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CN105158220B - 一种多荧光通道同步显微成像方法及装置 - Google Patents

一种多荧光通道同步显微成像方法及装置 Download PDF

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CN105158220B CN201510452279.1A CN201510452279A CN105158220B CN 105158220 B CN105158220 B CN 105158220B CN 201510452279 A CN201510452279 A CN 201510452279A CN 105158220 B CN105158220 B CN 105158220B
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Abstract

本发明公开了一种多荧光通道同步显微成像方法和装置，通过根据实验要求在多个单色荧光激发光源中同时点亮多个不同颜色的单色荧光激发光源，以通过不同颜色的单色荧光激发光源对待测样品板的预设检测区域进行同步激发，并经过荧光收集和预设检测区域放大后，对荧光进行多波段滤光处理，以将杂散光去除，最终获取预设检测区域的荧光图像。实现了多荧光通道同步显微成像，避免了因分步检测而导致的荧光淬灭性的影响。所有单色荧光激发光源所发出的单色荧光激发光均倾斜射入待测样品板的预设检测区域，大大减少了进入物镜的单色荧光激发光。由于本发明提供技术方案无需二色相镜，使得装置结构更加简单且成本低廉，避免了光损耗的情况。

Description

一种多荧光通道同步显微成像方法及装置
本申请要求于2015年07月01日提交中国专利局、申请号为201510376530.0、发明名称为“集成式荧光激发光源装置”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。
技术领域
本发明涉及荧光显微成像技术领域，更为具体的说，涉及一种多荧光通道同步显微成像方法及装置。
背景技术
参考图1所示，为现有的一种荧光显微成像装置，其包括：一单色荧光激发光源1、与单色荧光激发光源1的照射方向呈45度角设置的二色相镜2、物镜3、样品放置台4、发射滤光片5和相机6。其中，单色荧光激发光源1发出激发光，经过二色相镜2反射至物镜3后，照射至样品放置台4的待测样品板上，而待测样品板内颗粒受激发发出荧光，通过二色相镜2和发射滤光片5后，进入相机6成像。
现有的荧光显微成像装置一次只能实现一个荧光通道的检测，当需要多个荧光通道的检测时，只能在一个荧光通道检测完成后，切换至另一个荧光通道进行检测，而后对多个荧光通道的检测结果进行整合。现今很多荧光染料具有快速的淬灭性，在进行多个荧光通道分步检测时，由于样品被反复照射或照射的时间有差异，荧光的淬灭性影响很难测定。因此，若在多荧光通道的检测过程中，能够实现多荧光通道同步检测，即能解决因分步检测而导致的荧光淬灭性的影响。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种多荧光通道同步显微成像方法和装置，实现了多荧光通道同步显微成像，避免了因分步检测而导致的荧光淬灭性的影响，便于实验；而且减少了进入物镜的单色荧光激发光，使得获取的荧光图像更加精确；此外，该装置结构简单且成本低。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：
一种多荧光通道同步显微成像方法，将待测样品板放置完毕后，包括：
根据实验要求在多个单色荧光激发光源中同时点亮多个不同颜色的单色荧光激发光源的组合为目标光源，其中，每个单色荧光激发光源所发出的单色荧光激发光均倾斜射入所述待测样品板的预设检测区域；
在所述待测样品板背离所述目标光源一侧，收集所述预设检测区域内的颗粒受所述目标光源发出的多色荧光激发光的照射而激发的荧光，并将所述预设检测区域放大至预设倍数；
对所述预设检测区域内的颗粒激发的荧光进行多波段滤光处理；
获取所述预设检测区域的荧光图像。
优选的，在点亮所述目标光源后，且在所述目标光源所发出的多色荧光激发光未射入所述待测样品板之前，还包括：
对所述目标光源中每个单色荧光激发光源所发出的单色荧光激发光进行聚光处理。
相应的，本发明还提供了一种多荧光通道同步显微成像装置，包括：
光源装置、样品放置台、物镜、多波段滤光片和图像获取装置；
所述光源装置包括：多个单色荧光激发光源和与所述多个单色荧光激发光源电连接的控制系统，其中，所述多个单色荧光激发光源环绕所述物镜和图像获取装置所构成的成像光路中轴设置，且每个单色荧光激发光源所发出的单色荧光激发光与所述成像光路中轴相交于所述样品放置台的预设位置，所述控制系统根据实验要求在多个单色荧光激发光源中同时点亮多个不同颜色的单色荧光激发光源的组合为目标光源；
所述样品放置台设置于所述多个单色荧光激发光源所发出的单色荧光激发光交汇位置，用于放置待测样品板，且所述待测样品板的预设检测区域设置于所述样品放置台的预设位置；
所述物镜设置于所述样品放置台背离所述光源装置一侧；
所述多波段滤光片设置于所述物镜背离所述样品放置台一侧；
所述图像获取装置设置于所述多波段滤光片背离所述物镜一侧。
优选的，所述光源装置还包括：
明场光源，所述明场光源所发出的全波段白光朝向所述样品放置台、且与所述成像光路中轴重合。
优选的，所述单色荧光激发光源为单色LED荧光激发光源。
优选的，所述光源装置还包括：
设置于所述单色LED荧光激发光源的照射方向上、且设置于所述单色LED荧光激发光源与所述样品放置台之间的激发滤光片。
优选的，所述单色荧光激发光源包括：
白光激发光源；
以及，设置于所述白光激发光源的照射方向上、且设置于所述白光激发光源与所述样品放置台之间的激发滤光片。
优选的，所述光源装置还包括：
设置于所述单色荧光激发光源的照射方向上、且设置于所述单色荧光激发光源与所述样品放置台之间的聚光模组。
优选的，所述聚光模组为聚光透镜或多个镜片组成的聚光镜片组。
优选的，所述图像获取装置为目镜或相机。
相较于现有技术，本发明提供的技术方案至少具有以下优点：
本发明提供了一种多荧光通道同步显微成像方法和装置，包括：根据实验要求在多个单色荧光激发光源中同时点亮多个不同颜色的单色荧光激发光源的组合为目标光源，其中，每个单色荧光激发光源所发出的单色荧光激发光均倾斜射入所述待测样品板的预设检测区域；在所述待测样品板背离所述目标光源一侧，收集所述预设检测区域内的颗粒受所述目标光源发出的多色荧光激发光的照射而激发的荧光，并将所述预设检测区域放大至预设倍数；对所述预设检测区域内的颗粒激发的荧光进行多波段滤光处理；获取所述预设检测区域的荧光图像。
由上述内容可知，本发明提供的技术方案，通过根据实验要求在多个单色荧光激发光源中同时点亮多个不同颜色的单色荧光激发光源，以通过不同颜色的单色荧光激发光源对待测样品板的预设检测区域进行同步激发，并经过荧光收集和预设检测区域放大后，对荧光进行多波段滤光处理，以将杂散光去除，最终获取预设检测区域的荧光图像。由此实现了多荧光通道同步显微成像，避免了因分步检测而导致的荧光淬灭性的影响，便于实验。
另外，本发明提供的技术方案，所有单色荧光激发光源所发出的单色荧光激发光均倾斜射入待测样品板的预设检测区域，大大减少了进入物镜的单色荧光激发光，使得后续获取的荧光图像更加精确。此外，由于本发明提供的多荧光通道同步显微成像装置中，无需二色相镜，使得该装置结构更加简单且成本低廉，并且避免了光在透过二色相镜时出现损耗的情况，使得最终获取的荧光图像更加清晰。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为现有的一种荧光显微成像装置的结构示意图；
图2为本申请实施例提供的一种多荧光通道同步显微成像方法的流程图；
图3为本申请实施例提供的一种多荧光通道同步显微成像装置的结构示意图；
图4为本申请实施例提供的另一种多荧光通道同步显微成像装置的结构示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
正如背景技术所述，现有的荧光显微成像装置一次只能实现一个荧光通道的检测，当需要多个荧光通道的检测时，只能在一个荧光通道检测完成后，切换至另一个荧光通道进行检测，而后对多个荧光通道的检测结果进行整合。现今很多荧光染料具有快速的淬灭性，在进行多个荧光通道分步检测时，由于样品被反复照射或照射的时间有差异，荧光的淬灭性影响很难测定。因此，若在多荧光通道的检测过程中，能够实现多荧光通道同步检测，即能解决因分步检测而导致的荧光淬灭性的影响。
基于此，本申请实施例提供了一种多荧光通道同步显微成像方法和装置，实现了多荧光通道同步显微成像，避免了因分步检测而导致的荧光淬灭性的影响，便于实验；而且减少了进入物镜的单色荧光激发光，使得获取的荧光图像更加精确；此外，该装置结构简单且成本低。
具体的，参考图2所示，为本申请实施例提供的一种多荧光通道同步显微成像方法的流程图，其中，将待测样品板放置完毕后，包括：
S1、根据实验要求在多个单色荧光激发光源中同时点亮多个不同颜色的单色荧光激发光源的组合为目标光源，其中，每个单色荧光激发光源所发出的单色荧光激发光均倾斜射入待测样品板的预设检测区域；
S2、在待测样品板背离目标光源一侧，收集预设检测区域内的颗粒受目标光源发出的多色荧光激发光的照射而激发的荧光，并将预设检测区域放大至预设倍数；
S3、对预设检测区域内的颗粒激发的荧光进行多波段滤光处理；
S4、获取预设检测区域的荧光图像。
其中，本申请实施例提供的多个单色荧光激发光源中，包括有不同颜色(或波段)的单色荧光激发光源。其中，本申请实施例提供的所有单色荧光激发光源的颜色均不相同；或者，所有单色荧光激发光源分为多组，每组中单色荧光激发光源的颜色相同，且各组之间的颜色不同，以此提高每个颜色的荧光激发光的亮度，对此本申请不作具体限制。
由上述内容可知，通过根据实验要求在多个单色荧光激发光源中同时点亮多个不同颜色的单色荧光激发光源，以通过不同颜色的单色荧光激发光源对待测样品板的预设检测区域进行同步激发，并经过荧光收集和预设检测区域放大后，对荧光进行多波段滤光处理，以将杂散光去除，最终获取预设检测区域的荧光图像。由此实现了多荧光通道同步显微成像，避免了因分步检测而导致的荧光淬灭性的影响，便于实验。
另外，所有单色荧光激发光源所发出的单色荧光激发光均倾斜射入待测样品板的预设检测区域，大大减少了进入物镜的单色荧光激发光，使得后续获取的荧光图像更加精确。此外，由于本申请实施例提供技术方案中无需二色相镜进行分光，进而使得相应的装置结构更加简单且成本低廉，并且避免了光在透过二色相镜时出现损耗的情况，使得最终获取的荧光图像更加清晰。
需要说明的是，对于本申请实施例提供技术方案最终获取的荧光图像的分析，可以通过对每个颗粒激发的荧光颜色进行分析。其中，目标光源中不同颜色的单色荧光激发光源之间的波段是无交叠的，因此，在后续对颗粒激发的荧光进行滤光时，所有荧光的波段与任意一单色荧光激发光的波段同样是无交叠的，避免相同波段的单色荧光激发光对荧光滤光时造成影响，亦即，采用的多波段滤光片透过的波段与单色荧光激发光源的波段是无交叠的。
举例说明，假设根据实验要求同时点亮紫色激发光源(波段范围为385nm±10，包括端点值)、蓝色激发光源(波段范围为480nm±10，包括端点值)和绿色激发光源(波段范围为550nm±10，包括端点值)为目标光源时，即，目标光源中不同颜色的单色荧光激发光源之间的波段无交叠；
目标光源相应发出紫色激发光、蓝色激发光和绿色激发光。其中，当目标光源照射至预设检测区域时，若预设检测区域内的颗粒仅受紫色激发光的激发，则发出的荧光为蓝色(波段为460nm)；若预设检测区域内的颗粒仅受绿色激发光的激发，则发出的荧光为红色(波段为大于600nm)；若预设检测区域内的颗粒仅受蓝色激发光的激发，则发出的荧光为绿色(波段为520nm)；若预设检测区域内的颗粒受蓝色激发光和紫色激发光的激发，则发出的荧光为青色；若预设检测区域内的颗粒受紫色激发光和绿色激发光的激发，则发出的荧光为紫色；若预设检测区域内的颗粒受蓝色激发光和绿色激发光的激发，则发出的荧光为黄色；若预设检测区域内的颗粒受紫色激发光、绿色激发光和蓝色激发光的激发，则发出的荧光为白色。由于颗粒受不同颜色的荧光激发光的激发，而发出的颜色不同，因此可以通过此原理对获取的荧光图像进行分析。
与此同时，采用多波段滤光片透过波段为能够透过波段范围为460nm±10的波段(包括端点值)的蓝色光、520nm±10的波段(包括端点值)的绿色光和不小于600nm的波段的红色光的三波段滤光片。进而，多波段滤光片不仅能够透过颗粒激发出的蓝色荧光、绿色荧光和红色荧光；而且当颗粒受多色激发光激发时，同样能够透过蓝色荧光、绿色荧光和红色荧光中任意组合的荧光，例如，受蓝色激发光和紫色激发光激发，则发出蓝色荧光和绿色荧光组合的青色荧光，多波段滤光片透过青色荧光即为透过蓝色荧光和绿色荧光的组合。因此，将多波段滤光片的透过波段与目标光源中不同颜色的单色荧光激发光源的波段设置为无交叠，以此对颗粒发出的荧光进行滤光处理，以清除杂散光。
基于此，通过同时点亮多个不同颜色的单色荧光激发光源，以实现二通道同步显微成像、三通道同步显微成像等多荧光通道同步显微成像。
进一步的，为了提高单色荧光激发光源发出的荧光激发光的亮度，以提高目标光源所发出的多色荧光激发光的亮度，在点亮目标光源后，且在目标光源所发出的多色荧光激发光未射入待测样品板之前，还包括：
对目标光源中每个单色荧光激发光源所发出的单色荧光激发光进行聚光处理。
相应的，参考图3所述，为本申请实施例提供的一种多荧光通道同步显微成像装置的结构示意图，其中，多荧光通道同步显微成像装置包括：
光源装置100、样品放置台200、物镜300、多波段滤光片400和图像获取装置500；
光源装置100包括：多个单色荧光激发光源101和与多个单色荧光激发光源101电连接的控制系统(未画出)，其中，多个单色荧光激发光源101环绕物镜300和图像获取装置500所构成的成像光路中轴X设置，且每个单色荧光激发光源101所发出的单色荧光激发光与成像光路中轴相交于样品放置台200的预设位置，控制系统根据实验要求在多个单色荧光激发光源101中同时点亮多个不同颜色的单色荧光激发光源的组合为目标光源；
样品放置台200设置于多个单色荧光激发光源101所发出的单色荧光激发光交汇位置，用于放置待测样品板，且待测样品板的预设检测区域设置于样品放置台200的预设位置；
物镜300设置于样品放置台200背离光源装置100一侧，用于收集预设检测区域内的颗粒受目标光源发出的多色荧光激发光的照射而激发的荧光，并将预设检测区域放大至预设倍数；
多波段滤光片400设置于物镜300背离样品放置台200一侧，用于对预设检测区域内的颗粒激发的荧光进行多波段滤光处理；
图像获取装置500设置于多波段滤光片400背离物镜300一侧，用于获取预设检测区域的荧光图像，其中，图像获取装置可以为目镜、相机等，对此本申请不作具体限制。
进一步的，参考图3所示，本申请实施例提供的多荧光通道同步显微成像装置，其光源装置100还包括：
明场光源102，明场光源102所发出的全波段白光朝向样品放置台200、且与成像光路中轴X重合。
具体的，本申请实施例提供的单色荧光激发光源可以为单色LED(Light EmittingDiode，发光二极管)荧光激发光源。进一步的，为了提高单色LED荧光激发光源所发出的单色荧光激发光的单一性，本申请实施例提供的光源装置还包括：设置于单色LED荧光激发光源的照射方向上、且设置于单色LED荧光激发光源与样品放置台之间的激发滤光片。其中，通过激发滤光片将除单色荧光激发光的波段外的光吸收，仅仅通过单色荧光激发光，进而提高单色LED荧光激发光源所发出的单色荧光激发光的单一性。
或者，
在本申请实施例中，单色荧光激发光源还可以包括：白光激发光源；
以及，设置于白光激发光源的照射方向上、且设置于白光激发光源与样品放置台之间的激发滤光片。其中，白光激发光源发出全波段的白光，而后通过激发滤光片吸收不需要的波段的光，而通过预设波段的单色荧光激发光。需要说明的是，本申请实施例提供的白光激发光源可以为汞灯、氙灯等，对此本申请不作具体限制。
需要说明的是，由于LED具有响应时间短、耗能低、成本低、使用寿命长、体积小等诸多优点，因此，在本申请实施例中单色荧光激发光源优选为单色LED荧光激发光源。此外，本申请实施例提供的控制系统可以为单片机等，对此本申请不作具体限制。
进一步的，为了提高单色荧光激发光源发出的单色荧光激发光的亮度，即，提高目标光源所发出的多色荧光激发光的亮度，参考图4所示，为本申请实施例提供的另一种多荧光通道同步显微成像装置的结构示意图，其中，光源装置还包括：
设置于单色荧光激发光源101的照射方向上、且设置于单色荧光激发光源101与样品放置台200之间的聚光模组600。其中，聚光模组可以为单个的聚光透镜，或者为多个镜片组成的聚光镜片组，对此本申请实施例不作具体限制。
为了将光源装置、样品放置台、物镜、多波段滤光片、图像获取装置等结构固定，本申请实施例提供的荧光显微成像装置可以通过一固定架将其所有结构固定。
本申请实施例提供了一种多荧光通道同步显微成像方法和装置，包括：根据实验要求在多个单色荧光激发光源中同时点亮多个不同颜色的单色荧光激发光源的组合为目标光源，其中，每个单色荧光激发光源所发出的单色荧光激发光均倾斜射入所述待测样品板的预设检测区域；在所述待测样品板背离所述目标光源一侧，收集所述预设检测区域内的颗粒受所述目标光源发出的多色荧光激发光的照射而激发的荧光，并将所述预设检测区域放大至预设倍数；对所述预设检测区域内的颗粒激发的荧光进行多波段滤光处理；获取所述预设检测区域的荧光图像。
由上述内容可知，本申请实施例提供的技术方案，通过根据实验要求在多个单色荧光激发光源中同时点亮多个不同颜色的单色荧光激发光源，以通过不同颜色的单色荧光激发光源对待测样品板的预设检测区域进行同步激发，并经过荧光收集和预设检测区域放大后，对荧光进行多波段滤光处理，以将杂散光去除，最终获取预设检测区域的荧光图像。由此实现了多荧光通道同步显微成像，避免了因分步检测而导致的荧光淬灭性的影响，便于实验。
另外，本申请实施例提供的技术方案，所有单色荧光激发光源所发出的单色荧光激发光均倾斜射入待测样品板的预设检测区域，大大减少了进入物镜的单色荧光激发光，使得后续获取的荧光图像更加精确。此外，由于本申请实施例提供的多荧光通道同步显微成像装置中，无需二色相镜，使得该装置结构更加简单且成本低廉，并且避免了光在透过二色相镜时出现损耗的情况，使得最终获取的荧光图像更加清晰。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (10)

1.一种多荧光通道同步显微成像方法，其特征在于，将待测样品板放置完毕后，包括：
根据实验要求在多个单色荧光激发光源中同时点亮多个不同颜色的单色荧光激发光源的组合为目标光源，其中，每个单色荧光激发光源所发出的单色荧光激发光均倾斜射入所述待测样品板的预设检测区域；
在所述待测样品板背离所述目标光源一侧，收集所述预设检测区域内的颗粒受所述目标光源发出的多色荧光激发光的照射而激发的荧光，并将所述预设检测区域放大至预设倍数；
对所述预设检测区域内的颗粒激发的荧光进行多波段滤光处理；
获取所述预设检测区域的荧光图像。
2.根据权利要求1所述的多荧光通道同步显微成像方法，其特征在于，在点亮所述目标光源后，且在所述目标光源所发出的多色荧光激发光未射入所述待测样品板之前，还包括：
对所述目标光源中每个单色荧光激发光源所发出的单色荧光激发光进行聚光处理。
3.一种多荧光通道同步显微成像装置，其特征在于，包括：
光源装置、样品放置台、物镜、多波段滤光片和图像获取装置；
所述光源装置包括：多个单色荧光激发光源和与所述多个单色荧光激发光源电连接的控制系统，其中，所述多个单色荧光激发光源环绕所述物镜和图像获取装置所构成的成像光路中轴设置，且每个单色荧光激发光源所发出的单色荧光激发光与所述成像光路中轴相交于所述样品放置台的预设位置，所述控制系统根据实验要求在多个单色荧光激发光源中同时点亮多个不同颜色的单色荧光激发光源的组合为目标光源；
所述样品放置台设置于所述多个单色荧光激发光源所发出的单色荧光激发光交汇位置，用于放置待测样品板，且所述待测样品板的预设检测区域设置于所述样品放置台的预设位置；
所述物镜设置于所述样品放置台背离所述光源装置一侧；
所述多波段滤光片设置于所述物镜背离所述样品放置台一侧；
所述图像获取装置设置于所述多波段滤光片背离所述物镜一侧。
4.根据权利要求3所述的多荧光通道同步显微成像装置，其特征在于，所述光源装置还包括：
明场光源，所述明场光源所发出的全波段白光朝向所述样品放置台、且与所述成像光路中轴重合。
5.根据权利要求3所述的多荧光通道同步显微成像装置，其特征在于，所述单色荧光激发光源为单色LED荧光激发光源。
6.根据权利要求5所述的多荧光通道同步显微成像装置，其特征在于，所述光源装置还包括：
设置于所述单色LED荧光激发光源的照射方向上、且设置于所述单色LED荧光激发光源与所述样品放置台之间的激发滤光片。
7.根据权利要求3所述的多荧光通道同步显微成像装置，其特征在于，所述单色荧光激发光源包括：
白光激发光源；
以及，设置于所述白光激发光源的照射方向上、且设置于所述白光激发光源与所述样品放置台之间的激发滤光片。
8.根据权利要求3所述的多荧光通道同步显微成像装置，其特征在于，所述光源装置还包括：
设置于所述单色荧光激发光源的照射方向上、且设置于所述单色荧光激发光源与所述样品放置台之间的聚光模组。
9.根据权利要求8所述的多荧光通道同步显微成像装置，其特征在于，所述聚光模组为聚光透镜或多个镜片组成的聚光镜片组。
10.根据权利要求3所述的多荧光通道同步显微成像装置，其特征在于，所述图像获取装置为目镜或相机。
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