CN105263484A - 包含二甲双胍和二氢槲皮素的药物组合及其用于治疗癌症的用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种能够降低二甲双胍或其药学上可接受的盐的副作用并用作抗恶性肿瘤剂的新型药剂，其中组合了二甲双胍或其药学上可接受的盐和二氢槲皮素或其药学上可接受的盐。

Description

包含二甲双胍和二氢槲皮素的药物组合及其用于治疗癌症的用途

技术领域

本发明涉及一种药剂，其中组合了二甲双胍或其药学上可接受的盐和二氢槲皮素或其药学上可接受的盐。

背景技术

专利文献1描述了通过将吡喃酮类似物或其衍生物与一种或多种其他药物(例如，降脂药或降糖药)组合给药来治疗和预防代谢紊乱和其他疾病的方法。作为吡喃酮类似物的实例之一，描述了花旗松素，并且作为降糖药的实例之一，描述了二甲双胍。但是，该文献没有公开二甲双胍和花旗松素的组合的任何具体实例，并且没有描述组合包含它们的药剂的针对恶性肿瘤的协同效果或降低乳酸酸中毒的效果。

【文献列表】

【专利文献】

专利文献1：WO2010/042886

发明内容

本发明要解决的问题

盐酸二甲双胍作为双胍类口服降糖药是市售可得的，并且已知具有激活AMP激活性蛋白激酶(AMPK)的作用。

近年来，已经有报道通过单独使用或者与现有的抗癌药组合使用具有激活AMPK作用的化合物(AMPK激活剂)，例如二甲双胍、苯乙双胍、寡霉素、二硝基酚、2-脱氧葡萄糖、5-氨基咪唑-4-甲酰胺核糖核苷酸、过氧化氢、山梨糖醇、卡西霉素、4-羟基-3-(2'-羟基联苯-4-基)-6-氧代-6,7-二氢噻吩并[2,3-b]吡啶-5-腈(A-769662)、山羊豆碱(galegine)、曲格列酮、苯巴比妥、槲皮素、白藜芦醇、小檗碱等，显示出了抗恶性肿瘤效果，并且已经考虑了将其开发成抗恶性肿瘤药。

但是，在上述化合物中，例如二甲双胍、苯乙双胍、5-氨基咪唑-4-甲酰胺核糖核苷酸、山梨糖醇、卡西霉素、A-769662、山羊豆碱、曲格列酮等的AMPK激活剂在接受所述给药的患者中伴有严重的乳酸酸中毒问题。

本发明目的是提供能够降低二甲双胍或其药学上可接受的盐的所述副作用并且用作抗恶性肿瘤剂的新型药剂。

已知二甲双胍具有抑制肿瘤干细胞的作用。这种抑制肿瘤干细胞的药剂有望不仅提供了抗恶性肿瘤效果，而且能够抑制肿瘤转移并防止复发。

本发明目的还在于提供具有抑制肿瘤干细胞作用并且用作抗恶性肿瘤剂的新型药剂。

解决问题的手段

本发明的发明人已经进行了深入的研究以尝试解决上述问题，并且发现二甲双胍或其药学上可接受的盐和二氢槲皮素或其药学上可接受的盐的组合抑制了由二甲双胍或其药学上可接受的盐导致的血乳酸值的增加。另外，本发明的发明人发现，二甲双胍或其药学上可接受的盐和二氢槲皮素或其药学上可接受的盐的组合显著地增强了二甲双胍或其药学上可接受的盐的抗恶性肿瘤作用。

本发明的发明人还发现，二氢槲皮素或其药学上可接受的盐能有效用于预防或治疗胰腺肿瘤。

本发明的发明人发现，二氢槲皮素或其药学上可接受的盐能有效抑制胰腺肿瘤干细胞。

基于上述发现，本发明的发明人进行了进一步的研究并且完成了本发明。

因此，本发明提供了如下项目。

1、一种药剂，其中组合了二甲双胍或其药学上可接受的盐和二氢槲皮素或其药学上可接受的盐，其中将二甲双胍或其药学上可接受的盐和二氢槲皮素或其药学上可接受的盐包含在单一制剂中，或者将二甲双胍或其药学上可接受的盐和二氢槲皮素或其药学上可接受的盐分别配制成药物组合物并组合使用。

2、根据上述项目1所述的药剂，其中将二甲双胍或其药学上可接受的盐和二氢槲皮素或其药学上可接受的盐包含在单一制剂中。

3、根据上述项目1所述的药剂，其中将二甲双胍或其药学上可接受的盐和二氢槲皮素或其药学上可接受的盐分别配制成药物组合物并组合使用。

4、根据上述项目1至3中任一项所述的药剂，其用于预防或治疗恶性肿瘤。

5、根据上述项目4所述的药剂，其中，所述恶性肿瘤为：儿童脑肿瘤，所述儿童脑肿瘤选自星形胶质细胞瘤、恶性髓母细胞瘤、胚细胞瘤、颅咽管瘤和室管膜瘤；成人脑瘤，所述成人脑瘤选自神经胶质瘤、胶质瘤、脑膜瘤、垂体腺瘤和神经鞘瘤；头颈癌，所述头颈癌选自上颌窦癌、咽癌、喉癌、口腔癌、唇癌、舌癌和腮腺癌；胸部癌症和肿瘤，所述胸部癌症和肿瘤选自小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺瘤病和间皮瘤；胃肠癌和肿瘤，所述胃肠癌和肿瘤选自食道癌、肝癌、原发性肝癌、胆囊癌、胆管癌、胃癌、结直肠癌、结肠癌、直肠癌、肛门癌、胰腺癌和胰腺内分泌肿瘤；泌尿器官癌和肿瘤，所述泌尿器官癌和肿瘤选自阴茎癌、肾盂·输尿管癌、肾细胞癌、睾丸肿瘤、前列腺癌、膀胱癌、肾母细胞瘤和泌尿道上皮癌；妇科癌症和肿瘤，所述妇科癌症和肿瘤选自外阴癌、宫颈癌、子宫体癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤、绒毛膜癌、阴道癌、乳腺癌、卵巢癌和卵巢生殖细胞肿瘤；成人和儿童软组织肉瘤；骨肿瘤，所述骨肿瘤选自骨肉瘤和尤因瘤(Ewing’stumor)；内分泌组织的癌症和肿瘤，所述内分泌组织的癌症和肿瘤选自肾上腺皮质癌和甲状腺癌；恶性淋巴瘤和白血病，所述恶性淋巴瘤和白血病选自恶性淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’slymphoma)、霍奇金病(Hodgkin’sdisease)、多发性骨髓瘤、浆细胞肿瘤、急性髓样白血病、急性淋巴性白血病、成人T细胞白血病淋巴瘤、慢性髓样白血病和慢性淋巴性白血病；和皮肤癌和肿瘤，所述皮肤癌和肿瘤选自慢性骨髓增生性疾病、恶性黑色素瘤、鳞状细胞癌、基底细胞癌和蕈样肉芽肿病。

6、根据上述项目1至5中任一项所述的药剂，其用于治疗用除了二甲双胍或其药学上可接受的盐和二氢槲皮素或其药学上可接受的盐之外的抗恶性肿瘤剂仅提供不充分疗效的患者。

7、根据上述项目1至5中任一项所述的药剂，其中组合了一种或多种除了二甲双胍或其药学上可接受的盐和二氢槲皮素或其药学上可接受的盐之外的抗恶性肿瘤剂。

8、根据上述项目6或7所述的药剂，其中，所述除了二甲双胍或其药学上可接受的盐和二氢槲皮素或其药学上可接受的盐之外的抗恶性肿瘤剂为分子靶向药物、烷化剂、代谢拮抗剂、植物生物碱、抗癌抗生素、激素剂或免疫治疗剂。

9、一种商品包装物，其包含根据上述项目1至8中任一项所述的药剂以及与其相关的书面材料，所述书面材料描述了该药剂能够或应当用于预防或治疗恶性肿瘤。

10、一种用于降低二甲双胍或其药学上可接受的盐的副作用的试剂，其包含二氢槲皮素或其药学上可接受的盐作为活性成分。

11、一种二甲双胍或其药学上可接受的盐的抗恶性肿瘤作用的增强剂，其包含二氢槲皮素或其药学上可接受的盐作为活性成分。

12、一种用于降低二甲双胍或其药学上可接受的盐的副作用的试剂，其包含二氢槲皮素或其药学上可接受的盐作为活性成分，其与二甲双胍或其药学上可接受的盐一起组合使用。

13、一种包含二氢槲皮素或其药学上可接受的盐作为活性成分的抗恶性肿瘤作用的增强剂，其与二甲双胍或其药学上可接受的盐一起组合使用。

14、二氢槲皮素或其药学上可接受的盐与二甲双胍或其药学上可接受的盐组合在制备用于预防或治疗恶性肿瘤的药剂中的用途。

15、一种预防或治疗恶性肿瘤的方法，其包括对有此需要的对象给药二甲双胍或其药学上可接受的盐和二氢槲皮素或其药学上可接受的盐，其中二甲双胍或其药学上可接受的盐和二氢槲皮素或其药学上可接受的盐作为单一制剂给药，或者作为同时或在不同时间点给药的单独制剂给药。

16、一种用于预防或治疗胰腺癌的药剂，其包含二氢槲皮素或其药学上可接受的盐作为活性成分。

17、一种预防或治疗胰腺癌的方法，其包括对有此需要的对象给药二氢槲皮素或其药学上可接受的盐。

18、二氢槲皮素或其药学上可接受的盐作为用于预防或治疗胰腺癌的药剂的用途。

19、二氢槲皮素或其药学上可接受的盐，其用于预防或治疗胰腺癌。

20、二氢槲皮素或其药学上可接受的盐在制备用于预防或治疗胰腺癌的药剂中的用途。

21、一种胰腺癌干细胞抑制剂，其包含二氢槲皮素或其药学上可接受的盐作为活性成分。

22、一种抑制胰腺癌干细胞的方法，其包括对有此需要的对象给药二氢槲皮素或其药学上可接受的盐。

23、二氢槲皮素或其药学上可接受的盐作为胰腺癌干细胞抑制剂的用途。

24、二氢槲皮素或其药学上可接受的盐，其用于抑制胰腺癌干细胞。

25、二氢槲皮素或其药学上可接受的盐在制备胰腺癌干细胞抑制剂中的用途。

26、一种药剂，其包含用于与二氢槲皮素或其药学上可接受的盐组合使用的二甲双胍或其药学上可接受的盐。

27、一种药剂，其包含用于与二甲双胍或其药学上可接受的盐组合使用的二氢槲皮素或其药学上可接受的盐。

发明效果

组合包含二甲双胍或其药学上可接受的盐和二氢槲皮素或其药学上可接受的盐的本发明的药剂具有协同抗恶性肿瘤效果，并且作为抗恶性肿瘤药物是有用的。

因为二氢槲皮素或其药学上可接受的盐抑制了由二甲双胍或其药学上可接受的盐导致的血乳酸值的增加，所以本发明的药剂为降低了乳酸酸中毒的安全药剂。

因为本发明的药剂具有协同抗恶性肿瘤效果，其能实现低剂量，并且进一步有望减少副作用。

包含二氢槲皮素或其药学上可接受的盐作为活性成分的本发明的药剂作为胰腺癌的预防或治疗药物是有用的。

吉西他滨是用于治疗胰腺癌的第一选择药物，其允许胰腺癌干细胞的生长，如下述实施例12的结果所示。

具有协同胰腺癌干细胞抑制效果的本发明的药剂作为胰腺癌的预防或治疗药物是特别有用的。另外，本发明的药剂和吉西他滨的组合有望改善在吉西他滨治疗中肿瘤干细胞的增加和复发风险的增加的问题，并且作为胰腺癌的预防或治疗药物是特别有用的。

包含二氢槲皮素或其药学上可接受的盐作为活性成分的本发明的药剂显示出了胰腺癌干细胞抑制效果。因此，其作为胰腺癌的预防或治疗药物是有用的，并且进一步有望防止胰腺癌的转移或复发。

附图说明

图1显示了实施例1的结果。

图2显示了实施例2的结果。

图3显示了实施例3的结果。

图4显示了实施例10中的二氢槲皮素的外消旋体((2R,3R)-二氢槲皮素和(2S,3S)-二氢槲皮素)的结果。

图5显示了实施例10中的光学活性二氢槲皮素((2R,3R)-二氢槲皮素)的结果。

图6显示了实施例11的结果。

图7显示了实施例12的结果。在附图中，Met指的是二甲双胍，DHQ指的是二氢槲皮素，以及Gem指的是吉西他滨。

具体实施方式

(I)二甲双胍或其药学上可接受的盐与二氢槲皮素或其药学上可接受的盐的组合使用

二甲双胍的药学上可接受的盐的实例包括与无机酸所成的盐、与有机酸所成的盐、与酸性氨基酸所成的盐等。

与无机酸所成的盐的实例包括与盐酸、氢溴酸、硝酸、硫酸、磷酸等所成的盐。与有机酸所成的盐的实例包括与甲酸、乙酸、三氟乙酸、富马酸、草酸、酒石酸、马来酸、柠檬酸、琥珀酸、苹果酸、甲磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸等所成的盐。与酸性氨基酸所成的盐的实例包括与天冬氨酸、谷氨酸等所成的盐。在这些盐中，盐酸盐是优选的。

二氢槲皮素是槲皮素的吡喃环的2位和3位之间的双键被还原的化合物，并且由下面的化学式表示：

二氢槲皮素基于2个不对称碳原子(色烷环的2位和3位)包含4个立体异构体((2R,3R)-二氢槲皮素、(2S,3S)-二氢槲皮素、(2R,3S)-二氢槲皮素、(2S,3R)-二氢槲皮素)。虽然本发明的二氢槲皮素可以为一种或多种这些异构体的组合或者这些异构体的外消旋体(例如(2R,3R)-二氢槲皮素和(2S,3S)-二氢槲皮素的混合物)，但是优选(2R,3R)-二氢槲皮素和(2S,3S)-二氢槲皮素的外消旋体和(2R,3R)-二氢槲皮素，并且特别优选(2R,3R)-二氢槲皮素。

这些异构体中，已知由下面化学式表示的(2R,3R)-二氢槲皮素包含在西伯利亚落叶松(Larixsibirica)中，并且也称为花旗松素(taxifolin)。本发明中，可以使用例如通过已知方法等提取的例如花旗松素的天然产物，并且也可以使用市售可得的产品。

二氢槲皮素的药学上可接受的盐的实例包括与无机碱所成的盐、与有机碱所成的盐、与碱性氨基酸所成的盐等。

与无机碱所成的盐的实例包括与碱金属(例如钠、钾等)、碱土金属(例如钙、镁等)以及铝、铵等所成的盐。与有机碱所成的盐的实例包括与三甲胺、三乙胺、吡啶、甲基吡啶、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、二环己基胺、N,N-二苄基乙二胺等所成的盐。与碱性氨基酸所成的盐的实例包括与精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸等所成的盐。优选的盐的实例包括碱金属盐和碱土金属盐。

在本发明中可用的二甲双胍或其药学上可接受的盐与二氢槲皮素或其药学上可接受的盐还包括其中一个或多个原子用具有特殊原子质量或质量数的一个或多个原子代替的同位素标记的相同化合物。可以被引入这些化合物中的所述同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、硫、氟和氯的同位素，例如²H、³H、¹³C、¹⁴C、¹⁵N、¹⁸O、¹⁷O、³³S、³⁴S、³⁶S、¹⁸F、³⁶Cl等。包含上述同位素和/或其他原子的其他同位素的特殊同位素标记的化合物(例如，引入例如³H、¹⁴C等的放射性同位素的化合物)对于药物组织分布评价和/或底物组织分布评价是有用的。考虑到制备的容易性和可检测性，氚(即³H)同位素和碳-14(即¹⁴C)同位素是特别优选的。此外，用例如氘(即²H)等较重的同位素取代有望改善代谢稳定性，例如，通过由于体内半衰期的增加或必要剂量的降低而在治疗中提供特殊优点。

在本发明的药剂中，将二甲双胍或其药学上可接受的盐和二氢槲皮素或其药学上可接受的盐组合使用。在本发明的药剂中，二甲双胍或其药学上可接受的盐和二氢槲皮素或其药学上可接受的盐可以被同时制剂或者可以被包含在相同制剂中。或者，二甲双胍或其药学上可接受的盐和二氢槲皮素或其药学上可接受的盐可以分别制剂，并且可以用相同的途径或不同的途径同时或在不同的时间点给单个对象给药。也即是说，本发明的药剂包括在单一制剂中包含二甲双胍或其药学上可接受的盐和二氢槲皮素或其药学上可接受的盐的药剂，和组合使用分别制剂的包含二甲双胍或其药学上可接受的盐的药物组合物和包含二氢槲皮素或其药学上可接受的盐的药物组合物的药剂。

通过，例如，根据已知方法将二甲双胍或其药学上可接受的盐和/或二氢槲皮素或其药学上可接受的盐与药理学上可接受的载体混合，本发明的药剂可以被配制成，例如，药物组合物，例如片剂(包括糖衣片，薄膜包衣片)、散剂、颗粒剂、胶囊剂(包括软胶囊)、液体剂、注射剂、栓剂、缓释制剂(例如，缓释微胶囊)、或者速释制剂，并安全地口服给药或肠胃外给药(例如，局部、直肠、静脉内给药等)。所述注射剂能够用于静脉内、肌内、皮下或器官内给药，或能够直接施用于病灶。

能够用于制备本发明的药剂的所述药理学上可接受的载体包括常规使用的各种有机或无机载体物质，例如用于固体制剂的赋形剂、润滑剂、粘合剂和崩解剂，用于液体制剂的溶剂、增溶剂、悬浮剂、等渗剂、缓冲剂和安抚剂，等等。此外，在必要时，还可以使用适量的通用添加剂，例如防腐剂、抗氧化剂、着色剂、甜味剂、吸附剂、润湿剂等等。

赋形剂的实例包括：乳糖、蔗糖、D-甘露醇、淀粉、玉米淀粉、结晶纤维素、轻质无水硅酸等。

润滑剂的实例包括硬脂酸镁、硬脂酸钙、滑石、胶体二氧化硅等。

粘合剂的实例包括结晶纤维素、蔗糖、D-甘露醇、糊精、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、淀粉、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠等。

崩解剂的实例包括淀粉、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钙、羧甲基淀粉钠、L-羟丙基纤维素等。

溶剂的实例包括注射用水、醇、丙二醇、聚乙二醇、芝麻油、玉米油、橄榄油等。

增溶剂的实例包括聚乙二醇、丙二醇、D-甘露醇、苯甲酸苄酯、乙醇、三氨基甲烷、胆固醇、三乙醇胺、碳酸钠、柠檬酸钠等。

悬浮剂的实例包括：表面活性剂，如硬脂基三乙醇胺、月桂基硫酸钠、月桂基氨基丙酸、卵磷脂、苯扎氯铵、苄索氯铵、单硬脂酸甘油酯等；亲水性聚合物，如聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素等；等等。

等渗剂的实例包括葡萄糖、D-山梨醇、氯化钠、甘油、D-甘露醇等。

缓冲剂的实例包括如磷酸盐、乙酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐等的缓冲剂等；等等。

安抚剂的实例包括苄醇等。

防腐剂的实例包括对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苄醇、苯乙醇、脱氢乙酸、山梨酸等。

抗氧化剂的实例包括亚硫酸盐、抗坏血酸、α生育酚等。

在本发明的药剂中的二甲双胍或其药学上可接受的盐和二氢槲皮素或其药学上可接受的盐的含量可以根据制剂的形式等适当地选择。

例如，在单一制剂中的含有二甲双胍和二氢槲皮素的本发明药剂中，相对于整个制剂，二甲双胍含量一般为约0.01至约99.99wt％，优选为约0.1至约50wt％，并且相对于整个制剂，二氢槲皮素的含量一般为约0.01至约99.99wt％，优选为约0.1至约50wt％。

在本发明药剂中，二甲双胍和二氢槲皮素的含量比例为，每1重量份的二氢槲皮素，约0.0005至300重量份的二甲双胍，优选约0.5至300重量份的二甲双胍，更优选约0.5至100重量份的二甲双胍，还更优选约2.5至50重量份的二甲双胍，特别优选约2.5至10重量份的二甲双胍。

另外，在本发明药剂中，二甲双胍和二氢槲皮素的含量比例为，每1摩尔的二氢槲皮素，约1至600摩尔的二甲双胍，优选约1至200摩尔的二甲双胍，更优选约5至100摩尔的二甲双胍，还更优选约5至20摩尔的二甲双胍。

虽然在本发明药剂中，例如载体等的添加剂的含量根据制剂类型而变化，但是相对于整个制剂，通常为约1至约99.99wt％，优选约10至约90wt％。

当二甲双胍和二氢槲皮素被分别制剂时，在含有二甲双胍的制剂中，相对于整个制剂，二甲双胍含量一般为约0.01至约100wt％，优选为约0.1至约90wt％，并且在含有二氢槲皮素的制剂中，相对于整个制剂，二氢槲皮素的含量一般为约0.01至约100wt％，优选为约0.1至约90wt％。例如载体等的添加剂的含量如上所述。

当二甲双胍和二氢槲皮素被分别制剂时，它们使用比率一般为，每1重量份的二氢槲皮素，约0.0005至300重量份的二甲双胍，优选约0.5至300重量份的二甲双胍，更优选约0.5至100重量份的二甲双胍，还更优选约2.5至50重量份的二甲双胍，特别优选约2.5至10重量份的二甲双胍。

另外，当二甲双胍和二氢槲皮素被分别制剂时，它们使用比率一般为，每1摩尔的二氢槲皮素，约0.001至600摩尔的二甲双胍，优选约1至600摩尔的二甲双胍，更优选约1至200摩尔的二甲双胍，还更优选约1至100摩尔的二甲双胍，特别优选约5至20摩尔的二甲双胍。

当使用二甲双胍的药学上可接受的盐和/或二氢槲皮素的药学上可接受的盐时，它们在制剂中的含量和含量比例在与上述对于二甲双胍和二氢槲皮素的含量和含量比例相同的范围内。

这些制剂可以用在制备步骤中常规使用的已知方法制备。

在注射剂的情况下，例如，注射剂(例如，Captisol制剂)可以如下制备：通过将二甲双胍或其药学上可接受的盐和/或二氢槲皮素或其药学上可接受的盐与分散剂(例如，吐温80(由美国AtlasPowder公司制造)、HCO60(由日光化学株式会社(NikkoChemicals)生产)、聚乙二醇、羧甲基纤维素、藻酸钠、羟丙基甲基纤维素、糊精等)、稳定剂(例如，抗坏血酸、焦亚硫酸钠等)、表面活性剂(例如，聚山梨醇酯80、聚乙二醇等)、增溶剂(例如，甘油、乙醇、Captisol(商品名，磺丁基醚-β-环糊精钠盐)等)、缓冲剂(例如，柠檬酸、磷酸及其碱金属盐、柠檬酸及其碱金属盐等)、等渗剂(例如，氯化钠、氯化钾、甘露醇、山梨醇、葡萄糖等)、pH调节剂(例如，盐酸、氢氧化钠等)、防腐剂(例如，对羟基苯甲酸乙酯、苯甲酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苄醇等)、溶解剂(例如，浓缩甘油、葡甲胺等)、增溶剂(例如，丙二醇、蔗糖等)、安抚剂(例如，葡萄糖、苄醇等)等一起制备水溶液注射剂，或通过将它们溶解、悬浮或乳化于植物油(如橄榄油、芝麻油、棉籽油、玉米油等)或增溶剂(如丙二醇等)中制备油性注射剂。

在口服制剂(片剂)的情况下，例如，口服制剂可以如下制备：混合二甲双胍或其药学上可接受的盐和/或二氢槲皮素或其药学上可接受的盐和赋形剂(例如，乳糖、蔗糖、淀粉、玉米淀粉等)、崩解剂(如淀粉、碳酸钙等)、粘合剂(例如，淀粉、阿拉伯树胶、羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基纤维素、明胶等)、润滑剂(例如，滑石、硬脂酸镁、聚乙二醇6000等)等，压缩模制所述混合物，然后在必要时通过用于掩蔽味道、肠溶包衣或可持续性的已知方法将其包衣。

这里使用的包衣剂的实例包括羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、羟甲基纤维素、羟丙基纤维素、聚乙二醇、吐温80、普朗尼克F68、乙酸邻苯二甲酸纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、羟甲基纤维素乙酸琥珀酸酯、尤特奇(Eudragit，由德国Rohm公司制造，甲基丙烯酸-丙烯酸共聚物)和染料(例如，氧化铁红、二氧化钛等)等。糖衣的实例包括蔗糖、滑石、阿拉伯树胶、染料(例如，氧化铁红、二氧化钛等)、抛光剂(例如，蜂蜡等)等。

在栓剂的情况下，例如，可以根据已知方法，通过使用底物，例如油性赋形剂(例如，高级脂肪酸的甘油酯[例如，可可脂、witepsols(由德国Dynamitnovel有限公司制造)等]、中链脂肪酸[例如，miglyols(由德国Dynamitnovel有限公司制造)等]、植物油(例如，芝麻油、大豆油、棉籽油等)等))、水性赋形剂(如，聚乙二醇、丙二醇等)、水性凝胶赋形剂(例如，天然树胶、纤维素衍生物、乙烯基聚合物、丙烯酸聚合物等)等将二甲双胍或其药学上可接受的盐和/或二氢槲皮素或其药学上可接受的盐配制成油性或水性固体、半固体或液体栓剂。

本发明的药剂显示了降低的副作用，并且可以安全地给人类和动物(如小鼠，大鼠，兔，狗，猫，牛，马，猪，猴等)给药。

本发明药剂的剂量可以根据用途、患者的年龄和性别、疾病的严重程度等适当地选择。本发明药剂的剂量对于成人(体重60千克)每天通常为约250-3000毫克，优选500-2250毫克的二甲双胍或其药学上可接受的盐，以及通常为约40-1200毫克，优选50-900毫克的二氢槲皮素或其药学上可接受的盐。该剂量以每天一至几份给药。

本发明的药剂作为恶性肿瘤的预防或治疗剂是有用的。

所述恶性肿瘤的实例包括：儿童脑肿瘤，所述儿童脑肿瘤选自星形胶质细胞瘤、恶性髓母细胞瘤、胚细胞瘤、颅咽管瘤和室管膜瘤；成人脑瘤，所述成人脑瘤选自神经胶质瘤、胶质瘤、脑膜瘤、垂体腺瘤和神经鞘瘤；头颈癌，所述头颈癌选自上颌窦癌、咽癌(例如，鼻咽癌、口咽癌、下咽癌)、喉癌、口腔癌、唇癌、舌癌和腮腺癌；胸部癌症和肿瘤，所述胸部癌症和肿瘤选自小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺瘤病和间皮瘤；胃肠癌和肿瘤，所述胃肠癌和肿瘤选自食道癌、肝癌、原发性肝癌、胆囊癌、胆管癌、胃癌、结直肠癌、结肠癌、直肠癌、肛门癌、胰腺癌和胰腺内分泌肿瘤；泌尿器官癌和肿瘤，所述泌尿器官癌和肿瘤选自阴茎癌、肾盂·输尿管癌、肾细胞癌、睾丸肿瘤(testistumor)(也称，睾丸肿瘤(orchistumor))、前列腺癌、膀胱癌、肾母细胞瘤和泌尿道上皮癌；妇科癌症和肿瘤，所述妇科癌症和肿瘤选自外阴癌、宫颈癌、子宫体癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤、绒毛膜癌、阴道癌、乳腺癌、卵巢癌和卵巢生殖细胞肿瘤；成人和儿童软组织肉瘤；骨肿瘤，所述骨肿瘤选自骨肉瘤和尤因瘤(Ewing’stumor)；内分泌组织的癌症和肿瘤，所述内分泌组织的癌症和肿瘤选自肾上腺皮质癌和甲状腺癌；恶性淋巴瘤和白血病，所述恶性淋巴瘤和白血病选自恶性淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’slymphoma)、霍奇金病(Hodgkin’sdisease)、多发性骨髓瘤、浆细胞肿瘤、急性髓样白血病、急性淋巴性白血病、成人T细胞白血病淋巴瘤、慢性髓样白血病和慢性淋巴性白血病；和皮肤癌和肿瘤，所述皮肤癌和肿瘤选自慢性骨髓增生性疾病、恶性黑色素瘤、鳞状细胞癌、基底细胞癌和蕈样肉芽肿病。

因为本发明的药剂具有特别显著的抗恶性肿瘤效果，其有望对除了二甲双胍或其药学上可接受的盐和二氢槲皮素或其药学上可接受的盐之外的抗恶性肿瘤剂仅提供不充分疗效的患者显示出抗恶性肿瘤效果。

本发明的药剂可以进一步组合一种或多种除了二甲双胍或其药学上可接受的盐和二氢槲皮素或其药学上可接受的盐之外的抗恶性肿瘤剂。

所述除了二甲双胍或其药学上可接受的盐和二氢槲皮素或其药学上可接受的盐之外的抗恶性肿瘤剂包括：分子靶向药物、烷化剂、代谢拮抗剂、植物生物碱、抗癌抗生素、激素剂、免疫治疗剂等。

上述“分子靶向药物”的实例包括：伊马替尼(imatinib)、吉非替尼(gefitinib)、厄洛替尼(erlotinib)、舒尼替尼(sunitinib)、索拉非尼(sorafenib)、布立尼布(brivanib)、tivantinib、linifanib、硼替佐米(bortezomib)、尼罗替尼(nilotinib)、达沙替尼(dasatinib)、来妥替尼(lestaurtinib)、拉帕替尼(lapatinib)、沙利度胺(thalidomide)、来那度胺(lenalidomide)、西罗莫司(sirolimus)、依维莫司(everolimus)、坦罗莫司(temsirolimus)、伏林司他(vorinostat)、维A酸(tretinoin)、他米巴罗汀(tamibarotene)、利妥昔单抗(rituximab)、贝伐单抗(bevacizumab)、雷莫芦单抗(ramucirumab)、帕尼单抗(panitumumab)、西妥昔单抗(cetuximab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、阿仑珠单抗(alemtuzumab)、吉妥珠单抗(gemtuzumab)、奥加米星(ozogamicin)、替伊莫单抗(ibritumomabtiuxetan)、阿扎胞苷(azacitidine)、地西他滨(decitabine)、唑来膦酸(zoledronicacid)、三氧化二砷、奥利美生(oblimersen)等。

上述“烷化剂”的实例包括：氮芥(mechlorethamine)；环磷酰胺；异环磷酰胺；卡莫司汀(carmustine)；白消安(busulfan)；替莫唑胺(temozolomide)；丙卡巴肼(procarbazine)；洛莫司汀(lomustine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；苯达莫司汀(bendamustine)；美法仑(melphalan)；尼莫司汀(nimustine)；雷莫司汀(ranimustine)；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；福莫司汀(fotemustine)；铂制剂，例如奥沙利铂(oxaliplatin)、顺铂、卡铂等；等等。

上述“代谢拮抗药”的实例包括：吉西他滨(gemcitabine)、甲氨蝶呤(methotrexate)、卡培他滨(capecitabine)、阿糖胞苷(cytarabine)、氟达拉滨(fludarabine)、克拉立滨(cladribine)、依诺他滨(enocitabine)、卡莫氟(carmofur)、替加氟(tegafur)、替加氟·尿嘧啶(tegafur·uracil)、替加氟·吉美拉西·奥替拉西钾(tegafur·gimeracil·oteracilpotassium)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、奈拉滨(nelarabine)、羟基脲(hydroxycarbamide)、喷司他丁(pentostatin)、巯嘌呤(mercaptopurine)、亚叶酸(leucovorin)、培美曲塞(pemetrexed)等。

上述“植物生物碱”的实例包括：拓扑异构酶抑制剂，例如伊立替康(irinotecan)、托泊替康(topotecan)、nogitecan、依托泊苷(etoposide)、索布佐生(sobuzoxane)等；有丝分裂抑制剂，如紫杉醇(paclitaxel)、Abraxane(商品名)、多西紫杉醇(docetaxel)、伊沙匹隆(ixabepilone)、长春碱(vinblastine)、长春地辛(vindesine)、长春新碱(vincristine)、长春瑞滨(vinorelbine)、艾立布林(eribulin)等；等等。

上述“抗癌抗生素”的实例包括：多柔比星(doxorubicin)、丝裂霉素C(mitomycinC)、米托蒽醌(mitoxantrone)、表柔比星(epirubicin)、伊达比星(idarubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、阿柔比星(aclarubicin)、氨柔比星(amrubicin)、吡柔比星(pirarubicin)、放线菌素D(actinomycinD)、博来霉素(bleomycin)、培洛霉素(peplomycin)、环孢菌素(cyclosporin)等。

上述“激素剂”的实例包括：他莫昔芬(tamoxifen)、阿那曲唑(anastrozole)、来曲唑(letrozole)、依西美坦(exemestane)、氟维司群(fulvestrant)、氟他胺(flutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、雌莫司汀(estramustine)、氯地孕酮(chlormadinone)、托瑞米芬(toremifene)、戈舍瑞林(goserelin)、泼尼松(prednisone)、亮丙瑞林(leuprorelin)、阿比特龙(abiraterone)、地塞米松(dexamethasone)等。

上述“免疫治疗剂”的实例包括：GM-CSF、干扰素α2b(interferonalpha2b)、白细胞介素2(interleukin2)、非格司亭(filgrastim)、促红素α(epoetinalfa)等。

本发明还涉及一种商品包装物，其包含本发明的上述“组合了二甲双胍或其药学上可接受的盐与二氢槲皮素或其药学上可接受的盐的药剂”，以及与其相关的书面材料，所述书面材料描述了该药剂能够或应当用于预防或治疗恶性肿瘤。

本发明还涉及一种用于降低二甲双胍或其药学上可接受的盐的副作用(特别是乳酸酸中毒)的试剂，其包含二氢槲皮素或其药学上可接受的盐作为活性成分，并且涉及一种二甲双胍或其药学上可接受的盐的抗恶性肿瘤作用的增强剂，其包含二氢槲皮素或其药学上可接受的盐作为活性成分。本发明还涉及一种用于降低二甲双胍或其药学上可接受的盐的副作用(特别是乳酸酸中毒)的试剂，其包含二氢槲皮素或其药学上可接受的盐作为活性成分，与二甲双胍或其药学上可接受的盐一起组合使用，并且涉及一种包含二氢槲皮素或其药学上可接受的盐作为活性成分的抗恶性肿瘤作用的增强剂，其与二甲双胍或其药学上可接受的盐一起组合使用。

在所述副作用降低剂和抗恶性肿瘤作用增强剂中，“二甲双胍”、“二甲双胍或其药学上可接受的盐”、“二氢槲皮素或其药学上可接受的盐”、给药形式、剂量、给药对象、目标疾病等的实例与描述本发明的上述药剂的那些内容相似。

(II)包含二氢槲皮素或其药学上可接受的盐作为活性成分的药剂

本发明涉及一种用于预防或治疗胰腺癌的药剂，其包含二氢槲皮素或其药学上可接受的盐作为活性成分，并且涉及一种胰腺癌干细胞抑制剂，其包含二氢槲皮素或其药学上可接受的盐作为活性成分。

“二氢槲皮素或其药学上可接受的盐”、给药形式、给药对象等的实例与描述上述(I)的那些内容相似。

通过，例如，根据已知方法将二氢槲皮素或其药学上可接受的盐与药理学上可接受的载体混合，本发明的药剂和抑制剂可以被配制成，例如，药物组合物，例如片剂(包括糖衣片，薄膜包衣片)、散剂、颗粒剂、胶囊剂(包括软胶囊)、液体剂、注射剂、栓剂、缓释制剂(例如，缓释微胶囊)、或者速释制剂，并安全地口服给药或肠胃外给药(例如，局部、直肠、静脉内给药等)。所述注射剂能够用于静脉内、肌内、皮下或器官内给药，或能够直接施用于病灶。所述药理学上可接受的载体与描述上述(I)的那些内容相似。

这些制剂可以用通常用于所述制备步骤的已知方法制备。

在本发明的药剂和抑制剂中的二氢槲皮素或其药学上可接受的盐的含量可以根据制剂的形式等适当地选择。

例如，相对于整个制剂，二氢槲皮素或其药学上可接受的盐的含量通常为约0.01至约99.99wt％，优选约0.1至约90wt％。

虽然在本发明药剂和抑制剂中，例如载体等的添加剂的含量根据制剂类型而变化，但是相对于整个制剂，通常为约1至约99.99wt％，优选约10至约90wt％。

本发明的药剂和抑制剂优选包含二甲双胍或其药学上可接受的盐，因为二甲双胍或其药学上可接受的盐产生协同抗恶性肿瘤效果。所述“二甲双胍或其药学上可接受的盐”与描述上述(I)的那些内容相似。

每1重量份的二氢槲皮素，二甲双胍或其药学上可接受的盐的含量通常为约0.5至约100wt％，优选约2.5至约50wt％，更优选约2.5至约10wt％。

本发明的药剂和抑制剂可以与吉西他滨组合使用。

吉西他滨的剂量可以根据市售吉西他滨制剂的剂量确定。

本发明的药剂和抑制剂的剂量可以根据用途、患者的年龄和性别、疾病的严重程度等适当地选择。成人(体重60kg)每天的剂量通常为约40-1200mg，优选约50-900mg，更优选约100-1050mg的二氢槲皮素或其药学上可接受的盐该剂量以每天一至几份给药。

实施例

下面通过实施例来详细说明本发明，这些实施例不能被理解为是限制性的。

【实施例1】通过在人肺癌细胞系NCI-H1299中组合使用二甲双胍和二氢槲皮素对增殖相关的信号通路的抑制效果(体外)

1)试验材料

二甲双胍购自和光纯药工业株式会社(WakoPureChemicalIndustries,Ltd.)。二氢槲皮素((2R,3R)-二氢槲皮素和(2S,3S)-二氢槲皮素的外消旋体)购自Bionet。

2)实验材料的制备

将二甲双胍溶解在包含10％灭活(56℃，30分钟处理)的胎牛血清的RPMI-1640培养基(以下缩写为10％FBS-RPMI1640培养基)(NACALAITESQUE,INC.)来制备200mmol/L的二甲双胍(最终浓度20mmol/L)。将二氢槲皮素溶解在乙醇中，并用培养基稀释来制备5mmol/L的二氢槲皮素(最终浓度0.5mmol/L)。

3)细胞

源自人肺癌的细胞系NCI-H1299得自美国模式培养物保藏所(AmericanTypeCultureCollection，ATCC)(保藏号：CRL-5803,CancerRes.1992；52(9Suppl):2732s-2736s)。将细胞在37℃，5％CO₂的条件下在10％FBS-RPMI1640培养基中培养。

4)试验材料的添加和测量

在细胞接种后的第二天，加入试验材料并将细胞培养6小时，然后收获细胞。测量并评价在所制备的全细胞裂解物中包含的相对磷酸-4E-BP1蛋白含量。各个组(N＝3)如下进行处理：

(1)对照(载体对照)组：含1％乙醇的培养基

(2)二甲双胍单处理组：二甲双胍20mmol/L

(3)二氢槲皮素单处理组：二氢槲皮素0.5mmol/L

(4)组合处理组：二甲双胍20mmol/L+二氢槲皮素0.5mmol/L

将传代培养的NCI-H1299细胞用胰蛋白酶消化，并悬浮在新鲜培养基中。使用血细胞计数仪测定细胞悬浮液的细胞密度并调整至1×10⁶个细胞/mL。将细胞以0.5ml/孔接种到12孔多孔培养板(IWAKI)上，并在37℃，5％CO₂的条件下培养过夜。第二天，以给定浓度将包含二甲双胍或二氢槲皮素或同时包含二甲双胍和二氢槲皮素两者的培养基加入各个孔中。在孵育6小时后，将各个孔中的细胞用杜伯科磷酸缓冲盐溶液(Dulbecco’sphosphatebufferedsaline，D-PBS)洗涤两次，然后使用细胞裂解缓冲液(CellSignalingTechnology,Inc.)制备全细胞裂解液。离心后，将上清液取样，然后使用酶联免疫吸附测定试剂盒(ELISAkits)(CellSignalingTechnology,Inc.，目录号：7854)定量样品中的相对磷酸-4E-BP1(Thr37/Thr46)蛋白的含量。使用BCA蛋白测定法(Pierce)测量在细胞提取液中的总蛋白浓度，然后各个孔的相对磷酸-4E-BP1(Thr37/Thr46)蛋白含量用总蛋白量进行归一化。

5)统计分析

结果显示为平均值(MEAN)±标准偏差(SD)。

为了评估组合使用对相对磷酸-4E-BP1蛋白含量的影响，进行邓奈特检验(Dunnetttest)以比较组合处理组和各个单药物处理组。当在组合处理组与各个单药物处理组中对比观察到显著性差异时，进行双因素方差分析(双侧(two-tailed))(因子：组和浓度)来评估二甲双胍处理组(组1和2)和二氢槲皮素处理组(组3和4)之间的协同效应。使用9.3版SAS软件(日本SASInstitute公司)进行所述分析。当p值小于0.05时认为差异是统计学上显著的。

6)结果

组合使用二甲双胍和二氢槲皮素抑制了相对磷酸-4E-BP1蛋白含量，显著强于各个单化合物组(图1)。

7)结论

在NCI-H1299细胞中，观察到了通过组合使用二甲双胍和二氢槲皮素对增殖相关的信号通路的协同抑制效应。这表明了二甲双胍和二氢槲皮素的组合在癌症化疗中的有效性。

【实施例2】通过在人胰腺癌细胞系AsPC-1中组合使用二甲双胍和二氢槲皮素对与癌症细胞增殖相关的信号通路的抑制效果(体外)

1)试验材料

二甲双胍购自和光纯药工业株式会社(WakoPureChemicalIndustries,Ltd.)。二氢槲皮素((2R,3R)-二氢槲皮素和(2S,3S)-二氢槲皮素的外消旋体)购自Bionet。

2)实验材料的制备

将二甲双胍溶解在10％FBS-RPMI1640培养基中来制备200mmol/L的二甲双胍(最终浓度20mmol/L)。将二氢槲皮素溶解在乙醇中，并用培养基稀释来制备2mmol/L的二氢槲皮素(最终浓度0.2mmol/L)。

3)细胞

源自人胰腺癌的细胞系AsPC-1得自大日本制药株式会社(DainipponPharmaceuticalCo.,Ltd.)(现在为大日本住友制药株式会社(DSPHARMABIOMEDICALCO.,LTD.)，InVitro.1982；18:24-34)。将细胞在37℃，5％CO₂的条件下在10％FBS-RPMI1640培养基中培养。

4)试验材料的添加和测量

在细胞接种后的第二天，加入试验材料并将细胞培养6小时，然后收获细胞。测量并评价在所制备的全细胞裂解物中包含的相对磷酸-4E-BP1蛋白含量。各个组(N＝3)如下进行处理：

(1)对照(载体对照)组：含1％乙醇的培养基

(2)二甲双胍单处理组：二甲双胍20mmol/L

(3)二氢槲皮素单处理组：二氢槲皮素0.2mmol/L

(4)组合处理组：二甲双胍20mmol/L+二氢槲皮素0.2mmol/L

将传代培养的AsPc-1细胞用胰蛋白酶消化，并悬浮在新鲜培养基中。使用血细胞计数仪测定细胞悬浮液的细胞密度并调整至1×10⁶个细胞/mL。将细胞以0.5ml/孔接种到12孔多孔培养板上，并在37℃，5％CO₂的条件下培养过夜。第二天，以给定浓度将包含二甲双胍或二氢槲皮素或同时包含二甲双胍和二氢槲皮素两者的培养基加入各个孔中。在孵育6小时后，将各个孔中的细胞用D-PBS洗涤两次，然后使用细胞裂解缓冲液制备全细胞裂解液。离心后，将上清液取样，然后以与实施例1中相同的方式用酶联免疫吸附测定试剂盒定量样品中的相对磷酸-4E-BP1(Thr37/Thr46)蛋白的含量。使用BCA蛋白测定法测量在细胞裂解液中的总蛋白浓度，然后各个孔的相对磷酸-4E-BP1(Thr37/Thr46)蛋白含量用总蛋白量进行归一化。

5)统计分析

结果显示为平均值(MEAN)±标准偏差(SD)。

为了评估组合使用对相对磷酸-4E-BP1蛋白含量的影响，进行邓奈特检验(Dunnetttest)以比较组合处理组和各个单药物处理组。当在组合处理组与各个单药物处理组中对比观察到显著性差异时，进行双因素方差分析(双侧(two-tailed))(因子：组和浓度)来评估二甲双胍处理组(组1和2)和二氢槲皮素处理组(组3和4)之间的协同效应。使用9.3版SAS软件(日本SASInstitute公司)进行所述分析。当p值小于0.05时认为差异是统计学上显著的。

6)结果

组合使用二甲双胍和二氢槲皮素抑制了相对磷酸-4E-BP1蛋白含量，显著强于各个单化合物组(图2)。

7)结论

在AsPC-1细胞中，观察到了通过组合使用二甲双胍和二氢槲皮素对增殖相关的信号通路的协同抑制效应。这表明了二甲双胍和二氢槲皮素的组合在癌症化疗中的有效性。

【实施例3】在人肺成纤维细胞系WI-38中二氢槲皮素对二甲双胍诱导的乳酸产生的抑制效果

1)试验材料

二甲双胍购自和光纯药工业株式会社(WakoPureChemicalIndustries,Ltd.)。二氢槲皮素((2R,3R)-二氢槲皮素和(2S,3S)-二氢槲皮素的外消旋体)购自Bionet。

2)实验材料的制备

将二甲双胍溶解在10％FBS-RPMI1640培养基中来制备200mmol/L的二甲双胍(最终浓度20mmol/L)。将二氢槲皮素溶解在乙醇中，并用培养基稀释来制备10mmol/L的二氢槲皮素(最终浓度1mmol/L)。

3)细胞

源自人肺成纤维细胞的细胞系WI-38得自ATCC(保藏号：CCL-75，Exp.Cell.Res.,25:585-621,1961)。将细胞在37℃，5％CO₂的条件下在10％FBS-RPMI1640培养基中培养。

4)试验材料的添加和测量

在细胞接种后的第二天，加入二氢槲皮素并将细胞培养1小时。然后，加入二甲双胍，并将细胞培养6小时。培养后，将条件性培养基取样，并测量和评估在该培养基中包含的乳酸的浓度。各个组(N＝3)如下进行处理：

(1)对照(载体对照)组：含1％乙醇的培养基

(2)二甲双胍单处理组：二甲双胍20mmol/L

(3)二氢槲皮素和二甲双胍组合处理组：二甲双胍20mmol/L+二氢槲皮素1mmol/L

将传代培养的WI-38细胞用胰蛋白酶消化，并悬浮在新鲜培养基中。使用血细胞计数仪测定细胞悬浮液的细胞密度并调整至2.5×10⁵个细胞/mL。将细胞以0.5ml/孔接种到24孔多孔培养板(IWAKI)上，并在37℃，5％CO₂的条件下培养过夜。将包含给定浓度的二氢槲皮素的培养基加入到各个孔中，然后将细胞培养1小时。然后，加入包含给定浓度的二甲双胍的培养基，并将细胞再培养6小时。培养后，将各个孔的培养上清液取样并通过截留分子量10kDa的滤膜来获得滤液。使用乳酸测定试剂盒II(LactateAssayKitII，BioVision，产品目录号K627-100)测量乳酸浓度。将取样培养上清液后的细胞用D-PBS洗涤两次，然后加入细胞裂解缓冲液来制备全细胞裂解液。使用BCA蛋白测定法测定在全细胞裂解液中的蛋白浓度，然后各个孔的乳酸含量用该蛋白浓度进行归一化。

5)统计分析

结果显示为平均值(MEAN)±标准偏差(SD)。

为了评估二氢槲皮素对二甲双胍诱导产生的乳酸含量的影响，在二甲双胍单处理组和组合处理组之间对培养基中的乳酸浓度进行史蒂顿特t检验(Student’st-test)。当与二甲双胍单处理组相比，在组合处理组中的值显著较低时，二氢槲皮素被解释为对该含量具有抑制效果。使用9.3版SAS软件(日本SASInstitute公司)进行所述分析。当p值小于0.05时认为差异是统计学上显著的。

6)结果

二甲双胍在WI-38细胞中诱导乳酸的产生。二氢槲皮素显著抑制了由二甲双胍诱导的乳酸产生。

7)结论

在WI-38细胞中，观察到二氢槲皮素对二甲双胍诱导的乳酸产生的抑制效果。这表明二氢槲皮素在降低由二甲双胍导致的乳酸酸中毒风险中的临床有效性。

【实施例4】通过在人肝癌细胞系HuH-7中组合使用二甲双胍和二氢槲皮素对与癌症细胞增殖相关的信号通路的抑制效果(体外)

1)试验材料

二甲双胍购自和光纯药工业株式会社(WakoPureChemicalIndustries,Ltd.)。二氢槲皮素((2R,3R)-二氢槲皮素和(2S,3S)-二氢槲皮素的外消旋体)购自Bionet。

2)实验材料的制备

将二甲双胍溶解在10％FBS-RPMI1640培养基中来制备50mmol/L的二甲双胍(最终浓度5mmol/L)。将二氢槲皮素溶解在乙醇中，并用培养基稀释来制备2mmol/L的二氢槲皮素(最终浓度0.2mmol/L)。

3)细胞

源自人肝癌的细胞系HuH-7得自健康科学研究资源库(HealthScienceResearchResourcesBank，CancerRes.1982；42(9):3858-63)。将细胞在37℃，5％CO₂的条件下在10％FBS-RPMI1640培养基中培养。

4)试验材料的添加和测量

在细胞接种后的第二天，加入试验材料并将细胞培养6小时，然后收获细胞。测量并评价在所制备的全细胞裂解物中包含的相对磷酸-4E-BP1蛋白含量。各个组(N＝3)如下进行处理：

(1)对照(载体对照)组：含1％乙醇的培养基

(2)二甲双胍单处理组：二甲双胍5mmol/L

(3)二氢槲皮素单处理组：二氢槲皮素0.2mmol/L

(4)组合处理组：二甲双胍5mmol/L+二氢槲皮素0.2mmol/L

将传代培养的HuH-7细胞用胰蛋白酶消化，并悬浮在新鲜培养基中。使用血细胞计数仪测定细胞悬浮液的细胞密度并调整至2.5×10⁵个细胞/mL。将细胞以1ml/孔接种到12孔多孔培养板上，并在37℃，5％CO₂的条件下培养过夜。第二天，以给定浓度将包含二甲双胍或二氢槲皮素或同时包含二甲双胍和二氢槲皮素两者的培养基加入各个孔中。在孵育6小时后，将各个孔中的细胞用D-PBS洗涤两次，然后使用细胞裂解缓冲液制备全细胞裂解液。离心后，将上清液取样，然后以与实施例1中相同的方式用酶联免疫吸附测定试剂盒定量样品中的相对磷酸-4E-BP1(Thr37/Thr46)蛋白的含量。使用BCA蛋白测定法测量在细胞裂解液中的总蛋白浓度，然后各个孔的相对磷酸-4E-BP1(Thr37/Thr46)蛋白含量用总蛋白量进行归一化。

5)统计分析

结果显示为平均值(MEAN)±标准偏差(SD)。

为了评估组合使用对相对磷酸-4E-BP1蛋白含量的影响，进行邓奈特检验以比较组合处理组和各个单药物处理组。当在组合处理组与各个单药物处理组中对比观察到显著性差异时，进行双因素方差分析(双侧(two-tailed))(因子：组和浓度)来评估二甲双胍处理组(组1和2)和二氢槲皮素处理组(组3和4)之间的协同效应。使用9.3版SAS软件(日本SASInstitute公司)进行所述分析。当p值小于0.05时认为差异是统计学上显著的。

6)结果

结果显示在表1中。

组合使用二甲双胍和二氢槲皮素抑制了相对磷酸-4E-BP1蛋白含量，显著强于各个单化合物组。

[表1]

7)结论

在HuH-7细胞中，观察到了通过组合使用二甲双胍和二氢槲皮素对与癌症细胞增殖相关的信号通路的协同抑制效应。这表明了二甲双胍和二氢槲皮素的组合在癌症化疗中的有效性。

【实施例5】通过在人乳腺癌细胞系MDA-MB-231中组合使用二甲双胍和二氢槲皮素对与癌症细胞增殖相关的信号通路的抑制效果(体外)

1)试验材料

二甲双胍购自和光纯药工业株式会社(WakoPureChemicalIndustries,Ltd.)。二氢槲皮素((2R,3R)-二氢槲皮素和(2S,3S)-二氢槲皮素的外消旋体)购自Bionet。

2)实验材料的制备

将二甲双胍溶解在10％FBS-RPMI1640培养基中来制备50mmol/L的二甲双胍(最终浓度5mmol/L)。将二氢槲皮素溶解在乙醇中，并用培养基稀释来制备2mmol/L的二氢槲皮素(最终浓度0.2mmol/L)。

3)细胞

源自人乳腺癌的细胞系MDA-MB-231得自ATCC(JNatlCancerInst.1974；53(3):661-74)。将细胞在37℃，5％CO₂的条件下在10％FBS-RPMI1640培养基中培养。

4)试验材料的添加和测量

在细胞接种后的第二天，加入试验材料并将细胞培养6小时，然后收获细胞。测量并评价在所制备的全细胞裂解物中包含的相对磷酸-4E-BP1蛋白含量。各个组(N＝3)如下进行处理：

(1)对照(载体对照)组：含1％乙醇的培养基

(2)二甲双胍单处理组：二甲双胍5mmol/L

(3)二氢槲皮素单处理组：二氢槲皮素0.2mmol/L

(4)组合处理组：二甲双胍5mmol/L+二氢槲皮素0.2mmol/L

将传代培养的MDA-MB-231细胞用胰蛋白酶消化，并悬浮在新鲜培养基中。使用血细胞计数仪测定细胞悬浮液的细胞密度并调整至2.5×10⁵个细胞/mL。将细胞以1ml/孔接种到12孔多孔培养板上，并在37℃，5％CO₂的条件下培养过夜。第二天，以给定浓度将包含二甲双胍或二氢槲皮素或同时包含二甲双胍和二氢槲皮素两者的培养基加入各个孔中。在孵育6小时后，将各个孔中的细胞用D-PBS洗涤两次，然后使用细胞裂解缓冲液制备全细胞裂解液。离心后，将上清液取样，然后以与实施例1中相同的方式用酶联免疫吸附测定试剂盒定量样品中的相对磷酸-4E-BP1(Thr37/Thr46)蛋白的含量。使用BCA蛋白测定法测量在细胞裂解液中的总蛋白浓度，然后各个孔的相对磷酸-4E-BP1(Thr37/Thr46)蛋白含量用总蛋白量进行归一化。

5)统计分析

结果显示为平均值(MEAN)±标准偏差(SD)。

为了评估组合使用对相对磷酸-4E-BP1蛋白含量的影响，进行邓奈特检验以比较组合处理组和各个单药物处理组。当在组合处理组与各个单药物处理组中对比观察到显著性差异时，进行双因素方差分析(双侧(two-tailed))(因子：组和浓度)来评估二甲双胍处理组(组1和2)和二氢槲皮素处理组(组3和4)之间的协同效应。使用9.3版SAS软件(日本SASInstitute公司)进行所述分析。当p值小于0.05时认为差异是统计学上显著的。

6)结果

结果显示在表2中。

组合使用二甲双胍和二氢槲皮素抑制了相对磷酸-4E-BP1蛋白含量，显著强于各个单化合物组。

[表2]

7)结论

在MDA-MB-231细胞中，观察到了通过组合使用二甲双胍和二氢槲皮素对增殖相关的信号通道的协同抑制效应。这表明了二甲双胍和二氢槲皮素的组合在癌症化疗中的有效性。

【实施例6】通过在人前列腺癌细胞系22Rv1中组合使用二甲双胍和二氢槲皮素对与癌症细胞增殖相关的信号通路的抑制效果(体外)

1)试验材料

二甲双胍购自和光纯药工业株式会社(WakoPureChemicalIndustries,Ltd.)。二氢槲皮素((2R,3R)-二氢槲皮素和(2S,3S)-二氢槲皮素的外消旋体)购自Bionet。

2)实验材料的制备

将二甲双胍溶解在10％FBS-RPMI1640培养基中来制备100mmol/L的二甲双胍(最终浓度10mmol/L)。将二氢槲皮素溶解在乙醇中，并用培养基稀释来制备2mmol/L的二氢槲皮素(最终浓度0.2mmol/L)。

3)细胞

源自人前列腺癌的细胞系22Rv1得自ATCC(InVitroCellDevBiolAnim.1999；35(7):403-9)。将细胞在37℃，5％CO₂的条件下在10％FBS-RPMI1640培养基中培养。

4)试验材料的添加和测量

在细胞接种后的第二天，加入试验材料并将细胞培养6小时，然后收获细胞。测量并评价在所制备的全细胞裂解物中包含的相对磷酸-4E-BP1蛋白含量。各个组(N＝3)如下进行处理：

(1)对照(载体对照)组：含1％乙醇的培养基

(2)二甲双胍单处理组：二甲双胍10mmol/L

(3)二氢槲皮素单处理组：二氢槲皮素0.2mmol/L

(4)组合处理组：二甲双胍10mmol/L+二氢槲皮素0.2mmol/L

将传代培养的22Rv1细胞用胰蛋白酶消化，并悬浮在新鲜培养基中。使用血细胞计数仪测定细胞悬浮液的细胞密度并调整至2.5×10⁵个细胞/mL。将细胞以1ml/孔接种到12孔多孔培养板上，并在37℃，5％CO₂的条件下培养过夜。第二天，以给定浓度将包含二甲双胍或二氢槲皮素或同时包含二甲双胍和二氢槲皮素两者的培养基加入各个孔中。在孵育6小时后，将各个孔中的细胞用D-PBS洗涤两次，然后使用细胞裂解缓冲液制备全细胞裂解液。离心后，将上清液取样，然后以与实施例1中相同的方式用酶联免疫吸附测定试剂盒定量样品中的相对磷酸-4E-BP1(Thr37/Thr46)蛋白的含量。使用BCA蛋白测定法测量在细胞裂解液中的总蛋白浓度，然后各个孔的相对磷酸-4E-BP1(Thr37/Thr46)蛋白含量用总蛋白量进行归一化。

5)统计分析

结果显示为平均值(MEAN)±标准偏差(SD)。

为了评估组合使用对相对磷酸-4E-BP1蛋白含量的影响，进行邓奈特检验以比较组合处理组和各个单药物处理组。当在组合处理组与各个单药物处理组中对比观察到显著性差异时，进行双因素方差分析(双侧(two-tailed))(因子：组和浓度)来评估二甲双胍处理组(组1和2)和二氢槲皮素处理组(组3和4)之间的协同效应。使用9.3版SAS软件(日本SASInstitute公司)进行所述分析。当p值小于0.05时认为差异是统计学上显著的。

6)结果

结果显示在表3中。

组合使用二甲双胍和二氢槲皮素抑制了相对磷酸-4E-BP1蛋白含量，显著强于各个单化合物组。

[表3]

7)结论

在22Rv1细胞中，观察到了通过组合使用二甲双胍和二氢槲皮素对增殖相关的信号通路的协同抑制效应。这表明了二甲双胍和二氢槲皮素的组合在癌症化疗中的有效性。

【实施例7】通过在人胆管癌细胞系HuH-28中组合使用二甲双胍和二氢槲皮素对与癌症细胞增殖相关的信号通路的抑制效果(体外)

1)试验材料

二甲双胍购自和光纯药工业株式会社(WakoPureChemicalIndustries,Ltd.)。二氢槲皮素((2R,3R)-二氢槲皮素和(2S,3S)-二氢槲皮素的外消旋体)购自Bionet。

2)实验材料的制备

将二甲双胍溶解在10％FBS-RPMI1640培养基中来制备200mmol/L的二甲双胍(最终浓度20mmol/L)。将二氢槲皮素溶解在乙醇中，并用培养基稀释来制备2mmol/L的二氢槲皮素(最终浓度0.2mmol/L)。

3)细胞

源自人胆管癌的细胞系HuH-28得自健康科学研究资源库(ResExpMed(Berl).1988；188(5):367-75)。将细胞在37℃，5％CO₂的条件下在10％FBS-RPMI1640培养基中培养。

4)试验材料的添加和测量

在细胞接种后的第二天，加入试验材料并将细胞培养6小时，然后收获细胞。测量并评价在所制备的全细胞裂解物中包含的相对磷酸-4E-BP1蛋白含量。各个组(N＝3)如下进行处理：

(1)对照(载体对照)组：含1％乙醇的培养基

(2)二甲双胍单处理组：二甲双胍20mmol/L

(3)二氢槲皮素单处理组：二氢槲皮素0.2mmol/L

(4)组合处理组：二甲双胍20mmol/L+二氢槲皮素0.2mmol/L

将传代培养的HuH-28细胞用胰蛋白酶消化，并悬浮在新鲜培养基中。使用血细胞计数仪测定细胞悬浮液的细胞密度并调整至2.5×10⁵个细胞/mL。将细胞以1ml/孔接种到12孔多孔培养板上，并在37℃，5％CO₂的条件下培养过夜。第二天，以给定浓度将包含二甲双胍或二氢槲皮素或同时包含二甲双胍和二氢槲皮素两者的培养基加入各个孔中。在孵育6小时后，将各个孔中的细胞用D-PBS洗涤两次，然后使用细胞裂解缓冲液制备全细胞裂解液。离心后，将上清液取样，然后以与实施例1中相同的方式用酶联免疫吸附测定试剂盒定量样品中的相对磷酸-4E-BP1(Thr37/Thr46)蛋白的含量。使用BCA蛋白测定法测量在细胞裂解液中的总蛋白浓度，然后各个孔的相对磷酸-4E-BP1(Thr37/Thr46)蛋白含量用总蛋白量进行归一化。

5)统计分析

结果显示为平均值(MEAN)±标准偏差(SD)。

为了评估组合使用对相对磷酸-4E-BP1蛋白含量的影响，进行邓奈特检验以比较组合处理组和各个单药物处理组。当在组合处理组与各个单药物处理组中对比观察到显著性差异时，进行双因素方差分析(双侧(two-tailed))(因子：组和浓度)来评估二甲双胍处理组(组1和2)和二氢槲皮素处理组(组3和4)之间的协同效应。使用9.3版SAS软件(日本SASInstitute公司)进行所述分析。当p值小于0.05时认为差异是统计学上显著的。

6)结果

结果显示在表4中。

组合使用二甲双胍和二氢槲皮素抑制了相对磷酸-4E-BP1蛋白含量，显著强于各个单化合物组。

[表4]

7)结论

在HuH-28细胞中，观察到了通过组合使用二甲双胍和二氢槲皮素对增殖相关的信号通路的协同抑制效应。这表明了二甲双胍和二氢槲皮素的组合在癌症化疗中的有效性。

【实施例8】通过在人卵巢癌细胞系Caov-3中组合使用二甲双胍和二氢槲皮素对与癌症细胞增殖相关的信号途径的抑制效果(体外)

1)试验材料

二甲双胍购自和光纯药工业株式会社(WakoPureChemicalIndustries,Ltd.)。二氢槲皮素((2R,3R)-二氢槲皮素和(2S,3S)-二氢槲皮素的外消旋体)购自Bionet。

2)实验材料的制备

将二甲双胍溶解在10％FBS-RPMI1640培养基中来制备200mmol/L的二甲双胍(最终浓度20mmol/L)。将二氢槲皮素溶解在乙醇中，并用培养基稀释来制备2mmol/L的二氢槲皮素(最终浓度0.2mmol/L)。

3)细胞

源自人卵巢癌的细胞系Caov-3得自ATCC(GYNECOLONCOL.1994；53(1):70-7)。将细胞在37℃，5％CO₂的条件下在10％FBS-RPMI1640培养基中培养。

4)试验材料的添加和测量

在细胞接种后的第二天，加入试验材料并将细胞培养6小时，然后收获细胞。测量并评价在所制备的全细胞裂解物中包含的相对磷酸-4E-BP1蛋白含量。各个组(N＝3)如下进行处理：

(1)对照(载体对照)组：含1％乙醇的培养基

(2)二甲双胍单处理组：二甲双胍20mmol/L

(3)二氢槲皮素单处理组：二氢槲皮素0.2mmol/L

(4)组合处理组：二甲双胍20mmol/L+二氢槲皮素0.2mmol/L

将传代培养的Caov-3细胞用胰蛋白酶消化，并悬浮在新鲜培养基中。使用血细胞计数仪测定细胞悬浮液的细胞密度并调整至2.5×10⁵个细胞/mL。将细胞以1ml/孔接种到12孔多孔培养板上，并在37℃，5％CO₂的条件下培养过夜。第二天，以给定浓度将包含二甲双胍或二氢槲皮素或同时包含二甲双胍和二氢槲皮素两者的培养基加入各个孔中。在孵育6小时后，将各个孔中的细胞用D-PBS洗涤两次，然后使用细胞裂解缓冲液制备全细胞裂解液。离心后，将上清液取样，然后以与实施例1中相同的方式用酶联免疫吸附测定试剂盒定量样品中的相对磷酸-4E-BP1(Thr37/Thr46)蛋白的含量。使用BCA蛋白测定法测量在细胞裂解液中的总蛋白浓度，然后各个孔的相对磷酸-4E-BP1(Thr37/Thr46)蛋白含量用总蛋白量进行归一化。

5)统计分析

结果显示为平均值(MEAN)±标准偏差(SD)。

为了评估组合使用对相对磷酸-4E-BP1蛋白含量的影响，进行邓奈特检验以比较组合处理组和各个单药物处理组。当在组合处理组与各个单药物处理组中对比观察到显著性差异时，进行双因素方差分析(双侧(two-tailed))(因子：组和浓度)来评估二甲双胍处理组(组1和2)和二氢槲皮素处理组(组3和4)之间的协同效应。使用9.3版SAS软件(日本SASInstitute公司)进行所述分析。当p值小于0.05时认为差异是统计学上显著的。

6)结果

结果显示在表5中。

组合使用二甲双胍和二氢槲皮素抑制了相对磷酸-4E-BP1蛋白含量，显著强于各个单化合物组。

[表5]

7)结论

在Caov-3细胞中，观察到了通过组合使用二甲双胍和二氢槲皮素对增殖相关的信号通路的协同抑制效应。这表明了二甲双胍和二氢槲皮素的组合在癌症化疗中的有效性。

【实施例9】通过在人胰腺癌细胞系AsPC-1中组合使用二甲双胍和二氢槲皮素对与癌症细胞增殖相关的信号通路的抑制效果(体外)

1)试验材料

二甲双胍购自和光纯药工业株式会社(WakoPureChemicalIndustries,Ltd.)。二氢槲皮素((2R,3R)-二氢槲皮素和(2S,3S)-二氢槲皮素的外消旋体)购自Bionet。

2)实验材料的制备

将二甲双胍溶解在10％FBS-RPMI1640培养基中来制备15、30和60mmol/L的二甲双胍(最终浓度1.5、3和6mmol/L)。将二氢槲皮素溶解在乙醇中，并用培养基稀释来制备3mmol/L的二氢槲皮素(最终浓度0.3mmol/L)。

3)细胞

源自人胰腺癌的细胞系AsPC-1得自大日本住友制药株式会社。将细胞在37℃，5％CO₂的条件下在10％FBS-RPMI1640培养基中培养。

4)试验材料的添加和测量

各个组(N＝3)如下进行处理。

(1)对照(载体对照)组：含1％乙醇的培养基

(2)二甲双胍单处理组：二甲双胍1.5、3和6mmol/L

(3)二氢槲皮素单处理组：二氢槲皮素0.3mmol/L

(4)组合处理组：二甲双胍1.5、3和6mmol/L+二氢槲皮素0.3mmol/L将传代培养的AsPC-1细胞用胰蛋白酶消化，并悬浮在新鲜培养基中。使用血细胞计数仪测定细胞悬浮液的细胞密度并调整至2.5×10⁵个细胞/mL。将细胞以1ml/孔接种到12孔多孔培养板上，并在37℃，5％CO₂的条件下培养过夜。第二天，以给定浓度将包含二甲双胍或二氢槲皮素或同时包含二甲双胍和二氢槲皮素两者的培养基加入各个孔中。在37℃，5％CO₂的条件下培养24小时后，将各个孔中的细胞用D-PBS洗涤两次，然后使用细胞裂解缓冲液制备全细胞裂解液。离心后，将上清液取样，然后以与实施例1中相同的方式用酶联免疫吸附测定试剂盒定量样品中的相对磷酸-4E-BP1(Thr37/Thr46)蛋白的含量。使用BCA蛋白测定法测量在细胞裂解液中的总蛋白浓度，然后各个孔的相对磷酸-4E-BP1(Thr37/Thr46)蛋白含量用总蛋白量进行归一化。

5)统计分析

结果显示为平均值(MEAN)±标准偏差(SD)。

为了评估组合使用对相对磷酸-4E-BP1蛋白含量的影响，进行邓奈特检验以比较组合处理组和各个单药物处理组。当在组合处理组与各个单药物处理组中对比观察到显著性差异时，进行双因素方差分析(双侧(two-tailed))(因子：组和浓度)来评估二甲双胍处理组(组1和2)和二氢槲皮素处理组(组3和4)之间的协同效应。使用9.3版SAS软件(日本SASInstitute公司)进行所述分析。当p值小于0.05时认为差异是统计学上显著的。

6)结果

结果显示在表6-8中。

组合使用二甲双胍和二氢槲皮素抑制了相对磷酸-4E-BP1蛋白含量，显著强于各个单化合物组。

[表6]

二甲双胍:二氢槲皮素＝1.5mmol/L:0.3mmol/L

[表7]

二甲双胍:二氢槲皮素＝3mmol/L:0.3mmol/L

[表8]

二甲双胍:二氢槲皮素＝6mmol/L:0.3mmol/L

7)结论

在AsPC-1细胞中，观察到了通过组合使用二甲双胍和二氢槲皮素对增殖相关的信号通路的协同抑制效应。这表明了二甲双胍和二氢槲皮素的组合在癌症化疗中的有效性。

【实施例10】在人肺成纤维细胞系WI-38中二氢槲皮素对二甲双胍诱导的乳酸产生的抑制效果

1)试验材料

二甲双胍购自和光纯药工业株式会社(WakoPureChemicalIndustries,Ltd.)。二氢槲皮素的外消旋体((2R,3R)-二氢槲皮素和(2S,3S)-二氢槲皮素)购自Bionet，以及光学活性的二氢槲皮素((2R,3R)-二氢槲皮素)购自SIGMA。

2)实验材料的制备

将二甲双胍溶解在10％FBS-RPMI1640培养基中来制备200mmol/L的二甲双胍(最终浓度20mmol/L)。将二氢槲皮素溶解在乙醇中，并用培养基稀释来制备10mmol/L的二氢槲皮素(最终浓度1mmol/L)。

3)细胞

人肺成纤维细胞系WI-38得自ATCC(保藏号：CCL-75，Exp.Cell.Res.,25:585-621,1961)。将细胞在37℃，5％CO₂的条件下在10％FBS-RPMI1640培养基中培养。

4)试验材料的添加和测量

在细胞接种后的第二天，加入二氢槲皮素并将细胞培养1小时。然后，加入二甲双胍，并将细胞培养6小时。将条件性培养基取样，并测量和评估在该培养基中包含的乳酸的浓度。各个组(N＝3)如下进行处理：

(1)对照(载体对照)组：含1％乙醇的培养基

(2)二氢槲皮素单处理组：二氢槲皮素1mmol/L

(3)二甲双胍单处理组：二甲双胍20mmol/L

(4)组合处理组：二甲双胍20mmol/L+二氢槲皮素1mmol/L

将传代培养的WI-38细胞用胰蛋白酶消化，并悬浮在新鲜培养基中。使用血细胞计数仪测定细胞悬浮液的细胞密度并调整至2.5×10⁵个细胞/mL。将细胞以0.5ml/孔接种到24孔多孔培养板(IWAKI)上，并在37℃，5％CO₂的条件下培养过夜。向其中加入包含给定浓度的二氢槲皮素的培养基，然后将细胞培养1小时，加入包含给定浓度的二甲双胍的培养基，并再将细胞培养6小时。培养后，将各个孔的培养上清液取样并通过截留分子量10kDa的滤膜来获得滤液。使用乳酸测定试剂盒II(LactateAssayKitII，BioVision，产品目录号K627-100)测量乳酸浓度。将取样培养上清液后的细胞用D-PBS洗涤两次，然后加入细胞裂解缓冲液来制备全细胞裂解液。使用BCA蛋白测定法测定在全细胞裂解液中的蛋白浓度，然后各个孔的乳酸含量用该蛋白浓度进行归一化。

5)统计分析

结果显示为平均值(MEAN)±标准偏差(SD)。

为了评估二氢槲皮素对二甲双胍诱导产生的乳酸含量的影响，在对照组和二氢槲皮素单药物处理组之间以及对照组和二甲双胍单药物处理组之间对培养基中的乳酸浓度进行史蒂顿特t检验。另外，为了评估二氢槲皮素和二甲双胍的组合对归一化的产生的乳酸浓度的影响，在二氢槲皮素单药物处理组(组1和2)和二甲双胍处理组(组3和4)之间进行双因素方差分析(双侧)(因子：组和浓度)。当在二氢槲皮素单药物处理组中的归一化的产生的乳酸含量与对照组中的归一化的产生的乳酸含量相比为显著的时，该药物被判定为对乳酸产生具有抑制作用。当在二甲双胍单药物处理组中的归一化的产生的乳酸含量与对照组中的归一化的产生的乳酸含量相比为显著的时，该药物被判定为对乳酸产生具有诱导作用。当在组合治疗组和二甲双胍单药物治疗组之间的归一化的产生的乳酸含量中的差异显著大于在对照组和二氢槲皮素单药物治疗组之间的归一化的产生的乳酸含量中的差异时，二氢槲皮素被解释为对该含量具有抑制效果。使用9.3版SAS软件(日本SASInstitute公司)进行所述分析。当p值小于0.05时认为差异是统计学上显著的。

6)结果

与对照组相比，消旋和光学活性二氢槲皮素两者都抑制了WI-38中的乳酸产生。二甲双胍在细胞中诱导乳酸产生，而这被消旋和光学活性二氢槲皮素两者显著地抑制(消旋体：图4，光学活性：图5)。

7)结论

在WI-38细胞中，通过消旋和光学活性二氢槲皮素观察到二氢槲皮素对二甲双胍诱导的乳酸产生的抑制效果。这表明二氢槲皮素在降低由二甲双胍给药导致的乳酸酸中毒风险中的临床有效性。

【实施例11】在人胰腺癌细胞系AsPC-1中二氢槲皮素单药物对与癌症细胞增殖相关的信号通路的抑制效果(体外)

1)试验材料

二氢槲皮素((2R,3R)-二氢槲皮素和(2S,3S)-二氢槲皮素的外消旋体)购自Bionet。

2)实验材料的制备

将二氢槲皮素溶解在乙醇中，并用培养基稀释来制备5和10mmol/L的二氢槲皮素(最终浓度0.5和1mmol/L)。

3)细胞

源自人胰腺癌的细胞系AsPC-1得自大日本制药株式会社(现在为大日本住友制药株式会社，InVitro.1982；18:24-34)。将细胞在37℃，5％CO₂的条件下在10％FBS-RPMI1640培养基中培养。

4)试验材料的添加和测量

在细胞接种后的第二天，加入试验材料并将细胞培养6小时，然后收获细胞。测量并评价在所制备的全细胞裂解物中包含的相对磷酸-4E-BP1蛋白含量。各个组(N＝3)如下进行处理：

(1)对照(载体对照)组：含1％乙醇的培养基

(2)二氢槲皮素单处理组：二氢槲皮素0.5mmol/L

(3)二氢槲皮素单处理组：二氢槲皮素1mmol/L

将传代培养的AsPC-1细胞用胰蛋白酶消化，并悬浮在新鲜培养基中。使用血细胞计数仪测定细胞悬浮液的细胞密度并调整至1×10⁶个细胞/mL。将细胞以0.5ml/孔接种到12孔多孔培养板上，并在37℃，5％CO₂的条件下培养过夜。第二天，以给定浓度将包含二氢槲皮素的培养基加入各个孔中。在孵育6小时后，将各个孔中的细胞用D-PBS洗涤两次，然后使用细胞裂解缓冲液制备全细胞裂解液。离心后，将上清液取样，然后以与实施例1中相同的方式用酶联免疫吸附测定试剂盒定量样品中的相对磷酸-4E-BP1(Thr37/Thr46)蛋白的含量。使用BCA蛋白测定法测量在细胞裂解液中的总蛋白浓度，然后各个孔的相对磷酸-4E-BP1(Thr37/Thr46)蛋白含量用总蛋白量进行归一化。

5)统计分析

结果显示为平均值(MEAN)±标准偏差(SD)。

为了评估二氢槲皮素对相对磷酸-4E-BP1蛋白含量的剂量依赖性，进行线性回归分析。结果观察到了剂量依赖性。然后，在对照组和单药物处理组之间进行威廉姆斯检验(Williams’test)(单侧)。结果，观察到不小于0.5mmol/L的二氢槲皮素对相对磷酸-4E-BP1蛋白含量的显著抑制作用。当在二氢槲皮素单药物处理组中的相对磷酸-4E-BP1蛋白含量与对照组中的相对磷酸-4E-BP1蛋白含量相比为显著的时，该药物被判定为对该含量具有抑制作用。使用9.3版SAS软件(日本SASInstitute公司)进行所述分析。当p值小于0.05时认为差异是统计学上显著的。

6)结果

二氢槲皮素显示出对相对磷酸-4E-BP1蛋白含量的剂量依赖性抑制效果(图6)。

7)结论

在AsPC-1细胞中，观察到了二氢槲皮素单药物对增殖相关的信号通道的剂量依赖性抑制效果。这表明二氢槲皮素在癌症化疗中的有效性。

【实施例12】通过在人胰腺癌细胞系AsPC-1中组合使用二甲双胍和二氢槲皮素对癌干细胞的表面标记物表达的抑制效果(体外)

1)试验材料

二甲双胍购自和光纯药工业株式会社(WakoPureChemicalIndustries,Ltd.)。二氢槲皮素((2R,3R)-二氢槲皮素和(2S,3S)-二氢槲皮素的外消旋体)购自Bionet。吉西他滨购自多伦多研究化学品公司(TorontoResearchChemicalsInc.)。

2)实验材料的制备

将二甲双胍溶解在蒸馏水中，并用10％FBS-RPMI1640培养基稀释来制备15mmol/L的二甲双胍。将二氢槲皮素溶解在乙醇中，并用培养基稀释来制备0.3mmol/L的二氢槲皮素。将吉西他滨溶解在二甲基亚砜(DMSO)中，并用培养基稀释来制备100nmol/L的吉西他滨。

3)细胞

源自人胰腺癌的细胞系AsPC-1得自大日本住友制药株式会社。将细胞在37℃，5％CO₂的条件下在10％FBS-RPMI1640培养基中培养。

4)试验材料的添加和测量

各个组(N＝10)如下进行处理：

(1)对照(载体对照)组：含1.5％蒸馏水、0.3％乙醇和0.1％DMSO的培养基

(2)二甲双胍单处理组：二甲双胍15mmol/L

(3)二氢槲皮素单处理组：二氢槲皮素0.3mmol/L

(4)二甲双胍·二氢槲皮素组合处理组：二甲双胍15mmol/L+二氢槲皮素0.3mmol/L

(5)吉西他滨单处理组：吉西他滨100nmol/L

(6)二甲双胍·二氢槲皮素·吉西他滨组合处理组：二甲双胍15mmol/L+二氢槲皮素0.3mmol/L+吉西他滨100nmol/L

将传代培养的AsPC-1细胞用胰蛋白酶消化，并悬浮在新鲜培养基中。使用血细胞计数仪测定细胞悬浮液的细胞密度并调整至2×10⁴个细胞/mL。将细胞以3ml/孔接种到6孔多孔培养板(IWAKI)上，并在37℃，5％CO₂的条件下培养过夜。第二天，将培养基换为以给定浓度包含各个试验材料的培养基，并将细胞培养72小时。培养的最后，将细胞用胰蛋白酶消化，并悬浮在新鲜培养基中。在用FACS(荧光激活细胞分选(fluorescenceactivatedcellsorting))缓冲液洗涤后，细胞用FITC标记的抗人CD44抗体和APC标记的抗人CD24抗体染色，并在4℃处理30分钟。之后，细胞用FACS缓冲液洗涤，通过40微米筛网过滤器，并用流式细胞仪(日本BectonDickinsonandCompany,Ltd.)测定CD44和CD24双阳性细胞的比例。

5)统计分析

结果显示为平均值(MEAN)±标准偏差(SD)。

为了评估二甲双胍和二氢槲皮素单处理组和组合使用组对CD44和CD24双阳性细胞的比例的影响，进行未配对双因素方差分析来将对照组和各个材料单处理组和组合处理组进行比较。为了评估吉西他滨单处理组对CD44和CD24双阳性细胞的比例的影响，进行史蒂顿特t检验来比较对照组和吉西他滨单处理组。另外，为了评估吉西他滨、二甲双胍和二氢槲皮素组合处理组相对于吉西他滨单处理组对CD44和CD24双阳性细胞的比例的影响，进行史蒂顿特t检验来比较吉西他滨单处理组和吉西他滨、二甲双胍和二氢槲皮素组合处理组。使用9.3版SAS软件(日本SASInstitute公司)进行所述分析。当p值小于0.05时认为差异是统计学上显著的。

6)结果

与对照组相比，二氢槲皮素单处理组和二甲双胍和二氢槲皮素组合处理组显著降低了AsPC-1细胞中的CD44和CD24双阳性细胞的比例。与对照组相比，吉西他滨单处理组显著增加了AsPC-1细胞中的CD44和CD24双阳性细胞的比例。通过补充添加二甲双胍和二氢槲皮素显著抑制了由单独添加吉西他滨导致的CD44和CD24双阳性细胞的比例增加。

7)结论

在胰腺癌细胞系AsPC-1上评估CD24和CD44双阳性细胞的比例(测定为在胰腺癌中的癌干细胞)后，通过单独加入二氢槲皮素和组合加入二甲双胍和二氢槲皮素观察到了显著降低。相反，观察到了由吉西他滨导致的所述双阳性细胞的比例的显著增加。另外，通过组合加入二甲双胍和二氢槲皮素显著抑制了上述由单独添加吉西他滨导致的CD44和CD24双阳性细胞的增加。这些结果表明，取决于与吉西他滨治疗相关的癌干细胞富集的复发风险的增加的临床问题可以通过组合使用吉西他滨和二氢槲皮素或者组合使用吉西他滨、二甲双胍和二氢槲皮素来解决。

工业实用性

根据本发明，能够通过组合二甲双胍或其药学上可接受的盐和二氢槲皮素或其药学上可接受的盐提供具有协同抗恶性肿瘤效果并减少副作用的药剂，其作为抗恶性肿瘤药物是有效的。

本申请基于在日本提交的第2013-110278号专利申请，该专利申请的内容在此整体并入本文。

Claims (27)

1.一种药剂，其中组合了二甲双胍或其药学上可接受的盐和二氢槲皮素或其药学上可接受的盐，其中将二甲双胍或其药学上可接受的盐和二氢槲皮素或其药学上可接受的盐包含在单一制剂中，或者将二甲双胍或其药学上可接受的盐和二氢槲皮素或其药学上可接受的盐分别配制成药物组合物并组合使用。

2.根据权利要求1所述的药剂，其中将二甲双胍或其药学上可接受的盐和二氢槲皮素或其药学上可接受的盐包含在单一制剂中。

3.根据权利要求1所述的药剂，其中将二甲双胍或其药学上可接受的盐和二氢槲皮素或其药学上可接受的盐分别配制成药物组合物并组合使用。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的药剂，其用于预防或治疗恶性肿瘤。

5.根据权利要求4所述的药剂，其中，所述恶性肿瘤为：儿童脑肿瘤，所述儿童脑肿瘤选自星形胶质细胞瘤、恶性髓母细胞瘤、胚细胞瘤、颅咽管瘤和室管膜瘤；成人脑瘤，所述成人脑瘤选自神经胶质瘤、胶质瘤、脑膜瘤、垂体腺瘤和神经鞘瘤；头颈癌，所述头颈癌选自上颌窦癌、咽癌、喉癌、口腔癌、唇癌、舌癌和腮腺癌；胸部癌症和肿瘤，所述胸部癌症和肿瘤选自小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺瘤病和间皮瘤；胃肠癌和肿瘤，所述胃肠癌和肿瘤选自食道癌、肝癌、原发性肝癌、胆囊癌、胆管癌、胃癌、结直肠癌、结肠癌、直肠癌、肛门癌、胰腺癌和胰腺内分泌肿瘤；泌尿器官癌和肿瘤，所述泌尿器官癌和肿瘤选自阴茎癌、肾盂·输尿管癌、肾细胞癌、睾丸肿瘤、前列腺癌、膀胱癌、肾母细胞瘤和泌尿道上皮癌；妇科癌症和肿瘤，所述妇科癌症和肿瘤选自外阴癌、宫颈癌、子宫体癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤、绒毛膜癌、阴道癌、乳腺癌、卵巢癌和卵巢生殖细胞肿瘤；成人和儿童软组织肉瘤；骨肿瘤，所述骨肿瘤选自骨肉瘤和尤因瘤；内分泌组织的癌症和肿瘤，所述内分泌组织的癌症和肿瘤选自肾上腺皮质癌和甲状腺癌；恶性淋巴瘤和白血病，所述恶性淋巴瘤和白血病选自恶性淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金病、多发性骨髓瘤、浆细胞肿瘤、急性髓样白血病、急性淋巴性白血病、成人T细胞白血病淋巴瘤、慢性髓样白血病和慢性淋巴性白血病；和皮肤癌和肿瘤，所述皮肤癌和肿瘤选自慢性骨髓增生性疾病、恶性黑色素瘤、鳞状细胞癌、基底细胞癌和蕈样肉芽肿病。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的药剂，其用于治疗用除了二甲双胍或其药学上可接受的盐和二氢槲皮素或其药学上可接受的盐之外的抗恶性肿瘤剂仅提供不充分疗效的患者。

7.根据权利要求1至5中任一项所述的药剂，其中组合了一种或多种除了二甲双胍或其药学上可接受的盐和二氢槲皮素或其药学上可接受的盐之外的抗恶性肿瘤剂。

8.根据权利要求6或7所述的药剂，其中，所述除了二甲双胍或其药学上可接受的盐和二氢槲皮素或其药学上可接受的盐之外的抗恶性肿瘤剂为分子靶向药物、烷化剂、代谢拮抗剂、植物生物碱、抗癌抗生素、激素剂或免疫治疗剂。

9.一种商品包装物，其包含根据权利要求1至8中任一项所述的药剂以及与其相关的书面材料，所述书面材料描述了该药剂能够或应当用于预防或治疗恶性肿瘤。

10.一种用于降低二甲双胍或其药学上可接受的盐的副作用的试剂，其包含二氢槲皮素或其药学上可接受的盐作为活性成分。

11.一种二甲双胍或其药学上可接受的盐的抗恶性肿瘤作用的增强剂，其包含二氢槲皮素或其药学上可接受的盐作为活性成分。

12.一种用于降低二甲双胍或其药学上可接受的盐的副作用的试剂，其包含二氢槲皮素或其药学上可接受的盐作为活性成分，与二甲双胍或其药学上可接受的盐一起组合使用。

13.一种包含二氢槲皮素或其药学上可接受的盐作为活性成分的抗恶性肿瘤作用的增强剂，其与二甲双胍或其药学上可接受的盐一起组合使用。

14.二氢槲皮素或其药学上可接受的盐与二甲双胍或其药学上可接受的盐组合在制备用于预防或治疗恶性肿瘤的药剂中的用途。

15.一种预防或治疗恶性肿瘤的方法，其包括对有此需要的对象给药二甲双胍或其药学上可接受的盐和二氢槲皮素或其药学上可接受的盐，其中二甲双胍或其药学上可接受的盐和二氢槲皮素或其药学上可接受的盐作为单一制剂给药，或者作为同时或在不同时间点给药的单独制剂给药。

16.一种用于预防或治疗胰腺癌的药剂，其包含二氢槲皮素或其药学上可接受的盐作为活性成分。

17.一种预防或治疗胰腺癌的方法，其包括对有此需要的对象给药二氢槲皮素或其药学上可接受的盐。

18.二氢槲皮素或其药学上可接受的盐作为用于预防或治疗胰腺癌的药剂的用途。

19.二氢槲皮素或其药学上可接受的盐，其用于预防或治疗胰腺癌。

20.二氢槲皮素或其药学上可接受的盐在制备用于预防或治疗胰腺癌的药剂中的用途。

21.一种胰腺癌干细胞抑制剂，其包含二氢槲皮素或其药学上可接受的盐作为活性成分。

22.一种抑制胰腺癌干细胞的方法，其包括对有此需要的对象给药二氢槲皮素或其药学上可接受的盐。

23.二氢槲皮素或其药学上可接受的盐作为胰腺癌干细胞抑制剂的用途。

24.二氢槲皮素或其药学上可接受的盐，其用于抑制胰腺癌干细胞。

25.二氢槲皮素或其药学上可接受的盐在制备胰腺癌干细胞抑制剂中的用途。

26.一种药剂，其包含用于与二氢槲皮素或其药学上可接受的盐组合使用的二甲双胍或其药学上可接受的盐。

27.一种药剂，其包含用于与二甲双胍或其药学上可接受的盐组合使用的二氢槲皮素或其药学上可接受的盐。