CN105254726A

CN105254726A - 与植物抗逆相关的erf类转录因子及其编码基因和应用

Info

Publication number: CN105254726A
Application number: CN201510703816.5A
Authority: CN
Inventors: 孙占敏; 周美亮; 吴燕民; 唐益雄
Original assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Current assignee: Jinkeluowo Shanghai Biotechnology Co ltd; Biotechnology Research Institute of CAAS
Priority date: 2015-10-26
Filing date: 2015-10-26
Publication date: 2016-01-20
Anticipated expiration: 2035-10-26
Also published as: CN105254726B

Abstract

本发明公开了与植物抗逆相关的ERF类转录因子及其编码基因和应用。本发明首先提供了核苷酸序列为SEQ？ID？No.1所示的从百脉根中分离的ERF类转录因子基因LcERF056，所编码转录因子氨基酸序列为SEQ？ID？No.2所示。本发明还提供了能够与顺式作用元件结合而启动抗逆应答基因表达的SEQ？ID？NO.3所示的ERF类转录因子结构域。功能分析实验证明，在植物中过表达LcERF056基因能够有效提高或改善植物对高盐胁迫的抗性，说明LcERF056基因所编码的蛋白具有ERF类转录因子的功能。本发明进一步提供了它们在提高植物对逆境胁迫抗性以及培育耐逆境胁迫转基因植物新品种等方面的应用。

Description

与植物抗逆相关的ERF类转录因子及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及转录因子，尤其涉及从百脉根(LotuscorniculatusL.)中分离的与植物抗逆境胁迫相关的ERF类转录因子及其编码基因，本发明进一步涉及它们在提高植物抗逆境胁迫能力的应用，属于ERF类转录因子及其应用领域。

背景技术

盐分是降低农作物产量的首要因素，土壤盐碱化和次生盐碱化问题已在世界范围内广泛存在，特别是在干旱、半干旱地区，问题更为严重。据联合国科教文组织UNESCO、粮农组织FAO不完全统计，全球盐碱地面积已达9.5亿hm²，约占地球陆地总面积的10％，其中中国为9913万hm²，占全世界盐渍土壤的九分之一，相当于中国的18亿亩耕地面积，可见盐胁迫对农作物的影响已成为世界性普遍问题。

植物抗逆性是受多基因控制的复杂数量性状，单个基因表达的增强并不能从根本上改良植物对多种不良环境的抵抗能力，而转录因子(TranscriptionalFactors,TFs)是一类能与真核生物基因启动子区域中的顺式作用元件特异性结合,通过它们之间及其他相关蛋白之间的相互作用,从而激活或抑制目的基因以特定的强度在特定的时间与空间表达的DNA结合蛋白质，是目前抗逆研究最多、应用最广的一类基因。

植物逆境抗性相关转录因子可以分：AP2/ERF、bZIP、WRKY、MYB、NAC五大类。其中AP2/ERF转录因子是植物特有的一大类超基因家族，具有非常保守的DNA结合域，特异性的与ERE、GCC-box等顺式元件结合，调控胁迫应答基因表达，是参与植物生长发育、生物/非生物胁迫应答基因表达及信号转导的重要转录调控因子。AP2/ERF超家族分为AP2、DREB、ERF、RAV和Soloist共5个亚家族，其中DREB和ERF是首要的两大类亚家族，在生物/非生物胁迫应答中发挥至关重要的作用，是提高植物抗逆性能的理想候选基因。近年来，已有很多文献报道了AP2/ERF类转录因子参与提高植物的耐盐性：过表达拟南芥ERF类转录因子可以提高植物的耐盐性(ZhuQ,ZhangJ,GaoX,etal.TheArabidopsisAP2/ERFtranscriptionfactorRAP2.6participatesinABA,saltandosmoticstressresponses.Gene,2010,457(1-2):1-12.)；紫花苜蓿MsERF8(ZhaiY,WangY,LIY,etal.IsolationandmolecularcharacterizationofGmERF7,asoybeanethylene-responsefactorthatincreasessaltstresstoleranceintobacco.Gene,2013,513(1):174-183)、西红柿SIERF5(PanY,SeymourGB,LuC,etal.Anethyleneresponsefactor(ERF5)promotingadaptationtodroughtandsalttoleranceintomato.PlantCellRep,2012,31(2):349-360.)、大豆GmERF7(ChenT,YangQ,GruberM,etal.Expressionofanalfalfa(MedicagosativaL.)ethyleneresponsefactorgeneMsERF8intobaccoplantsenhancesresistancetosalinity.MolBiolRep,2012,39(5):6067-6075.)在烟草中过表达可以提高植物的耐盐性。

百脉根(LotuscorniculatusL.)是世界范围内广泛种植的多年生优良豆科牧草，具有营养丰富、耐贫瘠、耐酸碱、耐牧和饲用安全、适口性好等优点。其不仅是建设生态农业的优质草种，还是用于土壤改良的重要作物，在用作地被植物、保持水土、改良人工草场、防止土壤荒漠化等方面具有独特作用。另外，百脉根在西方国家也常被作为路旁和庭院观赏植物而栽培。目前，有关文献报道百脉根ERF基因参与植物的耐盐性还很少。仅有两篇文献(SunZM,ZhouML,XiaoXG,TangYX,WuYM.Genome-wideanalysisofAP2/ERFfamilygenesfromLotuscorniculatusshowsLcERF054enhancessalttolerance.Funct.Integr.Genomics,2014,14(3),453-466.SunZM,ZhouML,XiaoXG,TangYX,WuYM.OverexpressionofaLotuscorniculatusAP2/ERFtranscriptionfactorgene,LcERF080,enhancestolerancetosaltstressintransgenicArabidopsis.Plantbiotechnol.rep.,2014,8(4),315-324.)分别报道了百脉根转录因子LcERF054、LcERF080显著提高了转基因拟南芥的耐盐性，LcERF054、LcERF080分别属于ERF亚家族的B2和B4亚组，从百脉根中分离、鉴定出了ERF亚家族的B3亚组的新基因，并对其进行了抗逆功能分析未见报道。

因此，选择优质牧草百脉根为材料分离、鉴定ERF亚家族B3亚组转录因子并分析其抗逆功能，这对农牧业生产、生态环境建设以及土壤改良等均具有重要意义。

发明内容

本发明目的之一是提供从百脉根(LotuscorniculatusL.)中分离的与植物抗逆相关的ERF类转录因子及其编码基因。

本发明目的之二是提供含有上述编码基因的重组植物表达载体以及含有该表达载体的宿主细胞。

本发明目的之三是将所述的转录因子及其编码基因应用于提高或改善植物对于环境胁迫的抗性以及培育耐逆境胁迫的转基因植物新品种。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

为实现上述目的，本发明一方面提供了一种从百脉根(LotuscorniculatusL.)所分离的ERF类转录因子编码基因(命名为：LcERF056)，其多核苷酸为(a)、(b)、(c)、(d)或(e)所示：

(a)、SEQIDNo.1所示的多核苷酸；或

(b)、编码SEQIDNo.2所示氨基酸的多核苷酸；或

(c)、与SEQIDNO.1的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸，该多核苷酸所编码蛋白质仍具有ERF类转录因子功能；或

(d)、与SEQIDNo.1所示的多核苷酸至少有90％或以上同源性的多核苷酸；或

(e)、在SEQIDNO.1所示的多核苷酸的基础上进行一个或多个碱基的缺失、取代或插入的多核苷酸变体，且该多核苷酸变体所编码的蛋白仍具有ERF类转录因子功能的功能或活性。

本发明目的之二是提供由上述转录因子LcERF056基因所编码的能够提高植物对环境胁迫抗性的ERF类转录因子，其氨基酸为(a)或(b)所示:

(a)、SEQIDNo.2所示的氨基酸；

(b)、将SEQIDNo.2所示的氨基酸通过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或/和插入而衍生得到的仍具有ERF类转录因子功能或活性的蛋白变体；

其中，SEQIDNO.2的氨基端第121至185位氨基酸残基序列(SEQIDNO.3)为AP2/ERF结合域的编码序列，该结合域第14位氨基酸为丙氨酸(A)，第19位氨基酸为天冬氨酸(D)，此类结构域能够与GCCbox顺式作用元件结合而启动抗病防卫基因或抗逆应答基因的表达。另外，通过对LcERF056与拟南芥、水稻的同源AP2/ERF的氨基酸序列进行多序列比对，表明LcERF056与拟南芥ERF亚家族B3亚组的AtERF101同源关系最近，说明了LcERF056是ERF亚家族B3亚组的新基因。

本发明所述的蛋白变体可由遗传多态性或人为操作产生，这些操作方法通常为本领域所了解。例如，可通过DNA的突变来制备ERF转录因子的氨基酸序列变体或片段，其中由于诱变或改变多核苷酸的方法为本领域所习知。其中，保守的取代是将一种氨基酸残基替换成具有相似性质的另一种氨基酸。

本发明所述的LcERF056转录因子编码基因包括天然存在的序列和变体两种形式。“变体”意指基本相似的序列，对于多核苷酸，变体包含天然多核苷酸中一个或多个位点处一个或多个核苷酸的缺失、插入或/和替换。对于多核苷酸，保守的变体包括由于遗传密码的简并性而不改变编码的氨基酸序列的那些变体。诸如此类天然存在的变体可通过现有的分子生物学技术来鉴定。变体多核苷酸还包括合成来源的多核苷酸，例如采用定点诱变所得到的仍编码SEQIDNo.2所示的氨基酸的多核苷酸变体，或者是通过重组的方法(例如DNA改组)。本领域技术人员可通过以下分子生物技术手段来筛选或评价变体多核苷酸所编码蛋白的功能或活性：DNA结合活性、蛋白之间的相互作用，瞬时研究中基因表达的激活情况或转基因植物中表达的效应等。

本发明还提供了含有所述LcERF056转录因子编码基因的重组植物表达载体以及含有该重组植物表达载体的宿主细胞。

将所述LcERF056转录因子编码基因可操作的与表达调控元件相连接，得到可以在植物中表达该编码基因的重组植物表达载体；该重组植物表达载体可以由5′端非编码区、SEQIDNo.1所示的核苷酸和3′非编码区组成，其中，所述的5′端非编码区可以包括启动子序列、增强子序列或/和翻译增强序列；所述的启动子可以是组成性启动子、诱导型启动子、组织或器官特异性启动子；所述的3′非编码区可以包含终止子序列、mRNA切割序列等。合适的终止子序列可取自根癌农杆菌的Ti-质粒，例如章鱼碱合成酶和胭脂碱合成酶终止区。

另外，本领域技术人员可以将SEQIDNo.1所示的核苷酸进行优化以增强在植物中的表达效率。例如，可采用目标植物的偏爱密码子进行优化来合成多核苷酸以增强在目标植物中的表达效率。

所述重组植物表达载体还可含有用于选择转化细胞的选择性标记基因。选择性标记基因用于选择经转化的细胞或组织。标记基因包括：编码抗生素抗性的基因以及赋予除草化合物抗性的基因等。此外，所述的标记基因还包括表型标记，例如β-半乳糖苷酶和荧光蛋白等。

本发明还涉及将所述的LcERF056转录因子基因引入到植物中以提高植物对逆境胁迫的抗性；

由此，本发明提供了一种提高植物对逆境胁迫抗性的方法，包括：将本发明从百脉根中分离的LcERF056转录因子编码基因引入到目标植物或植物细胞中，能够有效提高目标植物对逆境胁迫的抗性；

本发明还提供了一种培育耐逆境胁迫的转基因植物新品种的方法，包括：(1)构建含有所述从百脉根中分离的LcERF056转录因子编码基因的重组植物表达载体；(2)将所构建的重组植物表达载体转化到植物或植物细胞中；(3)培育筛选得到对逆境胁迫抗性提高的转基因植物新品种。

其中，所述的逆境胁迫包括高盐、干旱、低温等逆境，优选的为高盐。

所述的“引入”指将LcERF056转录因子编码基因导入到植物细胞内部这样的方式将多核苷酸或多肽遗传转化到植物中。将所述多核苷酸或多肽引入到植物中的方法为本领域所习知，包括但不限于稳定转化法、瞬时转化法和病毒介导法等。“稳定转化”指被引入的多核苷酸构建体整合至植物细胞的基因组中并能通过其子代遗传；“瞬时转化”指多核苷酸被引入到植物中但只能在植物中暂时性表达或存在。

转化方案以及将所述多核苷酸或多肽引入植物的方案可视用于转化的植物(单子叶植物或双子叶植物)或植物细胞的类型而变化。将所述多核苷酸或多肽引入植物细胞的合适方法包括：显微注射、电穿孔、农杆菌介导的转化、直接基因转移以及高速弹道轰击等。在特定的实施方案中，可利用多种瞬时转化法将本发明的ERF转录因子基因提供给植物。在其它实施方案中，本发明的ERF转录因子基因可通过将植物与病毒或病毒核酸接触来引入到植物中，通常，这样的方法涉及将本发明的LcERF056转录因子编码基因构建体引入病毒DNA或RNA分子中。

利用常规方法可使已转化的细胞再生稳定转化植株(McCormicketal.PlantCellReports.1986.5:81-84)。本发明可用于转化任何植物种类，包括但不限于：单子叶植物或双子叶植物。更优选的，所述的目标植物包括农作物、蔬菜或观赏植物、果树等，例如，可以是玉米、水稻、高粱、小麦、大豆、马铃薯、大麦、番茄、菜豆、花生、甘蔗或棉花等。

为了分析本发明从百脉根(LotuscorniculatusL.)中分离的LcERF056转录因子的功能，本发明首先构建了含有LcERF056基因的重组植物高效表达载体，利用农杆菌介导，采用花序浸染法转化拟南芥，获得转基因拟南芥。通过抗性、基因组PCR及RT-PCR筛选鉴定阳性植株，对转基因拟南芥苗进行耐盐功能分析并且对其相关生理生化指标进行测定，结果表明，转基因LcERF056拟南芥种子发芽率和幼苗成活率显著高于野生型；高盐胁迫下，转基因LcERF056的相对含水量极显著高于野生型，相对电导率极显著低于野生型量，说明在高盐胁迫下，转基因LcERF056拟南芥通过提高植株相对含水量和降低细胞膜的损伤程度提高耐盐性的。

总之，通过拟南芥功能转化实验证明，百脉根LcERF056转录因子及其编码基因能够有效提高植物对高盐等逆境胁迫的抗性。因此，本发明克隆的百脉根LcERF056转录因子及其编码基因在提高植物对逆境胁迫抗性及培育耐逆境胁迫的转基因植物新品种中有着重要的应用前景。

本发明所涉及到的术语定义

除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。虽然在本发明的实践或测试中可使用与本文所述者类似或等效的任何方法、装置和材料，但现在描述优选方法、装置和材料。

术语“转录因子”是能够与真核生物基因启动子区域中顺式作用元件特异性结合，从而激活或抑制下游基因在特定时间和空间转录与表达的一类DNA结合蛋白。

术语“多核苷酸”或“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA(肽核酸)、在反义技术中所用的DNA类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等)。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选(或所有)密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(Batzer等人,NucleicAcidRes.19:5081(1991)；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；和Cassol等人,(1992)；Rossolini等人,MolCell.Probes8:91-98(1994))。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中互换使用以意指氨基酸残基的聚合物。即，针对多肽的描述同样适用于描述肽和描述蛋白，且反之亦然。所述术语适用于天然产生氨基酸聚合物以及其中一个或一个以上氨基酸残基为非天然编码氨基酸的氨基酸聚合物。如本文中所使用，所述术语涵盖任何长度的氨基酸链，其包括全长蛋白(即抗原)，其中氨基酸残基经由共价肽键连接。

本发明中所述“严谨杂交条件”意指在所属领域中已知的低离子强度和高温的条件。通常，在严谨条件下，探针与其靶序列杂交的可检测程度比与其它序列杂交的可检测程度更高(例如超过本底至少2倍。严谨杂交条件是序列依赖性的，在不同的环境条件下将会不同，较长的序列在较高温度下特异性杂交。通过控制杂交的严谨性或洗涤条件可鉴定与探针100％互补的靶序列。对于核酸杂交的详尽指导可参考有关文献(Tijssen,TechniquesinBiochemistryandMolecularBiology-HybridizationwithNucleicProbes,"Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidassays.1993)。更具体的，所述严谨条件通常被选择为低于特异序列在规定离子强度pH下的热熔点(T_m)约5-10℃。T_m为在平衡状态下50％与目标互补的探针杂交到目标序列时所处的温度(在指定离子强度、pH和核酸浓度下)(因为目标序列过量存在，所以在T_m下在平衡状态下50％的探针被占据)。严谨条件可为以下条件：其中在pH7.0到8.3下盐浓度低于约1.0M钠离子浓度，通常为约0.01到1.0M钠离子浓度(或其它盐)，并且温度对于短探针(包括(但不限于)10到50个核苷酸)而言为至少约30℃，而对于长探针(包括(但不限于)大于50个核苷酸)而言为至少约60℃。严谨条件也可通过加入诸如甲酰胺的去稳定剂来实现。对于选择性或特异性杂交而言，正信号可为至少两倍的背景杂交，视情况为10倍背景杂交。例示性严谨杂交条件可如下：50％甲酰胺，5×SSC和1％SDS，在42℃下培养；或5×SSC，1％SDS，在65℃下培养，在0.2×SSC中洗涤和在65℃下于0.1％SDS中洗涤。所述洗涤可进行5、15、30、60、120分钟或更长时间。

本发明中所述的“多个”通常意味着2-8个，优选为2-4个，这取决于ERF转录因子三维结构中氨基酸残基的位置或氨基酸的种类；所述的“替换”是指分别用不同的氨基酸残基取代一个或多个氨基酸残基；所述的“缺失”是指氨基酸残基数量的减少，也即是分别缺少其中的一个或多个氨基酸残基；所述的“插入”是指氨基酸残基序列的改变，相对天然分子而言，所述改变导致添加一个或多个氨基酸残基。

术语“重组宿主细胞株”或“宿主细胞”意指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。宿主细胞可为原核细胞或真核细胞，宿主细胞还可为单子叶或双子叶植物细胞。

术语“可操作的连接”指两个或更多个元件之间功能性的连接，可操作的连接的元件可为邻接或非邻接的。

术语“转化”：将异源性DNA序列引入到宿主细胞或有机体的方法。

术语“表达”：内源性基因或转基因在植物细胞中的转录和/或翻译。

术语“编码序列”：转录成RNA的核酸序列。

术语“重组植物表达载体”：一种或多种用于实现植物转化的DNA载体；本领域中这些载体常被称为二元载体。二元载体连同具有辅助质粒的载体是大多常用于土壤杆菌介导转化的。二元载体通常包括：T-DNA转移所需要的顺式作用序列、经工程化处理以便能够在植物细胞中表达的选择标记物，待转录的异源性DNA序列等。

附图说明

图1LcERF056cDNA全长序列得扩增结果；M：DNAMarker100001：cDNA扩增结果2：DNA扩增结果。

图2转录因子LcERF056的结构保守域分析

图3转录因子LcERF056的系统进化分析

图4LcERF056的组织表达分析

图5LcERF056在不同胁迫条件下的表达模式分析

图6植物表达载体pH7WG2D-LcERF056构建流程图；A：入门载体构建B：植物过表达载体构建

图7重组质粒pH7WG2D-LcERF056的PCR鉴定；M：DNAMarker1001：重组质粒扩增结果2：重组质粒扩增结果

图8含有表达载体pH7WG2D-LcERF056的农杆菌GV3101的菌落PCR；M：DNAMarker10000+：质粒阳性对照-：阴性对照1-10：单菌落1-10

图9转LcERF056基因拟南芥的DNA水平的PCR检测结果；M：DNAMarker10000+：质粒阳性对照-：野生型阴性对照1-22：转基因LcERF056拟南芥株系

图10转LcERF056基因拟南芥的RNA水平的PCR检测；M：DNAMarker100+：质粒阳性对照-：阴性对照1，2，3：转基因LcERF056拟南芥株系L7，L16，L21

图11、盐胁迫对转基因LcERF056拟南芥种子发芽率的影响；WT为野生型拟南芥；L7，L16和L21：转基因LcERF056拟南芥的不同株系

图12、盐胁迫对转基因LcERF056拟南芥幼苗存活率的影响；WT为野生型拟南芥；L7，L16和L21：转基因LcERF056拟南芥的不同株系

图13、盐胁迫对转基因LcERF056拟南芥生理指标的影响；WT为野生型拟南芥；L7，L16和L21：转基因LcERF056拟南芥的不同株系

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1百脉根LcERF056转录因子编码基因的分离、鉴定与克隆

1材料与方法

1.1材料

1.1.1植物材料培养及胁迫处理

以百脉根“Leo”为材料，选成熟饱满、无病虫害的种子，用2％NaClO浸泡15-20min，无菌水冲洗3次，晾干，把消过毒的种子置于B5培养基上，于光照培养箱中培养30天，用150mM的氯化钠、20％PEG处理0h、3h、12h、24h，采集叶片立即液氮速冻，保存于-80℃冰箱中备用。

组织表达特异性分析：取大田百脉根的根、茎、叶、花、种子,液氮速冻,-80℃保存待用。

激素处理百脉根,将培养30d的幼苗移栽至含有100μM的ABA、ACC、MeJA、SA的MS培养基中,处理0h、3h、12h、24h,取嫩叶,液氮速冻,-80℃保存待用。

1.1.2菌株与质粒

大肠杆菌(Escherichiacoli)：DH5α本发明人实验室保存

pEASY-T-Simple克隆载体购自全式金生物公司

1.1.3溶液

(1)TE(10mMTris-HCl，pH8.0；1mMEDTA，pH8.0)的配制

1MTris-HCl(pH8.0)1ml，0.5MEDTA(pH8.0)0.2ml，超纯水至100ml。

(2)50×TAE缓冲液

242gTris碱，57.1ml冰醋酸，100ml0.05mol/LEDTA(pH8.0)

(3)1.0MTris-HCl缓冲液(1L)

800ml去离子水中溶解121.1gTris碱，充分溶解后，加入浓HCL40ml，用去离子水定容至1L。

1.1.4培养基

(1)LB液体培养基(1L,pH7.4)

蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g,NaCl10.0g。如是固体培养基，添加琼脂粉15.0-20.0g。

(2)B5培养基(pH5.8)

B5干粉4.43g，蔗糖20g，溶于800mL去离子水中，调pH值至5.8-6.0，定容至1L，固体培养基中加入15g琼脂粉或2.5g植物凝胶，121℃高温高压灭菌15min。如果配制含有抗生素或激素培养基，将灭完菌的B5培养基冷却到60℃左右，再加入相应的试剂到所需浓度。

1.2实验方法

1.2.1百脉根总RNA的提取(按天根生化公司的多糖多酚植物总RNA提取试剂盒说明书进行，目录号：DP441)

1.2.2第一链cDNA的合成(按天根公司反转录试剂盒说明书进行)

1.2.3ERF转录因子基因cDNA的克隆

1.2.3.1引物的设计与合成

表1克隆LcERF056CDS全长的引物序列

1.2.3.1RT-PCR

以用150mMNaCl处理12h、24h的叶片为材料提取总RNA，以反转录的cDNA为模板进行RT-PCR，PCR条件为：94℃5min；94℃30sec，55℃30sec，72℃1min，30个循环；72℃10min；4℃保存。

1.2.3.3PCR产物的回收

采用北京全式金生物技术有限公司的EasypurePCRPurificationkit回收目的片段，按照试剂盒说明书的方法进行操作。

1.2.3.4目的片段与克隆载体的连接

将回收的PCR产物连接至pEASY-T-Simple载体上，连接反应体系见表2，25℃连接10min。

表2连接反应体系

1.2.3.5大肠杆菌感受态的制备

参照文献“One-steppreparationofcompetentEscherichiacoli:transformationandstorageofbacterialcellsinthesamesolution”(Chungetal.,1989)中所写的具体方法进行。

1.2.3.6大肠杆菌的转化(热激法)

参照《分子克隆实验指南》(第三版，J.萨姆布鲁克)一书中所列的具体方法进行。

1.2.3.7菌落PCR鉴定

以含有Kan的LB平板上挑取的白色单菌落，进行菌落培养并PCR验证，采用通用引物M13，扩增条件为：94℃3min；(94℃45sec，55℃45sec，72℃1min)30个循环；72℃10min。用1.5％的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定，并将筛选得到阳性克隆送中国农业科学院作物科学研究所重大工程开放实验室测序部测序。

2实验结果与分析

2.1LcERF056基因的克隆及其生物信息学分析

RT-PCR扩增出了LcERF056基因完整的ERF序列(SEQIDNO.1)(图1)，该核苷酸序列已提交Genbank，获得登录号：KC777345。其全长cDNA序列为558bp，开放阅读框含有558bp，没有内含子，即编码由185个氨基酸残基组成的蛋白LcERF056(SEQIDNo.2)。采用SMART软件分析转录因子LcERF056的保守结构域，第121至185位氨基酸残基序列为AP2/ERF结合域的编码序列(SEQIDNO.3)(图2)，该结合域第14位氨基酸为丙氨酸(A)，第19位氨基酸为天冬氨酸(D)，此类结构域能够与GCCbox顺式作用元件结合而启动抗病防卫基因或抗逆应答基因的表达。通过ExPASyComputepI/Mwtool软件预测蛋白LcERF056等电点为9.41，分子量为18.2kDa；采用SignalP4.1软件分析信号肽，结果显示：LcERF056蛋白没有信号肽，属于非分泌性蛋白；ProtScale软件分析疏水性、TMHMM软件分析跨膜结构，结果表明：LcERF056蛋白是亲水蛋白且没有跨膜结构。

采用ClustalX2软件将LcERF056与拟南芥、水稻的同源AP2/ERF的氨基酸序列进行多序列比对，用MEGA5.0构建进化树(图3)，LcERF056与拟南芥ERF亚家族B3亚组的AtERF101同源关系最近，因此LcERF056是ERF亚家族B3亚组的新基因。

2.2基因LcERF056在不同胁迫条件下的表达模式分析

采用RT-PCR方法分析了基因LcERF056在根、茎、叶、花和种子中的组织表达特异性(图4)，结果表明该基因在茎、叶中表达。

采用qRT-PCR方法分析了基因LcERF056受激素(ABA(脱落酸)、ACC(乙烯的供体)、JA(茉莉酸)、SA(水杨酸))和非生物胁迫(NaCl、PEG)诱导不同时间的表达量变化情况(图5)。基因LcERF056在受JA、SA诱导3h，表达量显著上调，说明该基因受JA和SA诱导表达且属于早期基因表达；受NaCl和ABA诱导24h，表达量显著上调，说明LcERF056受NaCl和ABA诱导表达；ACC和PEG诱导3h和24h，表达量显著下调，说明LcERF056受ACC和PEG抑制表达，因此，基因LcERF056受ABA、JA、SA和NaCl诱导表达。可见，基因LcERF056对盐非生物胁迫和脱落酸、茉莉酸、水杨酸等激素处理都有不同程度的应答，说明它可能参与了多种非生物胁迫及信号转导途径。

实施例2含有LcERF056基因的植物表达载体的构建及其在拟南芥中的耐盐功能验证

1材料与方法

1.1材料

1.1.1植物材料

拟南芥(Arabidopsisthaliana)哥伦比亚Columbia(Col-0)生态型：本发明人实验室保存。

1.1.2菌种及载体

根癌农杆菌菌株GV3101，本发明人实验室保存；gateway入门载体pDNOR201、表达载体pH7WG2D购自invitrogen公司。

1.1.3培养基

1.1.3.1YEB培养基(1L)

蛋白胨5g，酵母提取物1g，蔗糖5g，MgSO₄·7H₂O0.5g，去离子水定容至1L，若是固体培养基，加入15g琼脂粉，121℃高温高压灭菌15min。

1.1.3.2LB培养基(1L)

胰蛋白胨10g，氯化钠10g，酵母提取物5g，去离子水定容至1L，若是固体培养基，加入15g琼脂粉，121℃高温高压灭菌15min。

1.1.3.3MS培养基：

MS干粉4.43g，蔗糖20g，溶于800mL去离子水中，调pH值至5.8-6.0，定容至1L，固体培养基中加入15g琼脂粉或2.5g植物凝胶，121℃高温高压灭菌15min。如果配制含有抗生素或激素培养基，将灭完菌的MS培养基冷却到60℃左右，再加入相应的试剂到所需浓度。

1.2实验方法

1.2.1引物设计与合成

设计合成含有attb位点的引物。引物序列见表3。

表3构建重组植物表达载体所用引物

1.2.2植物表达载体的构建

1.2.2.1植物高效表达载体pH7WG2D-LcERF056的构建

利用引物LcERF056-attb(F)和LcERF056-attb(R)从连接有基因LcERF056的CDS全长的pEASY-T载体上扩增出含有attb位点的完整开放阅读框。扩增产物和入门载体pDNOR201经BP反应，将pDNOR201载体上的CDDB基因替换为LcERF056基因，构建含有目的基因LcERF056的入门载体，转化大肠杆菌DH5α，PCR扩增筛选重组质粒，并测序鉴定。将经测序正确的入门载体pDNOR201-LcERF056与表达载体pH7WG2D进行LR反应，将表达载体上的CCDB基因替换为目的基因LcERF056，构建植物表达载体pH7WG2D-LcERF056，转化大肠杆菌DH5α，PCR扩增鉴定重组质粒。

1.2.2.2重组质粒的小量提取

质粒提取方法参照百泰克质粒小量制备试剂盒所列的具体方法。

1.2.3农杆菌转化及培养

1.2.3.1农杆菌GV3101感受态细胞的制备和转化

农杆菌GV3101感受态细胞的制备(TSS法)，参照文献“One-steppreparationofcompetentEscherichiacoli:transformationandstorageofbacterialcellsinthesamesolution”(Chungetal.,1989)中所写的具体方法进行。

转化方法采用热激法，具体步骤参见参见《精编分子生物学实验指南》(奥斯伯)。

1.2.3.2含有重组质粒的农杆菌的PCR鉴定

分别挑取28℃培养1-2d的YEB(含50mg/LSpe,50mg/LRif)转化平板上的单菌落，以未转化的农杆菌作阴性对照，以植物表达载体质粒pH7WG2D-LcERF056为阳性对照，进行菌落PCR鉴定。

1.2.4拟南芥的遗传转化(侵染花序法转化拟南芥)

将含有植物表达载体pH7WG2D-LcERF056的农杆菌培养至OD₆₀₀为0.8-2.0，5500rpm离心10-15min，弃上清，菌体沉淀用MS渗透液重悬，调整OD₆₀₀为0.8-1.2，侵染拟南芥用。

4周左右的拟南芥抽薹后，从基部剪掉主茎，促使侧茎生长约一周，花蕾饱满且处于露白期时，采用蘸花法(CloughandBent，1998)转化拟南芥，花序在上述渗透液中浸泡15sec-45sec，倾斜放置，暗培养2-3d后，正常培养一周，再重复侵染拟南芥一次，四周后收获成熟的种子。

1.2.5转基因LcERF056拟南芥的筛选与鉴定

1.2.5.1转LcERF056基因拟南芥的抗性筛选

将收获的T₀代种子，无菌操作铺在含有25mg/L潮霉素的MS平板上，长出T₁代转基因阳性植株，正常培养，收获单株种子；选取50粒种子T₁代种子铺在潮霉素抗性平板上，长出T₂代转基因阳性植株，选择阳性植株与阴性植株的分离比为3:1的株系，正常培养，收获单株种子；选取50粒T₂代种子铺在潮霉素抗性平板上，鉴定T₃代的纯合度，收获纯合株系T₃代种子、保存，用于后续的功能分析。

1.2.5.2PCR鉴定阳性植株

利用CTAB法小量提取转基因拟南芥抗性苗基因组DNA，通过PCR检测进一步筛选阳性植株。采用0.8％的琼脂糖凝胶电泳。若扩增出了目标片段，而阴性对照中没有扩增出片段，即初步证明目的基因整合到拟南芥基因组中。

1.2.5.3RT-PCR进一步鉴定阳性植株

对DNA水平检测为阳性的拟南芥植株，利用TRIzol试剂提取总RNA，反转录获得cDNA作为模板，RT-PCR检测筛选阳性转化苗。方法参照实施例1中的1.2.3.1和1.2.3.2；采用0.8％的琼脂糖凝胶电泳。

1.2.6转基因拟南芥的耐盐功能分析

1.2.6.1转基因拟南芥种子在盐胁迫下的发芽率

转基因拟南芥种子在盐胁迫下的发芽率实验：将野生型和转基因型拟南芥种子经消毒后，分别种在0mM、100mM、150mM、200mM的NaCl的MS平板上，春化1-3d，光照培养箱培养7-15d，每天观察、统计发芽率。

1.2.6.2转基因拟南芥幼苗在盐胁迫下的存活率

幼苗的耐盐实验：将野生型和转基因型拟南芥种子经消毒后，种在MS平板上，春化1-3d，光照培养箱培养7d，选取大小生长一致的幼苗移栽至土盆，再培养2周后，用含有300mM的NaCl水溶液浇灌，每隔3-4d浇灌，7-15d后观察，取样，统计存活率，进行生理指标检测。

1.2.6.3转基因拟南芥在盐胁迫条件下的生理生化指标测定

(1)相对含水量的测定

对NaCl胁迫处理后的转基因和野生型拟南芥，用蒸馏水冲洗干净，吸水纸吸干表面水分。每个处理取3棵单株，并迅速测其鲜重，之后放入120℃烘箱中烘烤30min，80℃烘烤24h至恒重，称量其干重。对上述测得的干、鲜重，采用公式：相对含水量(占鲜重％)＝(鲜重-干重)/鲜重进行含水量的计算。

(2)相对电导率分析

称取经胁迫处理的拟南芥叶片0.2g于10mlEP管中，加入5ml去离子水，自然浸泡1h，之后测定电导率J1并记录，然后放入沸水浴中煮沸10min，冷却至室温测电导率J2并记录。

相对电导率的计算公式：相对电导率＝(J1-J0)/(J2-J0)×100％

(注：J0表示去离子水的电导率值)

2实验结果与分析

2.1植物表达载体的构建

2.1.1植物表达载体pH7WG2D-LcERF056的构建

植物表达载体pH7WG2D-LcERF056的构建流程见图6。

2.1.2重组质粒的PCR鉴定

在重组质粒的转化LB(Spe⁺)平板上，分别挑取10个白色单菌落，进行菌落PCR鉴定，结果有1个阳性克隆，提取阳性克隆的质粒，用基因LcERF056的上、下游引物(表1)和35S上游引物(35S-F：5'-GACGCACAATCCCACTATCC-3')和目的基因的下游引物(LcERF056-R)进行PCR鉴定，结果见图7，从图7中可以看出，两个均扩增出了目的条带，说明植物表达载体构建正确。

2.2含有表达载体的农杆菌鉴定

将重组质粒pH7GW2D-LcERF056转化农杆菌GV3101，以转化后的农杆菌的菌液为模板，未转化的农杆菌作阴性对照，质粒做阳性对照，进行菌液PCR鉴定。结果见图8，从图中可以看出，10个单菌落都是阳性克隆，说明该重组质粒已成功转入农杆菌中。

2.3转基因LcERF056拟南芥阳性苗的鉴定

2.3.1DNA水平的PCR检测

选取潮霉素抗性苗，剪取其叶片，采用CTAB法提取其DNA，以拟南芥基因组DNA为模板，以35S-F和LcERF056-R为引物，采用PCR技术，对潮霉素抗性苗进行DNA水平的检测。结果见图9，从图中可以看出，共检测出了22株阳性苗，这表明基因LcERF056已经整合到拟南芥基因组中。

2.3.2RNA水平的PCR检测

随机选取DNA水平鉴定的3株阳性拟南芥植株叶片为材料，提取总RNA，以反转录获得的cDNA为模板，RT-PCR对阳性苗作进一步的检测。结果见图10，从图中可以看出，3株都为阳性，这说明基因LcERF056能够在拟南芥中进行正常转录表达从而发挥正常的调控功能。

2.4转基因拟南芥种子在盐胁迫下发芽率实验

将野生型和转基因LcERF056拟南芥种子分别铺在含有0，100和150mMNaCl的MS平板上，培养10d，结果见图11，转基因LcERF056拟南芥种子发芽率在0mM和100mM的NaCl浓度下与野生型的没有显著区别，在150mM胁迫下，转基因LcERF056拟南芥的发芽率为85％，极显著地高于野生型的发芽率(45％)，说明转录因子LcERF056极显著地提高了转基因LcERF056拟南芥种子的耐盐性。

2.5转基因拟南芥幼苗在盐胁迫下存活率实验

四周龄的拟南芥幼苗，用300mMNaCl浇透，每隔一周浇一次盐水，共浇3次，周期21d，在此过程中注意观察表型，统计结果。由图12看出，高盐胁迫处理21d时，野生型和转基因LcERF056拟南芥的表型差异显著，95％的野生型拟南芥叶片干枯，植株死亡，而转基因LcERF056拟南芥叶片仍是绿色，仅5％的叶片周围开始干枯，植株存活率为95％。由此可见，在高盐持续胁迫下，转基因LcERF056拟南芥具有显著的耐盐表型，转录因子LcERF056极显著地提高了转基因植株的耐盐性，因此，LcERF056是AP2/ERF家族中优良的盐胁迫调控因子。

2.6转基因拟南芥在盐胁迫条件下的生理生化指标测定

在本发明中，检测了常见的抗逆生理指标：相对含水量和电导率，结果见图13。由图13A看出，在正常条件下，转基因LcERF056拟南芥和野生型的相对含水量无显著差别，在高盐胁迫下，野生型相对含水量降低至70％，而转基因LcERF056的相对含水量保持在90％，极显著地比野生型含水量高，这与表型结果也一致；由图13B看出，在正常条件下，转基因LcERF056和野生型的相对电导率在20％左右，在高盐胁迫下，野生型的相对电导率升至90％，转基因LcERF056的电导率为59％，极显著地比野生型的低。说明在盐胁迫下，转基因LcERF056拟南芥通过提高植株相对含水量和降低细胞膜的损伤程度提高耐盐性的。

Claims

1.从百脉根(LotuscorniculatusL.)分离的ERF类转录因子编码基因，其特征在于，其多核苷酸为(a)、(b)、(c)、(d)或(e)所示：

(a)、SEQIDNo.1所示的多核苷酸；或

(b)、编码SEQIDNo.2所示氨基酸的多核苷酸；或

2.权利要求1所述编码基因编码的ERF类转录因子，其特征在于，其氨基酸为(a)或(b)所示:

(a)、SEQIDNo.2所示的氨基酸；或

(b)、将SEQIDNo.2所示的氨基酸通过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或/和插入而衍生得到的仍具有ERF类转录因子功能或活性的蛋白变体。

3.与顺式作用元件结合而启动抗病防卫基因或抗逆应答基因表达的ERF类转录因子的结构域，其特征在于：其氨基酸序列为SEQIDNO.3所示。

4.含有权利要求1所述编码基因的表达载体。

5.按照权利要求4所述的表达载体，其特征在于：所述表达载体是重组植物表达载体。

6.权利要求1所述的编码基因在提高植物对逆境胁迫抗性中的应用。

7.按照权利要求6所述的应用，其特征在于，包括：(1)构建含有权利要求1所述编码基因的重组植物表达载体；(2)将所构建的重组植物表达载体转化到植物组织或植物细胞中；(3)培育筛选得到对逆境胁迫抗性提高的转基因植物。

8.一种培育耐逆境胁迫的转基因植物新品种的方法，其特征在于，包括：(1)构建含有权利要求1所述编码基因的重组植物表达载体；(2)将所构建的重组植物表达载体转化到植物组织或植物细胞中；(3)培育筛选得到对逆境胁迫抗性提高的转基因植物新品种。

9.权利要求2所述的ERF类转录因子或权利要求3所述的结构域在提高植物对逆境胁迫抗性中的应用。

10.按照权利要求6、7或9所述的应用，其特征在于：所述的逆境胁迫包括高盐胁迫、干旱胁迫或低温胁迫，优选为高盐胁迫。