLCL三维多孔支架进行NaOH处理、复合胶原，构建PLCL-COL复合支架用于软骨组织工程。首先，选用PLCL这种弹性、生物可降解材料更符合软骨的生物力学性能要求，并可通过加入两种原材料的比例调节支架的性能；其次，选用LDM技术打印三维多孔立体支架，实现支架孔径、孔隙率的可控，更符合支架材料的个体化和生物学制备；再次，通过NaOH改善支架的亲水性并复合胶原，更有利于细胞在支架的黏附、增殖等活动。由此PLCL、胶原蛋白组合得到的PLCL-COL复合支架，可明显改善支架的亲水性、细胞黏附及增殖活动，弥补了PLCL和COL各自性能不足、并发挥两种材料的优势，可望用于软骨组织工程中的理想支架。

下面结合具体实施例进行说明。

实施例1

一种PLCL三维多孔支架的制备方法，所述PLCL三维多孔支架采用低温沉积制造技术制备获得，具体包括以下步骤：

S11.计算机辅助下支架的建模、分层及堆积：首先通过CAD软件建模预处理，产生一个STL文件格式的模型；然后利用Aurora软件导入所述STL文件并对其进行分层切片，生成一个CLI文件；最后利用低温快速成型系统的Cark软件打开CLI文件，设计支架的打印参数并打印。通过CAD软件进行建模预处理、Aurora软件进行分层切片，并使用Cark软件设计PLCL三维多孔支架的打印参数；

S12.在烧杯中加入高精度电子天平准确称量的PLCL及一定量的1，4-二氧六环中，使配制的PLCL溶液浓度为10wt％，置入磁性搅拌子，塑料薄膜封口，于磁力搅拌器充分搅拌成PLCL匀浆液以备用；依次连接料罐、送料管、喷头，将所述PLCL匀浆液倒入料罐内，冰箱制冷，准备成型。

S13.待成型室温度降至-25～-35℃时，启动温控、数控，打开Cark软件并初始化系统，载入CLI后，平移CLI图形至理想的打印位置，在成型平台均匀涂抹一层1，4-二氧六环，通过控制面板调整喷头与载物平台间的距离(对高)，设置造型参数(扫描速度、喷头基础速度等)并开始造型。在启动造型后，喷嘴按所述CLI文件设置的运动轨迹及所述造型参数在X、Y轴上进行扫描并挤压喷出匀浆，匀浆在成型室迅速凝固，随着喷头运动而实现二维层面的打印；当扫描到下一层，成型平台在Z轴上下降一定高度，喷嘴继续进行下一二维层面的打印；各个二位层面叠加形成PLCL三维多孔支架预制件。其中，所述成型参数如下：支架规格为2.4×2.4×2.4cm3，成型温度-25～-35℃，喷嘴直径0.4mm，喷丝间距1.0mm，扫描速度15～30mm/s，喷头速度1.0～2.0mm/s。

S14.造型完毕后，将成型的所述PLCL三维多孔支架预制件从成型平台上取出后放置到冷冻干燥机48小时，在抽真空的状态下，固化的1，4-二氧六环有机溶剂升华，与支架发生气固相分离，以产生微孔及实现支架的常温保存，由此得到PLCL三维多孔支架。

实施例2

一种PLCL-COL复合支架的制备方法，包括以下步骤：

Q21.提供上述方法制备的PLCL三维多孔支架；

Q22.将所述PLCL三维多孔支架放置于0.2％NaOH乙醇溶液中10min，取出后蒸馏水浸泡、漂洗，得到第一样品；

Q23.将所述第一样品置于0.5％胶原溶液(0.5g胶原蛋白溶于100mL0.3％醋酸溶液)4小时，蒸馏水浸泡、漂洗多余的胶原溶液，得到PLCL-COL复合支架预制件；

Q24.将所述PLCL-COL复合支架预制件进行冷冻干燥处理，制备得到PLCL-COL复合支架。

对比例1

将所述PLCL三维多孔支架参照上述实施例2的方法置于0.2％的NaOH乙醇溶液中10min，取出后蒸馏水浸泡、漂洗，进行冷冻干燥处理，制备得到PLCL碱处理支架。

将上述实施例1、实施例2、对比例1制备的PLCL三维多孔支架、PLCL-COL复合支架、PLCL碱处理支架进行性能测试。

1、支架物理性能检测

1.1孔径大小测试：

方法：取PLCL三维多孔支架、PLCL-COL复合支架、PLCL碱处理支架，溅射仪表面喷金后，用电子扫描电镜分别扫描观察支架的横断面、侧面及内侧面，排除部分闭塞、边缘不整孔径后，用ImageJ软件测量截面孔径及微孔的大小。

结果：所述PLCL三维多孔支架结构如附图1所示，其中a、b为PLCL三维多孔支架，c、d为PLCL三维多孔支架根据实验要求切割成不同大小的形状。肉眼观察可见PLCLL三维多孔支架呈三维立体多孔结构，孔分布较规则有序呈网格状。由于打印过程中，打印头、推进速度和冷冻等因素，致使部分孔闭塞及出现裂痕，打印支架规格为1.9*1.9*1.9cm³(设计打印规格为2.4*2.4*2.4cm³)，较设计规格缩小。支架质地柔韧有弹性，按压后可迅速恢复原形。通过打孔器和手动切割，可以把支架处理形状成尺寸不等的支架，便于对支架进行检测和进一步应用。

所述PLCL三维多孔支架、PLCL-COL复合支架、PLCL碱处理支架电镜扫描图如附图2所示，其中，a、b、c、d为PLCL三维多孔支架，e、f、g、h为碱处理后支架，i、j、k、l为PLCL-COL支架。由图可见，所述PLCL三维多孔支架表面布满类圆形大孔，孔径分布较均匀，大孔周围的打印丝上布满微孔结构。所述PLCL碱处理支架较PLCL三维多孔支架其大体形状未有明显改变，电镜观察微观结构，发现表面更毛糙，表面可见更多许多细小凹陷。所述PLCL-COL复合支架表面和内部均可见胶原膜覆盖，大孔表面较圆滑，尖锐棱角明显减少，部分胶原覆盖不良，孔径闭塞。PLCL三维多孔支架大孔为533.65±82.78um，微孔为9.52±2.59um；PLCL碱处理支架大孔为526.41±68.11um，微孔为9.46±2.80um，PLCL-COL复合支架大孔为445.13±141.05um，微孔为6.95±1.47um。PLCL三维多孔支架与PLCL碱处理支架间孔径、微孔间无统计学差异(p>0.05)，PLCL-COL复合支架与PLCL三维多孔支架、PLCL碱处理支架间孔径、微孔有统计学差异(p<0.05)。

1.2支架孔隙率测定

方法：采用液体取代法测定所述PLCL三维多孔支架、PLCL-COL复合支架的支架孔隙率。先将待测样品切割成数个小长方体(n＝5)，并放入再将支架置入盛有体积为V2的乙醇的量筒中，抽真空至支架不再冒出气泡，测量此时量筒读数为V3，则支架的孔隙率ρ(％)＝(V1+V2－V3)/V1。

结果：支架孔隙率(％)检测结果如下表1所示。

表1

组别	Ⅰ	Ⅱ	Ⅲ	Ⅳ	Ⅴ	均数	标准差
								PLCL	85.65	85.75	87.47	89.58	85.19	86.73	1.81
PLCL-COL	84.32	83.64	85.97	86.75	82.73	84.68	1.66

由上表1可见，所述PLCL三维多孔支架支架孔隙率为86.73±1.81％，所述PLCL-COL复合支架支架孔隙率为84.68±1.66％，两组间无显著性差异(p>0.05)。

1.3支架亲水率检测

方法：将所述PLCL三维多孔支架、PLCL-COL复合支架切割成0.9×0.9×0.9cm³大小并称出其重量W1(n＝4)，浸泡到蒸馏水中，3d后将支架取出并用滤纸吸干表面水分，称其重量为W2，则支架材料的亲水率＝(W2-W1)/W2×100％。

结果：支架亲水率(％)检测结果如下表2所示。

表2

组别	Ⅰ	Ⅱ	Ⅲ	Ⅳ	均数	标准差
							PLCL	48.19	54.40	53.18	52.38	52.04	2.69
PLCL-COL	63.82	67.07	67.39	69.39	66.92	2.30

由上表2可见，所述PLCL三维多孔支架支架亲水率为52.04±2.69％，所述PLCL-COL复合支架支架亲水率为66.92±2.30％，两组间有显著性差异(p<0.05)，胶原蛋白的加入显著改善了合成材料支架的亲水性能。

1.4支架的力学检测

方法：使用深圳清华研究生院电子万能材料试验机测定所述PLCL三维多孔支架、PLCL-COL复合支架的抗压强度及弹性模量。将支架切割成0.9×0.9×0.9cm³立方体(n＝4)，采用100N载荷，加载速度为1mm/min，测得两组支架的抗压强度，并计算支架的弹性模量。

结果：所述PLCL三维多孔支架、PLCL-COL复合支架的力学性能测试结果如下表3所示，其应力-应变图如图3所示。

表3

由表3及图3可见，未处理和处理组经过抗压缩检测得到的应力-应变曲线均呈现典型的多孔材料抗压曲线，随压缩应变的增加，压缩应力也随之急剧增加。通过应力-应变曲线，计算得到PLCL三维多孔支架支架杨氏模量为0.3206±0.0455MPa，PLCL-COL复合支架支架杨氏模量为0.2066±0.0512MPa，两组间差异有统计学意义(p<0.05)，这是由于强碱处理，使材料的表面发生水解，降低了支架的力学性能。PLCL三维多孔支架压缩70％时的抗压强度为0.2947±0.0776MPa，PLCL-COL复合支架压缩70％时的抗压强度为0.1944±0.0466MPa，两组间差异无统计学意义(p>0.05)。

1.5红外检测(FTIR)

方法：使用傅立叶变换红外光谱仪对PLCL三维多孔支架、COL、PLCL-COL复合支架进行检测，观察化学基团吸收峰的变化。

结果：对所述PLCL三维多孔支架、COL、PLCL-COL复合支架红外检测图如图4所示。由图可见，PLCL三维多孔支架在1754cm^-1处有可见特征性吸收峰，为C＝O伸缩振动吸收形成，表明其内含酯键；COL在红外光谱中的1550cm^-1及1650cm^-1处有较强吸收峰，分别为酰胺I、酰胺II的吸收峰。上述三种吸收峰均可在PLCL-COL红外光谱中看到，但COL的酰胺I、酰胺II吸收峰明显减弱，这可能与胶原溶液浓度较低、胶原与支架部分复合不良等因素有关。

2.细胞支架复合培养，检测细胞在支架上的黏附、增殖活性

2.1兔软骨细胞分离、培养与鉴定

2.1.1软骨细胞分离与培养

取6周龄新西兰大白兔(Oryctolaguscuniculus)，耳缘静脉注射3％戊巴比妥钠溶液全身麻醉后，在无菌条件下取膝关节非负重区关节软骨，PBS溶液漂洗后切成软骨小块，置入10mL离心管，加入5mL胶原酶溶液，37℃下用恒温振荡器振荡6～8小时，100μm细胞滤网过滤后取滤液，1000r/min离心10min，弃上清，沉淀细胞加入软骨细胞培养基溶液制成细胞悬液，接种到25cm²细胞培养瓶。每3天换液1次，每天观察细胞生长情况，并随时照相记录细胞生长情况。

2.1.2软骨细胞传代

当软骨细胞生长至布满镜下90％视野时，进行细胞传代。培养瓶加入生理盐水冲洗后，加入400ul含0.25％胰蛋白酶-EDTA溶液，轻轻震荡瓶壁，倒置相差显微镜下观察见贴壁软骨细胞脱壁并变圆悬浮，培养瓶中加入含10％FBS的软骨细胞培养基停止消化，吸管轻吹打瓶壁使细胞完全脱落并悬浮混匀，吸取瓶中含软骨细胞的培养液至新的培养瓶中接种。每3天换液1次，观察细胞生长情况，直到细胞布满镜下90％时再进行传代。软骨细胞传代培养显微镜图如图5所示(均为10倍镜下视野，a为P1，6d，b为P1，10d，c为P2，11d，d为P3，18d，e为P4，32d，f为P5，41d)，由图可见，镜下见刚接种的软骨细胞悬浮呈圆球形，24h后细胞贴壁，变为多角形、圆形(原代、第1代、第2代)。原代软骨细胞接种10d后铺满镜下视野的90％后传代，传代的软骨细胞24h内贴壁增殖，经历5～7天可长满镜下90％视野。随传代次数的增加，第3、4、5代软骨细胞逐渐呈梭形，细胞的扩增时间也逐渐延长，分泌能力下降。这表明体外软骨细胞培养逐渐出现去分化现象。

2.1.3软骨细胞的鉴定

①甲苯胺蓝染色

取生长在盖玻片上的第2代软骨细胞进行细胞染色，甲苯胺蓝染色步骤如下：

a.1％甲苯胺蓝溶液配制：1g甲苯胺蓝粉末溶于10mL75％酒精，再取上述溶液1mL溶于10mL1％NaCl(1gNaCl溶于100mL蒸馏水)溶液中，配置成1％甲苯胺蓝溶液；

b.细胞爬片用生理盐水冲洗后用4％多聚甲醛溶液固定1h以上；

c.蒸馏水浸洗细胞爬片10min；

d.细胞爬片置于1％甲苯胺蓝染液2h；

e.90％冲洗细胞爬片，去除多余染料；

f.镜下观察细胞爬片，满意后晾干，树脂封片。

甲苯胺蓝染色结果如图6所示，由图可见，甲苯胺蓝染色显示软骨细胞周围异染性基质。软骨细胞内可见蓝紫色异染颗粒，而细胞周围亦出现少量异染颗粒，表明细胞有糖胺多糖等细胞外基质分泌。第2代软骨细胞呈圆形、多角形。

甲苯胺蓝是一种碱性染料，而糖胺多糖为碱性糖聚合物，与甲苯胺蓝反应时呈异染性。此在实验中观察到，软骨细胞内蓝紫色异染颗粒，而细胞周围有少量异染颗粒出现，表明软骨细胞细胞存在糖胺多糖等细胞外基质分泌。而胶原免疫荧光证实第2、5代软骨细胞内均存在I型、II型胶原，结合甲苯胺蓝染色结果及手术取材部位，可以证实培养的细胞为软骨细胞。软骨细胞体外单层培养存在着去分化现象，即随着传代次数及培养时间的增加，在体外单层培养的软骨细胞失去其原有表型，形态从原代的多角形、圆形逐渐变为类似成纤维细胞样的梭形，这与试验中观察到的软骨细胞形态从原代、第1代、第2代呈多角形、圆形逐渐变为第3、4、5的长梭形相符。与此同时细胞的一系列特征也发生的变化，II型胶原、蛋白多糖、SOX9基因表达减少，I型胶原基因表达增加，上述在实时荧光定量PCR也可观察到。由此，临床软骨组织工程取软骨细胞体外扩增，应尽量在软骨细胞培养到第2代前回植，此时软骨细胞尚保持良好表型。

②胶原免疫荧光染色

分别取第2代，第5代软骨细胞进行I、II型胶原免疫荧光染色，步骤如下：

a.固定：24孔板内培养的软骨细胞，PBS漂洗，吸干水分后滴加适量4％多聚甲醛，室温固定15min；

b.漂洗：PBS漂洗3次，每次5min；

c.封闭：在培养孔板内滴加5％BSA溶液，室温下封闭30min；

d.一抗孵育：用1％BSA稀释一抗(1：50-100)并滴加，4℃过夜；

e.漂洗：PBS漂洗3次，每次5min，吸干水分；

f.二抗孵育：用1％BSA稀释二抗(1：150-300)并滴加，置于37℃避光孵育1h；

g.漂洗：PBS漂洗3次，每次5min，吸干水分；

h.染核：滴入DAPI染核，置于37℃避光孵育10min；

i.观察：在荧光显微镜下分别观察第2代、第5代软骨细胞I、II型胶原表达并照相记录。

胶原免疫荧光如附图7所示(以上均为10倍镜下视野，a，b，c，d为P2，e，f，g，h为P5，a，e为DAPI染核，b，f为I型胶原染色，c，g为II型胶原染色，d，h为核及胶原表达图)，由图可见，软骨细胞核呈蓝色，I型胶原呈红色，II型胶原呈绿色，表明第2、5代软骨细胞均有I型、II型胶原表达。随培养代数的增加，II型胶原的表达逐渐降低，而I型胶原蛋白的表达逐渐增高，这是由于软骨细胞的去分化引起。

③各代软骨细胞实时荧光定量PCR检测

分别取原代软骨组织、第1、2、3、4、5代软骨细胞(布满镜下视野90％时收集)，各加入1mLTrizol总RNA提取液置入EP管，放入-80℃冰箱保存备用。

㈠软骨细胞RNA提取步骤：

a.从-80℃冰箱取出各代软骨细胞并缓慢复温，振荡，裂解(原代软骨组织利用匀浆器完全磨碎)，在各EP管的1mLRNA溶液中加入100μL氯仿(三氯甲烷)；

b.EP管振荡后冰上孵育10min；

c.EP管离心10min(1200r/min，4℃)后取上清液(300～600μL)至另一EP管中；

d.EP管中加入等体积异丙醇并冰上孵育10min；

e.4℃离心(12000r/min，，1r/min)，弃上清；

f.沉淀中加入200μL70％酒精后振荡；

g.再4℃离心(12000r/min，10min)，弃上清，留沉淀；

h.重复f.g步一次，放置EP管，待酒精完全挥发；

i.酒精挥发后，加入DEPC水10μL入EP管中，溶解RNA；

j.测定RNA浓度(A₂₆₀/A₂₈₀)并记录Ct值。

2.1.4转录PCR合成cDNA

提取各代软骨细胞RNA并测定浓度后取一定量RNA至另一EP管中，加入一定量RNaseFreedH₂O、5xgDNABuffer2μL、gDNAEraser1μL，构成10μL体系，将EP管放置到42℃2min后再放置到冰上，再加入去离子水4μL、Buffer21μL、MixI1μL、MIX1μL，共构成20μL体系，放到PCR扩增仪，设置37℃加热15min，85℃加热5s，4℃保存，以完成RNA反转录合成cDNA。

2.1.5RT-PCR检测各代软骨细胞基因表达

检测兔原代软骨组织、第1、2、3、4、5代软骨细胞的ColI、ColII、Sox9、Aggrecan等基因的表达。6个cDNA，每个cDNA重复检测3次，共18次；检测4个基因，共需检测72次。检测方法如下：

按TaKaRa试剂盒说明配置原液，

其中，1个cDNA检测3次，检测4个基因，每孔加入1μL，则每孔共需加入原液19μL(7+0.8+0.8+0.4+10)及1μLcDNA。

在96孔板加样结束后，再将96孔板放入实时荧光定量PCR仪中，实时PCR反应条件为：95℃预变性30s；95℃5S，60℃30S，40个循环；90℃15s；60℃1min。重复3次实验，取平均值，以P₀软骨细胞中ColI、ColII、Sox9、Aggrecan基因的表达量为基准样品(Calibrator)计算相对表达量。

兔引物序列如下表4所示：

表4

RT-PCR检测各代软骨细胞基因表达如图8所示，由图可见，随着传代次数的增加，ColI基因的表达逐渐上升，ColII、Sox9、Aggrecan的基因表达逐渐降低。第2代以内软骨细胞基质分泌可维持较高水平，第3代开始下降并随传代逐渐明显，进一步证明软骨细胞体外单层培养逐渐出现去分化现象。由于第2代以前的软骨细胞保持良好的细胞表型，可用于细胞与支架的复合培养。

2.2兔软骨细胞复合支架培养

将PLCL三维多孔支架、PLCL-COL复合支架裁割为多个直径10.2mm、厚1mm的圆柱形微支架，75％酒精消毒并干燥后放入48孔培养板。再取兔第2代软骨细胞，使用细胞计数分析仪调整细胞密度为5×10⁴/mL，接种细胞悬液至支架材料上，放置于5％CO₂、37℃恒温培养箱。

2.2.1细胞黏附检测

如上所述分别接种细胞到两组支架上并培养，于12h吸出细胞培养基(n＝4)，PBS洗去未黏附细胞，然后每孔加入胰酶将黏附在支架的细胞消化下来，收集并行细胞计数。则细胞黏附率＝黏附细胞数/接种细胞数。支架细胞黏附率(％)结果如下表5所示。

表5

组别	Ⅰ	Ⅱ	Ⅲ	Ⅳ	均数	标准差
							PLCL	45.54	43.25	47.38	46.32	45.62	1.75
PLCL-COL	50.24	52.84	55.26	56.42	53.69	2.74

由表可见，PLCL三维多孔支架支架细胞黏附率为45.62±1.75％，PLCL-COL复合支架孔隙率为53.69±2.74％，两组间相比差异有统计学意义(p<0.05)，胶原蛋白的加入，显著改善了支架的生物相容性，提高了支架的细胞粘附能力。

软骨细胞黏附实验证明细胞在PLCL-COL复合支架组比PLCL三维多孔支架更容易黏附，MTT实验表明细胞在胶原复合支架上生长更好，同时也证明成型过程中的有机溶剂1，4-二氧六环已完全处理干净，支架未见明显的细胞毒性。胶原蛋白的复合极大的改善了支架的生物相容性，有利于软骨细胞的粘附和增殖。

2.2.2细胞增殖检测

采用MMT法检测细胞在支架上的增殖情况。MMT，商品名为噻唑蓝，是一种黄色染料。其检测原理为活细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶可使外源性MMT还原成不溶于水的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中，而活细胞却不能。利用二甲基亚砜(DMSO)溶解此结晶，用酶标仪测定其在490mm波长出的吸光值(OD值)，以反映活细胞数量。此法MMT溶液浓度5mg/ml(0.5gMMT，溶于100mLPBS)。

将上述细胞(接种密度5×10⁴/mL)接种到支架上后，常规观察及更换培养基，在1、3、5、7、10d吸出支架表面的培养基(n＝4)，各孔加入500μL培养基、100μLMTT溶液，在5％CO₂、37℃恒温培养箱继续培养4h。终止培养后吸干支架表面溶剂，每孔加入200μLDMSO，置摇床上振荡10～20min。待结晶物完全溶解后，每孔吸取100ul至96孔板，利用酶标仪测定OD490nm上的吸光值。细胞增殖实验结果图如图9所示。由图可见，接种24h内细胞处于黏附期，可见PLCL-COL复合支架细胞黏附率要高于PLCL三维多孔支架，提示NaOH改性、I型胶原复合后支架更有利于细胞黏附；接种第3-7天，两组细胞呈基本成线性增长，且PLCL-COL复合支架较PLCL三维多孔支架增长更明显；接种7天以后，细胞增长速度放缓，但PLCL-COL复合支架仍高于PLCL三维多孔支架。在两组支架的对照中，细胞增殖有显著性差异(p<0.05)。

本发明实施例实验常用液配制如下：

胶原酶溶液(取0.05g胶原酶粉末溶解于50mLDMEM溶液中，配制成1mg/mL胶原酶溶液)；

软骨细胞培养基(50mL胎牛血清(FBS)、5mL双抗溶液溶解于450mLDMEM/F-12溶液中)；

0.5％I型胶原溶液(0.5gI型胶原蛋白溶于100mL0.3％醋酸溶液，4℃过夜)；

MTT溶液(0.5gMMT溶于100mLPBS，制备成浓度为5mg/mLMMT溶液，-20℃避光保存)。

2.3统计学分析

应用Excel、OriginPro等软件进行数据分析。数据均以均数±标准差表示，组间比较采用独立样品t检验，p值<0.05为统计学有意义。

本发明实施例通过LDM技术成功打印出三维多孔PLCL三维多孔支架，打印尺寸较设计尺寸缩小，部分大孔堵塞，考虑支架在冷冻干燥过程中1，4-二氧六环升华后PLCL材料弹性回缩所致。通过NaOH处理增加PLCL三维多孔支架的亲水性，SEM观察表现为支架表面变毛糙，细小凹陷增加，两组间孔径、微孔大小未见明显变化。但改性组力学性能较未改性组差，表现为杨氏模量下降，而压缩70％时未见明显差异，再与I型胶原溶液复合形成PLCL-COL支架，SEM显示胶原覆盖支架表面及内部，表面变圆滑，棱角减少，FTIR提示PLCL、胶原的特征吸收峰均在复合支架的红外图谱上出现，但胶原的吸收峰明显减弱，结合复合支架较前两组孔径、微孔减少，考虑由胶原浓度较低，部分支架胶原覆盖不良，胶原未完全冲净致胶原支架堵塞等原因引起。PLCL三维多孔支架与PLCL-COL复合支架的孔隙率未见明显差异，而后者亲水性明显优于前者。结合细胞复合实验的结果，可见PLCL-COL复合支架比PLCL三维多孔支架更有利于细胞的黏附与增殖。而两组支架的弹性模量有统计学差异，PLCL三维多孔支架高于PLCL-COL复合支架，原因可能为PLCL-COL复合支架经过NaOH处理导致支架表面水解，受到腐蚀，从而影响其弹性模量。然而，两组支架在压缩70％的抗压强度未见明显差异，原因可能为两组支架均超过弹性屈服阶段(此阶段失去抵抗变性的能力)，处于强化阶段，此阶段材料恢复抵抗变性的能力，因而两者差异不明显。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种PLCL三维多孔支架的制备方法，其特征在于，所述PLCL三维多孔支架采用低温沉积制造技术制备获得，具体包括以下步骤：

通过CAD软件进行建模预处理、Aurora软件进行分层切片，并使用Cark软件设计PLCL三维多孔支架的打印参数；

将PLCL溶于有机溶剂中制备PLCL匀浆液；

待成型室温度降至-25～-35℃时，在成型平台涂抹所述有机溶剂，使用所述Cark软件设置造型参数后开始打印造型得到PLCL三维多孔支架预制件；

将所述PLCL三维多孔支架预制件取出后进行冷冻干燥处理，得到PLCL三维多孔支架。

2.如权利要求1所述的PLCL三维多孔支架的制备方法，其特征在于，所述造型参数设置为：支架规格为2.4×2.4×2.4cm³，成型温度-25～-35℃，喷嘴直径0.4mm，喷丝间距1.0mm，扫描速度15～30mm/s，喷头速度1.0～2.0mm/s。

3.如权利要求1所述的PLCL三维多孔支架的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂为1，4-二氧六环。

4.如权利要求1-3任一所述的PLCL三维多孔支架的制备方法，其特征在于，所述PLCL匀浆液中，PLCL的重量百分含量为8-10％。

5.一种由权利要求1-4任一所述方法制备获得的PLCL三维多孔支架。

6.一种PLCL-COL复合支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

提供上述权利要求1-4所述方法制备的PLCL三维多孔支架；

将所述PLCL三维多孔支架置于质量百分含量为0.1-0.3％的NaOH溶液中进行第一浸泡处理，取出后采用蒸馏水浸泡、漂洗，得到第一样品；

将所述第一样品置于胶原溶液中进行第二浸泡处理，取出后采用蒸馏水浸泡、漂洗，得到PLCL-COL复合支架预制件；

将所述PLCL-COL复合支架预制件进行冷冻干燥处理，制备得到PLCL-COL复合支架。

7.如权利要求6所述的PLCL-COL复合支架的制备方法，其特征在于，所述胶原溶液为I型或II型胶原的醋酸溶液，且所述胶原溶液的质量体积百分比为0.1-0.5％。

8.如权利要求6所述的PLCL-COL复合支架的制备方法，其特征在于，所述NaOH溶液为NaOH的乙醇溶液。

9.一种由权利要求6-8任一所述方法制备获得的PLCL-COL复合支架。