CN105181960A - 一种荧光免疫层析检测试纸及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种荧光免疫层析检测试纸及制备方法。包括样品垫(1)，抗体承载膜(2)，吸水纸(3)，依次通过带有粘合剂的底板(4)互相搭接而成，所述抗体承载膜(2)上从靠近样品垫(1)一端分别依次包被标记物的混合物结合线(5)、检测线(6)和质控线(7)，所述标记物的混合物结合线(5)是将荧光微球分别与抗体1和生物素偶联标记物的混合物用划膜喷金仪包被在抗体承载膜预处理过的预处理区域(8)内。克服了因结合物在玻纤上滞留过多，释放量不足导致的结果不准确的问题，使检测的荧光值提高，提高了灵敏度或检测上限。同时在生产上，将荧光微球分别与抗体1和生物素偶联标记物的混合物包被在抗体承载膜上，可同时将标记物的混合物结合线、T线、C线包被上，省时省工艺，提高生产效率。

Description

一种荧光免疫层析检测试纸及制备方法

技术领域

本发明涉及检测试纸领域，尤其涉及一种荧光免疫层析检测试纸及制备方法。

背景技术

临床上所用的试纸大部分是由4部分构成，即依次由样品垫、结合垫、抗体承载膜、吸水纸依次通过有粘合剂的底板依次互相搭接而成，或者样品垫直接用玻璃纤维膜，省去结合垫。其中，在结合垫靠近抗体承载膜一侧涂或喷上带有荧光微球分别与抗体1和生物素偶联标记物的混合物。在抗体承载膜上包被检测项目的抗体(或抗原)的T线和质控C线，检测原理即向样品垫加入样品，样品中的待检物层析到结合线，待检物与结合线上的荧光微球与抗体1偶联标记物的混合物特异性反应后形成复合物，层析至T线，形成双抗夹心或竞争，结合线上的生物素标记物层析至C线与亲和素形成特异性反应，利用荧光定量检测系统检测T线和C线区域的富集的荧光强度，反映样本中待测物的含量。

这种方法有3个缺点：1，由于玻璃纤维膜材质因素，只能把荧光微球分别与抗体1和生物素偶联标记物的混合物喷上去，或者浸泡，如果是喷上去，会有不均匀的缺点，影响精密度，不适用于定量检测；如果是浸泡，不仅不均匀且会浪费大量的微球和抗体，增加成本；2，喷在玻璃纤维膜上的标记物混合物部分会勾到玻璃纤维素膜的立体空间，导致每次层析均一性较差，每次均有不同程度的标记物混合物滞留在玻璃纤维膜上，使得精密度和准确度变大。3，喷膜工艺的均一性比不上包被工艺，导致抗体-荧光结合物的均一性差。

发明内容

本发明的目的在于提供一种提高荧光值、精密度，节省材料并简化工艺的荧光免疫层析检测试纸。

为实现上述目的，本发明提供一种荧光免疫层析检测试纸，包括样品垫(1)，抗体承载膜(2)，吸水纸(3)，依次通过带有粘合剂的底板(4)互相搭接而成，所述抗体承载膜(2)上从靠近样品垫(1)一端分别依次包被标记物的混合物结合线(5)、检测线(6)和质控线(7)，其特征在于，所述标记物的混合物结合线(5)是将荧光微球分别与抗体1和生物素偶联标记物的混合物用划膜喷金仪包被在抗体承载膜预处理过的预处理区域(8)内。

进一步，所述抗体承载膜预处理为在靠近样品垫(1)的一端用划膜喷金仪包被上宽度1.8-2.2mm的预处理液；优选的，为在靠近样品垫(1)一端且距边缘4mm的抗体承载膜(2)膜上用划膜喷金仪包被；所述预处理液为PH7.4的0.01MPBS加入20质量体积％蔗糖，2质量体积％BSA和0.02质量体积％NaN₃；

进一步，所述标记物的混合物结合线(5)位于抗体承载膜预处理过的预处理区域(8)的居中位置。

进一步，所述检测线(6)包被被检测项目的抗体2或抗原。

进一步，所述预处理区域(8)的宽度大于标记物的混合物结合线(5)宽度；优选地，预处理区域(8)的宽度是标记物的混合物结合线(5)宽度的2倍。

进一步，所述荧光微球是采用稀土元素铕或荧光素包裹在二氧化硅颗粒或者乳胶颗粒上；优选地，所述荧光微球为采用稀土元素铕或荧光素包裹在二氧化硅颗粒。

进一步，所述标记物的混合物结合线(5)位于靠近样本垫(1)一端且距边缘4mm的抗体承载膜(2)膜上，标记物的混合物结合线(5)与检测线(6)相隔10mm，标记物的混合物结合线(5)距离质控线(7)15mm。

另一方面，本发明还提供一种所述荧光免疫层析检测试纸的制备方法，其特征在于，步骤为，

预处理液制备：取PH为7.4的0.01MPBS溶液加入20质量体积％蔗糖，加入2质量体积比％BSA和0.02质量体积％NaN₃，充分混匀后；

标记物的混合物的制备：选用荧光微球的氨基和葡聚糖的醛基偶联后，按质量比1:1加入抗体1混合，葡聚糖上其他醛基可与抗体1上的氨基偶联，形成荧光微球与抗体1偶联标记物的混合物；优选的，选用荧光微球和抗体1按质量比1:1混合，形成荧光微球与抗体1偶联标记物的混合物；以同样方法，用荧光微球的氨基和葡聚糖的醛基偶联后，按质量比1:1加入生物素混合，葡聚糖上其他醛基可与生物素上的氨基偶联，形成荧光微球和生物素偶联的标记物；将所述两种标记物按体积比1:1混合，并用含1质量比％BSA的pH7.4，0.01MPBS500倍稀释混合物；

T线包被液的配制：用pH7.4，0.01MPBS稀释液将鼠抗检测项目的单克隆抗体稀释至工作浓度；

C线包被液的配制：用pH7.4，0.01MPBS稀释液将亲和素稀释至工作浓度；

抗体承载膜(2)的预处理：选用硝酸纤维膜作为抗体承载膜，在靠近将要贴玻璃纤维膜的一端用划膜喷金仪包被上宽度约2mm的上述制备好的预处理液，该宽度约2mm的区域称为预处理区域；45℃2h烘干；

包被线：将上述预处理后的硝酸纤维膜通过划膜喷金仪将荧光微球分别与抗体1和生物素偶联标记物的混合物荧光、T线包被液、C线包被液同时包被上去，形成标记物的混合物结合线、T线、C线，所述3条线，线宽均为1mm；标记物的混合物结合线(5)与检测线(6)距离约10mm，标记物的混合物结合线(5)与质控线(7)距离约15mm；之后将该包被后的NC膜于45℃2h烘干；所述标记物的混合物结合线(5)位于预处理区域的居中位置；

组装成检测卡：将玻璃纤维膜和烘干包被后的硝酸纤维膜、吸水纸依次粘贴组装，组装完成后用切条机切成每条宽度为4mm的试条，装进试条卡，压卡，制备成检测卡即可。

还一方面，本发明还提供一种所述荧光免疫层析检测试纸用于抗原或抗体的检测的用途。

进一步，加样品于权利要求1所述荧光免疫层析检测试纸的样品垫上，样品中的待检物层析到结合线，待检物与所述荧光免疫层析检测试纸的结合线上的抗体1标记物特异性反应后形成复合物，层析至T线，形成双抗夹心或竞争，结合线上的生物素标记物层析至C线与亲和素形成特异性反应，利用荧光定量检测系统检测T线和C线区域的富集的荧光强度，将T/C荧光强度值处理后带入标准曲线即得出样品中待测物的含量；

优选的，所述标准曲线得到的方法为，用pH7.4，0.01MPBS稀释国家或国际标准品到所需的线性浓度，用荧光免疫层析检测试纸测试各浓度相应的荧光强度值，标准品浓度和荧光强度值比值拟合得到相关趋势线。

本发明的荧光免疫层析检测试纸用于抗原、抗体的检测，包括人体、动植物、中的抗原抗体检测，食品、食品添加剂中抗原抗体检测等。

所述样品垫(1)可以是玻璃纤维素膜；带有粘合剂的底板(4)可以是带粘合剂的衬板(PVC板)。所述标记物的混合物结合线(5)所在的预处理区域(8)离T线(6)位置保持有一定距离，保证预处理液不影响T线。

本发明所述检测线(6)又称为T线(6)。

所述标记物的混合物结合线(5)，所在的膜部位置上在包被前经过预处理，T线(6)为检测线包被检测项目的抗体2(或抗原)，C线为质控线(7)包被亲和素，通过待检物与结合线上的荧光微球与抗体1偶联标记物的混合物特异性反应后形成复合物，层析至T线(6)，形成双抗夹心或竞争，结合线上的生物素标记物层析至C线与亲和素形成特异性反应，利用荧光定量检测系统检测T线和C线区域的富集的荧光强度，反映样本中待测物的含量。

本发明所述荧光免疫层析检测试纸具有增强荧光颗粒微球与包被抗体的结合的效率，提高荧光值，提高精密度，节省材料，简化工艺并弥补了常规试条在检测中的缺陷的优点。

本发明将原本荧光微球分别与抗体1和生物素偶联标记物的混合物喷在玻璃纤维膜上的方式改为将荧光微球分别与抗体1和生物素偶联标记物的混合物用划膜喷金仪包被在承载膜预处理过的位置上。

本发明的荧光免疫层析检测试纸避免了生产上的以下缺点：

1，包被上去的荧光微球分别与抗体1和生物素偶联标记物的混合物比较均匀，包被工艺简便，损耗量少。

2，在包被荧光微球分别与抗体1和生物素偶联标记物的混合物前，先包被宽度为该结合物划的宽度的2倍的预处理液，该预处理液能起到封闭抗体承载膜的微孔，平滑膜面，形成保护膜。待烘干后，再在预处理的区域划上荧光微球分别与抗体1和生物素偶联标记物的混合物，避免了结合物勾在承载膜里造成损失结合物，使得在层析过程直接从预处理膜面全部释放。损失量降低到最低，因此本发明克服了因结合物在玻纤上滞留过多，释放量不足导致的结果不准确的问题，使检测的荧光值拉高，提高灵敏度或检测上限。

3，在生产上，将荧光微球分别与抗体1和生物素偶联标记物的混合物包被在抗体承载膜上，可同时将标记物的混合物结合线、T线、C线包被上，省时省工艺。提高生产效率。

附图说明

图1是本发明荧光免疫层析检测试纸的水平剖面图。

图2是本发明荧光免疫层析检测试纸的俯视平面图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

以下实施例结合图1和图2的结构。

实施例1：荧光免疫层析检测试纸的制备

一种荧光免疫层析检测试纸，由样品垫(1)、抗体承载膜(2)、吸水纸(3)依次通过带有粘合剂的底板(4)依次互相搭接而成，其中所述样品垫(1)是玻璃纤维素膜；带有粘合剂的底板(4)是带粘合剂的衬板(PVC板)。

制备方法如下步骤：

预处理液制备：配制PH为7.4的0.01MPBS溶液，备用。取部分配好的PBS加入20质量体积％蔗糖，加入2质量体积比％BSA和0.02质量体积％NaN₃，充分混匀后，2-8℃备用。

标记物的混合物的制备：选用荧光微球的氨基和葡聚糖的醛基偶联后，按质量比1:1加入抗体1混合，葡聚糖上其他醛基可与抗体1上的氨基偶联，形成荧光微球与抗体1偶联标记物的混合物；优选的，选用荧光微球和抗体1按质量比1:1混合，形成荧光微球与抗体1偶联标记物的混合物；以同样方法，用荧光微球的氨基和葡聚糖的醛基偶联后，按质量比1:1加入生物素混合，葡聚糖上其他醛基可与生物素上的氨基偶联，形成荧光微球和生物素偶联的标记物；将两者标记物体积比1:1混合，并用含1质量比％BSA的pH7.4，0.01MPBS500倍稀释混合物。T线包被液的配制：用pH7.4，0.01MPBS稀释液将鼠抗检测项目的单克隆抗体稀释至工作浓度(0.5-5mg/ml据实际实验调整)，2-8℃备用。

C线包被液的配制：用pH7.4，0.01MPBS稀释液将亲和素稀释至工作浓度(0.5-5mg/ml据实际实验调整)，2-8℃备用。

抗体承载膜(2)的预处理：选用市售的硝酸纤维膜即NC膜作为抗体承载膜，在靠近将要贴玻璃纤维膜的一端用划膜喷金仪包被上宽度约2mm的上述制备好的预处理液，该宽度约2mm的区域称为预处理区域。45℃2h烘干。

包被线：将上述预处理后的NC膜通过划膜喷金仪将荧光微球分别与抗体1和生物素偶联标记物的混合物、T线包被液、C线包被液同时包被上去，形成标记物的混合物结合线、T线、C线，所述3条线，线宽均为1mm。标记物的混合物结合线(5)与T线(检测线6)距离约10mm，标记物的混合物结合线(5)与C线(质控线7)距离约15mm。之后将该包被后的NC膜于45℃2h烘干。所述标记物的混合物结合线(5)位于预处理区域的居中位置；

组装成检测卡：按照图1所示将玻璃纤维膜和烘干的包被后的NC膜、吸水纸依次粘贴组装，组装完成后用切条机切成每条宽度为4mm的试条，装进试条卡，压卡，制备成检测卡。干燥环境下避光备用。

检测方法：取出检测卡，加样后，样品中的待检物层析到结合线，待检物与所述荧光免疫层析检测试纸的结合线上的抗体1标记物特异性反应后形成复合物，层析至T线，形成双抗夹心或竞争，结合线上的生物素标记物层析至C线与亲和素形成特异性反应，利用荧光定量检测系统检测T线和C线区域的富集的荧光强度。

拟合标准曲线：用国家或国际标准品用0.01MpH7.4的PBS稀释到所需的线性浓度，用荧光免疫层析检测试纸测试各浓度相应的荧光强度值，标准品浓度和荧光强度值比值拟合得到相关趋势线。

样本检测及结果：按上述检测方法检测，所得荧光强度值带入拟合曲线中，即可得到相应的样本浓度值。

对比试纸的制备

荧光微球分别与抗体1和生物素偶联标记物的混合物是喷在玻璃纤维膜上，其他均同实施例1，不再详细说明。

实施例2：效果验证

标准曲线拟合：取所购买的孕酮标准品用0.01MpH7.4PBS稀释成线性浓度，并用孕酮检测试纸测试对应的荧光强度。

表1对照组和本发明实验组定量检测标准曲线数据表

注：对照组为实施例对比试纸；本发明实验组为本发明实施例所得的荧光免疫层析检测试纸。

用浓度和T/C拟合出趋势线对照组y＝-0.13ln(x)+0.638，R²＝0.994≥0.9801相关性符合标准；本发明实验组y＝-0.15ln(x)+0.747，R²＝0.997≥0.9801相关性符合标准。

样本：孕酮浓度值分别为50ng/ml、25ng/ml、5ng/ml和0ng/ml的4份不同血清作为样本；

制备孕酮检测试剂盒，与实施例1荧光免疫层析检测试纸的制备方法一致，其T线包被物为孕酮抗原。

方法：每个浓度分别利用试剂盒测试10次，检测得出荧光值及测试浓度，并求出变异系数做对比。检测结果如表1-4所示。其中实验组为采用实施例1所得荧光免疫层析检测试纸。对照组为采用对比试纸的制备得到的对比试纸。

表20ng/ml时对照组与实验组的结果对比表

表35ng/ml时对照组与实验组的结果对比表

表425ng/ml时对照组与实验组的结果对比表

表550ng/ml时对照组与实验组的结果对比表

以上所述CV计算：测定10个结果的平均浓度(Mean，)、标准差(SD)，变异系数 $\left(CV\right)=(SD/\stackrel{\‾}{X})\×100\%.$

$\begin{array}{cc}SD-=\sqrt{\frac{\mathrm{\Σ}{(x-\stackrel{\‾}{x})}^2}{n-1}}& \stackrel{\‾}{X}=\frac{\mathrm{\Σ}X}{n}\end{array}$

$CV=\frac{\sqrt{\frac{\Σ{\left(x-\stackrel{\‾}{x}\right)}^2}{n-1}}}{\frac{\ΣX}{n}}\×100\%$

其中，X表示某一个结果的测定值，表示n个结果的平均测定值，n表示个数。

最低检测限计算：平行测定10相对荧光信号，计算相对荧光信号处理值(T/C：T为检测线荧光信号，C为质控线荧光信号)的平均值及标准差(SD)，将代入计量-反应曲线，计算出的浓度值即为最低检测限。

$\begin{array}{cc}SD-=\sqrt{\frac{\mathrm{\Σ}{(x-\stackrel{\‾}{x})}^2}{n-1}}& \stackrel{\‾}{X}=\frac{\mathrm{\Σ}X}{n}\end{array}$

从表2-5可以看出：1，荧光上分析，同一浓度样本的对照组结果和本发明的结果对比,用本发明所测的荧光值比对照试的荧光值均一且较高，说明本发明工艺使得结合线标记物的释放更彻底，低浓度可见，提高荧光值能提高灵敏度，使得检测结果更有临床价值。2，经过计算表明，本发明的检测结果的荧光值CV都小于对照组试纸检测的荧光值CV，可以看出本发明的试纸能明显降低CV，释放量稳定，对临床检测结果的准确性是一个保证。

综上所述，本实施例采用了不同样本范围浓度作为实验对象，实验结果是本发明组较对照组性能有较大的改善提升，说明浓度高低，都不影响本发明的优越性。

以上所涉及检测原理为竞争法，但不限定于所述方法。免疫层析夹心法也在本发明的范围之内。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种荧光免疫层析检测试纸，包括样品垫(1)，抗体承载膜(2)，吸水纸(3)，依次通过带有粘合剂的底板(4)互相搭接而成，所述抗体承载膜(2)上从靠近样品垫(1)一端分别依次包被标记物的混合物结合线(5)、检测线(6)和质控线(7)，其特征在于，所述标记物的混合物结合线(5)是将荧光微球分别与抗体1和生物素偶联标记物的混合物用划膜喷金仪包被在抗体承载膜预处理过的预处理区域(8)内。

2.权利要求1所述荧光免疫层析检测试纸，其特征在于，所述抗体承载膜预处理为在靠近样品垫(1)的一端用划膜喷金仪包被上宽度1.8-2.2mm的预处理液；优选的，为在靠近样品垫(1)一端且距边缘4mm的抗体承载膜(2)膜上用划膜喷金仪包被；所述预处理液为PH7.4的0.01MPBS加入20质量体积％蔗糖，2质量体积％BSA和0.02质量体积％NaN₃。

3.权利要求1所述荧光免疫层析检测试纸，其特征在于，所述标记物的混合物结合线(5)位于抗体承载膜预处理过的预处理区域(8)的居中位置。

4.权利要求1所述荧光免疫层析检测试纸，其特征在于，所述检测线(6)包被被检测项目的抗体2或抗原。

5.权利要求1所述荧光免疫层析检测试纸，其特征在于，所述标记物的混合物结合线预处理区域(8)的宽度大于标记物的混合物结合线(5)宽度；优选地，预处理区域(8)的宽度是标记物的混合物结合线(5)宽度的2倍。

6.权利要求1所述荧光免疫层析检测试纸，其特征在于，所述荧光微球是采用稀土元素铕或荧光素包裹在二氧化硅颗粒或者乳胶颗粒上；优选地，所述荧光微球为采用稀土元素铕或荧光素包裹在二氧化硅颗粒。

7.权利要求1所述荧光免疫层析检测试纸，其特征在于，所述标记物的混合物结合线(5)位于靠近样本垫(1)一端且距边缘4mm的抗体承载膜(2)膜上，标记物的混合物结合线(5)与检测线(6)相隔10mm，标记物的混合物结合线(5)距离质控线(7)15mm。

8.一种权利要求1所述荧光免疫层析检测试纸的制备方法，其特征在于，步骤为，

预处理液制备：取PH为7.4的0.01MPBS溶液加入20质量体积％蔗糖，加入2质量体积比％BSA和0.02质量体积％NaN₃，充分混匀后；

标记物的混合物的制备：选用荧光微球的氨基和葡聚糖的醛基偶联后，按质量比1:1加入抗体1混合，葡聚糖上其他醛基可与抗体1上的氨基偶联，形成荧光微球与抗体1偶联标记物的混合物；优选的，选用荧光微球和抗体1按质量比1:1混合，形成荧光微球与抗体1偶联标记物的混合物；以同样方法，用荧光微球的氨基和葡聚糖的醛基偶联后，按质量比1:1加入生物素混合，葡聚糖上其他醛基可与生物素上的氨基偶联，形成荧光微球和生物素偶联的标记物；将所述两种标记物按体积比1:1混合，并用含1质量比％BSA的pH7.4，0.01MPBS500倍稀释混合物；

T线包被液的配制：用pH7.4，0.01MPBS稀释液将鼠抗检测项目的单克隆抗体稀释至工作浓度；

C线包被液的配制：用pH7.4，0.01MPBS稀释液将亲和素稀释至工作浓度；

抗体承载膜(2)的预处理：选用硝酸纤维膜作为抗体承载膜，在靠近将要贴玻璃纤维膜的一端用划膜喷金仪包被上宽度约2mm的上述制备好的预处理液，该宽度约2mm的区域称为预处理区域；45℃2h烘干；

包被线：将上述预处理后的硝酸纤维膜通过划膜喷金仪将荧光微球分别与抗体1和生物素偶联标记物的混合物荧光、T线包被液、C线包被液同时包被上去，形成标记物的混合物结合线、T线、C线，所述3条线，线宽均为1mm；标记物的混合物结合线(5)与检测线(6)距离约10mm，标记物的混合物结合线(5)与质控线(7)距离约15mm；之后将该包被后的NC膜于45℃2h烘干；所述标记物的混合物结合线(5)位于预处理区域的居中位置；

组装成检测卡：将玻璃纤维膜和烘干包被后的硝酸纤维膜、吸水纸依次粘贴组装，组装完成后用切条机切成每条宽度为4mm的试条，装进试条卡，压卡，制备成检测卡即可。

9.一种权利要求1所述荧光免疫层析检测试纸用于抗原或抗体检测的用途。

10.权利要求9所述荧光免疫层析检测试纸用于抗原或抗体检测的用途，其特征在于，加样品于权利要求1所述荧光免疫层析检测试纸的样品垫上，样品中的待检物层析到结合线，待检物与所述荧光免疫层析检测试纸的结合线上的抗体1标记物特异性反应后形成复合物，层析至T线，形成双抗夹心或竞争，结合线上的生物素标记物层析至C线与亲和素形成特异性反应，利用荧光定量检测系统检测T线和C线区域的富集的荧光强度，将T/C荧光强度值处理后带入标准曲线即得出样品中待测物的含量；

优选的，所述标准曲线得到的方法为，用pH7.4，0.01MPBS稀释国家或国际标准品到所需的线性浓度，用荧光免疫层析检测试纸测试各浓度相应的荧光强度值，标准品浓度和荧光强度值比值拟合得到相关趋势线。