CN105142622A

CN105142622A - 硫雌酚用于治疗癌症

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Publication number: CN105142622A
Application number: CN201380065596.7A
Authority: CN
Inventors: J·J·普拉特尤维; M·德布里; E·克鲁姆佩尔
Original assignee: CHAMAELEO PHARMA bvba
Current assignee: CHAMAELEO PHARMA bvba
Priority date: 2012-10-15
Filing date: 2013-10-14
Publication date: 2015-12-09
Also published as: EP2906206A1; JP2016511218A; BR112015008366A2; CA2888040A1; US20150283108A1; US20170246137A1; MX2015004761A; WO2014060364A1

Abstract

本发明涉及硫雌酚(己烯雌酚硫酸酯)在痊愈性治疗或姑息性治疗哺乳动物癌症的方法中的应用。发明人意外地发现，硫雌酚可以适用于用作治疗哺乳动物癌症的有效药物。发明人进一步发现，即使高剂量地进行硫雌酚给药，也不会引起严重的副作用。除了硫雌酚的临床应用，本发明还涉及含有硫雌酚的口服剂量单位，以及用于静脉注射给药的含有硫雌酚的无菌液体。

Description

硫雌酚用于治疗癌症

技术领域

本发明涉及硫雌酚(Sulfestrol)(己烯雌酚硫酸酯(diethylstilbestrolsulfate))在痊愈性治疗或姑息性治疗(curativeorpalliativetreatment)哺乳动物癌症中的应用，例如，用于治疗乳腺癌或前列腺癌中的应用。

本发明还提供口服剂量单位，以及含有硫雌酚的无菌静脉注射液。

背景技术

在西方世界，癌症依然是位居死亡的主要原因。这适用于男性和女性。由于持续进行的对新的药物和治疗方法的研究，多年来，患有不同类型癌症的人群的预期寿命已经得到了稳步提高。尽管如此，仍需要更好的药物和增强的治疗方法。

在药物中，已经用于治疗癌症的药物是己烯雌酚(DES)。DES是一种人工合成的非甾体雌激素，它首次合成于1938年。它被设计用来实现睾酮的去势水平(castratelevels)。睾酮推动前列腺癌的生长，通过外科去势术取消睾酮是用于前列腺癌治疗的首次激素消融法。DES通过抑制睾丸产生睾酮以实现化学去势(chemicalcastration)。

然而，在前列腺癌的治疗中，DES的口服给药由于与血栓栓塞毒性的关联而受到限制。当进行例如DES的雌激素的口服给药时，它们由于受到肠和肝脏的首过效应，而导致在肝脏中的高激素浓度，从而促进凝血蛋白质如纤维蛋白原的合成。

在每天通过口服(p.o)接受5mg的DES的前列腺癌患者中，主要发源于心血管的非癌症相关的死亡增加了36％(ByarDP:Proceedings:TheVeteransAdministrationCooperativeUrologicalResearchGroup'sstudiesofcanceroftheprostate.Cancer(1973)32:1126-30)。其他评估低剂量DES的研究，报道了与用5mg的剂量和可接受的血栓栓塞毒性所获得的睾酮抑制效果类似的功效。这导致通过每天接受3mg口服剂量的DES用于治疗前列腺癌最常用。然而，副作用仍然值得关注，当研究公开表明亮丙瑞林(Leuprolide)和他莫昔芬(tamoxifen)的治疗具有与DES相似的效果但副作用少时，在一线疗法中，用亮丙瑞林替换了DES治疗前列腺癌，以及用他莫昔芬替换了DES治疗乳腺癌。

对于心血管副作用的关切已经导致不易于肠和肝脏首过效应的基于DES的制剂的开发。

GB732286描述了DES二磷酸酯(diphosphate)(磷雌酚(fosfestrol))的合成。磷雌酚被开发为DES的前药来实现安全抑制睾酮的生成而不引起由游离DES引起的血栓栓塞副作用。将磷酸基团加入到不具有活性的DES中，从而规避肠和肝脏的首过效应，并降低游离DES的循环水平。磷雌酚本身被认为是不具有活性的，并且已知前列腺癌细胞有升高水平的前列腺酸性磷酸酶(PAP)的表达。据认为，PAP将除去磷酸基团，并在接近DES的发挥作用侧释放DES。

在1950年代，磷雌酚被引入并以的名字销售，并在前列腺癌的治疗中得到成功应用多年。然而，磷雌酚与DES密切相关，并且当DES被替换为一线治疗时，磷雌酚还是被划上边界的(side-lined)。

即使在低剂量时对于DES的心血管副作用的关切，也会导致制剂和绕过肠和肝脏首过效应的DES的递送路径的开发。

WO2008/045461A2描述了一种用于治疗前列腺癌的方法，其包括经皮给药治疗有效量的DES或其药学上可接受的盐或复合物到患有前列腺癌的患者。经皮DES可以用作用于治疗前列腺癌的一线激素疗法或二线激素疗法。经皮给药可以通过经皮贴剂(patches)、洗剂、霜剂、凝胶剂、糊剂、喷雾剂、软膏剂、滴眼剂、滴鼻剂、滴耳剂、栓剂和/或类似的经皮给药技术来完成。DES可以以至少约0.1mg/天的剂量，以及更具体地约5.0mg/天的剂量给药。最大剂量约为25mg/天。所述剂量可以是每天的单剂量，它可以被分成至少两个单位剂量用于在24小时内给药，或者它可以是较长时间周期的连续剂量，例如3天至10周或1-10周。

US2011/0189288A1描述了一种通过使用含有水溶性基质的口腔药物组合物(buccalpharmaceuticalcomposition)以绕开首过效应的方式，所述水溶性基质含有有效量的DES和具有8-16的HLB的吸收增强剂。该美国专利申请还描述了用于治疗患者前列腺癌或乳腺癌的方法，该方法包括将该药物组合物作为水溶性基质给药至患者的口腔的口腔粘膜。在治疗前列腺癌和乳腺癌中，每天一至三次以0.1mg至15mg的DES单位剂量给药。

综上所述，如果DES作为磷雌酚前药给药，或者如果DES通过经皮或口腔途径给药，如果每日进行3mg的低口服剂量给药，DES可以安全地给药。

对DES的体外影响进行了研究，以探讨其致癌性和雌激素特性。Brandes等(ReceptorStatusandSubsequentSensitivityofSubclonesofMCF-7HumanBreastCancerCellsSurvivingExposuretoDiethylstilbestrol,cancerresearch43,2831-2835,June1983)调查了DES对MCF-7乳腺癌细胞的雌激素效应，以探索DES在乳腺癌的治疗中的潜在用途。他们第一次证明，DES意外地在体外降低了细胞的生长。

Hartley-Asp等(Diethylstilbestrolinducesmetaphasearrestandinhibitsmicrotubuleassembly,MutationResearch,143(1985)231-235)研究了DES对DU-145前列腺癌细胞的效应，以试图阐明DES的致癌作用。它们通过抑制微管的形成显示出了DES在前列腺癌细胞中的细胞毒性效应。

Schulz等(EvaluationoftheCytotoxicActivityofDiethylstilbestrolandItsMono-andDiphosphatetowardsProstaticCarcinomaCells,CancerRes.48(1988)2867-2870)的研究显示，DES浓度高达100ng/mL并不影响前列腺癌细胞的生长，以及诱导这些细胞中的细胞毒性效应的DES的最小浓度是1μg/mL。

本发明的一个目的是，通过诱导雄激素剥夺(deprivation)和/或具有可接受的副作用的细胞毒性效应，提供最佳效力的治疗哺乳动物癌症的方法。

发明内容

本发明人意外地发现，硫雌酚(Sulfestrol)(己烯雌酚硫酸酯(diethylstilbestrolsulfate))可以在治疗哺乳动物癌症中作为有效的药物适当地采用。此外，本发明人已经发现，硫雌酚即使在高剂量下给药，也不会引起严重的副作用。

不希望受理论的束缚，假设在过去已经观察到的口服给药DES(～每天3mg)的毒副作用大多不是由DES本身引起的，而是由氧化的DES代谢物引起的。当DES口服给药时，它在肝脏中积累并被氧化。因此，绕过DES的肝脏代谢是减少血栓栓塞副作用的关键。

不希望受理论的限制，人们推测硫雌酚为DES的前药，并且与DES相比，硫雌酚不易受到肠和肝的首过效应的影响。因此，硫雌酚给药之后，将形成硫雌酚池，至少部分所述硫雌酚池在肝中由硫酸酯酶(芳基硫酸酯酶C)转换为DES，或在癌发处由肿瘤细胞表达的硫酸酯酶转换为DES。从肝脏硫酸酯酶释放的DES进入循环，并且DES在肝脏中的积累被最小化。

据信，硫雌酚以相对高的量给药，从而实现细胞毒性效应是重要的。

现有技术中已经描述了DES的硫酸酯。

Giacomelli等(TERAPIAASSOCIATAORMONICA-CHIRURGICA-RADIOLOGICADELCANCROINOPERABILEDELLAMAMMELLA,Tumori,It.Vol.21(1947),338-345)描述了静脉注射己烯雌酚-二硫酸酯(diethylestilbestrol-disulphate)到具有不能手术的患有乳腺癌的女性中的测试。作者报告，结合放疗和手术，此治疗具有有利影响。

Cavallini(UNNUOVODER1VATOST1LBENICOINIETTABILEPERVIAENDOVENOSA,BollettiondellasocietaItalianadibiologiasperimetnale,Napoli,IT,vol.(1947),214-216)的结论是，己烯雌酚-二硫酸酯具有雌激素活性，其是水溶性的和可静脉注射的，并在小鼠中有良好的可耐受性。

Cavallini等(TERAPIADELCANCROESOSTANZEAATTIVITAESTROGENA,IlFarmaco,,ElsevierFrance,Editionsscientifiquesetmedicales,IT,vol.3,(1948),300-303)通过将含有以下物质的橄榄油注入去势雌性大鼠中研究了4-4'-二羟-苯偶姻(4-4'-dioxy-benzoin)，4-4'-二羟双脱氧苯偶姻(4-4'-dioxydesoxybenzoin)，4-4'-二羟乙基双脱氧苯偶姻(4-4'-dioxyethyldesoxybenzoin)，3,4-二(对羟苯基)n-己-3-醇(3,4-di(p.oxyphenyl)n-hesan3-ol)的二硫酯(disulphuricesters)(钠盐)的雌激素活性。

Bishop等(Stilbestrolsulphate,oestrone,andequilin:furtherobservationsonthepotencyandclinicalassessmentofoestrogens,TheLancet,1951,April13；818-820)研究了一系列硫酸雌激素的雌激素作用。该研究开始以前的结果表明，含有硫酸雌酮的制剂具有比母体化合物雌酮更高的雌激素活性。笔者想知道己烯雌酚的硫酸酯形式是否也将被证明更具有雌激素活性。在这项研究中，己烯雌酚硫酸酯通过每日剂量2mg的口服给药。该研究显示，己烯雌酚硫酸酯具有己烯雌酚雌激素活性的44％。

Demol等(InfluencedessteroidssexuelssurlacroissanceducarcinomamammaireT.M.2290A.A.L.chezelessourismalesdelaraceO₂₀A.A.L",ANNALESD'ENDOCRINOLOGIE,MASSON,PARIS,FR,vol.16,(1955)932-937)描述了研究通过皮下注射网状肿瘤组织的悬浮液诱导雄性小鼠(去势或非去势)成瘤。接下来，将小鼠用两种不同的给药方法暴露于己烯雌酚的二硫酸钠(disodiumdisulfate)中：皮下注射(12×0.16mg)或通过加入到饮用水中(0.04、0.1和0.2mg/天)。

Saruta等(TheMechanismofEstrogenHypertension,JAPANESECIRCULATIONJOURNAL,vol.36,no.6,(1972),611-616)讨论了口服避孕高血压(oral-contraceptiononhypertension)大鼠中的雌激素的作用。本文介绍了对雄性大鼠进行腹腔注射2mg己烯雌酚二硫酸酯并结合0.2mg肌肉注射雌三醇。

Curtis和他的同事们在他们的研究中使用了35-S放射性标记的DES硫酸酯，以阐明芳基硫酸酯酶C和芳基硫酸酯在体内的行为。更具体地，Gregory等(Thefateofthesulphateestersofdiethylstilboestrolintherat,BiochemJ.1971December；125(3):77–78)和Bradford等(MetabolicFatesofDiethylstilboestrolSulphatesintheRat,BiochemJ.1977；164:423–430)使用了其中的DES[³⁵S]单硫酸酯和DES[³⁵S]二硫酸酯作为模式化合物。成熟散养的(free-ranging)雄性和雌性大鼠接受DES[³⁵S]二硫酸酯的注射。此外，DES[³⁵S]单硫酸酯以胆管及输尿管插管的方式给药到麻醉大鼠。作者发现，这两种化合物以没有进一步代谢修饰的形式随胆汁排出，使得它们成为理解芳基硫酸酯酶C活性的代谢研究的理想模型化合物。

由于芳基硫酸酯酶C在肝脏中特别地被发现，作者把肝脏看作DES二硫酸酯和DES单硫酸酯代谢的主要部位。

除了硫雌酚的临床应用，本发明还涉及含有硫雌酚的口服剂量单位，和用于静脉注射给药的含有硫雌酚的无菌液体(sterileliquids)。

具体实施方式

本发明的第一个方面涉及硫雌酚(己烯雌酚硫酸酯)在痊愈性治疗或姑息性治疗(curativeorpalliativetreatment)哺乳动物癌症的方法中的应用。

如本文所用的术语“硫雌酚(Sulfestrol)”，除非另外指出，指的是己烯雌酚部分中的至少一个羟基被硫酸酯化。因此，在本文中使用的硫雌酚包括单-硫雌酚(己烯雌酚单硫酸酯或4-(4-(4-氧苯基)己-3-烯-3-基)苯基硫酸酯(4-(4-(4-oxidophenyl)hex-3-en-3-yl)phenylsulfate))，二-硫雌酚(己烯雌酚二硫酸酯或4,4'-(己-3-烯-3,4-二基)双(4,1-亚苯基)二硫酸酯(4,4'-(hex-3-ene-3,4-diyl)bis(4,1-phenylene)disulfate))，以及它们的混合物。单-硫雌酚的剩余羟基基团可以被例如磷酸基团酯化。术语“硫雌酚”还涵盖硫雌酚的药学上可接受的盐。

如本文所用的术语“药学上可接受的盐”，是指可以安全和有效地用于哺乳动物，并且具有所需的生物活性的本发明的化合物的那些盐。用于药物化合物的药学上可接受的盐的抗衡离子(counterions)的描述可以在P.HeinrichStahl,CamilleG.Wermuth(Eds.),HandbookofPharmaceuticalSalts,Properties,SelectionandUse,WileyVCH(2002)中找到。

本发明的硫雌酚的己烯雌酚部分可以是反式或顺式形式。当然，也可以使用反式和顺式形式的混合物。

本文中所用的术语“癌症”是指一种涉及不受调节的细胞生长的恶性肿瘤。在癌症中，细胞分裂和生长失控，形成恶性肿瘤，并侵入身体的临近部分。

本文中所用的术语“痊愈性治疗”是指一种目的在于治愈疾病或改善与疾病相关的症状的治疗。

本文所用的术语“姑息性治疗”是指一种并不旨在治愈疾病，而是提供减轻症状(providingrelief)的治疗或疗法。

本文中所用的术语“口服”(oral)，除非另外指出，与“经口给药”(peroral)同义。

本文中所用的术语“剂量”是指给药至哺乳动物的药物活性物质的量。因此，术语“剂量”不包括任何载体或其它被作为给药“剂量单位”的一部分的药学上可接受的赋形剂。

在本文及其权利要求中，动词“包括(tocomprise)”及其变型被用于在其非限制性意义上来表示还包括所列举词组之外的条目(itemsfollowingtheword)，但不排除未具体提及的条目。另外，通过不定冠词“一种”或“一个”(“a”or“an”)涉及的元素(anelement)并不排除一个以上的元素存在的可能性，除非上下文明确要求有一个且仅有一个元素。不定冠词“一种”或“一个”(“a”or“an”)因此通常是指“至少一个”。

激素依赖性癌症是指那些在特定激素的存在下生长更快的癌症类型。这种类型的癌症通常用激素疗法。激素疗法包括阻断这些激素的体内产生或作用。因此，激素疗法实际上是抗激素治疗。前列腺癌、乳腺癌、子宫颈癌、子宫内膜癌和卵巢癌可以是激素依赖性癌症，并可以根据本发明的方法治疗。

在激素依赖性前列腺癌中，雄激素消融疗法(androgenablationtherapy)(如睾丸切除术，使用LHRH类似物或LHRH拮抗剂治疗)被用作一线治疗，以减少雄激素特别是睾酮的产生，以停止或限制前列腺癌的生长。雄激素是前列腺肿瘤生长的关键驱动因素。雄激素消融疗法降低了雄激素的血浆水平，从而减少了前列腺肿瘤的生长潜力。雄激素消融疗法在一定时间的时期内是成功的，然而所有前列腺肿瘤最终对这种治疗方法变得较耐受。雄激素消融治疗失败后，使用抗雄激素的次级激素疗法以减缓前列腺肿瘤的生长。

乳腺癌通常基于其受体状态分类。乳腺癌细胞可以具有或可以不具有许多不同类型的受体，在本分类之中三个最重要的是：雌激素受体(ER)，孕酮受体(PR)和HER2/neu。ER/PR阳性乳腺癌具有最有利的临床结果，因为它们对抗激素治疗非常敏感。如果这些受体之一不是由肿瘤表达，激素疗法就不会那么有效。如果任何两种受体都没有表达，肿瘤对激素治疗不敏感，该癌症被称为“激素非依赖性(hormone-independent)”。除了ER和PR，乳腺癌还可以表达蛋白质HER2/neu。与HER2/neu的阴性肿瘤相比，HER2/neu的表达与更具有侵袭性的肿瘤和较差的临床结果相关。如果上述的三种标志物都不表达，该乳腺癌被称为“三阴性(triplenegative)”。

暴露在激素治疗中一定时间后，前面提到的大部分癌症类型会获得不需要激素生长的能力，并成为所谓的“激素非依赖性(hormone-independent)”。一旦这些癌症成为激素非依赖性，治疗通常被切换到化疗。激素非依赖性前列腺癌也称为激素难治性或去势抗性前列腺癌。这些术语可在下面互换使用，并被认为具有“去势抗性前列腺癌”的含义。如今，术语“去势抗性”已经取代了“激素难治性”，因为虽然这些前列腺癌不再响应去势治疗(可降低可得的雄激素/睾酮)，但由于雄激素受体活化，他们仍显示出对激素的一些依赖性。

本发明包括激素依赖性以及激素非依赖性癌症的治疗。本发明的方法特别适用于治疗激素非依赖性癌症，特别是用于治疗用激素疗法治疗激素依赖性癌症后发展出的激素非依赖性癌症。本发明的方法特别适用于治疗用抗雌激素、芳香酶抑制剂、抗雄激素或17α羟化酶/C17,20裂解酶抑制剂(CYP17A1)治疗激素依赖性癌症后发展出的激素非依赖性癌症。

本发明的治疗方法优选适用于治疗对使用抗雌激素、芳香酶抑制剂、或17α羟化酶/C17,20裂解酶抑制剂(CYP17A1)治疗不响应的乳腺癌。

本发明的治疗方法还优选适用于治疗对使用抗雄激素或17α羟化酶/C17,20裂解酶抑制剂(CYP17A1)治疗不响应的前列腺癌，尤其是对用17α羟化酶/C17,20裂解酶抑制剂(CYP17A1)，尤其是阿比特龙(Abiraterone)治疗不响应的前列腺癌。

在本发明的一种优选的实施方式中，所治疗的癌症是前列腺癌，特别是去势抗性前列腺癌。

在另一种优选的实施方式中，通过本发明的方法治疗的癌症是乳腺癌，特别是ER/PR阴性乳腺癌。在又一优选的实施方式中，治疗的方法是指三阴性乳腺癌的治疗。

在一种优选的实施方式中，硫雌酚是单-硫雌酚。在进一步优选的实施方式中，单-硫雌酚不是DES葡糖苷酸的硫酸酯(glucuronidesulfate)。优选的是，单-硫雌酚的己烯雌酚部分中的羟基中的至少一个未酯化。

在另一种优选的实施方式中，硫雌酚是二-硫雌酚。

如本文前面所解释的，硫雌酚在本发明的上下文中还包括硫雌酚的药学上可接受的盐。药学上可接受的盐包括由碱金属如钠、锂、钾，以及碱土金属如钙和镁的阳离子形成的盐。

在一种优选的实施方式中，硫雌酚是碱金属盐，特别是钠和/或钾盐。更优选地，硫雌酚是钾盐形式。

本发明的治疗方法可用于治疗多种哺乳动物，如人，马，牛等。本发明的方法特别适合于治疗人。

所述硫雌酚的剂量可根据具体情况和正在治疗的患者而变化。所述化合物的治疗有效剂量可以在产生显著临床效果的延长的治疗方案中作为重复剂量提供。

该化合物的实际剂量将根据例如疾病征兆和例如年龄、大小、健康状态、症状程度、易感因素等患者的特定状态的因素，以及其他因素(例如时间和给药途径、同时施用的其它药物或治疗)而变动。可以调整剂量方案以提供最佳的治疗响应。

典型地，本方法包括以日剂量至少0.001mmol，更优选至少0.01mmol，甚至更优选至少0.03mmol，还更优选还至少0.1mmol，最优选至少0.2mmol进行硫雌酚给药。硫雌酚的每日给药量最好不超过15mmol，更优选不超过5mmol，最优选不超过2mmol。

换一种表达方式，以每日优选至少0.013μmol每kg体重，更优选至少0.13μmol每kg体重，甚至更优选至少0.4μmol每kg体重以及最优选至少1.3μmol每kg体重进行硫雌酚给药。硫雌酚的每日给药量优选不超过200μmol每kg体重，更优选不超过80μmol每kg体重，最优选不超过26μmol每kg体重。

本发明的治疗方法的持续时间一般超过7天。更具体地，本发明的方法具有至少14天的持续时间，特别的至少28天。

根据本发明，硫雌酚优选口服给药、静脉注射给药、局部给药或粘膜给药。当然地，这些给药模式也可以组合使用。根据一种特别优选的实施方式，硫雌酚为口服给药和/或静脉注射给药。最优选地，硫雌酚为口服给药。

根据本发明的一种特别优选的实施方式，以至少0.001mmol，更优选至少0.01mmol，甚至更优选至少0.03mmol，还更优选至少0.1mmol，并且最优选至少0.2mmol的日剂量进行硫雌酚的口服给药。口服给药的日剂量最好不超过15mmol，更优选不超过5mmol，最优选不超过2mmol。

进一步优选以至少0.013μmol每kg体重，更优选至少0.13μmol每kg体重，甚至更优选至少0.4μmol每kg体重，最优选至少1.3μmol每kg体重的日剂量进行硫雌酚的口服给药。硫雌酚的口服给药的日剂量通常不超过200μmol每kg体重，更优选不超过80μmol每kg体重，最优选不超过26μmol每kg体重。

上述的日剂量可以为每日一次硫雌酚的给药，或者在或多或少的常规间隔内以两次或多次单独的剂量形式给药。根据一种特别优选的实施方式，本发明的治疗方法包括每天进行至少2个剂量，每个剂量至少0.001mmol的硫雌酚的口服给药，更优选其包括每天进行至少3个剂量，每个剂量至少0.001mmol的硫雌酚的口服给药。优选的是，后者的每个剂量含有至少0.01mmol，更优选至少0.03mmol，最优选至少0.05mmol的硫雌酚。

另一种优选的给药途径是静脉注射给药，直接将含有硫雌酚的药物配方输入静脉。与其它给药途径相比，静脉注射途径是向全身输送药物的最快方式。

典型地，本方法包括以至少0.001mmol，更优选至少0.01mmol，甚至更优选为至少0.03mmol，还更优选至少0.1mmol和最优选至少0.2mmol的日剂量进行硫雌酚的静脉注射给药。静脉注射给药的每日硫雌酚剂量通常不超过15mmol，更优选不超过5mmol，最优选不超过2mmol。

换一种表达方式，优选以至少0.013μmol每kg体重，更优选至少0.13μmol每kg体重，甚至更优选至少0.4μmol每kg体重和最优选至少1.3μmol每kg体重的日剂量进行硫雌酚的静脉注射给药。优选地，硫雌酚的每日给药量不超过200μmol每kg体重，更优选不超过80μmol每kg体重，最优选不超过26μmol每kg体重。

典型地，硫雌酚的静脉给药包括至少0.001mmol，更优选至少0.01mmol，甚至更优选至少0.03mmol，还更优选至少0.1mmol，最优选至少0.2mmol的静脉注射剂量给药。典型地，静脉注射剂量不超过15mmol，更优选不超过2mmol。本发明的治疗方法优选包括每天给药至少一个静脉注射剂量的硫雌酚。

本发明的另一方面涉及包括至少0.001mmol，优选为至少0.01mmol，更优选至少0.03mmol，最优选至少0.1mmol的硫雌酚而不是DES单[³⁵S]硫酸酯或DES二[³⁵S]硫酸酯的口服剂量单位。通常情况下，口服剂量单位包括不超过15mmol，更优选不超过5mmol和最优选不超过2mmol的硫雌酚而不是DES单[³⁵S]硫酸酯或DES二[³⁵S]硫酸酯。

本文中所用的术语DES单[³⁵S]硫酸酯和DES二[³⁵S]硫酸酯是指已经用³⁵S原子进行同位素标记的单-硫雌酚或二-硫雌酚。优选地，各种可能的S-同位素以其自然(相对)丰度存在于口服剂量单位中。

本发明的口服剂量单位，可在如本文之前所定义的痊愈性治疗或姑息性治疗癌症的方法中优选地被应用。

口服剂量单位优选选自由片剂、颗粒剂、胶囊剂、粉剂和液体所组成的组中。甚至更优选的是，口服剂量单位是片剂或胶囊。

口服剂量单位通常具有0.1-2g的重量，更优选0.15-1.0g，最优选0.2-0.5g。

口服剂量单位通常含有10-95重量％的选自着色剂、调味剂或掩味剂、稀释剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、稳定剂、表面活性剂、助流剂、增塑剂、防腐剂和甜味剂中的一种或多种的药学上可接受的赋形剂。

所述赋形剂优选选自由乳糖、无水乳糖、交聚维酮(crospovidone)、交联羧甲基纤维素钠、羧基乙酸淀粉钠(sodiumstarchglycolate)、羟丙基纤维素、波拉克林钾(polacrilinpotassium)、预凝胶淀粉(pregelatinizedstarch)和微晶纤维素以及它们的组合所组成的组中。在一种优选的实施方式中，口服剂量单位含有至多5重量％，优选2-4重量％的崩解剂。

本发明的剂量单位可适当地采取压缩片剂的形状。这样的片剂可以适当地包括两层或更多层不同的组合物，例如包裹在包衣中之前的包括本文所定义的硫雌酚的核心。

本发明的剂量单位方便在压片机中生产。为了能够容易从模具中除去片剂，剂量单位一般含有在0.5重量％和4重量％之间的润滑剂或滑动剂。优选地，润滑剂或滑动剂选自由滑石、硬脂酰富马酸钠、硬脂酸镁、硬脂酸钙、氢化蓖麻油、氢化大豆油、聚乙二醇、淀粉、无水硅胶(anhydrouscolloidalsilica)和它们的组合所组成的组中。

本发明的另一方面涉及用于静脉注射给药的无菌液体，所述液体含有至少0.1μmol/ml，优选至少0.5μmol/mL，甚至更优选至少3μmol/ml和最优选至少10μmol/mL的硫雌酚，而不是DES单[³⁵S]硫酸酯或DES二[³⁵S]硫酸酯。通常，所述无菌液体含有不超过1200μmol/ml，更优选地不超过700μmol/ml和最优选不超过400μmol/mL的硫雌酚，而不是DES单[³⁵S]硫酸酯或DES二[³⁵S]硫酸酯。

优选地，各种可能的S-同位素以其自然(相对)丰度存在于含有DES二硫酸酯(DES-disulfate)的用于静脉注射给药的液体中。

用于本发明的静脉注射给药的无菌液体可在如本文之前所定义的痊愈性治疗或姑息性治疗癌症的方法中优选地被应用。

用于静脉注射给药的无菌液体通过将硫雌酚和其它药学上可接受的赋形剂溶解在液态惰性载体中制备。一种用于注射的合适的惰性液态载体是水。

另外，需要存在1-8mg/mL的张度剂(例如氯化物)用以将张力(tonicity)调整到与人体血液相同的值。在一般情况下，制剂的渗透压(osmolarity)类似于人类血液。通常，无菌液体的渗透压在270-310mOsm/kg，更优选在275-300mOsm/kg的范围内，并且最优选在280-290mOsm/kg的范围内。

无菌液体的pH优选位于4-8的范围内，更优选在5-7的范围内。

用于静脉注射制剂的其他合适的赋形剂的非限制性的实例为如乙醇、甘油和丙二醇的溶剂，如EDTA(乙二胺四乙酸)和柠檬酸的稳定剂，如苄醇、对羟基苯甲酸甲酯(methylparaben)和对羟基苯甲酸丙酯(propylparaben)的抗微生物防腐剂，如柠檬酸/柠檬酸钠、乙酸/乙酸钠和磷酸/磷酸二氢钾的缓冲剂，和如氯化钠、甘露糖醇和葡萄糖的张力调节剂(tonicitymodifiers)。

本领域技术人员清楚适用于静脉注射给药的制剂的限制。所述制剂不应含有进入血液时会造成不良反应的赋形剂。此外，该制剂应允许一旦进入血液中，活性成分需保持可溶性。该限制列表并不详尽。选择满足这些要求的适当的赋形剂是在本领域技术人员的技能范围内。

以下实施例意在进一步说明本发明及其一些优选的实施方式，而并不旨在限制本发明的范围。

实施例

实施例1：

在本实施例中描述的实验的目的是合成10-25g单-硫雌酚和二-硫雌酚。

以毫克规模合成这些化合物发表在Biochem.J.(1977),164,423-430中。如该出版物中描述的，DES二硫酸酯(disulfate)的合成，开始于在-5℃下混合ClSO₃H、CS₂和N,N-二甲基苯胺，然后在室温下加入己烯雌酚。

使用这些条件的试验反应，得到了单硫酸酯和二硫酸酯(mono-anddisulfate)的混合物。使用己烯雌酚加入其中的位于吡啶中的ClSO₃H和DMAP，也得到了DES的单硫酸酯和二硫酸酯的混合物。

然而，当在N,N-二甲基甲酰胺中进行反应时，使用过量的吡啶-SO₃复合物作为反应物时，观察到了DES几乎完全转化成它的二硫酸酯。残留的起始原料，通过用Et₂O(乙醚)洗涤反应混合物除去。接下来从水中结晶，随后通过从KOH水溶液中除去任何剩余的单硫酸酯和吡啶残基以结晶产物，获得27g的DES二硫酸酯(DESdisulfate)，作为相应的二钾盐。

二-硫雌酚的合成

按照如下方法合成二-硫雌酚：

将己烯雌酚(30g，112mmol)溶解在N,N-二甲基甲酰胺(无水，100mL)中。将三氧化硫吡啶络合物(71.2g，447mmol)加入到该溶液中，并将混合物在环境温度下搅拌3小时。

沉淀白色固体并过滤样品。对该样品进行LCMS(PEVA39-013-3)，显示了含有单-硫雌酚和二-硫雌酚以及一些起始材料的混合物。

滤出该沉淀的残余物，并随后在过滤器上用乙醇(2×200mL)洗涤。LCMS显示了单-硫雌酚(6％)和二-硫雌酚(94％)的混合物。在500mL的25％的KOH溶液中重结晶该固体，得到白色晶体状的粗制二-硫雌酚。将晶体滤出并真空干燥，以除去任何残余的溶剂。

LCMS显示了具有纯度>99％和正确质量(m/z＝213(428-2H⁺/2))的产品。

¹H-NMR与其结构一致。所有芳香信号作为一个大的单谱线出现。¹³C-NMR(D₂O)显示出7个峰，均与二-硫雌酚的结构一致。

单硫酸酯(monosulfate)的合成可以通过使用位于DMF中的0.4-0.5当量的吡啶-SO₃实现。这导致了只有少量的二硫酸酯作为副产物。再次用Et₂O洗涤反应混合物除去任何未反应的起始材料。从水中结晶混合物，得到良好纯度的单硫酸酯。

然而，当该产物用KOH水溶液处理除去吡啶残渣时，形成了副产物。企图通过结晶或洗涤完全除去这种未知的副产物被证明是不成功的，得到纯度仅在90％以上的以二钾盐存在的单-硫雌酚。

单-硫雌酚的合成

按照如下方法合成单-硫雌酚：

将己烯雌酚(40g，149mmol)溶解在N,N-二甲基甲酰胺(无水，50ml)中。将三氧化硫吡啶络合物(9.49g，59.6mmol)加入到该溶液中，并将混合物在环境温度下搅拌3小时。沉淀固体并过滤。对该样品进行LCMS，显示了30％转化为单-硫雌酚以及存在少量的二-硫雌酚。

将来自沉淀的剩余部分的溶剂在真空中蒸发，得到白色固体的粗单-硫雌酚。将粗产物部分再溶于热水(80-90℃)中并趁热过滤。将滤液冷却至环境温度并过滤。对滞留的样本进行LCMS，显示了85:15的单-硫雌酚和DES起始材料的混合物。

滞留物的其余部分在乙醇中搅拌并过滤。然后将滤液在10％的KOH溶液中搅拌10分钟，将固体滤出。分2批将粗产物再次用乙醇重结晶，分别得到210mg和1.75g作为二钾盐的单-硫雌酚。LCMS分析表明，210mg批次具有约92％的纯度，并且还有一些乙醇存在。1.75g的批次具有约91％的LCMS纯度。

实施例2

在激素依赖性(LNCaP细胞)和激素非依赖性(DU-145)前列腺癌细胞系中，对DES、单-硫雌酚和二-硫雌酚的体外直接细胞毒性进行了试验。

在37℃、5％CO₂和湿润条件下，在体外将细胞保持在含有10％(V/V)热灭活的胎牛血清(FBS)和2mML-谷氨酰胺(生长培养基)的RPMI1640培养基中。收获细胞，洗涤，重悬在生长培养基中并计数。按照DU-145细胞以0.5×10⁵个细胞/mL，LNCaP细胞以1×10⁵个细胞/mL，将细胞重悬在测定培养基(RPMI1640+1％(V/V)热灭活的FBS+和2mML-谷氨酰胺)中，并以50μL/孔等份铺到96孔测定板(Corning，黑色壁板)中。

加入化合物之前，将细胞在37℃、5％湿润的CO₂条件下孵育过夜。以60mM的储液浓度将三种化合物(DES、单-硫雌酚和二-硫雌酚)溶解于100％DMSO中。

随后，将所有化合物的储液连续稀释，细胞暴露的终浓度是300、150、75、37.5、18.75、9.4、4.7、2.3、1.2和0.6μM。阳性对照是泰索帝(taxotere)。泰索帝稀释于100％DSMO中，得到浓度为1mM的储液。将储液连续稀释，细胞暴露的终浓度是1000、333.3、111.1、37.0、12.3、4.1、1.4、0.5和0.2nM。

加入化合物后，将平板在37℃、5％湿润的CO₂条件下孵育72小时。用Cell(Promega公司)分析法测定细胞的生存力。将10μL细胞滴度蓝^TM试剂加入每个测试/空白孔中。在分析前，将平板在37℃、5％湿润的CO₂条件下孵育3小时。使用FlexII平台平板阅读器(FlexIIstationplatereader)测定荧光。激发波长为570nm，发射波长为600nm，切断波长为590nm。原始数据通过Prism软件(GraphPadPrism)处理以计算平均值，标准偏差和IC50值。

暴露于DES、单-硫雌酚、二-硫雌酚和泰索帝的细胞系的生存力结果示于表1。

表1

结论：

这些结果表明，在体外，DES在LNCaP和DU-145前列腺癌细胞中是有细胞毒性的。单硫雌酚和二-硫雌酚均无细胞毒性。

实施例3

在激素依赖性(MCF-7)和激素非依赖性(MDA-MB321)三阴性乳腺癌细胞系中，对DES、单-硫雌酚和二-硫雌酚的体外直接的细胞毒性进行了试验。

在37℃、5％CO₂和湿润条件下，在体外将细胞保持在含有10％(V/V)热灭活的胎牛血清(FBS)和2mML-谷氨酰胺(生长培养基)的RPMI1640培养基中。收获细胞，洗涤，重悬在生长培养基中并计数。将细胞以0.5-1×10⁵个细胞/mL(取决于细胞类型)重悬在测定培养基(RPMI1640+1％(V/V)热灭活的FBS+和2mML-谷氨酰胺)中，并以50μL/孔等份铺到96孔测定板(Corning，黑色壁板)中。

加入化合物之前，将细胞在37℃、5％湿润的CO₂下孵育过夜。以60mM的储液浓度将三种化合物(DES、单-硫雌酚和二-硫雌酚)溶解于100％DMSO中。随后，将所有化合物的储液连续稀释，细胞暴露的终浓度是300、150、75、37.5、18.75、9.4、4.7、2.3、1.2和0.6μM。阳性对照是顺铂(Cisplatin)。将顺铂稀释于1％FBS培养基中，得到浓度为1mM的储液。将顺铂储液连续稀释。细胞暴露的终浓度是100、50、25、12.5、6.3、3.1、1.6、0.8、0.4和0.2μM。

暴露于DES、单-硫雌酚，二-硫雌酚和顺铂的细胞系的生存力结果示于表2中。

表2

结论：

在体外，DES和单-硫雌酚在MCF7和MDA-MB231乳腺癌细胞系中是有细胞毒性的。DES是毒性最高的化合物，其次是单-硫雌酚。二-硫雌酚在这些细胞中是无毒的。

实施例4

研究了DES、单-硫雌酚和二-硫雌酚对富血小板血浆(PRP)的血小板聚集诱导效果。

从4名健康人志愿者获得需要产生PRP的血液。从每名供体中获得的100mL新鲜静脉血直接分装到含有1/10th体积抗凝血剂柠檬酸三钠(3.2％W/V)的管中。将血液和抗凝血剂立即混合，柠檬酸三钠的最终浓度为0.0106M。

通过将抗凝血在室温下180g离心10分钟制备PRP。取出含有血小板的混浊的黄色上清液，并放置到干净的聚丙烯管中。通过将剩余的样品在室温下1200g离心20分钟制备贫血小板血浆(PPP)。通过加入PPP，将PRP调节到合适的血小板数量和630nm处的吸光度。

所有三种化合物溶解于100％DMSO中，得到浓度为60mmol的储液。连续稀释储液，血小板暴露的终浓度分别为150、75、37.5、18.75、9.4、4.7和2.3μM。进行测试的最终浓度分别为100、33、11.1、3.7、1.2、0.4和0.133nM。100nM的γ凝血酶(Cambridgebioscience)用作血小板聚集的对照。将90μL的PRP的等份加入到96孔板中。在630nm处读取基线吸光度。将5μL的化合物和γ凝血酶对照加入到适当的PRP中。

将96孔板于室温下在板振荡器上连续摇动孵育7分钟。孵育7分钟后读取第二个630nm处的数值，以测定由化合物诱导的任何血小板聚集。原始数据通过Prism软件(GraphPadPrism)处理以计算平均值和标准偏差。如此获得的结果示于表3中。

表3

结论：

与凝血酶对照相比，所有化合物显示出了高得多的吸光度。凝血酶的浓度设定为100ng/ml，因为这是诱导血小板聚集的最佳浓度。由于高吸光度与低聚合关联，这些结果表明，没有一个化合物可以直接诱导血小板聚集。

实施例5

对DES、单-硫雌酚和二-硫雌酚在人肝脏微粒体中的体外代谢途径进行了研究。

特别强调的是通过用类固醇硫酸酯酶(STS)脱硫(desulfatation)和用细胞色素P(CYP)代谢氧化。使用的是溶于600μL体积的pH7.4的磷酸盐缓冲液中的浓度为0.5mg/ml肝脏微粒体(Celsis体外技术)。雌甾酮-3-硫酸酯(Estrone-3-sulfate)被用作阳性对照。

为了从CYP代谢中区分STS代谢，测试了不同条件的四种不同的孵育。

1.什么都不加；STS是有活性的，而CYP酶是没有活性的。

2.加入NADPH；STS和CYP酶均是有活性的。

3.加入STS抑制剂667-Coumate：STS和CYP酶均是没有活性的。

4.加入667-Coumate和NADPH；STS是没有活性的，以及CYP酶是有活性的。

将5μM每种化合物(测试和对照化合物)加入到肝脏微粒体中，并将混合物在37℃下孵育5、10、20、30、50、90和120分钟。孵育后，取45μL样品，随后在150μL冰甲醇中淬火。样品在-20℃孵育≥1h进行蛋白质沉淀。沉淀后，将样品离心并将剩余上清液用于LC-MS/MS分析。基于每个时间点所获得的数据，计算化合物的半衰期、代谢速度或内在清除率(intrinsicclearance)(Clint)、对CYP代谢和STS代谢的贡献。

如此获得的结果示于表4a，4b，4c和4d中。

表4a

表4b

表4c

表4d

结论：

这些结果表明，DES仅由CYP酶代谢处理，从而产生氧化代谢产物。单-硫雌酚是由STS和CYP酶代谢。通过STS酶进行的单-硫雌酚的代谢导致产生DES，然后其进一步通过CYP酶代谢。单-硫雌酚也直接由CYP酶代谢，导致产生单-硫雌酚的氧化代谢产物。二-硫雌酚仅由STS酶代谢。二-硫雌酚几乎完全转化成单-硫雌酚，然后进一步由STS和CYP酶代谢。

实施例6

在雄性SpragueDawley大鼠中对单-硫雌酚和二-硫雌酚在血浆中的代谢物进行了测定。在化合物的口服给药和静脉注射给药后鉴定代谢物。

每组三只大鼠，共有12只动物。化合物的口服给药剂量和静脉注射给药剂量均为10mg/kg。0.9％的生理盐水溶液作为载体用于口服给药和静脉注射给药。

静脉注射给药前，将溶液用0.22μm过滤器过滤。使用灌胃法进行口服给药。使用尾静脉注射法用于静脉注射给药。

在给药0.5、1、2、4、6和8小时后，从动物抽取0.25mL血液，并立即转移至含有4μl的K2-EDTA的预冷微量离心管中以阻止聚集。通过离心血液(plasma)获得血浆，并保存于-70℃直至分析。将从各个大鼠获得的血浆按照下列时间表进行合并：

用LC-MS/MS分析合并的样品，在合并的样品中的每种代谢物的相对百分比，基于亲本和其在血浆中的代谢物的质谱峰面积进行测定。

如此获得的结果示于表5a和5b中。

表5a

P＝亲本；M＝代谢物；IV＝静脉注射给药；PO＝口服给药

表5b

P＝亲本；M＝代谢物；IV＝静脉注射给药；PO＝口服给药

结论

这些结果表明，循环单-硫雌酚经过最小的代谢加工。另外，对达到最高的单-硫雌酚血浆水平而言，单-硫雌酚的口服给药优于静脉注射给药。检测到了一些单-硫雌酚的氧化代谢物，尽管代谢物的水平较低。二-硫雌酚大多转化为单-硫雌酚，后者是二-硫雌酚最丰富的循环代谢物。检测到了一些氧化代谢物(metabolism)和葡糖苷酸的缀合，尽管在低的水平。

实施例7

通过LC-UV定量对实施例6中所述的合并样品中的单-硫雌酚的浓度进行定量。

通过将适量的单-硫雌酚加入到20％乙腈/0.1％甲酸的水溶液中，以配制10,000ng/mL的校准标准溶液。标准溶液和样品的峰面积用设定在200-360nm的波长进行测定。单-硫雌酚的浓度水平通过标准品和未知样品的峰面积(Area)以及标准品的浓度，用如下公式计算：

·Area_未知/Area_标准＝Conc_未知/Conc_标准

·Conc_未知＝Conc_标准(Area_未知/Area_标准)

结果示于表6中

表6

样品	单-硫雌酚(ng/ml)	单-硫雌酚(μM)
			单-硫雌酚静脉注射	630.0	1.5
单-硫雌酚口服	1150.6	2.7
			二-硫雌酚静脉注射	735.9	1.7
二-硫雌酚口服	261.3	0.6

实施例8

在雄性Sprague-Dawley大鼠中测定DES和二-硫雌酚的雌激素活性。通过测量体重和血浆胆固醇水平来确定雌激素活性。

将18只Sprague-Dawley大鼠随机分为三组(载体、DES和二-硫雌酚，N＝6)。用载体或测试化合物一天三次对每只动物给药，(第1次剂量7:30-8:00，第二次剂量12:30-13:00，第三次剂量17:00-17:30)，连续14天。DES以每次剂量时间0.5mg/kg的剂量给药，总剂量为1.5mg/kg每天。二-硫雌酚以每次剂量时间1mg/kg的剂量给药，总剂量为3mg/kg每天。

在第0、2、4、6、8、10、12和14天的13:00-13:30之间测量体重。

14天的治疗后，最后一次给药4小时后，通过心脏穿刺从所述动物收集血液来分析血浆胆固醇水平。血液立即转移至装有0.5MEDTA抗凝剂的管中。轻轻混合并在4℃下以1000×g离心15分钟。从离心血液样品中抽出血浆，快速在干冰上冷冻，并储存在-80℃以备后用。

使用购自NovaTeinBio(BG-RAT11262)的商业ELISA试剂盒测定血浆胆固醇水平。标准操作流程按照无任何调整的试剂盒说明书实施。

测定的体重和血浆胆固醇结果示于表7a和7b中。

表7a

表7b

	胆固醇(nmol/L)
		DES	14.9±0.724
二-硫雌酚	12.1±0.799
		载体	222±32.2

结论

通过降低大鼠体重和胆固醇水平，DES和二-硫雌酚均显示出雌激素活性。然而，不像DES，如体外细胞毒性数据(参见实施例2和3)所示，在乳腺癌和前列腺癌的细胞系中二-硫雌酚没有体外细胞毒性。

该数据表明，二-硫雌酚在大鼠中被脱硫，由此释放DES和相应的雌激素活性。同样地，在体内二-硫雌酚的脱硫将释放DES的细胞毒活性。

实施例9

进行实验以确定单-硫雌酚的体内功效。

经过验证的体内乳腺癌模型用于确定单-硫雌酚对肿瘤生长和发展的影响。为此目的，肿瘤在一组动物，优选在小鼠体内生长。

一旦肿瘤建立，使用单-硫雌酚和二-硫雌酚的口服治疗就启动。在治疗的过程中对肿瘤的大小进行监控。

实验的结果表明，当在适当的剂量给药时，单-硫雌酚可用于治疗乳腺癌。

实施例10

进行实验以确定二-硫雌酚的体内功效。

经过验证的体内前列腺癌模型用于确定二-硫雌酚对肿瘤的生长和发展的影响。为此目的，肿瘤在一组动物中生长。

一旦肿瘤建立，使用二-硫雌酚的口服治疗就启动。在治疗的过程中对肿瘤的大小进行监控。动物的整体存活率用来测量所述治疗的功效。

实验的结果表明，当在适当的剂量给药时，二-硫雌酚可用于治疗前列腺癌。

实施例11

一批1kg的含有50mg单-硫雌酚的250mg片剂的制备方法如下：

分别将200g单-硫雌酚，160g硅化微晶纤维素，570g乳糖一水合物和50g交联羧甲基纤维素钠通过710μm的筛子。将过筛材料放入翻滚混合器中混合20分钟。同时将20g硬脂酸镁通过500μm的筛子。将材料加入翻滚混合器中，再继续混合5分钟。

250mg重量的片剂在KorschEK0上用9.5mm直径的圆形冲头(roundpunches)制备。

实施例12

含有50mg二-硫雌酚的胶囊，通过称取50g二-硫雌酚，40g微晶纤维素，140g乳糖一水合物和4g硅胶，各自分别通过710μm的筛子后，将材料转移到V-混合器中并混合15分钟进行制备。

以平均填充重量234mg制备2号硬明胶胶囊。

实施例13

单-硫雌酚和二-硫雌酚对肿瘤发展的影响通过使用原位自发转移乳腺癌模型(orthotopicspontaneousmetastasisbreastmodel)来确定，该模型通过将生物发光的MDA-MB-231Dlux注入雌性MF-1裸鼠的乳腺脂肪垫(MFP)中建立。

雌性MF-1裸鼠(HsdOla：MF1-Foxn1nu，Harlan，UK)被分成3组，每组8只小鼠(N＝8)：

1)单-硫雌酚

2)二-硫雌酚

3)载体阴性对照

在研究的开始小鼠为5-6周龄，并保持在带有栅栏单元的无菌隔离器中，并通过将日光灯设置为给予12小时的光-暗循环(在07：00开，19：00关)进行照明。房间装配有空调以保持23±2℃的空气温度范围。提供随意量的辐照消毒的2019啮齿类动物食物(HarlanTekladUK,产品号Q219DJ1R2)和高压蒸汽处理(autoclaved)的水。

在体外，MDA-MB-231Dlux细胞于37℃、5％CO₂和湿润条件下被保持在含有2mM的L-谷氨酸(LifeTechnologies,UK)和10％(V/V)热灭活的胎牛血清(Sigma,Poole,UK)的RPMI中。将细胞用0.4mg/mL的吉欧霉素(Zeocin)每周处理一次。

在开始第一天，用0.05％胰蛋白酶-EDTA收获半汇的合单层细胞，在培养基中洗涤两次，并计数。将存活率>90％的细胞以2×10⁶个细胞/0.1mL重悬在1：1的PBS：基质胶(Matrigel)中，以用于体内给药。在注射之前，将细胞悬浮液均质，并用1mL注射器抽取0.1mL的细胞悬浮液。在麻醉状态下(美托咪定/氯胺酮)，将细胞悬浮液原位注射到各小鼠的左下侧第二乳房脂肪垫中。

起始后的第7天，以及其后的每6天，用150mg/kg的D-荧光素注射(s.c.)小鼠。D-荧光素给药10分钟后，将小鼠麻醉，给药15分钟后，将它们安置到成像室(频谱CT)并用于发光成像(腹面观；全身，和原发肿瘤的屏蔽)。使用LivingImage4.3.1软件(CaliperLS,US.)捕获和处理图像。

起始后的第7天，将小鼠分组，使得每组之间有相同的平均生物发光信号。

分组后随即开始治疗：

·第1组：接受溶于WFI(注射用水)中的60mg/kg单-硫雌酚，口服，每日一次。

·第2组：接受溶于WFI中的80mg/kg二-硫雌酚，口服，每日一次。

·第3组：接受用于注射的50/50的PEG/水的混合物，口服，每日一次。

所获得的结果示于表8中。该表给出了通过如上所述的全身生物发光测量方法确定的以10⁹为单位的测量的总流量(光子/秒)±标准偏差。

表8

	第7天(流量*10⁹)	第13天(流量*10⁹)	第19天(流量*10⁹)
				第1组	1.72	5.89	9.22
第2组	1.73	8.84	16.2
				第3组	1.72	13.4	23.1

该数据表明，单-硫雌酚和二-硫雌酚对信号强度均有降低效果，这表明当以适当的剂量对小鼠进行口服给药时，这两种化合物均具有对肿瘤发展的抑制效果。

Claims

1.硫雌酚(己烯雌酚硫酸酯)在痊愈性治疗或姑息性治疗哺乳动物癌症的方法中的应用。

2.根据权利要求1所述的硫雌酚的应用，其中，所述癌症是激素非依赖性癌症。

3.根据权利要求2所述的硫雌酚的应用，其中，所述激素非依赖性癌症是在用激素疗法对激素依赖性癌症治疗后变为激素非依赖性的。

4.根据权利要求3所述的硫雌酚的应用，其中，所述激素非依赖性癌症是在用抗雌激素、芳香酶抑制剂、抗雄激素或17α羟化酶/C17,20裂解酶抑制剂(CYP17A1)对激素依赖性癌症治疗后变为激素非依赖性的。

5.根据前述权利要求中任意一项所述的硫雌酚的应用，其中，所述癌症是乳腺癌或前列腺癌。

6.根据前述权利要求中任意一项所述的硫雌酚的应用，其中，所述方法包括口服给药、静脉注射给药或它们的组合。

7.根据权利要求6所述的硫雌酚的应用，其中，所述方法包括以至少0.03mmol的日剂量进行硫雌酚的口服给药。

8.根据权利要求7所述的硫雌酚的应用，其中，所述方法包括以至少0.2mmol的日剂量进行硫雌酚的口服给药。

9.根据权利要求6所述的硫雌酚的应用，其中，所述方法包括以至少0.03mmol的日剂量进行硫雌酚的静脉注射给药。

10.根据权利要求9所述的硫雌酚的应用，其中，所述方法包括以至少0.2mmol的日剂量进行硫雌酚的静脉注射给药。

11.根据前述权利要求中任意一项所述的硫雌酚的应用，其中，所述硫雌酚为单-硫雌酚(己烯雌酚单硫酸酯)。

12.根据权利要求1-10中的任一项所述的硫雌酚的应用，其中，所述硫雌酚是二-硫雌酚(己烯雌酚二硫酸酯)。

13.一种含有至少0.001mmol硫雌酚的口服剂量单位，其中，所述硫雌酚不是己烯雌酚单[³⁵S]硫酸酯或己烯雌酚二[³⁵S]硫酸酯。

14.根据权利要求13所述的口服剂量单位，其中，所述硫雌酚是单-硫雌酚(己烯雌酚单硫酸酯)。

15.根据权利要求13所述的口服剂量单位，其中，所述硫雌酚是二-硫雌酚(己烯雌酚二硫酸酯)。

16.根据权利要求13-15中的任意一项所述的口服剂量单位，其中，所述剂量单位含有至少0.03mmol的硫雌酚。

17.根据权利要求13-16中的任意一项所述的口服剂量单位，其中，所述口服剂量单位为片剂或胶囊。

18.一种用于静脉注射给药的无菌水性液体，所述液体含有至少0.1μmol/mL的硫雌酚，而不是己烯雌酚单[³⁵S]硫酸酯或己烯雌酚二[³⁵S]硫酸酯。

19.根据权利要求18所述的无菌水性液体，其中，所述硫雌酚是单-硫雌酚(己烯雌酚单硫酸酯)。

20.根据权利要求18所述的无菌水性液体，其中，所述硫雌酚是二-硫雌酚(己烯雌酚二硫酸酯)。

21.根据权利要求18-20中任意一项所述的无菌水性液体，其中，所述水性液体具有270-310mOsm/l的渗透压。