CN105219675A - 一种厌氧细菌的分离培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种厌氧细菌在一般实验室条件下的分离和培养方法，先配制透明的密封培养胶及选择性培养胶，再在无菌条件下，将密封培养胶倒入培养皿皿盖内，待冷却凝固后，将待接种的厌氧细菌接种、均匀涂布在密封培养胶的表面并静置，然后加入选择性培养胶直至完全覆盖密封培养胶表面，并在中央微凸起，速将灭菌后的培养皿皿底底部朝下，缓慢放入并轻压，排去气泡；最后，在培养皿皿底和培养皿皿盖之间的缝隙周缘用密封培养胶进行密封，装入事先用75％酒精和紫外灯灭过菌的自封袋中培养。本发明提供的方法不仅非常简单方便，氧气隔离效果非常好，完全满足厌氧细菌在培养过程中所需的条件，且密封培养胶透明，有利于在培养过程中观察菌落的生长情况。
Description
技术领域
本发明提供了一种厌氧菌的简易培养方法，采用培养皿双反夹心法培养厌氧细菌，此法可应用于大多数厌氧细菌的分离、诊断及计数等研究过程。
背景技术
细菌在自然界中呈混杂状态存在，要获得所需菌株，必需从中把它们分离出来。细菌分离和纯化的方法很多，但基本原理类似，即将待分离的样品按一定的比例稀释或浓缩，接种于选择性培养胶，分离培养过程中尽量使细菌的菌落以一定量、分散状态繁殖，并使其长成一个个纯种单菌落。
细菌的分离培养一般分为需氧菌的培养、嫌氧菌的培养、一般厌氧菌的培养、严格厌氧菌的培养。医学及环境监测中对厌氧菌的鉴定、分离培养及计数是常遇到的检验过程，操作要求高，所需设备及耗材多，分离鉴定成本高。由于部分厌氧菌暴露于空气中极易死亡的特殊性，病料及检测体在运送过程中的特殊要求、地域及一般实验室条件所限等因素，不利于厌氧菌的分离鉴定及科学研究工作。
目前，国内外用于纯化厌氧菌培养的方法较多，但都在培养过程中需辅助设备及大量的试验耗材。一般情况下分为两类，第一类为在厌氧菌培养过程中，需密闭容器，且在容器中添加特殊药剂(吸氧剂)；第二种方法需要大型的装置或设备，在培养过程中不断通入CO2以隔绝外界环境中的氧气(如CO2培养箱)，以上方法培养厌氧菌需一定的实验室条件，且培养过程中资源耗费较大。所有这些都是依据厌氧细菌均需要一定的厌氧环境培养这一特点，设法创造一个适合其生长繁殖的条件而进行的。
现有技术中的细菌培养方法在培养细菌过程中的不足之处在于，其一，现有市场上用于细菌培养的培养皿皿底和皿盖周缘密封都不严，在培养皿双反夹心法培养厌氧菌前期，需用琼脂胶进行灌注密封，以防氧气的渗透进入；其二，在培养后期菌落的选取方面操作不便，特别是致病菌的选取方面，需分离密封胶与选择性培养胶才能选取特定菌落，给操作者带来不便。
发明内容
本发明提供一种利用现有的培养皿通过双反夹心法进行厌氧细菌的分离培养方法，以解决一般实验室没有分离培养厌氧菌的条件，厌氧菌在送检过程中或已死亡，或部分死亡导致在厌氧细菌的分离培养、计数结果中存在较大误差的技术问题。
为此，本发明提供了一种厌氧细菌的分离培养方法，包括以下步骤，
S1：培养胶的配制
培养胶的配制包括密封培养胶的配制和选择性培养胶的配制两部分，其中密封培养胶由16g～20g琼脂和1L浓度为0.9％的生理盐水配制而成；选择性培养胶根据待接种的厌氧细菌的特性选择不同的培养胶进行配制。现有二氧化碳培养箱中能培养的厌氧细菌均可作为待接种的厌氧细菌；
S2：厌氧菌的接种及接种面的密封
首先，对培养皿进行灭菌，在无菌条件下，先用所述密封培养胶倒入灭菌后的培养皿皿盖内底部，待冷却凝固后，将待接种的厌氧细菌接种在密封培养胶表面并涂布均匀，静置5min～10min，以水分渗入密封培养胶内为止；其次，将选择性培养胶灭菌并冷却到45℃后，倒入培养皿皿盖已涂布好菌种的密封培养胶表面，所述选择性培养胶倒入的厚度完全覆盖所述密封培养胶，并在中央微凸起，速将灭菌后的培养皿皿底底部朝下，缓慢放入并轻压，排去气泡；最后，在培养皿皿底和培养皿皿盖之间的缝隙周缘中，缓慢倒入45℃的密封培养胶进行密封；
S3：厌氧菌的培养及菌落的选取
将S2所制得产物装入事先依次用酒精和紫外灯灭过菌的自封袋中进行培养，以防止培养胶水分散失和空气中杂菌在密封胶周缘的生长，培养时间为12h～72h，对菌落分类计数；选取菌落时，将培养后的产物倒入较大一点的培养皿中，用摄子轻挑密封培养胶层，即可选取厌氧细菌的菌落。
优选地，S1中，所述密封培养胶由18g琼脂和1L浓度为0.9％的生理盐水配制而成。
优选地，待接种的厌氧细菌为肠道厌氧菌。
更优选地，待接种的厌氧细菌为瘤胃梭菌、嫌氧性细菌、甲烷菌、硫酸盐还原菌、瘤胃细菌或纤维素分解细菌。
优选地，S2中，对培养皿进行灭菌时，将培养皿皿底朝下，与培养皿皿盖内部相接触，包好后在121～126℃条件下灭菌0.5h。
优选地，S3中，对所述自封袋内部先用75％的酒精擦试灭菌，再用紫外灯照射1h进一步灭菌。
更优选地，S3中，将S2所制得产物在所述自封袋中培养24h～48h，以防培养基水分的散失和空气中杂菌在培养皿周缘的生长，也可根据菌落生长情况缩短或延长培养时间。
本发明提供的培养皿双反夹心法在进行大量厌氧细菌培养过程中，总结经验，利用现有的培养皿，创新了一种能在普通实验室环境下进行厌氧细菌培养的新方法，虽然使用该方法培养厌氧菌与一般需氧菌的培养过程较相似，但本方法不仅非常简单方便，而且氧气隔离效果非常好，完全满足厌氧细菌培养过程中所需的条件。
具体实施方式
为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案能予以实施，下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
1.实验装置：
本发明的方法在分离培养厌氧细菌过程中，所用到的装置与一般需氧菌培养方法所需装置相同，培养容器选用普通的培养皿即可，包好灭菌备用，具体操作过程将培养皿皿底朝下，与培养皿皿盖内部相接触，包好后在121～126℃条件下灭菌0.5h。
2.实验试剂的制备：
由16g～20g的琼脂加入到1L浓度为0.9％的生理盐水中配制而成，配制成晶莹透亮的密封培养胶，便于厌氧细菌在培养过程中的观察。对于待接种的厌氧细菌，根据不同的厌氧细菌种类，采用各自常规方法和要求配制选择性培养胶。
3.厌氧菌的接种、胶封、培养及菌落的选取：
首先，在无菌条件下，先用所述密封培养胶倒入灭菌后的培养皿皿盖内部，待冷却凝固后，按一定量接种，将待接种厌氧细菌接种于培养皿皿盖内部已经灌注有密封培养胶的表面，涂布均匀，静置5min～10min，静置时间太短不利于水分的吸收，太长可能部分厌氧细菌会死亡，因此以5min～10min为最佳；
其次，将选择性培养胶灭菌，冷却到45℃后，倒入已涂布细菌的密封胶表面，所述选择性培养胶倒入的厚度完全覆盖所述密封培养胶，并在中央微凸起，速将灭菌后的培养皿底部朝下，从一侧缓慢放入并轻压，排去培养胶中的气泡；
因培养皿皿底直径较小，与培养皿皿盖间有空隙，最后，在培养皿皿底和培养皿皿盖之间的缝隙周缘中，缓慢倒入45℃的密封培养胶进行密封；
由于上述方法接种密封后，培养皿的缝隙周缘密封胶暴露在外面，在培养过程中，将接种密封后的产物装入事先用75％酒精和紫外灯灭过菌的自封袋中进行培养，以防水分散失和空气中的杂菌生长，培养时间为12h～72h，具体可根据菌落生长情况缩短或延长培养时间，培养后的厌氧菌菌落生长良好；
因密封培养胶和厌氧细菌选择性培养胶为两种不同培养胶，且为不同凝固时间倒入，在选取菌落时，将培养后的产物倒入较大一点的培养皿中，用摄子轻挑密封层培养胶，即可分层选取厌氧细菌菌落。
需要注意的是，上述操作均在无菌条件下进行操作。
实施例1
由0.9％的生理盐水1L加18g的琼脂而成，配制成晶莹透亮的密封培养胶。
筛选瘤胃梭菌用选择型培养胶，主要用于如溶纤维丁酸弧菌的分离和培养，由下列原料制成：肉膏10g、酵母膏1.5g、蛋白胨10g、水溶性淀粉1g、葡萄糖1g、醋酸钠5g、L-半胱氨酸0.5g、蒸馏水1L，将上述原料充分混合物混合后，调节混合物pH值在7.1～7.2之间，然后进行灭菌，上述培养胶灭菌后，每50ml，加入0.5ml浓度为5％的Na2S和0.5ml浓度为7％的柠檬酸铁(加入前两种试剂均经0.25μm孔径的超滤膜过滤杂菌)。上述筛选瘤胃梭菌用选择性培养胶与瘤胃液灭菌体积比1∶1混合后根据所需量，按100ml培养液加入1.8g普通琼脂制成。
在无菌条件下，先用上述制得的密封培养胶倒入灭菌后的培养皿皿盖内部，待冷却凝固后，按一定量接种筛选瘤胃梭菌，接种方法为0.1ml瘤胃液用10ml的生理盐水稀释，再取0.1ml、0.2ml、0.3ml三种量的稀释液分别接种于已经灌注有密封培养胶的表面，涂布均匀，静置5min；然后将筛选瘤胃梭菌用选择型培养胶冷却到45℃后，倒入培养皿皿盖中，所述筛选瘤胃梭菌用选择型培养胶倒入的厚度完全覆盖所述密封培养胶，并在中央微凸起，速将灭菌后的培养皿皿底朝下，从一侧缓慢放入并轻压，排去选择性培养胶表面的气泡；并在培养皿皿底和培养皿皿盖之间的缝隙周缘中，缓慢倒入45℃的上述密封培养胶进行密封，可用滴管逐滴加入；最后将接种密封后的产物装入事先依次用75％酒精和紫外灯灭过菌的自封袋中进行培养，培养时间为24h。
试验材料选取的是西藏黄牛瘤胃液，瘤胃液是通过瘤胃瘘管手术获取，菌种的鉴定通过Northernblot杂交实现，引物设计如下：溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibrio.fibrisolvens)，5’-CAGCAGGGAAGATAATGAC-3’，菌落计数为0.8～2.11×102。通过选择性培养基培养，观察菌落形态，细菌生长良好。
实施例2
由0.9％的生理盐水1L加18g的琼脂而成，配制成晶莹透亮的密封培养胶。
分离嫌氧性细菌用培养胶，主要用于如溶纤维丁酸弧菌和拟杆菌的分离和培养，由下列原料制成：胰蛋白胨1g、酵母膏0.5g、牛肉膏0.2g、琼脂1.5g、7.5ml盐溶液I、7.5ml盐溶液II、0.1ml浓度为0.1％的刃天青溶液、蒸馏水78ml。将上述原料依次溶解后，再加入葡萄糖2g、0.07％氯高铁血红素1ml，最后调节混合物pH值为7。灭菌后，再加入8％Na2CO3溶液5ml、3％盐酸半胱氨酸1ml。
其中，上述盐溶液I是浓度为0.6％的K2HPO4溶液；上述盐溶液II是由0.6％KH2PO4，1.2％(NH4)2SO4，1.2％NaCl，0.12％MgSO4·7H2O，0.12％CaCl2组成的混合溶液。
在无菌条件下，先用上述制得的密封培养胶倒入灭菌后的培养皿皿盖内部，待冷却凝固后，按一定量接种分离嫌氧性细菌，将待接种的分离嫌氧性细菌瘤胃液接种在已经灌注有密封培养胶的表面，涂布均匀，静置10min；然后将筛选细菌用选择型培养胶灭菌冷却到45℃后，倒入培养皿皿盖中，所述筛选细菌用选择型培养胶倒入的厚度完全能够覆盖所述密封培养胶，并多加一些，保证中央微凸起，速将灭菌后的培养皿底部朝下，从一侧缓慢放入并轻压，排去选择型培养胶表面的气泡；并在培养皿皿底和培养皿皿盖之间的缝隙周缘中，缓慢倒入45℃的上述密封培养胶进行密封；最后将接种密封后的产物装入事先依次用75％酒精和紫外灯灭过菌的自封袋中进行培养，培养时间为48h，培养后的厌氧菌菌落生长良好。
实施例3
由0.9％的生理盐水1L加18g的琼脂而成，配制成晶莹透亮的密封培养胶。
分离瘤胃细菌培养胶，主要用于初步分离瘤胃内常见厌氧菌，如白色瘤胃球菌数、黄化球菌数、产琥珀酸丝状杆菌、甲烷甲酸杆菌等，由下列原料制成：瘤胃液40ml、琼脂1.5g、葡萄糖0.025g、纤维二糖0.025g、可溶性淀粉0.025g、麦芽糖0.025g、7.5ml盐溶液I、7.5ml盐溶液II、0.1ml浓度为0.1％的刃天青溶液、蒸馏水38ml。将上述原料依次溶解后，进行灭菌，灭菌后再加入8％Na2CO3溶液5ml，盐酸半胱氨酸0.025g、Na2S0.025g。
其中盐溶液I和盐溶液II和实施例1中的相同。
试验材料选取的是西藏黄牛瘤胃液，瘤胃液是通过瘤胃瘘管手术获取，后续分离培养步骤和实施例2相同。
表1西藏黄牛瘤胃液菌种的引物设计
表2西藏黄牛瘤胃液细菌菌落计数结果
本实施例中菌株的鉴定通过Northernblot杂交实现，西藏黄牛瘤胃液菌种的引物设计如上表1所示，经实施例3的方法培养后的瘤胃的厌氧菌菌落生长良好，具体瘤胃液细菌菌落计数结果如表2所示。
实施例4
由0.9％的生理盐水1L加18g的琼脂而成，配制成晶莹透亮的密封培养胶。
纤维素分解细菌选择性培养胶，主要用于瘤胃内常见纤维素分解菌的初步分离，如白色瘤胃球菌数、黄化球菌数、产琥珀酸丝状杆菌、溶纤维丁酸弧菌等，由下列原料制成：纤维素粉5g、NaNO31g、Na2HPO4·7H2O1.18g、KH2PO40.9g、MgSO4·7H2O0.5g、KCl0.5g、酵母膏0.5g、水解酪素(酶解酪素)0.5g、蒸馏灭菌水1L、将上述原料充分混合物混合后，调节混合物pH值为6.8。
其中，上述纤维素粉制备培养胶之前需要进行预处理，具体的预处理方法为用1mol/L的HCl冷处理12h，以蒸馏灭菌水洗净后即可。
西藏黄牛纤维素分解菌的瘤胃液获取、后续分离培养步骤和实施例2的内容相同，培养后的厌氧菌菌落生长良好。
同时，对西藏绵羊的纤维素分解菌进行同样的培养，不同处是瘤胃液是通过胃管获取，菌种的鉴定与西藏黄牛相同，发现西藏绵羊的纤维素分解菌总数与年龄、饲喂间隔时间、饮水状况及饲草料等相关，变化范围在1.4×105CFU/ml～3.3×108CFU/ml之间。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，其保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内，本发明的保护范围以权利要求书为准。
Claims (8)
1.一种厌氧细菌的分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤，
S1：培养胶的配制
培养胶的配制包括密封培养胶的配制和选择性培养胶的配制两部分，其中密封培养胶由16g～20g琼脂和1L浓度为0.9％的生理盐水配制而成，选择性培养胶根据待接种的厌氧细菌的特性选择不同的培养胶进行配制；
S2：厌氧菌的接种及接种面的密封
首先，对培养皿进行灭菌，在无菌条件下，先用所述密封培养胶倒入灭菌后的培养皿皿盖内底部，待冷却凝固后，将待接种的厌氧细菌接种在密封培养胶表面并涂布均匀，静置5min～10min；
其次，将选择性培养胶灭菌并冷却到45℃后，倒入培养皿皿盖已涂布好菌种的密封培养胶表面，所述选择性培养胶倒入的厚度完全覆盖所述密封培养胶，并在中央微凸起，速将灭菌后的培养皿皿底底部朝下，缓慢放入并轻压，排去气泡；
最后，在培养皿皿底和培养皿皿盖之间的缝隙周缘中，缓慢倒入45℃的密封培养胶进行密封；
S3：厌氧菌的培养及菌落选取
将S2所制得产物装入事前依次用75％的酒精和紫外灯灭过菌的自封袋中进行培养，培养时间为12h～72h，培养结束后根据菌落形态和颜色进行分类计数；
选取菌落进行菌株鉴定时，将培养后的产物倒入较大一点的培养皿中，用摄子轻挑密封培养胶层，即可选取不同形态的厌氧细菌的菌落。
2.根据权利要求1所述的厌氧细菌的分离培养方法，其特征在于，S1中，所述密封培养胶由18g琼脂和1L浓度为0.9％的生理盐水配制而成。
3.根据权利要求1所述的厌氧细菌的分离培养方法，其特征在于，现有二氧化碳培养箱中能培养的厌氧细菌均可作为S1中待接种的厌氧细菌进行扩大培养。
4.根据权利要求1所述的厌氧细菌的分离培养方法，其特征在于，S2中，待接种的厌氧细菌为肠道厌氧菌。
5.根据权利要求4所述的厌氧细菌的分离培养方法，其特征在于，S2中，待接种的厌氧细菌为瘤胃羧菌、嫌氧性细菌、甲烷菌、硫酸盐还原菌、瘤胃菌或纤维素分解菌。
6.根据权利要求1所述的厌氧细菌的分离培养方法，其特征在于，S2中，对培养皿进行灭菌时，将培养皿皿底朝下，与培养皿皿盖内部相接触，包好后在121～126℃条件下灭菌0.5h。
7.根据权利要求1所述的厌氧细菌的分离培养方法，其特征在于，S3中，对所述自封袋内部先用75％的酒精擦试灭菌，再用紫外灯照射1h进一步灭菌待用。
8.根据权利要求7所述的厌氧细菌的分离培养方法，其特征在于，S3中，将S2所制得产物在所述自封袋中培养24h～48h。
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