CN105229472B

CN105229472B - 血液凝固检测方法

Info

Publication number: CN105229472B
Application number: CN201480029441.2A
Authority: CN
Inventors: 井上铃代; 林胜义; 岩崎弦; 堀内勉; 松浦伸昭; 为近惠美
Original assignee: Nippon Telegraph and Telephone Corp
Current assignee: Nippon Telegraph and Telephone Corp
Priority date: 2013-05-23
Filing date: 2014-05-21
Publication date: 2016-10-26
Anticipated expiration: 2034-05-21
Also published as: CN105229472A; JPWO2014189067A1; US10114032B2; WO2014189067A1; JP5941220B2; US20160116491A1

Abstract

在步骤S101中，将含有血浆的样品和凝固活化剂以凝固活化剂定位在前、在流路的延伸方向上依次排列的部分彼此接触地流动的状态引入流路中。在步骤S102中，在凝固活化剂、凝固活化剂和样品之间的接触区域以及样品以这样的顺序通过沿流路在中途设置的测定部的过程中，以按时间顺序的方式测定凝固活化剂和接触区域的折射率。在步骤S103中，通过比较第一折射率与第二折射率测定样品的血液凝固能力，所述第一折射率是凝固活化剂的折射率，所述第二折射率是接触区域的最小折射率。

Description

血液凝固检测方法

技术领域

本发明涉及测定血液或血浆凝固能力的血液凝固检测方法。

背景技术

血液凝固活性是用于得到指标的重要项目，所述指标用于筛选外源性凝血因子不足或监测肝功能的异常和口服给药的抗凝血剂治疗。

这种血液凝固检测主要使用PT(凝血酶原时间)测定法、APTT(活化部分促凝血酶原激酶时间)测定法、血纤蛋白原检测等。通过使用医院里的大型分析设备进行这些测定和检测。当使用这些方法中的PT测定法和APTT测定进行检测时，将蛋白(血栓调节蛋白或鞣花酸)和凝固血液的钙离子大体上混合作为血浆中的凝固反应触发物，测定从混合开始到凝固完成的时间(凝固点)，并通过比较测得时间与标准血浆结果估测滞后时间。

这种测定内源性/外源性血液凝固途径的血液凝固活性的PT法目前在国际上已经标准化(PT-INR)并且被认为是高重复性和高可靠性的检测项目。例如，首先，搅拌阻力方案作为物理的实施PT法的方法是可行的。搅拌阻力方案是这样的方法：将样品(标本)与活化剂一起引入，并从用叶片搅拌样品和活化剂时搅拌阻力的上升测定血液凝固时间。

此外，作为实施PT测定法的方法，光散射法是可行的(参见专利文献1、2和3)。光散射法是这样的方法：在测定容器中将作为靶标的血浆与含有用于促进凝固活化的成分的试剂混合，使光进入容器，并通过测定入射光的散射光的量的改变测定血液凝固时间。从散射光的量得到血液凝固时间的方法包括直接使用散射光的量的方法，使用散射光的量的导数值的方法和得到直到散射光的量达到预定值的时间的方法(参见专利文献1)。

以上搅拌阻力方案和光散射法目前在许多情况下常用于血液凝固的检测。除它们之外，已经开发了热传导方案、晶体振荡器方案、使用磁珠的聚集测定法(参见专利文献4)等。

此外，本发明的发明人已提出一种通过使用SPR(表面等离子体共振)测定法测定流速来检测凝固活性方法，所述测定法使用具有微流路的芯片。在该检测中，首先，在即将测定之前制备通过与凝固活化剂(鞣花酸和氯化钙)混合而完全活化的血浆样品。然后，将血浆样品引入预先用缓冲溶液填充的流路以将血浆在流路中流动的流速转化为凝固时间(参见专利文献5)。使用这样的微流路的流速测定具有可以使用少量样品快速测定凝固活性的优点。

相关技术文献

专利文献

专利文献1：日本专利公开号06-027115

专利文献2：日本专利公开号2009-506332

专利文献3：日本专利公开号09-266798

专利文献4：日本专利公开号09-502800

专利文献5：日本专利公开号2011-232137

专利文献6：日本专利公开号2010-133727

非专利文献

非专利文献1：Masayuki NAYA等，“使用单片棱镜尖的高敏感度SPR传感器”，FUJIFILM RESEARCH & DEVELOPMENT，NO.50，pp.51-54，2005

发明内容

本发明要解决的问题

然而，以上基于流速的血液凝固检测不能进行精确的检测。在血液凝固检测中，在通过使用凝固活化剂在血浆中产生凝固活性物质后，测定归因于粘度增加的流速变化，所述粘度增加由主要从血纤蛋白形成的凝固物质引起。出于这一原因，不溶性蛋白非特异性吸附于用于测定的测定容器而污染其表面。特别是，血纤蛋白是具有分子量大到允许多个蛋白残基之间同时相互作用的蛋白，因此具有比其他蛋白更高的非特异性吸附能力。

如上描述的，在血液凝固检测中，由于用于检测的流路内部被污染，该污染将改变流速。由污染所致的流速改变造成大的测定误差，导致不能得到精确的测定值。为了解决这一问题，例如，可以清洗流路内部以总是保持流路内部一致清洁。这样的清洗技术包括，例如，用蛋白移除溶液例如碱性清洗溶液填充流路内部或浸渍每个微流路芯片的方法，以及作为物理技术的使用清洗溶液喷射、超声清洗等的组合的方法(参见专利文献6)。

然而，由于在清洗期间不能进行检测，当例如连续进行多个检测时，检测通过量大幅下降。此外，通过测定流速来进行血液凝固检测的技术被设计为测定依赖于粘度的流速。出于这一原因，当测定具有相同凝固能力但具有不同粘度的样品时，不可能正确区分这些凝固能力。

如上所述，使用微流路的血液凝固检测具有可以通过使用少量样品快速测定凝固活性的优点。然而，使用流速将产生不能进行精确检测的问题。

为了解决上述问题做出本发明，并且其目的是通过使用微流路的血液凝固检测更精确地检测血液凝固能力。

解决问题的手段

根据本发明的血液凝固检测方法包括：第一步骤，将含有血浆的样品和凝固活化剂以所述凝固活化剂定位在前、在流路的延伸方向上依次排列的部分彼此接触地流动的状态引入所述流路中；第二步骤，在所述凝固活化剂、所述凝固活化剂和所述样品之间的接触区域和所述样品以这样的顺序通过沿所述流路在中途设置的测定部的过程中，以按时间顺序的方式测定所述凝固活化剂和所述接触区域的折射率；和第三步骤，通过比较第一折射率值与第二折射率值测定所述样品的血液凝固能力，所述第一折射率值是所述凝固活化剂的测得折射率，所述第二折射率值是所述接触区域的测得最小折射率。注意：优选将在测定部通过表面等离子体共振测定测得的表面等离子体共振角用作折射率值。

发明效果

如上描述，根据本发明，可以得到以下优异的效果：能够通过使用微流路的血液凝固检测更精确地检测血液凝固能力。

附图说明

图1是用于说明根据本发明的一个实施方案的血液凝固检测方法的流程图；

图2是用于说明凝固活化剂211和样品212如何在基板201和流路基板203之间形成的微流路204中流动的图；

图3是显示在不发生凝固反应的时候，当凝固活化剂211和样品212在微流路204中流动时测得的折射率的变化的图；

图4是显示在发生凝固反应的时候，当凝固活化剂211和样品212在微流路204中流动时测得的折射率的变化的图；

图5是显示测定芯片400和SPR设备500的布置的透视图；

图6图示了显示测定芯片400的布置的剖面图(a)和(b)和平面图(c)；

图7图示了显示在接触区域413通过测定区域431的过程中测得的SPR角度变化的图；

图8是用于说明相对于折射率已经下降的接触区域设置的宽度和深度的参数的图；

图9图示了显示与在测定区域上的位置(像素)对应的深度(a)和宽度(b)参数的变化的图，所述位置(像素)与构成传感器504的多个光电二极管元件的位置相对应；

图10是显示使用标准样品(活性度：86％)和75％PT凝固活化剂的实验中重复测定的结果作为深度(第二折射率值和第一折射率值)的图；和

图11是显示在用稀释剂稀释标准样品(活性度：86％)而制备具有不同活性度(64％、43％和22％)的样品后，由根据以上实施方案的测定测得的结果(深度)产生的校准曲线的图。

具体实施方式

以下将描述本发明的一个实施方案。图1是用于说明根据本发明的一个实施方案的血液凝固检测方法的流程图。首先，在步骤S101中，将含有血浆的样品和凝固活化剂以凝固活化剂定位在前、在流路的延伸方向上依次排列的部分彼此接触地流动的状态引入流路中(第一步)。所述流路是例如形成在当附到表面等离子体共振测定设备时使用的测定芯片中的微流路。

在步骤S102中，在凝固活化剂，凝固活化剂和样品之间的接触区域，和样品以这样的顺序通过沿流路在中途设置的测定部的过程中，以按时间顺序的方式测定凝固活化剂和接触区域的折射率(第二步)。在步骤S103中，通过在按时间顺序测定得到的结果中，比较第一折射率值与第二折射率值来测定样品的血液凝固能力，所述第一折射率值是凝固活化剂的折射率，所述第二折射率值是接触区域的最小折射率(第三步)。

在以上表面等离子体共振测定设备中使用的测定芯片中，在沿微流路位于中途的测定部上，在测定设备侧上形成Au层。众所周知，在表面等离子体共振测定中，与上述测定区域接触的液体的折射率由照射测定区域下表面的光的反射光强度测得。在与液体接触的Au层的表面上，观察到波谷，其中折射率在隐失波与表面等离子体波共振的角度处降低。发生这一共振的表面等离子体共振角度取决于与Au层接触的液体的折射率。因而，由测得的反射光强度的改变得到通过流路测定区域的液体的折射率的改变。

在步骤S102中的测定中，首先，测得凝固活化剂的折射率作为几乎恒定的值(第一折射率值)直到凝固活化剂通过测定部。与此相反，在接触区域通过测定部的过程中，接触区域的折射率一度减小然后增加。其后，测得样品的折射率作为恒定的值直到样品通过测定区域。可以将接触区域分类为凝固活化剂附近区域、中间区域和样品附近区域。这些区域中，中间区域具有折射率变为最小的部分。通过比较第一折射率值与折射率变为最小的部分的折射率(第二折射率)，可以测定样品的血液凝固能力。

以下将详细描述如何能够从第一和第二折射率值测定样品(血浆)的血液凝固能力。

首先，如图2所示，当凝固活化剂211和样品212在基板201和流路基板203之间形成的微流路204里依次地流动时，凝固活化剂211和样品212在作为它们之间的分界部的接触区域213通过扩散而混合。注意：图2显示了其中Au层202形成在基板201上的状态。

在这两种液体依次供应的时候，当两种物质之间不发生化学反应时，在接触区域213中仅出现两种液体之间的中间组合物。例如，当凝固活化剂211没有引发样品212中的凝固反应时，凝固活化剂211和样品212之间的中间组合物出现在接触区域213中。因为血浆或生物化学试剂包含大量蛋白质，通常测得的溶液的折射率比凝固活化剂的折射率大。出于这一原因，当不发生凝固反应时，当凝固活化剂211和样品212在微流路204中流动时测得的折射率如图3所示地变化。

如图3所示，随着测定时间经过，首先测得凝固活化剂211的折射率。然后，在接触区域213中的测定中，凝固活化剂211和样品212之间的中间组合物的折射率逐渐接近样品212的折射率。其后，测定样品212的折射率。在这种情况下，由于样品212的折射率极大地依赖于蛋白质的浓度，不同血浆成分的测得折射率值有很大不同。

另一方面，当凝固活化剂211引起包含在样品212中的血浆的凝固反应时，接触区域213中的折射率与上述状态不同地变化。例如，在含有血浆的样品212和凝固活化剂211之间的接触区域213中，包含在凝固活化剂211中的促凝血酶原激酶将包含在样品212的血浆中的凝血酶原转化为凝血酶以开始凝固反应。这导致由产生的凝血酶将包含在血浆里的血纤蛋白原转为作为不溶蛋白的血纤蛋白的生物化学反应。这些血纤蛋白进一步形成聚合物以产生血栓。

作为以这种方式观察接触区域213中折射率变化的结果，观测到折射率比凝固活化剂211和样品212的折射率低的区域，如图4所示。这种现象据认为是由升力(Saffman力)引起的，所述升力源自当粒子在直的微流路204中流动时，在表现出大的速度梯度的接触区域213中的流中形成的粒子221周围产生的循环流。

假设在垂直于流动的方向上由升力移动具有直径d的球形粒子。在这种情况下，当作用在粒子上的流体阻力由Stokes阻力定律表示时，粒子的移动速度v_p由以下Saffman方程式表示：

v_{p} = \frac{81.2}{12 π} \frac{d}{v^{0.5}} (u - u_{p}) \sqrt{\frac{d u}{d y}} ... (1)

在方程式(1)中，v是液体的动态粘度系数，u是流动方向上的液体的平均速度，并且u_p是流动方向上的粒子速度。根据方程式(1)，如果流动方向上的粒子速度等于流动方向上的液体的平均速度(u_p＝u)，由升力造成的粒子移动可以忽略。然而，如果粒子速度不同于流体速度，则由升力造成的粒子移动不可忽略。如果粒子速度高于流体速度，粒子向流路的壁移动。另一方面，如果粒子速度低于流体速度，粒子向主流动方向移动。出于这一原因，如果粒子速度不同于流体速度，粒子向作为边界层的接触区域的外侧移动。

粒子速度受从流体物质(流体)的流动速度接受的驱动力和阻力影响。作为流体中的物体(粒子)从流动流体受到的阻力，已知阻力由以下给出的Newton阻力定律表示。

D = \frac{1}{2} {ρCdSV}^{2} ... (2)

在方程式(2)中，ρ是液体密度，Cd是效率因子，S是物体投影面积并且V是速度。根据方程式(2)，随着投影面积随流体中物体尺寸的增加而增加，物体对抗流体的阻力增加。这降低了粒子速度，并因此增加了Saffman力。Saffman力的增加将提高使粒子移动到其中流速高的流路中心部分的力。

此外，液体中的物质受浮力影响。浮力F_b由“F_b＝ρ_fVg”表示，其中ρ_f是流体密度，V是物体体积，g是重力加速度。因此，随着物体表面积增加，浮力增加。这增加了从流路内壁分离的力。

随着两种液体，即凝固活化剂和样品，向前移动和液体之间界面上凝固反应的进行，不溶血纤蛋白的量增加。此外，聚合反应使体积快速增加。出于这一原因，如图2所示，由已经获得低于流体速度的粒子速度的血纤蛋白形成的粒子221向微流路204的中心部分移动，而不沉降在作为微流路204内壁的Au层202上。作为以上过程的结果，在测定部的Au层202(内壁部分)上，据认为随着作为周围血纤蛋白快速消耗后的残余物的接触区域213中的成分的折射率反映在测定结果中，观察到折射率的减小。

实施例

以下将更具体描述实施例。首先将描述用于测定的测定芯片400和SPR设备500。如图5和6所示，测定芯片400包括由BK7玻璃形成的基板401、具有约50nm厚度的Au层402和流路基板403。可以由公知的沉积技术例如溅射法形成Au层402。

此外，流路基板403包括用作微流路404的凹槽部、进口405和出口406。例如，流路基板403可以由聚二甲基硅氧烷(PDMS)形成。凹槽部可以具有约50μm的深度(高度)。进口405具有3mm的孔径。出口406具有1.5mm的孔径。这些口可以由例如公知的活组织检查环钻(biopsy trepan)形成。此外，分开制造基板401和流路基板403。最后，组装测定芯片400使得微流路404与测定区域重叠。

在将其上形成Au层402的基板401和其中形成流路凹槽的流路基板403的结合表面通过用氧气等离子体(反应离子)照射而活化之后，将各自的结合表面彼此接触并彼此结合，从而使两个基板成为一体。等离子体照射在等离子体处理设备的处理室中进行。等离子体由具有70W输出功率的微波产生。此外将氧气以100sccm供应到处理室中，并将处理室中氧气分压设为10Pa。注意sccm是流量单位，并表示0℃和1013hPa的流体以1cm³/分钟的速度流动。此外，等离子体照射进行约5秒。

此外，将负压机构421连接到出口406。这使得通过出口406牵引(吸引)微流路404中的液体成为可能。负压机构421包括，例如，彼此通过不锈钢管连接的排水槽和负压泵(来自Fluigent的MFCS-VAC)。

测定中，将具有与BK7玻璃相同折射率的匹配油(未示出)施加到在SPR设备500的测定棱镜502上形成的测定表面503上，并将测定芯片400的基板401的背表面设置在油上。此外，将测定芯片400的测定区域设置成与从SPR设备500的光源501发出的光的光轴重叠。SPR设备500是例如来自NTT advanced technology的“Smart SPR SS-100”。

将从光源501发出的光聚集以进入棱镜502，并照射与测定棱镜502的测定表面503紧密接触的测定芯片400的测定区域。Au层402形成在成为测定芯片400的测定区域的微流路404的部分上，并且Au层402的背表面用透过测定芯片400的聚集光照射。

已经以这种方式照射背表面的聚集光被作为流速测定目标的流体所接触的Au层402的背表面反射。由图像传感器例如所谓的CCD图像传感器形成的传感器504光电转化所述光以得到强度(光强度)。从以这种方式得到的光强度的变化得到折射率的变化。

首先，将微流路404用作为凝固活化剂的PT凝固试剂411(10mL)填充。微流路404的容量是约1mL至2mL。如图6的(b)和(c)中所示的，可以将由血浆形成的样品412(10mL)通过进口405引入填充有PT凝固试剂411的微流路404的一端，并用恒定压力(负压)牵引通过微流路404的另一端中的出口406。可以将负压机构421连接到出口406以吸引PT凝固试剂411。采用这一操作，当PT凝固试剂411在微流路404中的另一侧(进口405侧)存在并且样品412在一端侧(出口406侧)存在时，以PT凝固试剂411的尾端与样品412的前端接触的状态，将PT凝固试剂411和样品412输送到微流路404内部的另一端。

在这种情况下，在与样品412和PT凝固试剂411接触的接触区域413中，将PT凝固试剂411加到样品412，并因此在接触区域413中可以发生凝固反应。出于这一原因，如以上描述的，当以其中PT凝固试剂411和样品412在微流路404中流动同时被排列的状态形成接触区域413时，凝固反应在接触区域413中开始。

如以上描述的，当样品412的前端与PT凝固试剂411的尾端接触以形成接触区域413并且样品412和PT凝固试剂411如图6所示在微流路404中流动时，测定微流路404中流体的折射率(SPR角度)变化。在微流路404中的预定测定区域431中测定SPR角度。在SPR角度的这一测定中，测定当接触区域413通过测定区域431时的SPR角度变化。传感器504的检测区域对应测定区域431。将多个光电二极管元件在传感器504的检测区域中在流动方向上并排布置。在测定区域431中，在每个光电二极管元件的位置(每个像素位置)处测定光强度的变化(SPR角度)。

将n作为基板401的折射率，εm作为Au层402的介电常数，εs作为样品的介电常数，θ作为入射基板401和Au层402之间界面的光的入射角。在这种情况下，当“n(ω/c)sinθ＝(ω/c)[εm×εs/(εm+εs)]^1/2...(1)”成立时，在入射角度及基板401与Au层402之间的界面处引起的等离子体共振(参见非专利文献1)。角度θ是SPR角度。

此外，当等离子体共振发生时，由于反射光被衰减，该状态显示为通过任何传感器504的光电二极管元件检测的值的变化。因此，基于其检测到的光强度减小的光电二极管元件的像素位置(像素值)得到SPR角度。结果，得到折射率。例如，采用以上像素值，由转换公式例如“折射率值＝像素值×1.2739×10^-4+1.3188(光源波长：770nm)”得到折射率值。

将描述以上实施例中的测定结果。首先，图7示出了在测定区域431中三个观察点处SPR角度的变化。图7显示了各自示出在接触区域413通过测定区域431的过程中测得的SPR角度变化的图。参考图7，将表示用于测定的SPR设备中图像传感器(成像装置)中像素位置的像素值用作纵轴上“SPR角度”的替代。

图7中，(a)表示由传感器504的第一光电二极管元件得到的检测结果。图7中，(a)表示在测定区域431的进口405侧上的起始端处得到的检测结果。

图7中，(b)表示由传感器504的第240个光电二极管元件得到的检测结果。图7中，(b)表示在测定区域431的中部得到的检测结果。

图7中，(c)表示由传感器504的第480个光电二极管元件得到的检测结果。图7中，(c)表示在测定区域431的出口406侧上的结束端处得到的检测结果。

如图7所示，显然，低折射率区域出现在接触区域中，在所述接触区域中，在每个测定点在凝固活化剂的折射率和样品(血浆)的折射率之间发生转变。

在这种情况下，如图8所示，相对于折射率已经下降的接触区域设置宽度和深度的参数。深度是当从第一折射率值(其是凝固活化剂的测得折射率)看时，接触区域中测得的最小的第二折射率，并由“第一折射率值-第二折射率值”给出。出于这一原因，第一折射率值和第二折射率值的差越大，深度值越大。

图9是显示对应测定区域中的位置(像素)的深度(a)和宽度(b)参数变化的图，所述位置(像素)对应构成传感器504的多个光电二极管元件的位置。

如由图9中(a)所示的，深度的值从接触区域的初始点到出口侧(下游)增加，并在接触区域的中间点变为最大。由图9中(b)所示的“宽度”沿着接触区域的移动(流动)单调地增加。与此相反，由图9中(a)所示的“深度”在接触区域的移动期间在给定位置(下游)之后、在达到预定值后趋向饱和。即，认为在接触区域中发生的凝固反应的过程反映在这一趋势中。出于这一原因，深度(第一折射率值-第二折射率值)代表依赖凝固活性的数值，并因此可以是一个指标。

图10是显示在使用标准样品(活性度：86％)和75％PT凝固活化剂的实验中通过重复测定得到的结果作为折射率差值(第一折射率值-第二折射率值)的图。微流路仅通过使碱性清洗液在各测定之间流过一次而清洗。如图10所示，作为10次连续测定的结果，可以将测定值(波谷深度)的变化抑制低至CV＝2.4％。

用稀释剂稀释标准样品(活性度：86％)以制备具有不同活性度(64％、43％和22％)的样品，并从由以上实施方案中测定得到的结果(折射率差)产生校准曲线。图11是显示产生的校准曲线的图。注意：图11的纵轴上的“折射率差”对应参考图8描述的“深度”。参考图11，将用于测定的SPR设备中图像传感器(成像装置)中的像素值差作为纵轴上“折射率差”的替代。

在这种情况下，由于接触区域中折射率下降的部分受到作为样品成分的血纤蛋白之外的组成的折射率的很大影响，如果将低折射率溶液例如水用作稀释剂，则稀释部分加算到深度。出于这一原因，在用于得到以上校准曲线的测定中，使用具有与标准样品相同折射率的葡萄糖溶液作为稀释剂。此外，使用75％PT凝固活化剂作为凝固活化剂。

作为产生校准曲线的结果，可以确认：随着样品活性度增加，第一和第二折射率值之间的差值增加。这可能是因为第一和第二折射率值之间的差值极大地依赖血纤蛋白的消耗，并且其中产生大量血纤蛋白的高活性样品的折射率变得比整个低折射率区域的折射率更低。

如以上描述的，根据本发明，在使凝固活化剂、接触区域和样品以所述顺序通过微流路的过程中，以按时间顺序的方式测定凝固活化剂和接触区域的折射率，并通过比较作为凝固活化剂的测得折射率的第一折射率值与作为接触区域的测得折射率中最小折射率的第二折射率值，测定样品的血液凝固能力。这使得通过使用微流路的血液凝固检测来更精确检测血液凝固能力成为可能。

根据本发明，由于测定相对于流速的影响是鲁棒的(robust)，因此可以反复使用通常被设计成在拆除后进行强力清洗或是一次性的测定池(cell)或微流路。这使得实现成本降低成为可能。此外，本发明被配置为仅测定经过流路的凝固活化剂和接触区域的折射率，并因此测定所需的时间非常短。这使得更快速进行测定成为可能。

注意：很明显本发明并不限于上述实施方案，并且具有本领域普通知识的人可以在本发明的技术思想之内进行许多修改和组合。例如，可以通过使用产生血纤蛋白的凝固活化剂，以相同的方式进行其他凝固测定法，以及PT检测。例如，可以通过使用由样品与APTT凝固活化剂混合得到的样品和作为凝固活化剂的氯化钙应对APTT(活化部分促凝血酶原激酶时间)检测。此外，可以通过使用样品而没有任何改变并使用凝血酶凝固活化剂作为凝固活化剂应对凝固活化剂血纤蛋白原(Fib)浓度检测。

此外，要进行的按时间顺序的折射率(折射率变化)测定不限于表面等离子体共振测定，也可以使用全反射测定。当例如保持微流路中的测定区域透明而不形成任何Au层时，可以测定在流路下表面上的透明部发生全反射时的入射角(临界角)，作为用于折射率的指标值。

附图标记说明

201...基板、202...Au层、203...流路基板、204...微流路，211...凝固活化剂、212...样品、213...接触区域、221...粒子。

Claims

1.一种血液凝固检测方法，其包括：

第一步骤，将含有血浆的样品和凝固活化剂以所述凝固活化剂定位在前、在流路的延伸方向上依次排列的部分彼此接触地流动的状态引入所述流路中；

第二步骤，在所述凝固活化剂、所述凝固活化剂和所述样品之间的接触区域和所述样品以这样的顺序通过沿所述流路在中途设置的测定部的过程中，以按时间顺序的方式测定所述凝固活化剂和所述接触区域的折射率；和

第三步骤，通过比较第一折射率值与第二折射率值测定所述样品的血液凝固能力，所述第一折射率值是所述凝固活化剂的测得折射率，所述第二折射率值是所述接触区域的测得最小折射率。

2.根据权利要求1所述的血液凝固检测方法，其中将在测定部由表面等离子体共振测定测得的表面等离子体共振角用作折射率值。