CN105283549A - 细菌肝素前体-葡萄糖醛酸-5-差向异构酶以及使用其的多糖的制造方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种具有细菌肝素前体-葡萄糖醛酸-5-差向异构酶活性的多肽，以及提供一种制造己糖醛酸残基被异构化的多糖的方法。筛选非洲大蜗牛cDNA文库，得到对作用于N-乙酰基细菌肝素前体的葡萄糖醛酸残基和/或完全脱硫酸化·N-乙酰化肝素的艾杜糖醛酸残基的异构酶即细菌肝素前体-葡萄糖醛酸-5-差向异构酶的多肽进行编码的DNA。在昆虫细胞中表达被该DNA编码的多肽，得到具有细菌肝素前体-葡萄糖醛酸-5-差向异构酶活性的多肽。通过使该多肽与N-乙酰基细菌肝素前体、或完全脱硫酸化·N-乙酰化肝素接触，从而得到己糖醛酸残基被异构化的多糖。
Description
技术领域
本发明涉及一种细菌肝素前体-葡萄糖醛酸-5-差向异构酶(heparosan-glucuronicacid-5-epimerase)。具体而言，本发明涉及一种具有将N-乙酰基细菌肝素前体的葡萄糖醛酸残基异构化为艾杜糖醛酸残基的活性和/或将完全脱硫酸化·N-乙酰化肝素的艾杜糖醛酸残基异构化为葡萄糖醛酸残基的活性的源自非洲大蜗牛的酶；具有该活性的多肽；编码该多肽的核酸、含有该核酸的载体、保持该核酸和/或该载体的宿主细胞、该多肽的制造方法、使用该酶和/或该多肽的己糖醛酸残基被异构化的多糖的制造方法等。
背景技术
本申请的说明书中有使用以下简写符号的情况。
GAG：糖胺聚糖
PG：蛋白多糖
GlcNAc：N-葡糖胺乙酰萄糖胺
GlcNS：N-硫酸化葡糖胺
GlcN：葡糖胺
GlcA：葡萄糖醛酸
IdoA：艾杜糖醛酸
IdoA(2S)：2-O-硫酸化艾杜糖醛酸
HexA：己糖醛酸
aMan：2,5-脱水甘露糖
AS：acharan硫酸(acharansulfate)
ACH：acharan(2-O-脱硫酸化AS)
NAH：N-乙酰基细菌肝素前体
NSH：N-脱乙酰化·N-硫酸化细菌肝素前体
HEP：肝素
CDSNAc-HEP：完全脱硫酸化·N-乙酰化肝素
CDSNS-HEP：完全脱硫酸化·N-再硫酸化肝素
HS：硫酸乙酰肝素
C5-epi：细菌肝素前体-N-硫酸-葡萄糖醛酸-5-差向异构酶
HG-5epi：细菌肝素前体-葡萄糖醛酸-5-差向异构酶
已知AcharanSulfate(AS)是从非洲大蜗牛(Achatinafulica)分离出来的糖胺聚糖(GAG)的一种，为包含下述结构式(1)所示的由GlcNAc和IdoA(2S)构成的二糖(-[4GlcNAcα1-4IdoA(2S)α1]-)进行重复聚合的结构的直链状的GAG(非专利文献1、2)。另外，已知AS具有与作为糖链骨架共同的GAG的肝素(HEP)或硫酸乙酰肝素(HS)相似的生理活性，具体地显示出血管新生抑制活性(非专利文献3)、免疫刺激活性(非专利文献4)、降低血糖活性(非专利文献4)、抗凝血活性(非专利文献5)、抗肿瘤活性(非专利文献6)、幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)的粘附抑制活性(非专利文献7)等。
HEP和HS的生物合成根据对基因敲除小鼠或突变细胞株所表达的糖链结构的解析、或对酶的底物特异性进行评价的实验结果可以明确的是，依次进行包含由GlcNAc和GlcA构成的二糖(-[4GlcNAcα1-4GlcAβ1]-)进行重复聚合的结构的GAG即N-乙酰基细菌肝素前体(NAH)的合成、N-脱乙酰化和N-硫酸化、GlcA残基向IdoA残基的异构化、O-硫酸化(非专利文献8、9)。在这些步骤中，GlcA残基向IdoA残基的异构化通过细菌肝素前体-N-硫酸-葡萄糖醛酸-5-差向异构酶(C5-epi，EC：5.1.3.17)被催化。即，已知有关HEP和HS的生物合成的公知的C5-epi均是以NAH被N-脱乙酰化和被N-硫酸化而生成的GAG即N-脱乙酰化·N-硫酸化细菌肝素前体(NSH)作为底物，而并不是以NAH本身作为底物(非专利文献10～14、专利文献1、2)。
关于非洲大蜗牛，对生物合成蛋白多糖(PG)的酶组进行了全面鉴定的蛋白质组分析，从与已知蛋白的同源性来看，发现了各种生物合成PG的核心蛋白或GAG的酶(非专利文献15)。对于HEP和HS的合成体系而言，发现了推定为NAH的合成酶、N-脱乙酰化/N-硫酸化酶和O-硫酸化酶的蛋白。然而，却没有发现与已知的差向异构酶即C5-epi具有同源性的蛋白质。另外，对于非洲大蜗牛而言，参与AS的生物合成的酶级联还未得以阐明，合成IdoA的酶所作用的底物、通过酶反应而得到的产品是不清楚的。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第1998/048006号小册子
专利文献2：国际公开第2002/046379号小册子
非专利文献
非专利文献1：KimYS,JoYY,ChangIM,ToidaT,ParkY,LinhardtRJ.,JBiolChem.1996May17；271(20)：11750-5.
非专利文献2：KimYS,AhnMY,WuSJ,KimDH,ToidaT,TeeschLM,ParkY,YuG,LinJ,LinhardtRJ.,Glycobiology.1998Sep；8(9)：869-77.
非专利文献3：GhoshAK,HirasawaN,LeeYS,KimYS,ShinKH,RyuN,OhuchiK.,BrJPharmacol.2002Oct；137(4)：441-8.
非专利文献4：ShimJY,LeeYS,JungSH,ChoiHS,ShinKH,KimYS.,ArchPharmRes.2002Dec；25(6)：889-94.
非专利文献5：LiDW,LeeIS,SimJS,ToidaT,LinhardtRJ,KimYS.,ThrombRes.2004；113(1)：67-73.
非专利文献6：JooEJ,YangH,ParkY,ParkNY,ToidaT,LinhardtRJ,KimYS.,JCellBiochem.2010Aug1；110(5)：1272-8.
非专利文献7：SimJS,HahnBS,ImAR,ParkY,ShinJE,BaeEA,KimDH,KimYS.,GlycoconjJ.2011Aug；28(6)：411-8.
非专利文献8：LindahlU,Kusche-GullbergM,KjellenL.,JBiolChem.1998Sep25；273(39)：24979-82.
非专利文献9：EskoJD,LindahlU.,JClinInvest.2001Jul；108(2)：169-73.
非专利文献10：CampbellP,HannessonHH,SandbackD,RodenL,LindahlU,LiJP.,JBiolChem.1994Oct28；269(43)：26953-8.
非专利文献11：LiJ,Hagner-McWhirterA,KjellenL,PalgiJ,JalkanenM,LindahlU.,JBiolChem.1997Oct31；272(44)：28158-63.
非专利文献12：Hagner-McwhirterA,LindahlU,LiJp.,BiochemJ.2000Apr1；347Pt1：69-75.
非专利文献13：LiJP,GongF,ElDarwishK,JalkanenM,LindahlU.,JBiolChem.2001Jun8；276(23)：20069-77.
非专利文献14：CrawfordBE,OlsonSK,EskoJD,PinhalMA.,JBiolChem.2001Jun15；276(24)：21538-43.
非专利文献15：GesteiraTF,Coulson-ThomasVJ,OgataFT,FariasEH,CavalheiroRP,deLimaMA,CunhaGL,NakayasuES,AlmeidaIC,TomaL,NaderHB.,BiochimBiophysActa.2011Dec；1814(12)：1862-9.
发明内容
发明要解决的问题
本发明的问题在于，提供一种细菌肝素前体-葡萄糖醛酸-5-差向异构酶(HG-5epi)。具体而言，本发明的问题在于，提供一种具有将NAH的GlcA残基异构化为IdoA残基的活性和/或将CDSNAc-HEP的IdoA残基异构化为GlcA残基的活性(以下总称为“HG-5epi活性”。)的源自非洲大蜗牛的酶；具有该活性的多肽；编码该多肽的核酸；含有该核酸的载体；保持该核酸和/或该载体的宿主细胞；该多肽的制造方法；使用该酶和/或该多肽的HexA残基被异构化的多糖的制造方法等。
用于解决问题的方案
本发明人等着眼于AS以GlcNAc和IdoA(2S)作为构成成分、且为骨架中不含GlcNS的GAG，认为非洲大蜗牛中存在与参与HEP和HS的生物合成的公知的C5-epi底物特异性完全不同的新型的差向异构酶。即，本发明人等认为在非洲大蜗牛中存在以NAH作为底物的异构酶即HG-5epi，参与AS的生物合成。
本发明人等为了解决上述问题而进行了深入研究，结果发现作为新型异构酶的HG-5epi存在于非洲大蜗牛中，成功地从非洲大蜗牛中分离出对HG-5epi进行编码的DNA，从而完成了本发明。
即，本发明如下示例。
[1]
一种源自非洲大蜗牛的酶，其具有以下的(A)和(B)的特征：
(A)具有将N-乙酰基细菌肝素前体的葡萄糖醛酸残基异构化为艾杜糖醛酸残基的活性和/或将完全脱硫酸化·N-乙酰化肝素的艾杜糖醛酸残基异构化为葡萄糖醛酸残基的活性；
(B)实质上不具有将N-硫酸化细菌肝素前体的葡萄糖醛酸残基异构化为艾杜糖醛酸残基的活性和/或将完全脱硫酸化·N-再硫酸化肝素的艾杜糖醛酸残基异构化为葡萄糖醛酸残基的活性。
[2]
一种多肽，其为选自由以下的(A)～(C)组成的组。
(A)含有以下的(a1)或(a2)的氨基酸序列的多肽，
(a1)序列号2中的氨基酸编号1～601所示的氨基酸序列，
(a2)序列号2中的氨基酸编号34～601所示的氨基酸序列。
(B)含有在前述(A)的多肽的氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加1个或几个氨基酸残基的氨基酸序列，且具有将N-乙酰基细菌肝素前体的葡萄糖醛酸残基异构化为艾杜糖醛酸残基的活性和/或将完全脱硫酸化·N-乙酰化肝素的艾杜糖醛酸残基异构化为葡萄糖醛酸残基的活性的多肽。
(C)含有向前述(A)或(B)的多肽添加了肽标签的融合多肽的氨基酸序列，且具有将N-乙酰基细菌肝素前体的葡萄糖醛酸残基异构化为艾杜糖醛酸残基的活性和/或将完全脱硫酸化·N-乙酰化肝素的艾杜糖醛酸残基异构化为葡萄糖醛酸残基的活性的多肽。
[3]
一种多肽，其具有以下的(A)～(C)的特征。
(A)具有将N-乙酰基细菌肝素前体的葡萄糖醛酸残基异构化为艾杜糖醛酸残基的活性和/或将完全脱硫酸化·N-乙酰化肝素的艾杜糖醛酸残基异构化为葡萄糖醛酸残基的活性。
(B)最适pH为5.5～6.0。
(C)在0.1％(w/v)以上的脱氧胆酸钠的存在下，实质上失去前述活性。
[4]
一种核酸，其对前述酶或前述多肽进行编码。
[5]
一种DNA，其为选自由以下的(A)～(C)组成的组。
(A)含有以下的(a1)或(a2)的碱基序列的DNA，
(a1)序列号1中的碱基编号1～1806所示的碱基序列，
(a2)序列号1中的碱基编号100～1806所示的碱基序列。
(B)与由和前述(A)的DNA互补的碱基序列构成的DNA在严格的条件下杂交，且对具有将N-乙酰基细菌肝素前体的葡萄糖醛酸残基异构化为艾杜糖醛酸残基的活性和/或将完全脱硫酸化·N-乙酰化肝素的艾杜糖醛酸残基异构化为葡萄糖醛酸残基的活性的多肽进行编码的DNA。
(C)含有在前述(A)或(B)的DNA中添加了编码肽标签的DNA的融合DNA的碱基序列，且对具有将N-乙酰基细菌肝素前体的葡萄糖醛酸残基异构化为艾杜糖醛酸残基的活性和/或将完全脱硫酸化·N-乙酰化肝素的艾杜糖醛酸残基异构化为葡萄糖醛酸残基的活性的多肽进行编码的DNA。
[6]
一种载体，其含有前述核酸和/或前述DNA。
[7]
一种宿主细胞，其保持前述核酸、前述DNA和/或前述载体。
[8]
一种多肽的制造方法，其包括以下的(A)和(B)。
(A)使用前述宿主细胞，对具有将N-乙酰基细菌肝素前体的葡萄糖醛酸残基异构化为艾杜糖醛酸残基的活性和/或将完全脱硫酸化·N-乙酰化肝素的艾杜糖醛酸残基异构化为葡萄糖醛酸残基的活性的多肽进行表达的工序。
(B)收集前述(A)的工序中所表达的多肽的工序。
[9]
一种多肽，其是通过前述方法得到的。
[10]
一种己糖醛酸残基被异构化的多糖的制造方法，其包括以下工序：将酶和/或多肽与包含由N-乙酰萄糖胺残基和己糖醛酸残基构成的二糖的多糖接触，所述酶和/或多肽对将具有将N-乙酰基细菌肝素前体的葡萄糖醛酸残基异构化为艾杜糖醛酸残基的活性和/或将完全脱硫酸化·N-乙酰化肝素的艾杜糖醛酸残基异构化为葡萄糖醛酸残基的活性。
[11]
一种己糖醛酸残基被异构化的多糖的制造方法，其包括以下工序：将前述酶和/或前述多肽与包含由N-乙酰萄糖胺残基和己糖醛酸残基构成的二糖的多糖接触。
[12]
一种多糖，其是通过前述方法得到的。
[13]
一种多糖，其含有N-乙酰基细菌肝素前体的葡萄糖醛酸残基被异构化为艾杜糖醛酸残基的结构。
[14]
前述多糖，存在于多糖的骨架中的己糖醛酸残基中的艾杜糖醛酸残基的比率为20％～75％。
附图说明
图1是将进行柱精制而得到的HG-5epi的溶出组分供于在还原条件下的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)而得到的凝胶的CBB染色后的照片。
图2是表示HPLC柱后标记法(postcolumnlabelingmethod)的流程图的图。
图3是表示将NAH或CDSNAc-HEP进行N-脱乙酰化和亚硝酸分解之后、供于HPLC柱后标记法而得到的色谱图的图。
图4是表示将与粗精制HG-5epi接触的NAH进行N-脱乙酰化和亚硝酸分解之后、供于HPLC柱后标记法而得到的色谱图的图。
图5是表示将与粗精制HG-5epi接触的NSH进行亚硝酸分解之后、供于HPLC柱后标记法而得到的色谱图的图。
图6是表示将与HG-5epi接触的NAH进行N-脱乙酰化和亚硝酸分解之后、供于HPLC柱后标记法而得到的色谱图的图。
具体实施方式
(1)本发明的酶
本发明的酶是具有以下的(A)和(B)的特征的源自非洲大蜗牛的酶。
(A)具有将NAH的GlcA残基异构化为IdoA残基的活性和/或将CDSNAc-HEP的IdoA残基异构化为GlcA残基的活性。
(B)实质上不具有将NSH的GlcA残基异构化为IdoA残基的活性和/或将CDSNS-HEP的IdoA残基异构化为GlcA残基的活性。
此处所谓的“源自非洲大蜗牛”是指能够从非洲大蜗牛中取得。
本发明的酶是具有HG-5epi活性的酶。此处所谓的“HG-5epi活性”如上所述，是指将NAH的GlcA残基异构化为IdoA残基的活性和/或将完全脱硫酸化·N-乙酰化肝素(CDSNAc-HEP)的IdoA残基异构化为GlcA残基的活性。HG-5epi活性可通过使用例如后述的<实施例14>、<实施例16>或<实施例17>所述的HPLC柱后标记法的方法进行测定。另外，HG-5epi活性也可通过使用例如后述的<实施例20>或<实施例21>所述的放射性同位素的方法进行测定。具体而言，将NAH的GlcA残基异构化为IdoA残基的活性可根据后述的<实施例14>、<实施例16>、<实施例20>或<实施例21>的方法进行测定。另外，具体而言，将CDSNAc-HEP的IdoA残基异构化为GlcA残基的活性可根据后述的<实施例17>的方法进行测定。
本发明的酶可具有将NAH的GlcA残基异构化为IdoA残基的活性及将CDSNAc-HEP的IdoA残基异构化为GlcA残基的活性的两者，也可仅具有其一者。例如本发明的酶可具有将NAH的GlcA残基异构化为IdoA残基的活性，且实质上不具有将CDSNAc-HEP的IdoA残基异构化为GlcA残基的活性。
NAH是包含由GlcNAc残基和GlcA残基构成的二糖的多糖。CDSNAc-HEP是包含由GlcNAc残基和GlcA残基构成的二糖、及由GlcNAc残基和IdoA残基构成的二糖的多糖。以下也将GlcA和IdoA总称为“HexA”。即，NAH和CDSNAc-HEP均为包含由GlcNAc残基和HexA残基构成的二糖的多糖。
NAH和CDSNAc-HEP是本发明的酶所作用的底物的示例，并不对本发明的酶所作用的底物进行限定。即，本发明的酶只要具有HG-5epi活性，进而，也可具有包含由GlcNAc残基和HexA残基构成的二糖的其它的多糖(NAH和CDSNAc-HEP以外的多糖)中的、对邻接于GlcNAc残基的HexA残基进行异构化的活性。此处所谓的“其它的多糖”，只要为包含由GlcNAc残基和HexA残基构成的二糖的多糖，没有特别限制。此处所谓的“其它的多糖”，更具体而言，为包含由GlcNAc残基和GlcA残基构成的二糖和/或由GlcNAc残基和IdoA残基构成的二糖的多糖。此处所谓的“HexA残基的异构化”是指，从GlcA残基向IdoA残基的异构化和/或从IdoA残基向GlcA残基的异构化。
此处所谓的“由GlcNAc残基和HexA残基构成的二糖”是指，GlcNAc残基和HexA残基连接而成的二糖。此处所谓的“由GlcNAc残基和HexA残基构成的二糖”中的GlcNAc残基和HexA残基的连接的顺序没有限制。作为“由GlcNAc残基和HexA残基构成的二糖”，具体而言，例如可举出下述结构式(2)～(5)所示的二糖。
即，关于本发明的酶，具体而言，例如可为具有将存在于多糖的骨架中的下述结构式(2)所示的由GlcNAc残基和GlcA残基构成的二糖(GlcNAcα1-4GlcA)异构化为下述结构式(3)所示的由GlcNAc残基和IdoA残基构成的二糖(GlcNAcα1-4IdoA)的活性、和/或将存在于多糖的骨架中的下述结构式(3)所示的二糖异构化为下述结构式(2)所示的二糖的活性的酶。
另外，关于本发明的酶，具体而言，例如可为具有将存在于多糖的骨架中的下述结构式(4)所示的由GlcA残基和GlcNAc残基构成的二糖(GlcAβ1-4GlcNAc)异构化为下述结构式(5)所示的由IdoA残基和GlcNAc残基构成的二糖(IdoAα1-4GlcNAc)的活性、和/或将存在于多糖的骨架中的下述结构式(5)所示的二糖异构化为下述结构式(4)所示的二糖的活性的酶。
通过本发明的酶异构化为IdoA残基的GlcA残基在NAH等多糖中的位置没有特别限制。即，关于这样的GlcA残基，包括在NAH等多糖的骨架中有存在于还原末端的情况、存在于非还原末端的情况、存在于多糖的骨架中间部位的情况这3种，可为其中任意情况。
通过本发明的酶异构化为GlcA残基的IdoA残基在CDSNAc-HEP等多糖中的位置没有特别限制。即，关于这样的IdoA残基，在CDSNAc-HEP等多糖的骨架中有存在于还原末端的情况、存在于非还原末端的情况、存在于多糖的骨架中间部位这3种情况，可为其中任意的情况。
另外，本发明的酶为实质上不具有C5-epi活性的酶。此处所谓的“C5-epi活性”是指，将NSH的GlcA残基异构化为IdoA残基的活性和/或将完全脱硫酸化·N-再硫酸化肝素(CDSNS-HEP)的IdoA残基异构化为GlcA残基的活性。C5-epi活性可通过使用例如后述的<实施例15>或<实施例18>所述的HPLC柱后标记法的方法进行测定。具体而言，将NSH的GlcA残基异构化为IdoA残基的活性，可根据后述的<实施例15>的方法进行测定。另外，具体而言，将CDSNS-HEP的IdoA残基异构化为GlcA残基的活性，可根据后述的<实施例18>的方法进行测定。
此处所谓的“实质上不具有活性”是指，在将对应活性的多糖与酶接触前后进行比较的情况下，IdoA含量完全没有变化(增加或减少)、或几乎没有变化(增加或减少)。即，例如“实质上不具有C5-epi活性”是指，在将NSH与酶接触前后进行比较的情况下，IdoA含量完全没有变化(增加或减少)、或几乎没有变化(增加或减少)、和/或在将CDSNS-HEP与酶接触前后进行比较的情况下，IdoA含量完全没有变化(增加或减少)、或几乎没有变化(增加或减少)。
此处所谓的“IdoA含量”是指，存在于多糖的骨架中的HexA残基中的IdoA残基的比率，即，IdoA残基的总数除以HexA残基的总数(GlcA残基的总数与IdoA残基的总数的合计)并进行百分比换算而得的数值。这样的IdoA含量例如可根据后述的<实施例14>、<实施例15>、<实施例16>、<实施例17>或<实施例18>的方法进行测定。因此，此处所谓的“IdoA含量几乎没有变化”是指，例如将与本发明的酶接触前后的多糖分别供于HPLC柱后标记法，在对IdoA含量进行测定并比较的情况下，只发生测定误差程度的变化，具体而言，只发生5％以下、2％以下、1％以下、或0.5％以下的变化(即，酶反应前的IdoA含量为n(％)的情况下，酶反应后的IdoA含量为n-5(％)以上且n+5(％)以下、n-2(％)以上且n+2(％)以下、n-1(％)以上且n+1(％)以下、或n-0.5(％)以上且n+0.5(％)以下)。
某蛋白质是否具有HG-5epi活性可根据后述的<实施例14>、<实施例16>、<实施例17>、<实施例20>或<实施例21>的方法进行判定。另外，某蛋白质是否实质上不具有C5-epi活性可根据后述的<实施例15>或<实施例18>的方法进行判定。因此，只要根据这些方法就可判定源自非洲大蜗牛的任意的蛋白质是否为本发明的酶。
本发明的酶能够从非洲大蜗牛取得。具体而言，例如能够从对非洲大蜗牛的细胞进行破碎而得到的细胞破碎物或细胞提取液中取得本发明的酶。这样的“破碎”可通过根据细胞的种类而适宜选择的方法来实施。作为破碎方法，示例出进行均质化的方法、进行超声波处理的方法、进行冻融的方法、添加表面活性剂的方法等。这些方法可以适宜地进行组合来使用。关于取得本发明的酶的细胞，只要表达本发明的酶就没有特别限制。作为这样的细胞，例如可举出粘液腺的细胞。
本发明的酶的取得可通过用于蛋白质的分离精制的公知方法进行。作为这样的方法，例如可举出硫酸铵沉淀、凝胶过滤层析法、离子交换层析法、疏水相互作用层析法、羟基磷灰石层析法、亲和层析法。这些方法可以适宜地进行组合来使用。
本发明的酶可仅由本发明的酶构成，也可含有本发明的酶以外的成分。作为这样的“本发明的酶以外的成分”，示例出碱金属盐、表面活性剂、缓冲剂、源自非洲大蜗牛的成分等。另外，本发明的酶的形状也没有特别限制，可为液态也可为固态。以液态提供本发明的酶的情况下，既可以冷冻状态提供，也可以液体状态(熔解状态)提供。另外，以固态提供本发明的酶的情况下，示例出冷冻干燥物、作为与琼脂糖微球等结合的固定化酶等的提供。
在本发明的酶中，本发明的酶所占的重量浓度可适宜设定为任意的浓度。在本发明的酶中，关于本发明的酶所占的重量浓度例如可为0.001％以上、0.01％以上、0.1％以上、1％以上、5％以上、10％以上、25％以上或50％以上。另外，在本发明的酶中，关于本发明的酶所占的重量浓度例如可为100％以下、75％以下、50％以下、25％以下、10％以下、5％以下或1％以下。
(2)本发明的多肽
本发明的多肽是具有HG-5epi活性的多肽。本发明的多肽只要是具有HG-5epi活性的多肽，没有特别限制。本发明的多肽的一个方式可为上述的本发明的酶的一个方式。
本发明的多肽例如可为含有特定的氨基酸序列，且具有HG-5epi活性的多肽。
关于本发明的多肽，具体而言，例如可为选自由以下的(A)～(C)组成的组的多肽。
(A)含有以下的(a1)或(a2)的氨基酸序列的多肽。
(a1)序列号2中的氨基酸编号1～601所示的氨基酸序列。
(a2)序列号2中的氨基酸编号34～601所示的氨基酸序列。
(B)含有在上述(A)的多肽的氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加1个或几个氨基酸残基的氨基酸序列，且具有HG-5epi活性的多肽。
(C)含有向上述(A)或(B)的多肽添加了肽标签的融合多肽的氨基酸序列，且具有HG-5epi活性的多肽。
即，作为本发明的多肽可举出以下三个方式。第一方式为含有序列号2中的氨基酸编号1～601或34～601所示的氨基酸序列的多肽。第二方式为含有在第一方式所示的多肽的氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加1个或几个氨基酸残基的氨基酸序列，且具有HG-5epi活性的多肽。第三方式为含有向第一方式或第二方式所示的多肽中添加了肽标签的融合多肽的氨基酸序列、且具有HG-5epi活性的多肽。
需要说明的是，本申请中“含有氨基酸序列”这一表述包括“由该氨基酸序列构成”的情况。
第二方式中所谓的“几个”是指，即使进行取代、缺失、插入和/或添加，也不失去HG-5epi活性的氨基酸残基的数量，例如相对于构成多肽的全部氨基酸残基数可以是优选为10％以下、更优选为5％以下、进而优选为2％以下、特别优选为1％以下的数。
即，由序列号2中的氨基酸编号1～601所示的氨基酸序列构成的多肽的情况下，全部氨基酸数为601，所以“几个”可优选为2～60个、更优选为2～30个、进而优选为2～12个、特别优选为2～6个。另外，由序列号2中的氨基酸编号34～601的氨基酸序列构成的多肽的情况下，全部氨基酸数为568，所以“几个”可优选为2～56个、更优选为2～28个、进而优选为2～11个、特别优选为2～5个。另外，在这些多肽中“几个”可为2个、2～3个、2～4个或2～5个。
第二方式中所谓的“取代、缺失、插入和/或添加”例如为不失去HG-5epi活性的保守性突变。保守性突变的代表例为保守性取代。保守性取代是指，在取代部位为芳香族氨基酸的情况下，在Phe、Trp、Tyr之间进行相互取代的突变，取代部位为疏水性氨基酸的情况下，在Leu、Ile、Val之间进行相互取代的突变，取代部位为极性氨基酸的情况下，在Gln、Asn之间进行相互取代的突变，取代部位为碱基性氨基酸的情况下，在Lys、Arg、His之间进行相互取代的突变，取代部位为酸性氨基酸的情况下，在Asp、Glu之间进行相互取代的突变，取代部位为具有羟基的氨基酸的情况下，在Ser、Thr之间进行相互取代的突变。作为被视为保守性取代的取代，具体而言可举出从Ala向Ser或Thr的取代、从Arg向Gln、His或Lys的取代、从Asn向Glu、Gln、Lys、His或Asp的取代、从Asp向Asn、Glu或Gln的取代、从Cys向Ser或Ala的取代、从Gln向Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg的取代、从Glu向Gly、Asn、Gln、Lys或Asp的取代、从Gly向Pro的取代、从His向Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr的取代、从Ile向Leu、Met、Val或Phe的取代、从Leu向Ile、Met、Val或Phe的取代、从Lys向Asn、Glu、Gln、His或Arg的取代、从Met向Ile、Leu、Val或Phe的取代、从Phe向Trp、Tyr、Met、Ile或Leu的取代、从Ser向Thr或Ala的取代、从Thr向Ser或Ala的取代、从Trp向Phe或Tyr的取代、从Tyr向His、Phe或Trp的取代和从Val向Met、Ile或Leu的取代。
另外，换言之，例如相对于第一方式所示的多肽的氨基酸序列整体，第二方式所示的多肽可为具有优选为90％以上、更优选为95％以上、进而优选为98％以上、特别优选为99％以上的同源性，且具有HG-5epi活性的多肽。需要说明的是，此处所谓的“同源性”(homology)也可是“同一性”(identity)的意思。
第三方式中所谓的“肽标签”是指易于进行蛋白的检测或精制的由氨基酸序列构成的肽。关于此处所谓的“肽标签”的长度和氨基酸序列，只要将该肽标签添加至第一方式或第二方式所示的多肽后的融合多肽不失去HG-5epi活性，就没有特别限制。作为这样的肽标签，示例出FLAG(注册商标)肽(FLAG标签)、6×His肽(His·Tag(注册商标))、c-myc肽(myc标签)、蛋白A、MBP(麦芽糖结合蛋白)、GST(谷胱甘肽-S-转移酶)等，其中优选为FLAG肽(序列号32)。
这样的“肽标签”既可直接添加于第一方式或第二方式所示的多肽，也可经由由任意的氨基酸序列构成的肽接头来添加。此处所谓的“肽接头”的长度和氨基酸序列与肽标签的情况相同，只要添加于第一方式或第二方式所示的多肽后的融合多肽不失去HG-5epi活性，就没有特别限制。作为这样的肽接头，例如可举出N末端侧为天冬酰胺且C末端侧为丝氨酸的二肽、N末端侧为缬氨酸且C末端侧为天冬氨酸的二肽。
另外，这样的“肽标签”既可仅添加至第一方式或第二方式所示的多肽的N末端侧，也可仅添加至C末端侧，也可添加至两末端，其中优选为仅添加至N末端侧。
本发明的多肽是具有HG-5epi活性的多肽。HG-5epi活性的有无例如可根据后述的<实施例14>、<实施例16>、<实施例17>、<实施例20>或<实施例21>的方法进行判定。因此，通过这些方法可选择第二方式或第三方式所示的多肽。即，关于第二方式所示的多肽，例如将HG-5epi活性的有无作为指标，能够从第一方式所示的多肽的氨基酸序列中选择并得到以不失去HG-5epi活性的方式可引入1个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加的部位。另外，关于第三方式所示的多肽，例如将HG-5epi活性的有无作为指标，能够从第一方式或第二方式所示的多肽的氨基酸序列中选择并得到能够以不失去HG-5epi活性的方式添加肽标签的氨基酸序列。
本发明的多肽只要具有HG-5epi活性，进而也可具有对包含由GlcNAc残基和HexA残基构成的二糖的其它的多糖(NAH和CDSNAc-HEP以外的多糖)中的、邻接于GlcNAc残基的HexA残基进行异构化的活性。
本发明的多肽可具有C5-epi活性，也可实质上不具有。C5-epi活性的有无例如可根据后述的<实施例15>或<实施例18>的方法进行判定。
本发明的多肽也可具有HG-5epi活性的最适pH为5.5～6.0这样的特征。最适pH例如可根据后述的<实施例22>所述的方法进行确定。
本发明的多肽也可具有在0.1％(w/v)以上的脱氧胆酸钠的存在下实质上失去HG-5epi活性这样的特征。
本发明的多肽也可具有依赖于碱金属氯化物和/或碱土金属氯化物的浓度而HG-5epi活性降低这样的特征(即，若碱金属氯化物和/或碱土金属氯化物的浓度增大，则HG-5epi活性降低这样的特征)。作为此处所谓的“碱金属氯化物”示例出氯化钠。另外，作为此处所谓的“碱土金属氯化物”示例出氯化镁、氯化钙、氯化锰。该特征可在碱土金属氯化物，其中氯化钙中为显著。另外，具体而言，该特征也可为例如在64mM以上的氯化钙的存在下实质上失去HG-5epi活性这样的特征。
此处所谓的“实质上失去HG-5epi活性”是指，例如在对象物质(脱氧胆酸钠、碱金属氯化物、碱土金属氯化物等)的存在下的HG-5epi活性为对象物质的非存在下的HG-5epi活性的10％以下、5％以下、2％以下或1％以下。
另外，是否实质上失去HG-5epi活性例如可根据使用后述的<实施例23>或<实施例24>所述的放射性同位素的方法进行判定。在此情况下，具体而言，“实质上失去HG-5epi活性”可以是如下意思，即，例如在对象物质(脱氧胆酸钠、碱金属氯化物、碱土金属氯化物等)的存在下使多肽与用3H(氚)取代HexA残基的5位的氢原子的对象多糖(例如[5-3H]NAH)接触，将从接触前后的反应液中去除上述对象多糖(例如[5-3H]NAH)并回收的溶液供于闪烁计数器，在通过HG-5epi活性对上述对象多糖(例如[5-3H]NAH)中的HexA残基被异构化时所产生的3H2O的放射活性进行测定并比较时，测定值(dpm)不存在显著性差异，例如源自接触后的反应液的溶液的测定值是源自接触前的反应液的溶液的测定值的3倍以下的数值。此处所谓的“[5-3H]NAH”例如可根据后述的<实施例19>的方法进行制备。
本发明的多肽只要具有HG-5epi活性的多肽，不限于含有第一方式～第三方式所示的特定的氨基酸序列的多肽。本发明的多肽可为例如具有HG-5epi活性，且具有上述示例的特征的1者或其以上的多肽。
具体而言，关于本发明的多肽例如可为具有以下的(A)～(C)的特征的多肽。
(A)具有HG-5epi活性。
(B)最适pH为5.5～6.0。
(C)在0.1％(w/v)以上的脱氧胆酸钠的存在下实质上失去HG-5epi活性。
这样的多肽进而可具有上述示例的特征的1者或其以上。即，这样的多肽例如也可具有包含由GlcNAc残基和HexA残基构成的二糖的其它的多糖(NAH和CDSNAc-HEP以外的多糖)中的、对邻接于GlcNAc残基的HexA残基进行异构化的活性。另外，这样的多肽例如可具有C5-epi活性，也可实质上不具有。另外，这样的多肽例如可具有碱金属氯化物和/或碱土金属氯化物的浓度依存性活性降低这样的特征。
本发明的多肽例如可通过使用后述的本发明的宿主细胞，根据基因工程学的方法进行制备。作为这样的“基因工程学的方法”，示例出后述的<实施例6>～<实施例13>所述的使用昆虫细胞的方法。
(3)本发明的核酸
本发明的核酸为对本发明的酶或本发明的多肽进行编码的核酸。需要说明的是，如上所述，本发明的多肽的一个方式可为上述的本发明的酶的一个方式。因此，本发明的核酸的一个方式可为对本发明的酶进行编码的核酸。本发明的核酸只要对本发明的多肽进行编码，就没有特别限制。对于本发明的核酸只要对本发明的多肽进行编码而言，包含由基因密码的简并所致的不同的碱基序列所构成的所有的核酸。
此处所谓的“核酸”中包含DNA和RNA。另外，本发明的核酸既可为双链也可为单链，双链的情况也可为由DNA和RNA构成的杂交链。进而，本发明的核酸只要对本发明的多肽进行编码即可，可为在对本发明的多肽进行编码的区域内含有内含子的序列的核酸，也可为在对本发明的多肽进行编码的区域内不含内含子的序列的核酸。作为本发明的核酸，例如可举出源自非洲大蜗牛的mRNA(mRNA前体或成熟mRNA)、由mRNA通过逆转录反应而合成的cDNA。另外，本发明的核酸可为分离的核酸。
本发明的核酸例如可为含有特定的碱基序列、且对具有HG-5epi活性的多肽进行编码的核酸。
具体而言，本发明的核酸例如可为选自由以下的(A)～(C)组成的组中的DNA。
(A)含有以下的(a1)或(a2)的碱基序列的DNA。
(a1)序列号1中的碱基编号1～1806所示的碱基序列。
(a2)序列号1中的碱基编号100～1806所示的碱基序列。
(B)与由和上述(A)的DNA互补的碱基序列构成的DNA在严格的条件下杂交，且对具有HG-5epi活性的多肽进行编码的DNA。
(C)含有在上述(A)或(B)的DNA中添加了编码肽标签的DNA的融合DNA的碱基序列，且对具有HG-5epi活性的多肽进行编码的DNA。
即，作为本发明的核酸，可举出以下三个方式。第一方式为含有序列号1中的碱基编号1～1806或100～1806所示的碱基序列的DNA。第二方式为与由和第一方式所示的DNA互补的碱基序列构成的DNA在严格的条件下杂交，且对具有HG-5epi活性的多肽进行编码的DNA。第三方式为含有在第一方式或第二方式所示的DNA中添加了编码肽标签的DNA的融合DNA的碱基序列，且对具有HG-5epi活性的多肽进行编码的DNA。这样的DNA可为分离的DNA。
需要说明的是，本申请中“含有碱基序列”这一表述包括“由该碱基序列构成”的情况。
第一方式所示的DNA可通过例如后述的<实施例1>～<实施例5>所述的方法得到。另外，第一方式所示的DNA也可通过将基于序列号1所示的碱基序列而制作的寡核苷酸用作引物的PCR(聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction))反应，将源自非洲大蜗牛的核酸(染色体DNA或cDNA)作为模板扩增DNA片段而得到。
第二方式中所谓的“严格的条件”是指形成特异性杂交、且不形成非特异性杂交的条件。即，此处所谓的“严格的条件”是指可针对由与第一方式所示的DNA互补的碱基序列构成的DNA形成特异性杂交的条件。作为严格的条件，可举出如下条件：同源性高的DNA彼此，例如具有80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进而优选为97％以上、特别优选为99％以上的同源性的DNA彼此进行杂交，与此相比同源性低的DNA彼此不进行杂交。作为这样的条件，例如可举出如下条件：在相当于通常的Southern杂交的清洗的条件即60℃、1×SSC、0.1％SDS、优选为60℃、0.1×SSC、0.1％SDS、更优选为68℃、0.1×SSC、0.1％SDS的盐浓度和温度下清洗1次、优选清洗2～3次。另外，作为这样的条件，例如也可举出如下条件：在42℃下在包含50％甲酰胺、4×SSC、50mMHEPES-NaOH(pH7.0)、10×Denhardt’ssolution和100μg/mL鲑鱼精DNA的溶液中进行杂交，在包含2×SSC和0.1％SDS的溶液中在室温下进行清洗，进而在50℃下在包含0.1×SSC和0.1％SDS的溶液中进行清洗(SambrookJ,etal.,MolecularCloning：ALaboratoryManual,SecondEdition,ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989))。
关于第二方式所示的DNA，例如可通过对第一方式所示的DNA的碱基序列进行核酸残基的取代、缺失、插入和/或添加(以下总称为“突变的引入”。)来制备。此处所谓的“突变的引入”例如可通过公知的方法进行。
作为进行“突变的引入”的方法，例如可举出使用限制酶和T4DNA连接酶的方法。即，将以对由所期望的氨基酸序列构成的多肽进行编码的方式在碱基序列中引入突变的DNA片段的两末端通过限制酶进行限定分解，将由以相同的限制酶进行限定分解的序列号1的碱基序列构成的DNA与亚克隆后的载体进行混合，然后通过T4DNA连接酶使两者连接，从而可得到引入了突变的DNA。关于这样的“在碱基序列中引入了突变的DNA片段”，例如可通过将引入了这样的突变的寡核苷酸用作引物的PCR反应而得到。另外也可通过将以形成在所期望的部位的碱基引入突变的序列的方式合成的2条的互补的寡核苷酸在水溶液中进行混合，在90～100℃下加热1～2分钟，然后冷却至室温而得到。
另外，作为进行“突变的引入”的方法，例如也可举出部位特异性突变引入法。作为部位特异性突变引入法，例如可举出使用PCR反应的方法(Higuchi,R.,61,inPCRtechnology,Erlich,H.A.Eds.,Stocktonpress(1989)；Carter,P.,Meth.inEnzymol.,154,382(1987))、使用噬菌体的方法(Kramer,W.andFrits,H.J.,Meth.inEnzymol.,154,350(1987)；Kunkel,T.A.etal.,Meth.inEnzymol.,154,367(1987))。关于部位特异性突变引入法，具体而言，例如可利用KOD-Plus-MutagenesisKit(东洋纺株式会社)进行。
第三方式中所谓的“肽标签”与上述“(2)本发明的多肽”中详述的肽标签相同。因此，对于进行编码的多肽只要具有HG-5epi活性，作为本发明的核酸也示例出添加了编码肽标签的DNA的融合DNA。此处所谓的“编码肽标签的DNA”可为仅编码肽标签的DNA，也可为由编码肽标签的DNA和编码接头序列的DNA构成的融合DNA。
另外，本发明的核酸也可通过对该碱基序列进行化学性地全合成而得到。
本发明的核酸所编码的多肽具有HG-5epi活性。本发明的核酸所编码的多肽可通过上述“(2)本发明的多肽”中所述的方法制备。本发明的核酸所编码的多肽的HG-5epi活性的有无可通过上述“(2)本发明的多肽”中所述的方法进行判定。
(4)本发明的载体
本发明的载体为含有本发明的核酸的载体。本发明的载体可含有1种本发明的核酸，也可含有2种或其以上本发明的核酸。本发明的载体可含有1拷贝的本发明的核酸，也可含有2拷贝或其以上的本发明的核酸。
此处所谓的“载体”是指，用于将本发明的核酸引入至宿主细胞的核酸分子。载体只要可在宿主细胞中进行本发明的核酸的扩增或本发明的核酸所编码的多肽的表达，就没有特别限制。作为这样的载体示例出噬菌体、质粒、病毒等。载体可根据宿主细胞的种类、本发明的核酸所编码的多肽所期望的表达量等诸条件进行适宜选择。例如在利用细菌细胞等原核细胞作为宿主细胞的情况下，作为载体可优选利用噬菌体、质粒。另外，例如在利用昆虫细胞等真核细胞作为宿主细胞的情况下，作为载体可优选利用质粒、病毒。
作为可在细菌细胞中利用的噬菌体，例如可举出对作为噬菌体DNA发挥作用的质粒进行封装的噬菌体颗粒。作为可在细菌细胞中利用的质粒，例如可举出pBlueScriptIISK(+)。作为可在昆虫细胞等中利用的质粒，例如可举出pIZ-V5(LifeTechnologies公司制)。
作为可在昆虫细胞等中利用病毒，例如可举出杆状病毒(Baculovirus)。作为杆状病毒优选为核型多角体病毒(NuclearPolyhedrosisVirus；NPV)。作为NPV可举出AcNPV(AutographacalifornicaNPV)、BmNPV(BombyxmoriNPV)，其中优选为AcNPV。通过使引入了本发明的核酸的病毒通过通常的方法使昆虫细胞等宿主细胞感染，从而保持本发明的核酸，可得到对本发明的核酸所编码的多肽进行表达的宿主细胞。
向噬菌体中引入本发明的核酸可根据通常的方法进行。作为向噬菌体中引入本发明的核酸的方法，示例出后述的<实施例2>所述的方法。即，例如只要将含有本发明的核酸的噬菌体DNA封装于噬菌体颗粒中即可。具体而言，例如只要从存在于作为噬菌体DNA发挥作用的质粒的多克隆位点的限制酶位点选择任意2个，将质粒和本发明的核酸通过这些限制酶进行限定分解之后连接即可。作为这样的质粒，例如可举出LambdaZAPII。另外，作为本发明的核酸，只要使用通过将限制酶位点添加至5’末端侧的寡核苷酸用作引物的PCR反应而得到的DNA即可。另外，关于向本发明的核酸中引入限制酶位点，也可将在5’末端具有用限制酶进行限定分解时所产生的结构的DNA片段与作为本发明的核酸的DNA片段进行连接。
向质粒引入本发明的核酸可根据通常的方法进行。作为向质粒引入本发明的核酸的方法，示例出后述的<实施例6>或<实施例10>所述的方法。即，例如只要从存在于质粒的多克隆位点对限制酶位点选择任意2个，通过这些限制酶使质粒与本发明的核酸进行限定分解之后连接即可。作为本发明的核酸，只要使用通过将在5’末端侧添加了限制酶位点的寡核苷酸用作引物的PCR反应而得到的DNA即可。另外，关于向本发明的核酸中引入限制酶位点，可将在5’末端具有通过限制酶进行限定分解时所产生的结构的DNA片段与作为本发明的核酸的DNA片段进行连接来进行。
向病毒引入本发明的核酸可根据通常的方法进行。例如向病毒引入本发明的核酸可通过制备杆状病毒质粒进行。具体而言，例如可通过使用引入了本发明的核酸的供体质粒对杆状病毒质粒制备用的细菌株进行转化，从而制备引入了本发明的核酸的杆状病毒质粒。作为杆状病毒质粒制备用的细菌株，例如可举出大肠杆菌DH10Bac株。作为供体质粒，例如可举出pFastBac1。以此方式制备的杆状病毒质粒通过对昆虫细胞等宿主细胞进行转化，从而可直接作为病毒发挥作用。
另外，例如向病毒引入本发明的核酸也可通过利用被称为转移载体的质粒进行。具体而言，例如通过使引入了本发明的核酸的转移载体和病毒基因组共转染于昆虫细胞等宿主细胞，从而得到引入了本发明的核酸的病毒。作为转移载体，可举出pPSC8(ProteinSciences公司制)、pVL1393(ABVector公司制)。
(5)本发明的宿主细胞
本发明的宿主细胞为保持本发明的核酸和/或本发明的载体(以下总称为“本发明的载体等”。)的宿主细胞。需要说明的是，本发明的载体为含有本发明的核酸的载体，所以保持本发明的载体的宿主细胞也相当于保持本发明的核酸的宿主细胞。本发明的宿主细胞既可保持1种本发明的载体等，也可保持2种或其以上本发明的载体等。本发明的宿主细胞既可保持1拷贝本发明的载体等，也可保持2拷贝或其以上本发明的载体等。本发明的宿主细胞既可在染色体上保持本发明的载体等，也可在染色体之外保持本发明的载体等，也可在染色体上和染色体之外的两者上保持本发明的载体等。关于本发明的宿主细胞，具体而言，可为使用本发明的载体等进行转化后的宿主细胞。此处所谓的“宿主细胞”是指作为用于扩增本发明的载体等的宿主、或作为用于表达本发明的载体等所编码的多肽的宿主所使用的细胞。这样的宿主细胞只要可进行使用本发明的载体等的转化，就没有特别限制。宿主细胞优选为分离后的细胞。宿主细胞可根据使用本发明的载体等的目的进行适宜选择。
在将本发明的载体等的扩增作为目的的情况下，宿主细胞例如为原核细胞，具体而言优选为细菌细胞，其中优选为大肠杆菌(Escherichiacoli)。作为大肠杆菌，例如可举出XL-1BlueMRF’株、JM109株、DH5α株。
在将本发明的载体等所编码的多肽的表达作为目的的情况下，作为宿主细胞，例如可利用通常用于异种蛋白质的表达的物质。这样的宿主细胞例如为真核细胞，具体而言，优选为昆虫细胞、动物细胞、植物细胞、或酵母细胞，其中优选为昆虫细胞。作为昆虫细胞，例如可举出源自草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)的Sf9细胞、Sf21细胞、SF+细胞、或源自粉纹夜蛾(Trichoplusiani)的HighFive细胞。昆虫细胞优选为源自草地夜蛾，其中优选为Sf21细胞。
宿主细胞的转化可根据通常的方法进行。转化宿主细胞的方法只要可向宿主细胞引入本发明的载体等，就没有特别限制。作为转化宿主细胞的方法，具体而言示例出磷酸钙法、脂质体转染法、DEAE葡聚糖法、电穿孔法、显微注射法等，其中优选为脂质体转染法。脂质体转染法优选使用CellfectinIIReagent实施。
(6)本发明的多肽制造方法
关于本发明的多肽，例如可使用本发明的宿主细胞来制造。即，本发明的多肽，例如可通过包括以下的(A)和(B)的工序的多肽的制造方法(以下称为“本发明的多肽制造方法”。)来制造。
工序(A)，使用本发明的宿主细胞表达具有HG-5epi活性的多肽。
工序(B)，收集上述(A)的工序中所表达的多肽。
上述(A)的工序是培养本发明的宿主细胞，对具有本发明的载体等所编码的HG-5epi活性的多肽(即，本发明的多肽)进行表达的工序。
作为上述(A)的工序，具体而言，例如可举出如下工序：从使用引入了本发明的核酸的pFastBac1进行转化后的大肠杆菌DH10Bac株中提取杆状病毒质粒，使用该杆状病毒质粒并通过脂质体转染法培养转化后的Sf21细胞。
培养宿主细胞时的培养条件只要可对本发明的载体等所编码的本发明的多肽进行表达，就没有特别限制。培养条件可根据宿主细胞的种类或本发明的载体等所编码的本发明的多肽的所期望的表达量等诸条件进行适宜选择。例如昆虫细胞的培养可使用通常用于昆虫细胞的培养的培养基。作为这样的培养基，例如可举出市售的昆虫细胞用的无血清培养基，具体而言可举出Sf900III无血清培养基。培养例如可在27℃～28℃下，通过震荡培养进行。
上述(B)的工序为收集在上述(A)的工序中使宿主细胞表达的本发明的多肽的工序。此处所谓的“收集”是指从宿主细胞的培养液中得到含有本发明的多肽的组分。即，在以向细胞外分泌本发明的多肽的方式进行表达时，可作为本发明的多肽收集培养液本身，也可作为本发明的多肽收集离心分离后的上清，也可作为本发明的多肽收集供于柱等并精制之后的组分。
另外，在以蓄积于细胞内的方式表达本发明的多肽的情况下，可将破碎细胞而得到的提取液作为本发明的多肽收集，也可将该提取液供于柱等并精制之后的组分作为本发明的多肽收集。另外，在以蓄积于细胞膜的方式表达本发明的多肽的情况下，可将细胞本身作为本发明的多肽收集，也可将破碎细胞而得到的破碎物作为本发明的多肽收集。这样的“破碎”可通过依据宿主细胞的种类进行适宜选择的方法来实施，可示例出进行均质化的方法、进行超声波处理的方法、进行冻融的方法、添加表面活性剂的方法等。这些方法可以适宜地进行组合来使用。
精制可通过用于蛋白质的分离精制的公知方法进行。作为这样的方法，例如可举出硫酸铵沉淀、凝胶过滤层析法、离子交换层析法、疏水相互作用层析法、羟基磷灰石层析法、亲和层析法。特别是在本发明的多肽中添加肽标签的情况下，可通过利用针对该标签的亲和性的亲和层析法进行精制。这些方法可以适宜地进行组合来使用。
精制可进行至所期望的程度。本发明的多肽在所收集的组分中所占的重量浓度例如可为0.001％以上、0.01％以上、0.1％以上、1％以上、5％以上、10％以上、25％以上或50％以上。另外，本发明的多肽在所收集的组分中所占的重量浓度例如可为100％以下、75％以下、50％以下、25％以下、10％以下、5％以下或1％以下。
关于在以此方式收集的组分中是否含有本发明的多肽，可根据上述“(2)本发明的多肽”中所述的方法，通过对HG-5epi活性的有无进行测定来判定。另外，以此方式收集的组分中是否含有本发明的多肽也可通过使用与本发明的多肽结合的抗体的WesternBlotting进行判定。WesternBlotting可根据后述的<实施例9>的方法进行。
(7)本发明的多糖制造方法
本发明的多糖制造方法是HexA残基被异构化的多糖的制造方法，所述制造方法包括如下工序：将具有HG-5epi活性的酶和/或多肽(以下总称为“本发明的HG-5epi”。)与包含由GlcNAc残基和HexA残基构成的二糖的多糖接触。本发明的HG-5epi可具有C5-epi活性，也可实质上不具有该活性。作为本发明的HG-5epi，可使用具有HG-5epi活性的1种酶，也可使用具有HG-5epi活性的2种或其以上的酶。作为本发明的HG-5epi，可使用具有HG-5epi活性的1种多肽，也可使用具有HG-5epi活性的2种或其以上的多肽。作为本发明的HG-5epi，可以组合使用具有HG-5epi活性的1种或其以上的酶和具有HG-5epi活性的1种或其以上的多肽。作为“具有HG-5epi活性的酶”可举出本发明的酶。作为“具有HG-5epi活性的多肽”可举出本发明的多肽。
此处所谓的“包含由GlcNAc残基和HexA残基构成的二糖的多糖”只要为本发明的HG-5epi所作用的底物，就没有特别限制。
此处所谓的“由GlcNAc残基和HexA残基构成的二糖”是指GlcNAc残基和HexA残基结合而成的二糖。“由GlcNAc残基和HexA残基构成的二糖”中的GlcNAc残基和HexA残基的结合的顺序没有限制。“由GlcNAc残基和HexA残基构成的二糖”，只要在1分子的多糖的骨架中至少存在1处即可。“由GlcNAc残基和HexA残基构成的二糖”，既可在1分子的多糖的骨架中仅存在1处，也可存在2处或其以上。“由GlcNAc残基和HexA残基构成的二糖”在1分子的多糖中存在2处或其以上的情况下，既可在多糖的骨架中作为具有2个或其以上的二糖结合而成的四糖或其以上的链长的糖链存在，也可在多糖的骨架中作为经由其它的分子而结合的状态存在。作为此处所谓的“其它的分子”，例如可举出为由1个或其以上的糖残基构成的糖链、且由GlcNAc残基和HexA残基构成的二糖以外的糖残基。
“由GlcNAc残基和HexA残基构成的二糖”中的GlcNAc残基和HexA残基的结合方式只要本发明的HG-5epi可发挥作用，就没有特别限制。“由GlcNAc残基和HexA残基构成的二糖”的结合方式优选为1-4糖苷键。另外，关于“由GlcNAc残基和HexA残基构成的二糖”中的GlcNAc残基和HexA残基的端基异构体，GlcNAc残基优选为α端基异构体，GlcA残基优选为β端基异构体，IdoA残基优选为α端基异构体。
作为这样的“由GlcNAc残基和HexA残基构成的二糖”，具体而言，示例出GlcNAc残基和GlcA残基的键为[-4GlcNAcα1-4GlcAβ1-]或[-4GlcAβ1-4GlcNAcα1-]所示的二糖，GlcNAc残基和IdoA残基的键为[-4GlcNAcα1-4IdoAα1-]或[-4IdoAα1-4GlcNAcα1-]所示的二糖。作为包含这样的“由GlcNAc残基和HexA残基构成的二糖”的多糖，具体而言，示例出NAH、完全脱硫酸化·N-乙酰化HS(CDSNAc-HS)、CDSNAc-HEP，ACH(2-O-脱硫酸化AS)等，其中优选为NAH、CDSNAc-HEP。
此处所谓的“HexA残基的异构化”是指从GlcA残基向IdoA残基的异构化和/或从IdoA残基向GlcA残基的异构化。即，此处所谓的“HexA残基被异构化的多糖”是指，通过将本发明的HG-5epi与包含由GlcNAc残基和HexA残基构成的二糖的多糖接触的工序而得到的多糖，具体而言，是指通过下述工序而得到的多糖，即，多糖的骨架中所含的该二糖的GlcA残基的全部或一部分异构化为IdoA残基的工序、和/或多糖的骨架中所含的该二糖的IdoA残基的全部或一部分异构化为GlcA残基的工序。
本发明的多糖制造方法包括：对包含由GlcNAc残基和HexA残基构成的二糖的多糖的骨架中所含的该二糖的HexA残基(即，邻接于GlcNAc残基的HexA残基)进行异构化，使该多糖的IdoA含量增加或减少的方法；及利用了该方法的多糖的制造方法。
作为此处所谓的“HexA残基被异构化的多糖”，具体而言，例如可举出：含有NAH的GlcA残基的全部或一部分被异构化为IdoA残基的结构的多糖；含有CDSNAc-HEP的GlcA残基的全部或一部分被异构化为IdoA残基的结构和/或IdoA残基的全部或一部分被异构化为GlcA残基的结构的多糖。
此处所谓的“HexA残基被异构化的多糖”可为具有IdoA残基的多糖。“HexA残基被异构化的多糖”中的IdoA含量没有特别限制，可根据使本发明的HG-5epi与包含由GlcNAc残基和HexA残基构成的二糖的多糖接触的条件控制为任意的数值。具体而言，适宜设定向反应体系中添加的本发明的HG-5epi的量、反应时间等诸条件，设定为成为所期望的IdoA含量的条件即可。此处所谓的“IdoA含量”的定义如上述“(1)本发明的酶”中详述的相同。
这样的“HexA残基被异构化的多糖”，例如可为与IdoA含量为77％的HEP或IdoA含量为19％的HS(HookM,LindahlU,IveriusPH.,BiochemJ.1974Jan；137(1)：33-43.)的IdoA含量不同作为特征的多糖。
“HexA残基被异构化的多糖”的IdoA含量可适宜进行设定。“HexA残基被异构化的多糖”中的IdoA含量例如可为0.1％以上、1％以上、5％以上、10％以上、20％以上、25％以上、30％以上、35％以上、40％以上或50％以上。另外，此处所谓的“IdoA含量”例如可为100％以下、99％以下、95％以下、90％以下、80％以下、75％以下、70％以下、65％以下、60％以下、50％以下、40％以下、30％以下、20％以下、10％以下、5％以下或1％以下。作为“HexA残基被异构化的多糖”中的IdoA含量，优选示例出20％～75％、25％～75％、30％～75％、35％～75％、40％～75％、20％～70％、25％～70％、30％～70％、35％～70％、40％～70％、20％～65％、25％～65％、30％～65％、35％～65％、40％～65％、20％～60％、25％～60％、30％～60％、35％～60％、40％～60％等。
根据本发明的多糖制造方法得到的HexA残基被异构化的多糖作为新型材料有用。
实施例
以下，通过实施例具体说明本发明，但这些不对本发明的技术范围有任何限制。
本实施例中使用的CDSNAc-HEP、CDSNS-HEP、NAH和NSH是根据公知的文献所述的方法得到的。
CDSNAc-HEP和CDSNS-HEP的制备中将完全脱硫酸化肝素(CDS-HEP)作为中间体使用。
CDS-HEP是通过参照公知的文献的方法对HEP进行脱硫酸化而得到的。即，将源自猪大肠的HEP(Sigma-Aldrich公司制)供于在使用了N-甲基-N-(三甲基甲硅烷基)三氟乙酰胺(MTSTFA)的6-O-脱硫酸化、及在氢氧化钠的存在下进行冷冻干燥的2-O-脱硫酸化(KariyaY,HerrmannJ,SuzukiK,IsomuraT,IshiharaM.,JBiochem.1998Feb；123(2)：240-6.)、以及在DMSO溶剂中进行加热的溶剂分解反应所致的N-脱硫酸化(AyotteL,PerlinAS.,CarbohydrRes.1986Jan1；145(2)：267-77.)而得到的物质。由此方式而得到的CDS-HEP具有从HEP中实质上去除了全部的硫酸基的结构。
CDSNAc-HEP是将CDS-HEP供于使用了醋酸酐的N-乙酰化(DanishefskyI.,MethodsCarbohydr.Chem.1965；5：407-409.)而得到的物质。
CDSNS-HEP是将CDS-HEP供于使用了三氧化硫-吡啶络合物的N-硫酸化(LealiD,BelleriM,UrbinatiC,ColtriniD,OresteP,ZoppettiG,RibattiD,RusnatiM,PrestaM.,JBiolChem.2001Oct12；276(41)：37900-8.)而得到的物质。
NAH是根据公知的文献(日本特开2004-018840号公报)所述的方法，培养大肠杆菌K5株(SerotypeO10：K5(L)：H4,ATCC23506)，将培养上清供于精制而得到的物质。
NSH是将NAH供于在氢氧化钠水溶液中进行加热的N-脱乙酰化、及使用了三氧化硫-吡啶络合物的N-硫酸化(LealiD,BelleriM,UrbinatiC,ColtriniD,OresteP,ZoppettiG,RibattiD,RusnatiM,PrestaM.,JBiolChem.2001Oct12；276(41)：37900-8.)而得到的物质。
<实施例1>源自非洲大蜗牛粘液腺的mRNA的分取
非洲大蜗牛的mRNA通过利用热酚法(例如VerwoerdTC,DekkerBM,HoekemaA.,NucleicAcidsRes.1989Mar25；17(6)：2362.)从粘液腺提取总RNA之后，供于使用磁珠的精制法并对mRNA进行分取而得到。以下示出步骤。
将用切刀将1只非洲大蜗牛切开，用蒸馏水清洗摘出的粘液腺，然后密闭于1.5mL的螺旋盖试管中。将试管浸渍于液体氮1分钟使进行冷冻，然后使用均质机破碎粘液腺，加入0.5mL的在水浴中加热至80℃的hotextractionbuffer(在55℃的水浴中进行加热使其溶解的苯酚和缓冲液(0.1MLiCl，100mMTris-HCl(pH＝8.0)，10mMEDTA，1％SDS)以1：1加入并进行搅拌的溶液)，使用试管混合器搅拌30秒钟。之后加入0.25mL氯仿溶液(氯仿和异戊醇以24：1加入并进行搅拌的溶液)，使用试管混合器再搅拌30秒钟。
在20,000×g下离心分离该溶液5分钟，从上层(水层)取出0.2mL移至别的试管，然后加入0.2mL的4MLiCl进行混合，在-20℃下静置整夜。之后，在4℃、20,000×g下离心5分钟，去除上清得到总RNA的沉淀。将该沉淀溶解于0.25mL蒸馏水中之后，加入0.025mL3MCH3COONa(pH5.2)、0.5mL乙醇并进行混合。之后，在20,000×g下离心5分钟，去除上清并再次得到总RNA的沉淀。加入0.5mL的70％乙醇并清洗沉淀之后去除上清，使其风干并再次得到总RNA的沉淀。
在该总RNA的沉淀中加入0.5mL的蒸馏水，平稳地吸液并使沉淀溶解。接着，使用PolyATract(注册商标)mRNAIsolationSystem(Promega公司制)进行依据另附的实验方案的操作，从该溶液中分取源自非洲大蜗牛粘液腺的mRNA。
<实施例2>非洲大蜗牛cDNA噬菌体文库的制备
使用AccuScriptHi-FicDNASynthesisKit(AgilentTechnologies公司制)进行依据另附的实验方案的操作，从通过上述<实施例1>得到的mRNA中得到cDNA。即，将在上述<实施例1>中得到的mRNA作为模板，进行使用添加了XhoI位点的寡dT引物(序列号6)、5-甲基dCTP和Moloneymurineleukemiavirusreversetranscriptase(MMLV-RT)的逆转录反应。接着，在RNaseH的存在下进行利用DNApolymeraseI的缺口平移反应，得到双链cDNA。
使试剂盒中附带的PfuDNAPolymerase对该双链cDNA产生作用，对cDNA的两末端进行平滑化，然后使用DNALigationKitVer.2.1(TakaraBIO公司制)进行依据另附的实验方案的操作，使EcoRI接头(后述)连接该双链cDNA。接着，使用限制酶XhoI(TakaraBIO公司制)进行限定分解，使用QIAEXIIGelExtractionKit(Qiagen公司制)进行依据另附的实验方案的操作精制，得到5’末端具有EcoRI的粘性末端和3’末端具有XhoI的粘性末端的cDNA片段。
此处所谓的“EcoRI接头”是指在5’末端具有通过限制酶EcoRI进行限定分解时所产生的结构的DNA片段。这样的DNA例如可通过在溶液中混合由序列号7的碱基序列构成的DNA与由序列号8的碱基序列构成的DNA，在90～100℃下加热1～2分钟之后，冷却至室温来制备。由序列号8的碱基序列构成的DNA优选在将5’末端进行磷酸化之后用于制作EcoRI接头。
其次，使用DNALigationKitVer.2.1进行依据另附的实验方案的操作，连接上述的cDNA片段和Uni-ZAPXR(用EcoRI和XhoI对LambdaZAPII(AgilentTechnologies公司制)进行限定分解，对5’末端进行了脱磷酸化的克隆用载体)。其次，使用GigapackIIIGoldPackagingExtract(AgilentTechnologies公司制)进行依据另附的实验方案的操作，将连接后的载体封装于噬菌体颗粒中，得到非洲大蜗牛cDNA噬菌体文库。封装后的噬菌体溶液的效价为1.0×107pfu/mL。
<实施例3>对HG-5epi的多肽进行编码的DNA片段的取得
作为使在上述<实施例2>中得到的cDNA噬菌体文库感染的宿主细胞(宿主菌)使用大肠杆菌XL-1BlueMRF’株(AgilentTechnologies公司制)，根据下述详细说明的平板裂解法进行噬菌体的扩增和回收。
将宿主菌植菌于20mL的LB培养基(含有0.2％麦芽糖、10mMMgSO4)中并在37℃下振荡培养整夜，得到测定波长600nm下的吸光度为1.5左右的培养液。将在上述<实施例2>中得到的噬菌体文库的溶液以每30μL分注于3个50mL的试管中，在每个试管中加入宿主菌的培养液5mL并进行混合。之后，在37℃的水浴中静置15分钟使噬菌体颗粒感染于宿主菌。
为了使噬菌体颗粒所感染的宿主菌在平板上进行培养并形成斑块，分别在该噬菌体颗粒和宿主菌的混合液中加入35mL加热到45℃的LB顶层琼脂(琼脂浓度：0.7％)并迅速混合，分别在3个LB平板(纵：24cm×横：24cm)上进行重层。之后使其在37℃下静置培养6小时形成斑块。
分别在形成有斑块的各平板中加入50mL的SM缓冲液(0.1MNaCl，10mMMgSO4·H2O，50mMTris-HCl(pH7.5)、0.01％明胶)和1mL的氯仿的混合液，之后在4℃下静置整夜。从各自的平板中回收40mL的上清至不同的离心分离管中，加入2mL的氯仿之后，使用试管混合器搅拌数秒钟。将这些离心分离管在8,000×g下离心15分钟，分别将从上清中回收并进行合并的溶液35mL用作噬菌体溶液。回收后的噬菌体溶液的效价为3.4×109pfu/mL。
其次，使用LambdaMiniKit(Qiagen公司制)进行依据另附的实验方案的操作，从该噬菌体溶液得到λDNA。将该0.5μgλDNA作为模板进行PCR反应。PCR反应的引物中将序列号9、序列号10或序列号11的寡核苷酸作为正义引物、将序列号12或序列号13的寡核苷酸作为反义引物分别组合来使用。PCR反应使用ExTaqDNAPolymerase(TakaraBIO公司制)进行依据另附的实验方案的操作使基因扩增。PCR反应的条件设为94℃2分钟，(94℃30秒钟、55℃1分钟、72℃2分钟)×40个循环，72℃5分钟。其结果，通过使用序列号9和序列号13的引物实施的PCR反应得到约0.3kbp的DNA片段。
使用QIAEXIIGelExtractionKit进行依据另附的实验方案的操作，对上述的DNA片段进行精制。其次，使用BluntingKinationLigationKit(TakaraBIO公司制)进行依据另附的实验方案的操作并进行DNA片段末端的平滑化和5’末端的磷酸化之后，再次精制DNA片段。之后在通过限制酶EcoRV(NewEnglandBiolabs社制)进行限定分解之后，将该DNA片段与用AlkalinePhosphatase、CalfIntestinal(CIP)(NewEnglandBiolabs公司制)进行脱磷酸化后的pBlueScriptIISK(+)(AgilentTechnologies公司制)(以下作为pBS。)连接。
使用该连接反应液对大肠杆菌JM109株(TakaraBIO公司制)进行转化之后，涂布于含有50μg/mL的氨苄西林的LB培养基(以下作为LB/Amp。)的琼脂培养基中，在37℃下静置培养整夜。分别将平板上的任意3个单菌落植菌至1mL的LB/Amp培养基中，在37℃下振荡培养5小时，从培养液中取样0.5mL并在20,000×g下离心1分钟，之后去除上清并得到大肠杆菌的菌体。另外，将剩余的培养液中取10μL植菌至2mL的LB/Amp培养基中，在37℃下振荡培养整夜。
通过根据通常的方法的碱少量提取法(alkaliminiprep)(SambrookJ,etal.,MolecularCloning：ALaboratoryManual,SecondEdition,ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989))从该菌体中获得质粒的沉淀之后，将风干后的沉淀溶解于10μL的蒸馏水中。其次，将该质粒作为模板进行使用T3引物(序列号14)和T7引物(序列号15)的PCR反应。PCR反应使用ExTaqDNAPolymerase，实施依据另附的实验方案的操作对基因进行扩增。PCR反应的条件设为(94℃30秒钟、60℃30秒钟、72℃1分钟)×25个循环。将PCR反应液供于琼脂糖凝胶电泳，结果确认了在所有的PCR反应液中有约0.4kbp的DNA片段。
其次，将振荡培养整夜的上述培养液2mL在20,000×g下离心1分钟后，去除上清并得到大肠杆菌的菌体。之后，使用Wizard(注册商标)PlusSVMiniprepsDNAPurificationSystem(Promega公司制)进行依据另附的实验方案的操作，从该菌体中得到质粒。其次，为了对该质粒所具有的DNA片段的碱基序列进行解析，进行了将该质粒作为模板的序列反应。序列反应使用BigDye(注册商标)Terminatorv3.1CycleSequencingKit(AppliedBiosystems公司制)进行依据另附的实验方案的操作。序列的解析使用ABIPRISM(注册商标)310GeneticAnalyzer(AppliedBiosystems公司制)实施。其结果，DNA的碱基序列如序列号16所示。
<实施例4>对HG-5epi的多肽进行编码的DNA的测序
为了对编码HG-5epi的多肽的DNA进行测序，对于<实施例3>中得到的DNA片段的5’侧和3’侧的未知区域而言，实施利用InversePCR的测序。
通过限制酶BamHI(TakaraBIO公司制)对在上述<实施例3>中得到的6μgλDNA进行限定分解后，供于琼脂糖凝胶电泳，用切刀切取并回收0.5～4.0kbp的范围。之后，使用QIAEXIIGelExtractionKit进行依据另附的方实验方案的操作，得到用BamHI进行限定分解的λDNA的片段。其次，使用DNALigationKitVer.2.1进行依据另附的实验方案的操作，使λDNA的片段进行自我连接。将该连接反应液作为模板，进行将序列号17和序列号18的寡核苷酸作为引物的PCR反应。PCR反应使用ExTaqDNAPolymerase进行依据另附的实验方案的操作来制备PCR反应液。PCR反应的条件设为94℃2分钟，(94℃30秒钟、50℃30秒钟、72℃3分钟)×40个循环，72℃5分钟。
进而，将该反向PCR(InversePCR)的反应液作为模板进行巢式PCR(NestedPCR)。PCR反应的引物使用序列号19和序列号20的寡核苷酸。PCR反应使用ExTaqDNAPolymerase进行依据另附的实验方案的操作来制备PCR反应液。PCR反应在(94℃30秒钟、50℃30秒钟、72℃3分钟)×40个循环的条件下实施。其结果得到约1.8kbp的DNA片段。
使用BluntingKinationLigationKit进行依据另附的实验方案的操作，进行DNA片段末端的平滑化和5’末端的磷酸化之后，使用MicropureEZEnzymeRemovers(Millipore公司制)精制DNA片段。之后，在用EcoRV进行限定分解之后，使该DNA片段与以CIP进行脱磷酸化后的pBS进行连接。
使用该连接反应液对大肠杆菌JM109株进行转化之后，涂布在LB/Amp琼脂培养基的平板上，在37℃下静置培养整夜并得到单菌落。将该菌落植菌于4mLLB/Amp培养基中并在37℃下振荡培养整夜，得到大肠杆菌的菌体。使用QIAprepSpinMiniprepKit(Qiagen公司制)进行依据另附的实验方案的操作，从该菌体中得到质粒。其次，为了对该质粒所具有的DNA片段的碱基序列进行解析，进行了将该质粒作为模板的序列反应。序列反应使用BigDyeTerminatorv3.1CycleSequencingKit进行依据另附的实验方案的操作。序列的解析使用ABIPRISM310GeneticAnalyzer进行。其结果，确认了由巢式PCR(NestedPCR)得到的DNA片段为其两端含有在<实施例3>中得到的序列号16的碱基序列的一部分的DNA。另外，由此也确定了进行自我连接的λDNA的片段中的、含有序列号16的碱基序列的cDNA的两末端的碱基序列。
其次，实施使用了分别与该cDNA的两末端进行退火的引物的PCR克隆，试图取得对HG-5epi进行编码的DNA全长。即，将序列号21和序列号22的寡核苷酸用作引物，进行将在<实施例3>中制备的0.5μgλDNA作为模板的PCR反应。PCR反应使用PfuTurboDNAPolymerase(AgilentTechnologies公司制)进行依据另附的实验方案的操作来制备PCR反应液。PCR反应在94℃2分钟、(94℃30秒钟、55℃30秒钟、72℃2分钟)×40个循环、72℃5分钟的条件下实施。其结果，得到约1.1kbp的DNA片段。
使用QIAEXIIGelExtractionKit进行依据另附的实验方案的操作，精制上述的DNA片段。其次，使用BluntingKinationLigationKit进行依据另附的实验方案的操作并进行DNA片段末端的平滑化和5’末端的磷酸化之后，再次精制DNA片段。之后，在用EcoRV进行限定分解之后，使该DNA片段与用CIP进行脱磷酸化后的pBS连接。
使用该连接反应液对大肠杆菌JM109株进行转化之后，涂布于LB/Amp琼脂培养基，在37℃下静置培养整夜。分别将3个单菌落植菌于4mL的LB/Amp培养基中并在37℃下振荡培养整夜，在20,000×g下离心1分钟，之后去除上清并得到大肠杆菌的菌体。之后，使用WizardPlusSVMiniprepsDNAPurificationSystem进行依据另附的实验方案的操作，从该菌体中得到质粒。其次，为了对该质粒所具有的DNA片段的碱基序列进行解析，进行了将该质粒作为模板的序列反应。序列反应使用BigDyeTerminatorv3.1CycleSequencingKit进行依据另附的实验方案的操作。序列的解析使用ABIPRISM310GeneticAnalyzer实施。其结果，由PCR克隆得到的DNA的碱基序列如序列号23所示。
然而，将从序列号23的碱基序列中预测的HG-5epi的氨基酸序列与公知的C5-epi(参考例1所述的物质)的氨基酸序列进行比较，可认为序列号23的碱基序列是欠缺了对HG-5epi的N末侧进行编码的区域的不完全的碱基序列。因此，为了对含有该序列号23的碱基序列的cDNA的5’侧的序列再进行测序，进行了利用5’RACE法的未知区域DNA的扩增反应。成为5’RACE反应的模板的cDNA的制备和5’RACE反应使用Marathon(注册商标)cDNAAmplificationKit(Clontech公司制)进行依据另附的实验方案的操作实施。成为cDNA合成的材料的RNA使用在<实施例1>中精制的0.5μgmRNA。引物使用序列号24和序列号25的寡核苷酸。将结合了MarathoncDNA接头后的cDNA稀释液作为模板，PCR反应使用Advantage(注册商标)2Polymerasemix(Clontech公司制)进行依据另附的实验方案的操作来制备PCR反应液。PCR反应的条件设为94℃30秒钟、(94℃5秒钟、72℃4分钟)×5个循环、(94℃5秒钟、70℃4分钟)×5个循环、(94℃5秒钟、68℃4分钟)×25个循环。
进而，将该5’RACE的反应液作为模板进行巢式PCR(NestedPCR)。PCR反应的引物使用序列号26和序列号27的寡核苷酸。PCR反应使用Advantage2Polymerasemix进行依据另附的实验方案的操作来制备PCR反应液。PCR反应的条件设为94℃30秒钟、(94℃5秒钟、72℃4分钟)×5个循环、(94℃5秒钟、70℃4分钟)×5个循环、(94℃5秒钟、68℃4分钟)×25个循环。其结果，得到约1.2kbp的DNA片段。
使用QIAEXIIGelExtractionKit进行依据另附的实验方案的操作，精制上述的DNA片段。其次，使用BluntingKinationLigationKit进行依据另附的实验方案的操作并进行DNA片段末端的平滑化和5’末端的磷酸化之后，再次精制DNA片段。之后，在用EcoRV进行限定分解之后，使该DNA片段与用CIP进行脱磷酸化的pBS连接。
使用该连接反应液对大肠杆菌JM109株进行转化之后，涂布于LB/Amp琼脂培养基，在37℃下静置培养整夜。分别将3个单菌落植菌于4mL的LB/Amp培养基中，并在37℃下振荡培养整夜，在20,000×g下离心1分钟之后，去除上清并得到大肠杆菌的菌体。之后，使用WizardPlusSVMiniprepsDNAPurificationSystem进行依据另附的实验方案的操作，从该菌体中得到质粒。其次，为了对该质粒所具有的DNA片段的碱基序列进行解析，进行了将该质粒作为模板的序列反应。序列反应使用BigDyeTerminatorv3.1CycleSequencingKit进行依据另附的实验方案的操作。序列的解析使用ABIPRISM310GeneticAnalyzer实施。其结果，由5’RACE反应得到的DNA的碱基序列如序列号28所示。
<实施例5>对HG-5epi的多肽全长进行编码的DNA的克隆
关于分别对在上述<实施例4>中得到的HG-5epi的DNA片段进行连接的pBS，在用相同的限制酶进行限定分解之后进行连接，得到将编码HG-5epi的全长的DNA进行亚克隆后的载体(pBS/HG-5epi)。以下示出步骤。
用EcoRI(TakaraBIO公司制)和EcoRV对连接了由序列号28的碱基序列构成的DNA的pBS进行限定分解，得到含有对HG-5epi的N末端侧进行编码的DNA的约1.2kbp的DNA片段。使用QIAEXIIGelExtractionKit进行依据另附的实验方案的操作，精制该DNA片段。
另外，用EcoRI和EcoRV对连接了由序列号23的碱基序列构成的DNA的pBS进行限定分解，得到由对HG-5epi的C末端侧进行编码的DNA和pBS的DNA构成的约3.7kbp的DNA片段。使用QIAEXIIGelExtractionKit进行依据另附的实验方案的操作，精制该DNA片段。其次，用CIP对该DNA片段进行脱磷酸化之后，再次进行精制。
需要说明的是，EcoRI对pBS的1处进行切断。另外，EcoRV在其重复的区域上对由序列号28的碱基序列构成的DNA和由序列号23的碱基序列构成的DNA的1处进行切断。因此，通过对由上述得到的2个DNA片段进行连接，从而得到对被pBS亚克隆后的HG-5epi的全长进行编码的DNA。
使用DNALigationKitVer.2.1进行依据另附的实验方案的操作，对由上述得到的2个DNA片段进行连接。使用该连接反应液对大肠杆菌JM109株进行转化之后，涂布在LB/Amp琼脂培养基的平板上，在37℃下整夜静置培养并得到单菌落。将该菌落植菌于4mLLB/Amp培养基中并在37℃下振荡培养整夜，得到大肠杆菌的菌体。使用QIAprepSpinMiniprepKit进行依据另附的实验方案的操作，从该菌体中得到质粒。其次，为了对该质粒所具有的DNA片段的碱基序列进行解析，进行了将该质粒作为模板的序列反应。序列反应使用BigDyeTerminatorv3.1CycleSequencingKit进行依据另附的实验方案的操作。序列的解析使用ABIPRISM310GeneticAnalyzer实施。其结果，确认了亚克隆为pBS后的DNA为含有序列号1的碱基序列的DNA。
<参考例1>公知的C5-epi和HG-5epi的同源性
对于由序列号1的碱基序列构成的DNA所编码的HG-5epi的氨基酸序列(序列号2)而言，通过GENETYX(注册商标)Ver.11(GENETYX社制)对与公知的C5-epi的氨基酸序列的同源性进行解析，其结果源自人(NCBI保藏编号：NP_056369，序列号3)为39％，源自斑马鱼(NCBI保藏编号：NP_998015，序列号4)为39％，源自线虫(NCBI保藏编号：NP_497876，序列号5)为30％。
<参考例2>HG-5epi的疏水性图谱分析
对HG-5epi的氨基酸序列(序列号2)进行了疏水性图谱分析，其结果暗示了HG-5epi可能在N末端具有跨膜区域。因此，在之后的HG-5epi的表达实验中，利用了在序列号1所示的碱基序列中去除了预测为编码N末端的跨膜区域的部分的碱基编号100～1806的区域。
<实施例6>HG-5epi的昆虫细胞表达系统用载体的制作(1)
为了得到HG-5epi的昆虫细胞表达系统用载体，进行了将在上述<实施例5>中得到的pBS/HG-5epi作为模板的PCR反应。PCR反应的引物使用序列号29和序列号30的寡核苷酸。PCR反应使用AccuprimeTaqDNAPolymeraseHighFidelity(Invitrogen公司制)进行依据另附的实验方案的操作来制备PCR反应液。PCR反应的条件设为94℃20秒钟、(94℃20秒钟、58℃20秒钟、68℃3分钟)×20个循环。其结果，得到约1.7kbp的DNA片段。
使用MinEluteGelExtractionKit(Qiagen公司制)进行依据另附的实验方案的操作，精制上述DNA片段。使用限制酶EcoRI和NotI(TakaraBIO公司制)对该DNA片段进行限定分解之后，再次相同地精制DNA片段。对于作为表达载体的pFBIF1(后述)而言，也实施了利用相同限制酶的限定分解和精制。其次，使用T4DNALigase(NewEnglandBiolabs公司制)进行依据另附的实验方案的操作，使pFBIF1与该DNA片段进行连接。
使用该连接反应液对大肠杆菌DH5α株(东洋纺株式会社)进行转化之后，涂布在LB/Amp琼脂培养基的平板上，在37℃下静置培养整夜并得到单菌落。将该菌落植菌于4mLLB/Amp培养基中并在37℃下振荡培养整夜，得到大肠杆菌的菌体。使用QIAprepSpinMiniprepKit进行依据另附的实验方案的操作，从该菌体中得到载体。其次，进行了使用BigDyeTerminatorv3.1CycleSequencingKit的序列反应，使用AppliedBiosystems3130xlGeneticAnalyzer(AppliedBiosystems公司制)进行了序列解析。其结果，确认了所连接的DNA片段的碱基序列与序列号1的碱基编号100～1806的碱基序列相同。以此方式得到HG-5epi的昆虫细胞表达用载体(pFBIF1/HG-5epi)。
此处所谓的pFBIF1是指将对由小鼠Igκ链的分泌信号肽的氨基酸序列(序列号31)和FLAG标签的氨基酸序列(序列号32)构成的多肽的氨基酸序列(序列号34)进行编码的DNA插入pFastBac1(Invitrogen公司制)的多克隆位点而制作的昆虫细胞表达用载体。具体而言，pFBIF1是如下载体：将对由序列号33的碱基序列构成的DNA进行亚克隆的载体作为模板，与使用限制酶和T4DNALigase的上述的方法相同地在将pFastBac1的BamHI和EcoRI作为两端的部位插入通过将序列号35和序列号36的寡核苷酸作为引物的PCR反应而得到的DNA片段而得到的。
关于由序列号33的碱基序列构成的DNA，例如可通过合成具有该碱基序列的寡核苷酸和与其互补的核苷酸，用T4PolynucleotideKinase对各自的5’末端进行磷酸化后在溶液中进行混合，在90～100℃下加热1～2分钟之后，冷却至室温来制备。因此，通过用任意的载体例如EcoRV对该DNA进行限定分解之后，对用CIP进行脱磷酸化后的pBS进行亚克隆，从而可用作上述PCR反应的模板。
由此方式而得到的pFBIF1/HG-5epi是用于表达融合了小鼠Igκ链的分泌信号、FLAG标签、由天冬酰胺和丝氨酸构成的二肽的接头、由序列号2中的氨基酸编号34～601所示的氨基酸序列构成的多肽的多肽的载体。
<实施例7>HG-5epi表达用杆状病毒质粒的制备(1)
接着，使用Bac-to-Bac(注册商标)杆状病毒表达系统(Invitrogen公司制)进行依据另附的实验方案的操作，在pFBIF1/HG-5epi与杆状病毒质粒之间进行基因的重组，在杆状病毒质粒中插入了对小鼠Igκ链的分泌信号、FLAG标签、由天冬酰胺和丝氨酸构成的二肽的接头、由序列号2中的氨基酸编号34～601所示的氨基酸序列构成的多肽的融合多肽进行编码的DNA。
即，使用pFBIF1/HG-5epi对作为杆状病毒质粒制备用的大肠杆菌的DH10Bac株(Invitrogen公司制)进行转化，将含有卡那霉素、正大霉素、四环素、5-溴吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷(Bluo-gal)和异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)的LB琼脂培养基涂布于平板上，在37℃下静置培养整夜并得到白色的单菌落。将该菌落植菌于1.5mL的LB培养基中并在37℃下振荡培养整夜，得到大肠杆菌的菌体。之后，对Bac-to-Bac杆状病毒表达系统进行依据另附的实验方案的操作，从该菌体中得到杆状病毒质粒。通过琼脂糖凝胶电泳对通过将M13Forward(-40)(序列号41)和M13Reverse(序列号42)作为引物的PCR反应所扩增的DNA片段的大小进行确认，确认了在杆状病毒质粒中全长插入了目标DNA。
<实施例8>使用昆虫细胞的HG-5epi的制备(1)
将在上述<实施例7>中得到的杆状病毒质粒引入昆虫细胞Sf21中。即，使用2mLGrace’sInsectMedium、Unsupplemented(Invitrogen公司制)，在35mm培养皿中接种8×105个Sf21细胞，在27℃下培养1小时并使细胞粘附在培养皿上。确认了细胞粘附在培养皿上之后，添加0.2mLlipid-DNAcomplexes溶液(后述)，在27℃下培养5小时。之后，从培养皿中吸引去除培养基后，添加4mLSf900III培养基(Invitrogen公司制)，在27℃下培养72小时。之后，通过吸取操作从平板中回收游离的细胞和培养液，在5,000×g下离心5分钟之后，将上清作为一次病毒液进行回收。
在此，lipid-DNAcomplexes溶液是指，将分别制备的A溶液(100μLGrace’sInsectMedium、Unsupplemented和10μL杆状病毒质粒(0.1μg/μL)的混合液)和B溶液(Grace’sInsectMedium、Unsupplemented100μL和Cellfectin(注册商标)IIReagent(Invitrogen公司制)8μL的混合液)平稳地充分混合后，在室温下静置30分钟后的溶液。
使用50mLSf900III培养基，对于在转瓶(容量：100mL)中接种5×107个Sf21细胞的培养液总量添加一次病毒液，在27℃下搅拌培养72小时。之后，将培养液在5,000×g下离心5分钟之后，将上清作为二次病毒液进行回收。
使用900mLSf900III培养基，对于在带挡板烧瓶(容量：3L)中接种1×109个Sf21细胞的培养液添加40mL二次病毒液，在27℃下振荡培养72小时。之后，将培养液在10,000×g下离心20分钟之后，回收上清并得到含有HG-5epi的培养液。
<实施例9>HG-5epi的精制(1)
对于含有在上述<实施例8>中得到的HG-5epi的培养液80mL，添加1.6mL的10％CHAPS(3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]propanesulfonate)并进行平稳地混合。将该溶液以流速1mL/分钟总量进样在使用50mMTris-HCl(pH7.4)/0.1％CHAPS10mL进行平衡化后的HiTrapHeparinHP柱(GEHEALTHCARE公司制)1mL中。接着，以流速0.2mL/分钟对4mL的50mMTris-HCl(pH7.4)/0.1％CHAPS进行通液，溶出HG-5epi。
HG-5epi的溶出组分通过使用作为抗FLAG抗体的M2monoclonalantibody(Sigma-Aldrich公司制)的WesternBlotting法进行确认。即，将上述的柱精制中的溶出组分供于还原条件下的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，通过半干法将在凝胶内分离的蛋白质转录于PVDF膜。将转录后的PVDF膜浸渍于含有5％脱脂乳的TBS-T(20mMTris-HCl(pH7.4)、500mMNaCl、0.2％TritonX-100、0.05％Tween20)中，在室温下振荡1小时进行阻断。接着，将PVDF膜浸渍在用含有5％脱脂乳的TBS-T将过氧化物酶标记抗FLAG抗体(Sigma-Aldrich公司制)稀释至2,000倍的溶液中，在室温下振荡1小时进行抗体染色。用TBS-T清洗PVDF膜，浸渍于SuperSignal(注册商标)WestDura(ThermoScientific公司制)中1分钟之后，使用ImageQuantLAS4000(GEHEALTHCARE公司制)检测出发光信号。基于对作为浓度已知的标准试样与同时供于电泳的Amino-terminalFLAG-BAPFusionProtein(Sigma-Aldrich公司制)的发光信号强度(亮度)的比较计算出蛋白质浓度，其结果HG-5epi的浓度为0.4μg/μL。
将由此方式得到的HG-5epi的溶出组分作为“粗精制重组HG-5epi”供于以后的实验。
<实施例10>HG-5epi的昆虫细胞表达用载体的制作(2)
为了得到HG-5epi的昆虫细胞表达系统用载体，进行了将在上述<实施例5>中得到的pBS/HG-5epi作为模板的PCR反应。PCR反应的引物使用序列号37和序列号38的寡核苷酸。PCR反应使用AccuprimeTaqDNAPolymeraseHighFidelity进行依据另附的实验方案的操作来制备PCR反应液。PCR反应的条件设为94℃20秒钟、(94℃20秒钟、62℃20秒钟、68℃4分钟)×18个循环。使用TOPO(注册商标)TACloning(注册商标)Kit(Invitrogen公司制)进行依据另附的实验方案的操作，得到插入了在pCR(注册商标)2.1-TOPO扩增的DNA片段的载体。
使用该载体对大肠杆菌DH5α株进行转化之后，涂布在LB/Amp琼脂培养基的平板上，在37℃下静置培养整夜并得到单菌落。将该菌落植菌于LB/Amp培养基2mL中并在37℃下振荡培养整夜，得到大肠杆菌的菌体。使用QIAprepSpinMiniprepKit进行依据另附的实验方案的操作，从该菌体中得到载体。使用限制酶SalI(TakaraBIO公司制)和KpnI(TakaraBIO公司制)对该载体进行限定分解之后，使用MinEluteGelExtractionKit进行依据另附的实验方案的操作，精制并得到DNA片段(约1.7kbp)。对于作为表达载体的pFBIF2(后述)而言也同样实施了利用限制酶的限定分解和精制。其次，使用T4DNALigase进行依据另附的实验方案的操作，使pFBIF2与该DNA片段连接。
使用该连接反应液对大肠杆菌TOP10株(Invitrogen公司制)进行转化之后，涂布在LB/Amp琼脂培养基的平板上，在37℃下静置培养整夜并得到单菌落。将该菌落植菌于4mLLB/Amp培养基中并在37℃下振荡培养整夜，得到大肠杆菌的菌体。使用QIAprepSpinMiniprepKit进行依据另附的实验方案的操作，从该菌体中得到载体。其次，进行了使用BigDyeTerminatorv3.1CycleSequencingKit的序列反应，使用AppliedBiosystems3130xlGeneticAnalyzer进行序列解析。其结果，确认了所连接的DNA片段的碱基序列与序列号1的碱基编号100～1806的碱基序列相同。以此方式得到HG-5epi的昆虫细胞表达用载体(pFBIF2/HG-5epi)。
此处所谓的pFBIF2是指，将对由小鼠Igκ链的分泌信号肽的氨基酸序列(序列号31)和FLAG标签的氨基酸序列(序列号32)构成的多肽的氨基酸序列(序列号34)进行编码的DNA插入pFastBac1的多克隆位点而制作的昆虫细胞表达用载体。具体而言，pFBIF2是如下载体：将亚克隆由序列号33的碱基序列构成的DNA的载体作为模板，通过以序列号39和序列号40的寡核苷酸为引物的PCR反应而得到DNA片段，通过将该DNA片段与使用了限制酶和T4DNALigase的上述的方法相同地，在将pFastBac1的EcoRI和SalI作为两端的部位插入而得到。
由此方式而得到的pFBIF2/HG-5epi是用于表达融合了小鼠Igκ链的分泌信号、FLAG标签、由缬氨酸和天冬氨酸构成的二肽的接头、由序列号2中的氨基酸编号34～601所示的氨基酸序列构成的多肽的多肽的载体。
<实施例11>HG-5epi表达用杆状病毒质粒的制备(2)
接着，使用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统进行依据另附的实验方案的操作，在pFBIF2/HG-5epi与杆状病毒质粒之间进行基因的重组，在杆状病毒质粒中插入了对小鼠Igκ链的分泌信号、FLAG标签、由缬氨酸和天冬氨酸构成的二肽的接头、由序列号2中的氨基酸编号34～601所示的氨基酸序列构成的多肽的融合多肽进行编码的DNA。
即，使用pFBIF1/HG-5epi对作为杆状病毒质粒制备用的大肠杆菌的DH10Bac株(Invitrogen公司制)进行转化，将含有卡那霉素、正大霉素、四环素、5-溴吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷(Bluo-gal)和异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)的LB琼脂培养基涂布于平板上，在37℃下静置培养整夜并得到白色的单菌落。之后，对Bac-to-Bac杆状病毒表达系统进行依据另附的实验方案的操作，从该菌体中得到杆状病毒质粒。通过琼脂糖凝胶电泳对通过将M13Forward(-40)(序列号41)和M13Reverse(序列号42)作为引物的PCR反应而进行扩增的DNA片段的大小进行确认，确认了在杆状病毒质粒中全长插入了目标DNA。
<实施例12>使用昆虫细胞的HG-5epi的制备(2)
将在上述<实施例7>中得到的杆状病毒质粒引入昆虫细胞Sf21中。即，使用Grace’sInsectMedium、Unsupplemented(Invitrogen公司制)2mL，在35mm培养皿中接种8×105个Sf21细胞，在27℃下培养1小时并使细胞粘附在培养皿上。确认细胞粘附在培养皿上之后，添加0.2mLlipid-DNAcomplexes溶液(后述)，在27℃下培养5小时。之后，从培养皿中吸引去除培养基之后，添加4mLSf900III培养基(Invitrogen公司制)，在27℃下培养72小时。之后，通过吸取操作从平板中回收游离的细胞和培养液作为一次病毒液。
在此，lipid-DNAcomplexes溶液是指，将分别制备的A溶液(Grace’sInsectMedium、Unsupplemented100μL和杆状病毒质粒(0.1μg/μL)10μL的混合液)和B溶液(Grace’sInsectMedium、Unsupplemented100μL和8μLCellfectin(注册商标)IIReagent(Invitrogen公司制)的混合液)平稳地充分混合之后，在室温下静置30分钟后的溶液。
使用Sf900III培养基100mL，对于在转瓶(容量：100mL)中接种1×108个Sf21细胞的培养液总量添加一次病毒液，在27℃下搅拌培养72小时。之后，将培养液作为二次病毒液进行回收。
使用Sf900III培养基1.8L，对于在带挡板烧瓶(容量：3L)中接种2×109个Sf21细胞的培养液总量添加二次病毒液，在27℃下振荡培养96小时。之后，将培养液在10,000×g下离心20分钟之后，回收上清并得到含有HG-5epi的培养液。
<实施例13>HG-5epi的精制(2)
对于含有在上述<实施例12>中得到的HG-5epi的培养液400mL，添加10％CHAPS(3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]propanesulfonate)8mL并进行平稳地混合。将该溶液以流速2mL/分钟总量进样在使用50mL蒸馏水进行平衡化的HiTrapHeparinHP柱5mL中。接着，以流速1mL/分钟对22mL的20mMTris-HCl(pH7.4)/0.1％CHAPS进行通液，溶出HG-5epi并回收了组分。将含有HG-5epi的组分进行合并，以流速0.2mL/分钟总量进样在使用20mMTris-HCl(pH7.4)/0.1％CHAPS10mL进行平衡化的ANTI-FLAG(注册商标)M2AffinityGel柱(Sigma-Aldrich公司制)1mL中。接着，以流速0.2mL/分钟对10mL的20mMTris-HCl(pH7.4)/0.1％CHAPS/0.5MNaCl进行通液并清洗柱，然后以流速0.2mL/分钟将含有0.4mg/mL的FLAG肽的20mMTris-HCl(pH7.4)/0.1％CHAPS/150mMNaCl6mL进行通液，溶出HG-5epi并回收了组分。将含有HG-5epi的组分进行合并，总量移至Slide-A-Lyzer7.0KMWCODialysisCassette(ThermoScientific公司制)中，使用20mMTris-HCl(pH7.4)/0.1％CHAPS/150mMNaCl进行透析。
在各自的精制工序中，HG-5epi的溶出组分通过使用作为抗FLAG抗体的M2monoclonalantibody的WesternBlotting法进行确认。即，将上述的柱精制中的溶出组分供于还原条件下的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，通过半干法将在凝胶内分离的蛋白质转录于PVDF膜。将转录后的PVDF膜浸渍于含有5％脱脂乳的TBS-T(20mMTris-HCl(pH7.4)、500mMNaCl、0.2％TritonX-100、0.05％Tween20)中，在室温下振荡1小时进行阻断。接着，将PVDF膜浸渍在用含有5％脱脂乳的TBS-T将过氧化物酶标记抗FLAG抗体稀释至2,000倍的溶液中，在室温下振荡1小时进行抗体染色。用TBS-T清洗PVDF膜，浸渍于SuperSignalWestDura中1分钟之后，使用ImageQuantLAS4000检测出发光信号。基于对作为浓度已知的标准试样与同时进行电泳的Amino-terminalFLAG-BAPFusionProtein的发光信号强度(亮度)的比较计算出蛋白质浓度，其结果HG-5epi的浓度为0.5μg/μL。
另外，关于通过上述的柱精制而得到的HG-5epi的溶出组分，如图1所示，在对供于还原条件下的SDS-PAGE的凝胶进行CBB染色时，与分子量标准(Precisionplusproteinunstainedstandards；Bio-Rad公司制)进行比较，仅约75kDa的单条带为可确认的组分。
将由此方式得到的HG-5epi的溶出组分作为“重组HG-5epi”供于以后的实验。
<参考例3>通过HPLC柱后标记法的IdoA含量的测定方法
IdoA含量的测定通过图2所示的流程图的HPLC柱后标记法进行。为了进行通过荧光光度计的检测而在标记糖的试剂(标签化试剂)中使用2-氰基乙酰胺。分析柱中作为保护柱使用CarboPacPA1(内径：4mm×长度：50mm)(NIPPONDIONEXK.K.制)、作为分离柱使用CarboPacPA1(内径：4mm×长度：250mm)(NIPPONDIONEXK.K.制)，使用将两者串联连接的柱。另外，柱温为室温。
对洗脱液进行送液的HPLC系统使用Alliance2695(Waters公司制)。流动相使用溶剂A(蒸馏水)和溶剂B(0.1M乙酸钠)。洗脱根据线性梯度进行，从分析开始到2分钟后溶剂B的比率为0％，从2分钟后到5分钟后之间溶剂B的比率从0％变化为5％，从5分钟后到65分钟后之间溶剂B的比率从5％变化为10％。流速设为0.8mL/分钟。
对标签化试剂进行送液的HPLC泵使用600E(Waters公司制)。流动相使用溶剂C(0.5％2-氰基乙酰胺)和溶剂D(0.25MNaOH)。送液以等度洗脱进行，对将溶剂C和溶剂D以在线计1：1的比率混合而成的溶液进行送液。流速设为0.6mL/分钟。
根据上述的条件介由三通将柱通液的洗脱液与标签化试剂进行合流之后，依次使反应线圈(内径：0.5mm×长度：10m)、冷却线圈(内径：0.25mm×长度：3m)、荧光检测器进行通液。为了用2-氰基乙酰胺标记从柱溶出的糖，反应线圈使用DryReactionBathDB-5(ShimamuraTech公司制)并加热至125℃。为了对用反应线圈加热的溶液进行冷却，冷却线圈以浸渍于室温的蒸馏水的状态使用。荧光检测器使用2475(Waters公司制)，设定激发波长为346nm、以及荧光波长为410nm。
对NAH或CDSNAc-HEP进行N-脱乙酰化和亚硝酸分解，将供于HPLC柱后标记法而得到的色谱图示于图3。N-脱乙酰化和亚硝酸分解根据在后述的<实施例14>、<实施例16>或<实施例17>中所述的方法实施。关于进行N-脱乙酰化和亚硝酸分解而得到的二糖，NAH的情况下，仅为由GlcA和aMan构成的二糖(GlcA-aMan)，CDSNAc-HEP的情况下，为由IdoA和aMan构成的二糖(IdoA-aMan)与GlcA-aMan这2种。因此，从两色谱图的比较中可知，能够分离并检测出GlcA-aMan和IdoA-aMan。
另外，对将GlcA-aMan和IdoA-aMan的标准品分别供于HPLC柱后标记法而得到的峰面积进行比较，其结果可知有关每一峰面积的物质量，IdoA-aMan为GlcA-aMan的1.3倍。因此，IdoA含量可以将GlcA-aMan和IdoA-aMan的峰面积代入到下述的数学式中计算出。
此处使用的GlcA-aMan的标准品是通过后述的<参考例4>而得到的物质。另外，此处使用的IdoA-aMan的标准品是通过后述的<参考例5>而得到的物质。
<参考例4>GlcA-aMan标准品的制备
将20mgNAH的干燥粉末溶解于4mL的肼试剂(将硫酸肼40mg溶解于肼一水合物1mL的溶液)中，使用加热块在96℃下培养5小时。在该溶液中加入4mL蒸馏水进行稀释之后，总量移至Slide-A-Lyzer2.0KMWCODialysisCassette中，在蒸馏水中进行整夜透析并脱盐。之后，将该溶液供于冷冻干燥并制成干燥粉末。将该干燥粉末溶解于3mL的33％醋酸中，加入3mL的5％亚硝酸钠水溶液进行混合之后，在室温下静置90分钟。在该溶液中加入3mL的12.5％氨基磺酸铵水溶液并进行混合之后，在室温下静置30分钟。以此方式得到含有GlcA-aMan的溶液。
使用离心蒸发器将该溶液浓缩为1mL，将总量供于凝胶过滤柱进行脱盐。凝胶过滤柱使用填充了Bio-GelP-4Gel(Bio-Rad公司制)的柱(内径：2cm×长度：120cm)。另外，柱温设为4℃。流动相使用0.1M醋酸铵，流速设为0.15mL/分钟。洗脱液以每4.3mL进行分级，通过硫酸咔唑法(BITTERT,MUIRHM.,AnalBiochem.1962Oct；4：330-4.)确认GlcA-aMan的溶出组分。对GlcA-aMan的溶出组分进行合并，供于冷冻干燥并制成干燥粉末。
将该干燥粉末溶解于0.2mL的蒸馏水中，将总量分2次供于CarboPacPA1(内径：9mm×长度：250mm)(NIPPONDIONEXK.K.制)进行精制。流动相使用溶剂A(蒸馏水)和溶剂B(0.1M乙酸钠)。洗脱通过线性梯度进行，从0～5分钟后溶剂B的比率为0％，5～12分钟后溶剂B的比率从0％变化为5％，12～162分钟后溶剂B的比率从5％变化为10％。流速设为1.6mL/分钟。洗脱液以每0.8mL进行分级，将各组分供于HPLC柱后标记法，确认了GlcA-aMan的溶出组分。对GlcA-aMan的溶出组分进行合并，通过硫酸咔唑法对摩尔浓度进行了定量。
通过以上方式得到256μM的GlcA-aMan标准品的溶液3.2mL。
<参考例5>IdoA-aMan标准品的制备
将40mgCDSNS-HEP的干燥粉末溶解于0.4mL蒸馏水中，加入3.6mL的亚硝酸-硫酸溶液(在冰冷却后的0.5M亚硝酸钡2mL中加入2mL的0.5M硫酸进行混合之后，在20,000×g下离心1分钟而得到的上清)进行混合之后，在室温下静置20分钟。以此方式得到含有IdoA-aMan的溶液。
在该溶液中加入1.1mL的1M碳酸钠进行混合之后，使用离心蒸发器浓缩为1mL，将总量供于凝胶过滤柱进行脱盐。凝胶过滤柱使用填充了Bio-GelP-4Gel的柱(内径：2cm×长度：120cm)。另外，柱温设为4℃。流动相使用0.1M醋酸铵，流速设为0.24mL/分钟。洗脱液以每4mL进行分级，通过硫酸咔唑法对IdoA-aMan的溶出组分进行了确认。对IdoA-aMan的溶出组分进行合并，供于冷冻干燥并制成干燥粉末。
将该干燥粉末溶解于0.2mL的蒸馏水中，将总量分3次供于CarboPacPA1(内径：9mm×长度：250mm)进行精制。流动相使用溶剂A(蒸馏水)和溶剂B(0.1M乙酸钠)。洗脱根据线性梯度进行，0～5分钟后溶剂B的比率为0％，5～12分钟后溶剂B的比率从0％变化为5％，12～162分钟后溶剂B的比率从5％变化为10％。流速设为1.6mL/分钟。洗脱液以每0.8mL进行分级，将各组分供于HPLC柱后标记法，确认了IdoA-aMan的溶出组分。对IdoA-aMan的溶出组分进行合并，根据硫酸咔唑法对摩尔浓度进行定量。
通过以上方式得到362μM的IdoA-aMan标准品的溶液8mL。
<实施例14>将NAH作为底物的粗精制HG-5epi的活性测定
使用在上述<实施例9>中得到的粗精制重组HG-5epi(2μg)5μL，制备总量50μL的反应液，在30℃的水浴中培养17小时。反应液以最终浓度成为50mMPIPES-NaOH(pH7.0)、0.1％CHAPS、10mg/mLNAH的组成的方式进行制备。之后，加入含1.3％乙酸钾的乙醇117μL并进行混合后，在20,000×g下离心5分钟使多糖沉淀。去除上清，将沉淀溶解于100μL蒸馏水中。进而，加入含1.3％乙酸钾的乙醇234μL并进行混合之后，在20,000×g下离心5分钟使多糖再次沉淀。去除上清并使其风干后，将沉淀溶解于60μL蒸馏水中，供于冷冻干燥并制成干燥粉末。
将该干燥粉末溶解于0.12mL肼试剂(将硫酸肼40mg溶解于肼一水合物1mL的溶液)中，使用加热块在96℃下培养5小时。加入0.2mL蒸馏水进行稀释之后，将总量移至Slide-A-Lyzer2.0KMWCODialysisCassette中，在蒸馏水中进行整夜透析并脱盐。之后，供于冷冻干燥并制成干燥粉末。
将该干燥粉末溶解于80μL的33％醋酸，加入80μL的5％亚硝酸钠水溶液并进行混合之后，在室温下静置80分钟。之后，加入80μL的12.5％氨基磺酸铵水溶液并进行混合之后，在室温下静置30分钟。使用离心蒸发器使其干燥之后，溶解于50μL蒸馏水中，将总量供于凝胶过滤柱进行脱盐。凝胶过滤柱使用将SuperdexPeptide10/300GL(GEHEALTHCARE公司制)2根进行串联连接的柱。另外，柱温设为室温。流动相使用0.1M醋酸铵，流速设为0.6mL/分钟。溶出物的检测使用分光检测器，紫外波长设定为200nm。对含有二糖(GlcA-aMan或IdoA-aMan)的峰的组分进行分取，供于冷冻干燥并制成干燥粉末。
接着，根据在上述<参考例3>中所述的方法，将分取的试样供于分析。具体而言，将该干燥粉末溶解于300μL的蒸馏水的溶液作为分析试样，取50μL供于HPLC柱后标记法。该结果示于图4。如图4的色谱图所示，由于能确认IdoA-aMan的峰，所以可知HG-5epi为NAH的GlcA残基异构化为IdoA残基的酶。另外，GlcA-aMan和IdoA-aMan的峰面积比(GlcA-aMan的峰面积：IdoA-aMan的峰面积)为72.7：27.3。因此，根据上述的数学式1计算出IdoA含量为32.8％。
<实施例15>将NSH作为底物的粗精制HG-5epi的活性测定
使用在上述<实施例9>中得到的粗精制重组HG-5epi(8μg)20μL，制备总量50μL的反应液，在30℃的水浴中培养17小时。反应液以最终浓度成为50mMPIPES-NaOH(pH7.0)、0.1％CHAPS、5mg/mLNSH的组成的方式进行制备。之后，加入含1.3％乙酸钾的乙醇117μL并进行混合之后，在20,000×g下离心分离5分钟使多糖沉淀。去除上清，将沉淀溶解于100μL蒸馏水中。进而，加入含1.3％乙酸钾的乙醇234μL并进行混合之后，在20,000×g下离心5分钟使多糖再次沉淀。去除上清并使沉淀风干之后，溶解于10μL蒸馏水中。
在该溶液中加入40μL的亚硝酸-硫酸溶液(在0.5mL的冰冷却后的0.5M亚硝酸钡中加入0.5mL的0.5M硫酸并进行混合之后，在20,000×g下离心1分钟而得到的上清)并进行混合之后，在室温下静置15分钟。加入12μL的1M碳酸钠并进行混合之后，将总量供于凝胶过滤柱进行脱盐。凝胶过滤柱使用将SuperdexPeptide10/300GL(GEHEALTHCARE公司制)2根进行串联连接的柱。另外，柱温设为室温。流动相使用0.1M醋酸铵，流速设为0.6mL/分钟。溶出物的检测使用分光检测器，紫外波长设定为200nm。对含有二糖(GlcA-aMan或IdoA-aMan)的峰的组分进行分取，供于冷冻干燥并制成干燥粉末。
接着，根据在上述<参考例3>中所述的方法，将分取的试样供于分析。具体而言，将该干燥粉末溶解于300μL的蒸馏水的溶液作为分析试样，取50μL供于HPLC柱后标记法。该结果示于图5。如图5的色谱图所示，由于未能检测出IdoA-aMan的峰，所以可知HG-5epi为实质上未将NSH的GlcA残基异构化为IdoA残基的酶。
<实施例16>将NAH作为底物的HG-5epi的活性测定
使用在上述<实施例13>中得到的重组HG-5epi(5μg)10μL，制备总量50μL的反应液，在30℃的水浴中培养12小时。反应液以最终浓度成为50mMBisTris-NaOH(pH6.0)、5mg/mLNAH的组成的方式进行制备。之后，加入含1.3％乙酸钾的乙醇117μL并进行混合之后，在20,000×g下离心5分钟使多糖沉淀。去除上清，将沉淀溶解于100μL蒸馏水中。进而，加入含1.3％乙酸钾的乙醇234μL并进行混合之后，在20,000×g下离心5分钟使多糖再次沉淀。去除上清并使其风干后，将沉淀溶解于60μL蒸馏水中，供于冷冻干燥并制成干燥粉末。
将该干燥粉末溶解于0.12mL肼试剂(将硫酸肼40mg溶解于肼一水合物1mL的溶液)，使用加热块在96℃下培养5小时。加入0.2mL蒸馏水进行稀释之后，将总量移至Slide-A-Lyzer2.0KMWCODialysisCassette，在蒸馏水中整夜透析并进行脱盐。之后，供于冷冻干燥并制成干燥粉末。
将该干燥粉末溶解于100μL的33％醋酸，加入100μL的5％亚硝酸钠水溶液并进行混合之后，在室温下静置80分钟。之后，加入100μL的12.5％氨基磺酸铵水溶液并进行混合之后，在室温下静置30分钟。使用离心蒸发器使其干燥之后，溶解于50μL蒸馏水中，将总量供于凝胶过滤柱进行脱盐。凝胶过滤柱使用将SuperdexPeptide10/300GL(GEHEALTHCARE公司制)2根进行串联连接的柱。另外，柱温设为室温。流动相使用0.1M醋酸铵，流速设为0.6mL/分钟。溶出物的检测使用分光检测器，紫外波长设定为200nm。通过硫酸咔唑法对二糖(GlcA-aMan或IdoA-aMan)的溶出组分进行确认并分取，供于冷冻干燥并制成干燥粉末。
接着，根据在上述<参考例3>中所述的方法，将分取的试样供于分析。具体而言，将该干燥粉末溶解于250μL的蒸馏水的溶液作为分析试样，取50μL供于HPLC柱后标记法。该结果示于图6。如图6的色谱图所示，由于能确认IdoA-aMan的峰，所以可知HG-5epi为NAH的GlcA残基异构化为IdoA残基的酶。另外，GlcA-aMan和IdoA-aMan的峰面积比(GlcA-aMan的峰面积：IdoA-aMan的峰面积)为73.1：26.9。由此，根据上述的数学式1计算出IdoA含量为32.4％。
<实施例17>将CDSNAc-HEP作为底物的HG-5epi的活性测定
使用在上述<实施例13>中得到的重组HG-5epi(1.0～8.0μg)2～16μL制备总量100μL的反应液，在30℃的加热块中静置并培养6小时。反应液以最终浓度成为50mMBisTris-NaOH(pH6.0)、0.1％CHAPS、5mg/mLCDSNAc-HEP组成的方式进行了制备。之后，加入含1.3％乙酸钾的乙醇234μL并进行混合之后，在20,000×g下离心5分钟使多糖沉淀。去除上清，将沉淀溶解于100μL蒸馏水中。进而，加入含1.3％乙酸钾的乙醇234μL并进行混合之后，在20,000×g下离心5分钟使多糖再次沉淀。去除上清并使其风干后，将沉淀溶解于200μL蒸馏水中，供于冷冻干燥并制成干燥粉末。
将该干燥粉末溶解于0.3mL肼试剂(将硫酸肼40mg溶解于肼一水合物1mL的溶液)，使用加热块在96℃下培养7小时。加入0.2mL蒸馏水进行稀释之后，将总量移至Slide-A-Lyzer2.0KMWCODialysisCassette，使用蒸馏水进行透析。之后，供于冷冻干燥并制成干燥粉末。
将该干燥粉末溶解于200μL的33％醋酸，加入200μL的5％亚硝酸钠水溶液并进行混合之后，在室温下静置90分钟。之后，加入200μL的12.5％氨基磺酸铵水溶液并进行混合之后，在室温下静置30分钟。使用离心蒸发器浓缩为100μL，将总量供于凝胶过滤柱进行脱盐。凝胶过滤柱使用将SuperdexPeptide10/300GL(GEHEALTHCARE公司制)2根进行串联连接的柱。另外，柱温设为室温。流动相使用0.1M醋酸铵，流速设为0.6mL/分钟。溶出物的检测使用分光检测器，紫外波长设定为200nm。对含有二糖(GlcA-aMan或IdoA-aMan)的峰的组分进行分取，供于冷冻干燥并制成干燥粉末。
接着，根据在上述<参考例3>中所述的方法，对分取的试样进行分析。具体而言，将该干燥粉末溶解于300μL的蒸馏水的溶液作为分析试样，取50μL供于HPLC柱后标记法。该结果示于表1。
[表1]
表1
如表1所示，由于确认到HG-5epi的添加量依存性IdoA含量减少的倾向，所以可知HG-5epi为将CDSNAc-HEP的IdoA残基异构化为GlcA残基的酶。
<实施例18>将CDSNS-HEP作为底物的HG-5epi的活性测定
使用在上述<实施例13>中得到的重组HG-5epi(2.5μg)5μL，制备总量50μL的反应液，在30℃的水浴中培养17小时。反应液以最终浓度成为50mMPIPES-NaOH(pH7.0)、0.1％CHAPS、5mg/mLCDSNS-HEP的组成的方式进行制备。之后，加入含1.3％乙酸钾的乙醇117μL并进行混合之后，在20,000×g下离心5分钟使多糖沉淀。去除上清，将沉淀溶解于100μL蒸馏水中。进而，加入含1.3％乙酸钾的乙醇234μL并进行混合之后，在20,000×g下离心5分钟使多糖再次沉淀。去除上清并使沉淀风干之后，溶解于10μL蒸馏水中。
在该溶液中加入40μL的亚硝酸-硫酸溶液(在0.5mL的冰冷却后的0.5M亚硝酸钡中加入0.5mL的0.5M硫酸并进行混合之后，在20,000×g下离心1分钟而得到的上清)并进行混合之后，在室温下静置15分钟。加入12μL的1M碳酸钠并进行混合之后，将总量供于凝胶过滤柱进行脱盐。凝胶过滤柱使用将SuperdexPeptide10/300GL(GEHEALTHCARE公司制)2根进行串联连接的柱。另外，柱温设为室温。流动相使用0.1M醋酸铵，流速设为0.6mL/分钟。溶出物的检测使用分光检测器，紫外波长设定为200nm。根据硫酸咔唑法对二糖(GlcA-aMan或IdoA-aMan)的溶出组分进行确认并分取，供于冷冻干燥并制成干燥粉末。
接着，根据在上述<参考例3>中所述的方法，将分取的试样供于分析。具体而言，将该干燥粉末溶解于300μL的蒸馏水的溶液作为分析试样，取50μL供于HPLC柱后标记法。该结果示于表2。
[表2]
表2
如表2所示，由于反应前后的IdoA含量实质上没有发生变化，所以可知HG-5epi为实质上未将CDSNS-HEP的IdoA残基异构化为GlcA残基的酶、以及实质上未将CDSNS-HEP的GlcA残基异构化为IdoA残基的酶。
<实施例19>[5-3H]NAH的制备
由于作为使用了放射性同位素的HG-5epi活性的测定中的底物使用，所以制备了用3H(氚)取代HexA残基的5位的氢原子的NAH(以下称为“[5-3H]NAH”。)。以下示出步骤。
使用在上述<实施例9>中得到的粗精制重组HG-5epi(0.08mg)0.2mL，制备总量2.7mL的反应液，在30℃的加热块中培养24小时。反应液是对于溶液混合0.2mL的重组HG-5epi制备而成，所述溶液是将0.5MPIPES-NaOH(pH7.0)0.25mL、10％CHAPS0.025mL、50mg/mLNAH1mL的混合液进行冷冻干燥之后，将冷冻干燥物再溶解于2.5mL的3H2O(氚水)而得到的。之后，使用加热块在95℃下5分钟培养，使酶失活。
将该溶液以流速2mL/分钟总量进样至使用20mMPIPES-NaOH(pH7.0)/0.1％CHAPS100mL平衡化了的QSepharoseHP柱(GEHEALTHCARE公司制)20mL中。接着，对20mMPIPES-NaOH(pH7.0)/0.1％CHAPS/0.1MNaCl66mL进行通液并清洗柱之后，对20mMPIPES-NaOH(pH7.0)/0.1％CHAPS/0.5MNaCl34mL进行通液，使[5-3H]NAH溶出并进行组分回收。
[5-3H]NAH的溶出组分根据使用了液体闪烁计数器(Tri-Carb3110TR；PerkinElmer公司制)的测定进行了确认。对含有[5-3H]NAH的组分进行合并，将总量移至Slide-A-Lyzer2.0KMWCODialysisCassette，根据使用蒸馏水的透析进行脱盐。将该溶液供于冷冻干燥并制成干燥粉末之后，再溶解于1.6mL蒸馏水中。
进行2次从上述的酶反应到回收[5-3H]NAH的操作，对得到的组分进行合并。根据以上方式，得到3.0mL6.3KBq/mL的[5-3H]NAH的溶液。
<实施例20>使用放射性同位素的HG-5epi的活性测定(1)
使用了放射性同位素的HG-5epi活性的测定方法是使用[5-3H]NAH作为底物，对由HG-5epi活性对[5-3H]NAH中的HexA残基被异构化时所产生的3H2O的放射活性进行测定并对HG-5epi活性进行定量的方法。以下示出步骤。
使用0.3～10μL(0.15～5μg)在上述<实施例13>中得到的重组HG-5epi，制备总量50μL的反应液，在30℃的水浴中培养4小时。反应液以最终浓度成为50mMPIPES-NaOH(pH7.0)、0.1％CHAPS、100kdpm/mL[5-3H]NAH的组成的方式进行制备。反应结束后，为了从该溶液中去除[5-3H]NAH，将总量进样至使用蒸馏水平衡化了的填充有QSepharoseHP0.16mL的离心柱中，在2,000×g下离心20秒钟。其次，将0.1mL的蒸馏水进样离心柱，重复2次在2,000×g下离心20秒钟的操作。对从离心柱被溶出后的溶液进行总量回收，使用液体闪烁计数器测定溶液中的3H浓度(dpm)。该结果示于表3。
[表3]
表3
如表3所示，由于重组HG-5epi的混合量(HG-5epi活性的量)和测定值(dpm)为正相关，所以可知通过本实施例所述的方法可对HG-5epi活性进行定量。另外，可知通过适宜设定重组HG-5epi的混合量从而可得到包括所期望的IdoA含量的多糖。
<实施例21>使用放射性同位素的HG-5epi的活性测定(2)
使用0.21～5μL(0.110～2.630μg)在上述<实施例13>中得到的重组HG-5epi，制备总量50μL的反应液，在30℃的水浴中培养2～48小时。反应液以最终浓度成为50mMBis-Tris-HCl(pH6.0)、180kdpm/mL[5-3H]NAH的组成的方式进行制备。之后，混合0.1mL0.1MTris并使酶反应停止。为了从该溶液中去除[5-3H]NAH，将总量进样至填充有使用蒸馏水平衡化了的QSepharoseHP0.16mL的离心柱中，在2,000×g下离心20秒钟。其次，0.1mL的0.1MTris进样在离心柱中，重复2次在2,000×g下离心20秒钟的操作。对从离心柱被溶出后的溶液进行总量回收，使用液体闪烁计数器测定溶液中的3H浓度(dpm)。该结果示于表4。
[表4]
表4
表4所示的值(dpm/μg)是从3H浓度的测定值(dpm)减去空白值之后，除以混合的HG-5epi的量(μg)而计算出的值。如表4所示，由于反应时间与每一单位酶量的测定值(dpm/μg)成正相关，所以可知在使用[5-3H]NAH的HG-5epi的活性测定中，测定值(dpm)与HG-5epi的混合量(HG-5epi活性的量)和反应小时的乘积成正相关。由此可知，反应时间与测定值为正相关，可通过测定3H浓度(dpm)的经时变化对HG-5epi活性进行定量。另外，通过适宜设定反应时间，从而能得到包括所期望的IdoA含量的多糖。
<实施例22>HG-5epi活性的最适pH的研究
为了对HG-5epi活性的最适pH进行研究，在pH4.5～pH7.5的水溶液中进行酶反应，测定HG-5epi活性。
使用5μL(2.5μg)在上述<实施例13>中得到的重组HG-5epi，制备总量50μL的反应液，在30℃的水浴中培养2小时。反应液以最终浓度成为50mMMcIlvaineBuffer(pH4.5～7.5)、0.1％CHAPS、180kdpm/mL[5-3H]NAH的组成的方式进行制备。之后，混合0.1MTris0.1mL并使酶反应停止。为了从该溶液中去除[5-3H]NAH，将总量进样至填充有使用蒸馏水平衡化了的QSepharoseHP0.16mL的离心柱中，在2,000×g下离心20秒钟。其次，将0.1mL的0.1MTris进样在离心柱中，重复2次在2,000×g下离心20秒钟的操作。对从离心柱被溶出后的溶液进行总量回收，使用液体闪烁计数器测定溶液中的3H浓度(dpm)。该结果示于表5。需要说明的是，表5中所述的测定值(dpm)是pH7.0中的空白值，即，是减去了代替重组HG-5epi加入等量的水并进行与上述相同的操作而得到的溶液的测定值之后的值。
[表5]
表5
如表5所示，HG-5epi活性在pH5.5时变为最大，在pH6.0时也显示出同等活性。由此，可知HG-5epi是最适pH为pH5.5～6.0的酶。
<实施例23>盐对HG-5epi活性所产生的影响的研究
为了评价盐对HG-5epi活性所产生的影响，以氯化钠(NaCl)、氯化镁(MgCl2)、氯化钙(CaCl2)或氯化锰(MnCl2)的最终浓度成为1～64mM的方式混合并进行酶反应，测定HG-5epi活性。
使用2μL(1μg)在上述<实施例13>中得到的重组HG-5epi，制备总量50μL的反应液，在30℃的水浴中培养5小时。反应液除了以成为所期望的最终浓度的方式添加盐之外，以最终浓度成为50mMBis-Tris-HClBuffer(pH6.0)、180kdpm/mL[5-3H]NAH的组成的方式进行制备。之后，混合0.1MTris0.1mL并使酶反应停止。为了从该溶液中去除[5-3H]NAH，将总量进样至填充有使用蒸馏水平衡化了的QSepharoseHP0.16mL的离心柱中，在2,000×g下离心20秒钟。其次，将0.1mL的0.1MTris进样在离心柱中，重复2次在2,000×g下离心20秒钟的操作。对从离心柱被溶出后的溶液进行总量回收，使用液体闪烁计数器测定溶液中的3H浓度(dpm)。该结果示于表6。
[表6]
表6
如表6所示，可知NaCl、MgCl2、CaCl2或MnCl2的浓度依存性地抑制了HG-5epi活性。特别是可知在64mMCaCl2的存在下，测定值为空白值(30dpm)的3倍以下，因此可知实质上失去HG-5epi活性。
<实施例24>表面活性剂对HG-5epi活性所产生的影响的研究
为了评价表面活性剂对HG-5epi活性所产生的影响，将3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸(CHAPS)、脱氧胆酸钠、正辛基-β-D-葡萄糖苷或TritonX-100以最终浓度成为0.01～0.3％(w/v)的方式混合并进行酶反应，测定HG-5epi活性。
使用在上述<实施例13>中得到的重组HG-5epi(1μg)2μL，制备总量50μL的反应液，在30℃的水浴中培养5小时。反应液除了以成为所期望的最终浓度的方式添加表面活性剂之外，以最终浓度成为50mMBis-Tris-HClBuffer(pH6.0)、180kdpm/mL[5-3H]NAH的组成的方式进行制备。之后，混合0.1MTris0.1mL并使酶反应停止。为了从该溶液中去除[5-3H]NAH，将总量进样至填充有使用蒸馏水平衡化了的QSepharoseHP0.16mL的离心柱中，在2,000×g下离心分离20秒钟。其次，将0.1mL的0.1MTris进样在离心柱中，重复2次在2,000×g下离心20秒钟的操作。对从离心柱被溶出后的溶液进行总量回收，使用液体闪烁计数器测定溶液中的3H浓度(dpm)。该结果示于表7。
[表7]
表7
如表7所示，可知CHAPS、脱氧胆酸钠或正辛基-β-D-葡萄糖苷的浓度依存性地抑制了HG-5epi活性。特别是可知HG-5epi活性因脱氧胆酸钠而被强烈抑制，在最终浓度0.1％以上的脱氧胆酸钠的存在下HG-5epi活性被完全抑制。
产业上的可利用性
根据本发明，可提供一种具有HG-5epi活性的酶或多肽，由此可制造HexA残基被异构化的多糖。这样的HexA残基被异构化的多糖可期待作为新型材料有用。
<序列表的说明>
序列号1：非洲大蜗牛的HG-5epi的cDNA的碱基序列
序列号2：非洲大蜗牛的HG-5epi的氨基酸序列
序列号3：人的C5-epi的氨基酸序列
序列号4：斑马鱼的C5-epi的氨基酸序列
序列号5：线虫的C5-epi的氨基酸序列
序列号6：引物
序列号7、8：EcoRI接头
序列号9～15：引物
序列号16：非洲大蜗牛的HG-5epi的cDNA的部分序列
序列号17～22：引物
序列号23：非洲大蜗牛的HG-5epi的cDNA的部分序列
序列号24～27：引物
序列号28：非洲大蜗牛的HG-5epi的cDNA的部分序列
序列号29，30：引物
序列号31：小鼠Igκ链的分泌信号肽的氨基酸序列
序列号32：FLAG标签的氨基酸序列
序列号33：对小鼠Igκ链的分泌信号肽和FLAG标签进行编码的重组DNA的碱基序列
碱基编号34：由小鼠Igκ链的分泌信号肽和FLAG标签构成的多肽的氨基酸序列
序列号35～42：引物
Claims (14)
1.一种源自非洲大蜗牛的酶，其具有以下的(A)和(B)的特征：
(A)具有将N-乙酰基细菌肝素前体的葡萄糖醛酸残基异构化为艾杜糖醛酸残基的活性和/或将完全脱硫酸化·N-乙酰化肝素的艾杜糖醛酸残基异构化为葡萄糖醛酸残基的活性；
(B)实质上不具有将N-硫酸化细菌肝素前体的葡萄糖醛酸残基异构化为艾杜糖醛酸残基的活性和/或将完全脱硫酸化·N-再硫酸化肝素的艾杜糖醛酸残基异构化为葡萄糖醛酸残基的活性。
2.一种多肽，其为选自由以下的(A)～(C)组成的组：
(A)含有以下的(a1)或(a2)的氨基酸序列的多肽，
(a1)序列号2中的氨基酸编号1～601所示的氨基酸序列，
(a2)序列号2中的氨基酸编号34～601所示的氨基酸序列；
(B)含有所述(A)的多肽的氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加1个或几个氨基酸残基的氨基酸序列，且具有将N-乙酰基细菌肝素前体的葡萄糖醛酸残基异构化为艾杜糖醛酸残基的活性和/或将完全脱硫酸化·N-乙酰化肝素的艾杜糖醛酸残基异构化为葡萄糖醛酸残基的活性的多肽；
(C)含有向所述(A)或(B)的多肽添加了肽标签的融合多肽的氨基酸序列，且具有将N-乙酰基细菌肝素前体的葡萄糖醛酸残基异构化为艾杜糖醛酸残基的活性和/或将完全脱硫酸化·N-乙酰化肝素的艾杜糖醛酸残基异构化为葡萄糖醛酸残基的活性的多肽。
3.一种多肽，其具有以下的(A)～(C)的特征：
(A)具有将N-乙酰基细菌肝素前体的葡萄糖醛酸残基异构化为艾杜糖醛酸残基的活性和/或将完全脱硫酸化·N-乙酰化肝素的艾杜糖醛酸残基异构化为葡萄糖醛酸残基的活性；
(B)最适pH为5.5～6.0；
(C)在0.1％(w/v)以上的脱氧胆酸钠的存在下，实质上失去所述活性。
4.一种核酸，其对权利要求1所述的酶、或权利要求2或3所述的多肽进行编码。
5.一种DNA，其为选自由以下的(A)～(C)组成的组：
(A)含有以下的(a1)或(a2)的碱基序列的DNA，
(a1)序列号1中的碱基编号1～1806所示的碱基序列，
(a2)序列号1中的碱基编号100～1806所示的碱基序列；
(B)与由和所述(A)的DNA互补的碱基序列构成的DNA在严格的条件下杂交，且对具有将N-乙酰基细菌肝素前体的葡萄糖醛酸残基异构化为艾杜糖醛酸残基的活性和/或将完全脱硫酸化·N-乙酰化肝素的艾杜糖醛酸残基异构化为葡萄糖醛酸残基的活性的多肽进行编码的DNA；
(C)含有向所述(A)或(B)的DNA中添加了编码肽标签的DNA的融合DNA的碱基序列，且对具有将N-乙酰基细菌肝素前体的葡萄糖醛酸残基异构化为艾杜糖醛酸残基的活性和/或将完全脱硫酸化·N-乙酰化肝素的艾杜糖醛酸残基异构化为葡萄糖醛酸残基的活性的多肽进行编码的DNA。
6.一种载体，其含有权利要求4所述的核酸和/或权利要求5所述的DNA。
7.一种宿主细胞，其保持权利要求4所述的核酸、权利要求5所述的DNA和/或权利要求6所述的载体。
8.一种多肽的制造方法，其包括以下的(A)和(B)：
(A)使用权利要求7所述的宿主细胞，对具有将N-乙酰基细菌肝素前体的葡萄糖醛酸残基异构化为艾杜糖醛酸残基的活性和/或将完全脱硫酸化·N-乙酰化肝素的艾杜糖醛酸残基异构化为葡萄糖醛酸残基的活性的多肽进行表达的工序；
(B)收集在所述(A)的工序中所表达的多肽的工序。
9.一种多肽，其是通过权利要求8所述的方法得到的。
10.一种己糖醛酸残基被异构化的多糖的制造方法，其包括以下工序：
将酶和/或多肽与包含由N-乙酰萄糖胺残基和己糖醛酸残基构成的二糖的多糖接触，所述酶和/或多肽具有将N-乙酰基细菌肝素前体的葡萄糖醛酸残基异构化为艾杜糖醛酸残基的活性和/或将完全脱硫酸化·N-乙酰化肝素的艾杜糖醛酸残基异构化为葡萄糖醛酸残基的活性。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述酶为权利要求1所述的酶，所述多肽为权利要求2、3或9所述的多肽。
12.一种多糖，其是通过权利要求10或11所述的方法得到的。
13.一种多糖，其含有N-乙酰基细菌肝素前体的葡萄糖醛酸残基被异构化为艾杜糖醛酸残基的结构。
14.根据权利要求12或13所述的多糖，其中，存在于多糖的骨架中的己糖醛酸残基中的艾杜糖醛酸残基的比率为20％～75％。
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