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CN105130792A - 一种对由生物法合成的(r)-(-)-扁桃酸进行分离纯化的方法 - Google Patents

一种对由生物法合成的(r)-(-)-扁桃酸进行分离纯化的方法 Download PDF

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CN105130792A
CN105130792A CN201510603641.0A CN201510603641A CN105130792A CN 105130792 A CN105130792 A CN 105130792A CN 201510603641 A CN201510603641 A CN 201510603641A CN 105130792 A CN105130792 A CN 105130792A
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acid
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SHANGHAI BAIRUI BIOTECHNOLOGY CO Ltd
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Abstract

本发明提供了一种对由生物法合成的(R)‐(‐)‐扁桃酸进行分离纯化的方法，其包括如下步骤：将扁桃腈流加入含有用于分泌J2315腈水解酶的E.coli工程菌的转化液中，使其发生反应得到反应液，依次对反应液进行前处理、酸化处理、浓缩处理、结晶处理和精制处理，得到纯化后的(R)‐(‐)‐扁桃酸；本发明的分离纯化的方法具有操作步骤简单、反应条件温和、分离效果好、成本低和周期短的优点，便于由生物法合成的(R)‐(‐)‐扁桃酸的大规模生产，具有良好的工业化应用前景。

Description

一种对由生物法合成的(R)-(-)-扁桃酸进行分离纯化的方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，涉及一种对由生物法合成的(R)‐(‐)‐扁桃酸进行分离纯化的方法。
背景技术
扁桃酸是极其重要的手性药物中间体，具有消炎和杀菌的双重作用。目前，在国际市场上，对扁桃酸的需求约以年均10％左右的速度增长，尤其是(R)‐(‐)‐扁桃酸早已成为国内外急需的产品。
(R)‐(‐)‐扁桃酸及其衍生物是合成环扁桃酯、羟苄唑、匹莫林等血管扩张剂、杀菌剂、镇痉剂的重要药物中间体，且具有很好的生物分解性，是目前最受瞩目的酸性光学拆分剂，可使多数外消旋体胺类和氨基酸类经非对映体异构盐形成法进行光学拆分，如止咳药甲吗南的中间体八氢异喳琳衍生物可由(R)‐(‐)‐扁桃酸拆分。
目前，常见的制备扁桃酸旋光性单体的方法大致有：(1)物理化学法，其中包括不对称合成法、光学异构体拆分法和层析法等，不对称合成法可直接化学合成扁桃酸的异构体，拆分法先合成外消旋体扁桃酸，再拆分获得手性扁桃酸；(2)生物合成法。
申请号为201510334809.2的专利提出了一种生物法合成(R)‐(‐)‐扁桃酸的方法以取代传统的化学拆分法。该方法单批次反应(R)‐(‐)‐扁桃酸的累积浓度达到2.9M，ee值大于97％。为了使该方法生产出的(R)‐(‐)‐扁桃酸更容易达到产业化生产，有必要开发一种能够简便并且廉价地将(R)‐(‐)‐扁桃酸从终产物混合物中进行分离并纯化的方法。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种对由生物法合成的(R)‐(‐)‐扁桃酸进行分离纯化的方法，该方法具有操作简便、分离效果好、成本低和周期短等优点。
为达到上述目的，本发明的解决方案是：
一种对由生物法合成的(R)‐(‐)‐扁桃酸进行分离纯化的方法，其包括如下步骤：
(1)、将扁桃腈流加入含有用于分泌J2315腈水解酶的E.coli工程菌的转化液中，在pH为6.0‐9.0和温度为20‐40℃的条件下反应20‐24h，停止流加并继续反应2‐6h，得到反应液；
(2)、对步骤(1)所得反应液进行前处理以去除不溶物，得到处理液；
(3)、对步骤(2)所得处理液进行酸化处理，可以在20‐30℃的温度下收集析出的晶体并得到酸化液；
(4)、对步骤(3)所得酸化液进行浓缩处理和结晶处理，收集析出的晶体；
(5)、合并步骤(3)和步骤(4)所得晶体，进行精制处理后得到(R)‐(‐)‐扁桃酸。
其中，步骤(1)所涉及的方法与申请号为201510334809.2的中国专利所用的方法相同。
在步骤(1)中，将扁桃腈以第一流加速度流加10‐12h，在剩余的反应时间内以第二流加速度进行流加，第一流加速度大于第二流加速度，优选为第一流加速度是第二流加速度的2倍。
在步骤(1)中，第一流加速度可以为10‐40gL‐1h‐1，第二流加速度可以为5‐20gL‐1h‐1；优选地，第一流加速度可以为15‐35gL‐1h‐1，第二流加速度可以为7.5‐17.5gL‐1h‐1；更优选地，第一流加速度可以为20‐30gL‐1h‐1，第二流加速度可以为10‐15gL‐1h‐1；最优选地，第一流加速度为24gL‐1h‐1，第二流加速度为12gL‐1h‐1。
在步骤(1)中，pH可以为7‐8.5，还可以优选为7.9‐8.1；温度可以为25‐37℃，还可以优选为30℃。
在步骤(1)中，转化液的制备方法包括如下步骤：
a、将E.coli工程菌在发酵培养基中进行扩增培养并诱导表达，离心以得到静息细胞；
b、收集静息细胞，并将其悬浮在pH为6.0‐9.0的缓冲液中，得到转化液。
其中，在步骤a中，发酵培养基的组分及含量如下：酵母膏16‐60gL‐1、蛋白胨12‐80gL‐1、甘油1‐500mlL‐1、K2HPO424.75gL‐1、KH2PO43.47gL‐1、MgSO41gL‐1。
在步骤b的转化液中，静息细胞的浓度可以大于10gL‐1，优选为10‐100gL‐1，进一步优选为10‐50gL‐1，最优选为10‐20gL‐1。
在步骤b中，缓冲液可以为NaH2PO4/Na2HPO4缓冲液、KH2PO4/K2HPO4缓冲液中和Tris‐HCl缓冲液的任意一种。缓冲液的浓度可以为20‐200mM。
在步骤b中，转化液还可以含有助溶剂，助溶剂为体积分数为1‐25％的甲醇、乙醇、异丙醇和正己烷中的任意一种或几种，优选为体积分数为5‐10％的甲醇、乙醇、异丙醇和正己烷中的任意一种或几种。
在步骤(2)中，前处理步骤可以为过滤、吸附、旋转蒸发、离心和萃取中的任意一种或几种。过滤可以采用硅藻土过滤；吸附可以采用活性炭吸附。
在步骤(3)中，酸化处理可以为使用酸将处理液的pH值调至1‐7，优选为调至1‐5，更优选为调至2‐4。酸可以为盐酸、磷酸和醋酸中的任意一种或几种。酸的添加体积与处理液的体积之比可以为5％‐30％，优选为10％‐15％。
在步骤(3)中，晶体的收集方式为过滤收集或离心收集，优选为真空抽滤收集。
在步骤(4)中，浓缩处理为在55‐100℃的温度下采用旋转蒸发将酸化液的体积浓缩至10‐60％，优选为浓缩至20‐40％。浓缩处理也可以优选为在65‐85℃的条件下进行，更优选在75℃的条件下进行。旋转蒸发的次数可以为1‐5次，还可以优选为2‐3次。
在步骤(4)中，在浓缩处理完毕后继续进行结晶处理。结晶处理为将经过浓缩处理后的酸化液的温度(即结晶温度)降至0‐50℃，优选为降至10‐30℃，更优选为降至20‐30℃。当温度降至50℃以下后，处于过饱和状态的扁桃酸便会结晶析出。
在步骤(5)中，精制处理包括如下步骤：将步骤(5)所得的合并后的晶体在50‐100℃烘干，采用溶剂溶解，并继续进行步骤(4)的浓缩处理和结晶处理2～3次，收集析出的晶体，继续在50‐100℃下烘干12h，得到(R)‐(‐)‐扁桃酸。
在步骤(5)中，烘干温度可以为70‐80℃。溶剂可以为水、甲醇、乙醇、异丙醇、乙酸乙酯、甲苯、二氯甲烷和正己烷中的任意一种。
由于采用上述方案，本发明的有益效果是：
本发明对由生物法合成的(R)‐(‐)‐扁桃酸进行了一系列处理，从而实现对终产物混合物中的(R)‐(‐)‐扁桃酸的分离纯化。
首先，本发明的方法特别针对通过生物法合成的(R)‐(‐)‐扁桃酸的分离，其操作步骤较少，因此操作简单、分离纯化的周期较短，生产效率较高。
其次，本发明的方法的各个操作步骤不需要大型的仪器设备即可完成，反应条件比较温和，能耗较低，若投入工业化应用无需前期较大的成本投入，有利于由生物法合成的(R)‐(‐)‐扁桃酸的后继产业化生产。
最后，本发明的方法分离效果好。经过测试证明，采用本发明的方法后，扁桃酸的收率可以达到96％；对所得的扁桃酸采用多种检测方法(如碱式滴定法、高效液相色谱和核磁共振等)进行检测，结果显示，表面分离纯化后的扁桃酸纯度高于99％。
具体实施方式
本发明提供了一种对由生物法合成的(R)‐(‐)‐扁桃酸进行分离纯化的方法，其包括如下步骤：
(1)、将扁桃腈流加入含有用于分泌J2315腈水解酶的E.coli工程菌的转化液中，在pH为6.0‐9.0和温度为20‐40℃的条件下反应20‐24h，停止流加并继续反应2‐6h，得到反应液；
(2)、对步骤(1)所得反应液进行前处理以去除不溶物，得到处理液；
(3)、对步骤(2)所得处理液进行酸化处理，在20‐30℃的温度下收集析出的晶体并得到酸化液；
(4)、对步骤(3)所得酸化液进行浓缩处理，在20‐30℃的温度下收集析出的晶体；
(5)、合并步骤(3)和步骤(4)所得晶体，进行精制处理后得到(R)‐(‐)‐扁桃酸。
其中，在步骤(1)中，J2315腈水解酶(BCJ2315)是伯克霍尔德氏菌J2315菌株(BurkholderiacenocepaciaJ2315)分泌的。用于分泌J2315腈水解酶的E.coli工程菌是通过在EscherichiacoliM15中克隆BCJ2315基因并且过表达从而构建而成的E.coliM15/BCJ2315重组体(RecombinantE.coliM15/BCJ2315)。关于该E.coli工程菌，请详见Wang等人在BMCBiotechnology2013,13:14公开的非专利文献《DiscoveryandcharacterizationofahighlyefficientenantioselectivemandelonitrilehydrolasefromBurkholderiacenocepaciaJ2315byphylogeny‐basedenzymaticsubstratespecificityprediction》的记载。
在步骤(1)中，扁桃腈在整个流加反应过程的不同阶段可以以不同的流加速度进行流加。在流加反应初始的10‐12h，扁桃腈可以以第一流加速度进行流加，在剩余的流加反应时间内，扁桃腈可以以第二流加速度进行流加，但第一流加速度应大于第二流加速度，并且优选为第二流加速度的两倍。本发明在整个流加反应过程(20‐24h)的不同阶段采用不同的流加速度进行流加的原因如下：扁桃腈对J2315腈水解酶具有一定的毒性，随着流加反应的进行，J2315腈水解酶的催化效率会逐渐降低。第一流加速度采用较大的数值能够充分利用J2315腈水解酶的最高催化效率，而当J2315腈水解酶的催化效率降低至一定程度，则采用第二流加速度从而保证扁桃腈被充分转化。如果整个流加反应的全过程只采用第一流加速度则会导致扁桃腈转化效率降低，而整个流加反应的全过程均采用第二流加速度则会导致J2315腈水解酶的催化效率的浪费。
在步骤(1)中，转化液的制备方法包括如下步骤：
a、将E.coli工程菌在发酵培养基中进行扩增培养并诱导表达，离心以得到静息细胞；
b、收集静息细胞，并将其悬浮在pH为6.0‐9.0的缓冲液中，得到转化液。
其中，在步骤a中，发酵培养基的组分及含量如下：酵母膏16‐60gL‐1、蛋白胨12‐80gL‐1、甘油1‐500mlL‐1、K2HPO424.75gL‐1、KH2PO43.47gL‐1、MgSO41gL‐1。然而，还可以根据实际情况添加发酵补料培养基。
在步骤b所得的转化液中，静息细胞的浓度应大于10gL‐1，优选为10‐100gL‐1，更优选为10‐50gL‐1，最优选为10‐20gL‐1。催化反应所需的J2315腈水解酶是通过静息细胞分泌的，所以静息细胞的浓度影响的是J2315腈水解酶的浓度。而J2315腈水解酶的浓度越高则相对的催化效率越高，即单位时间内扁桃腈的转化量越高。理论上随着静息细胞的浓度的提高，第一流加速度是可以成比例增加的，即第一流加速度所需静息细胞的浓度等于在15‐20min内能够完全转化100mM扁桃腈的静息细胞的浓度。
在本发明的一个优选实施例中，第一流加速度可以为10‐40gL‐1h‐1，第二流加速度可以为5‐20gL‐1h‐1；在本发明的另一个优选实施例中，第一流加速度也可以为15‐35gL‐1h‐1，第二流加速度也可以为7.5‐17.5gL‐1h‐1；在本发明的再一个优选实施例中，第一流加速度可以为20‐30gL‐1h‐1，第二流加速度可以为10‐15gL‐1h‐1；在本发明的最优选实施例中，第一流加速度可以为24gL‐1h‐1，第二流加速度可以为12gL‐1h‐1。
上述的流加方式只是一种优选的流加方式，由于在整个反应的过程中，J2315腈水解酶的催化效率随着反应的进行是逐渐下降的，因此，还可以在流加反应的不同阶段以逐渐降低的流加速度进行流加，或者将整个流加反应阶段分为若干个阶段，每一个阶段采用一个不同的流加速度，并且前一阶段的流加速度大于后一阶段的流加速度。如：可以将整个流加反应阶段分为三个阶段，每个阶段分别对应于第一流加速度、第二流加速度和第三流加速度，第一流加速度大于第二流加速度，第二流加速度大于第三流加速度；还可以将整个流加反应阶段分为四个阶段，每个阶段分别对应于第一流加速度、第二流加速度、第三流加速度和第四流加速度，第一流加速度大于第二流加速度，第二流加速度大于第三流加速度，第三流加速度大于第四流加速度；还可以将整个流加反应阶段分为五个阶段，每个阶段分别对应于第一流加速度、第二流加速度、第三流加速度、第四流加速度和第五流加速度，第一流加速度大于第二流加速度，第二流加速度大于第三流加速度，第三流加速度大于第四流加速度，第四流加速度大于第五流加速度，以此类推。
在步骤b中，缓冲液可以为NaH2PO4/Na2HPO4缓冲液、KH2PO4/K2HPO4缓冲液中、Tris‐HCl缓冲液或其他任何常用pH缓冲液中的任意一种。该缓冲液的浓度可以为20‐200mM。
步骤b中除了添加缓冲液外，还可以添加扁桃腈的助溶剂，助溶剂为体积分数为1‐25％的甲醇、乙醇、异丙醇和正己烷中的任意一种或几种，优选为体积分数为5‐10％的甲醇、乙醇、异丙醇和正己烷中的任意一种或几种。助溶剂的添加体积可以为缓冲液体积的5％‐10％。
在步骤(1)中，pH还可以为7‐8.5，优选为7.5‐8.3，更优选为7.9‐8.1。对pH的调节可以采用氨水、NaOH溶液或者Na2CO3溶液。其中，氨水的浓度可以为1M到纯氨水，优选为2‐10M，更优选为4‐8M，最优选为6M。转化时温度还可以为25‐37℃，优选为30℃。转化时pH和温度直接对J2315腈水解酶的活力即J2315腈水解酶的催化效率产生影响。酶的活力在不同的转化温度或者不同的转化pH条件下是不同的。本发明选择的转化温度与转化pH适于酶的最佳催化效率的发挥。通过影响酶的催化效率从而影响扁桃腈的第一流加速度，最终影响的即是反应完成时(R)‐(‐)‐扁桃酸的最终浓度。
在步骤(1)中，所得到的反应液与申请号为201510334809.2的中国专利记载的方法所得到的反应液一样。
在步骤(2)中，前处理步骤可以为过滤、吸附、旋转蒸发、离心和萃取中的任意一种或几种。其中，过滤可以优选为采用硅藻土进行过滤，吸附可以优选为采用活性炭进行吸附。处理步骤的目的是用于除去反应液中的生物催化剂或底物等不溶物。
在本发明的一个优选实施例中，前处理步骤包括离心分离、硅藻土过滤和活性炭吸附。其中，离心分离可以在常温下(一般为25℃)，以8000rpm离心60min；硅藻土过滤可以采用硅藻土助滤剂以及采用布氏漏斗真空抽滤，在布氏漏斗中装填一层硅藻土以达到固体截留的目的；活性炭吸附所选用的活性炭优选为柱状活性炭。
在步骤(3)中，酸化处理为使用酸将步骤(2)所得处理液的pH值调至1‐7，优选为调至1‐5，更优选为调至2‐4。酸可以为盐酸、磷酸和醋酸中的任意一种或几种。酸的添加体积与处理液的体积之比为5％‐30％，优选为10％‐15％。酸化的目的是使溶液中的扁桃酸盐转化为扁桃酸，因此，如果酸的添加量过低会使扁桃酸盐无法全部转化为扁桃酸，从而影响产品质量；如果酸的添加量过高会使溶液体积膨胀过多，对扁桃酸产生稀释效应，影响后续纯化流程。
在步骤(3)中，析出的晶体应在20‐30℃的温度下收集，这是因为：扁桃酸的结晶与其在溶液中的溶解度相关，酸化后溶液中的扁桃酸处于过饱和状态而结晶析出，若要收获更多的晶体，则需降低扁桃酸的溶解度，由于溶解度会随着温度的升高而增加，因此过高的温度不利于扁桃酸的结晶，但是低温又会增加能耗，因此将结晶的温度设置在20‐30℃为佳。
在步骤(3)中，对析出的晶体的收集方式为过滤收集或离心收集，优选为真空抽滤收集。真空抽滤收集的具体步骤如下所示：采用布氏漏斗，在漏斗表面铺一层滤布或滤纸，将酸化后的溶液倒入漏斗，通过循环水真空泵抽滤，将晶体从酸化后的溶液中分离，待抽滤结束后，收集滤布上的晶体即可。生产上，采用刮刀卸料离心机离心收集的方式，转鼓转速1000±50rpm。
在步骤(4)中，浓缩处理为在55‐100℃的温度下采用旋转蒸发将酸化液的体积浓缩至10‐60％，优选为浓缩至20‐40％。浓缩处理的温度(即旋转蒸发的温度)可以优选为65‐85℃，还可以更优选为75℃。旋转蒸发的次数为1‐5次，优选为2‐3次。在步骤(3)中，由于已有相当一部分扁桃酸从过饱和溶液(即步骤(2)所得的处理液)中结晶析出并被收集，此时，该溶液中的扁桃酸已达到非过饱和状态而无法结晶。因此需要通过浓缩以除去部分水，使该溶液中的扁桃酸重新达到过饱和状态。将酸化液的体积浓缩至原体积的10％‐60％是为了使扁桃酸重新达到过饱和状态。
在步骤(4)中，在浓缩处理完毕后继续进行结晶处理。结晶处理为将经过浓缩处理后的酸化液的温度(即结晶温度)降至0‐50℃，优选为降至10‐30℃，更优选为20‐30℃。当温度降至50℃以下后，处于过饱和状态的扁桃酸便会结晶析出。
在步骤(5)中，精制处理包括如下步骤：将步骤(5)所得的合并后的晶体在50‐100℃烘干，采用溶剂溶解，并进行步骤(4)的浓缩处理和结晶处理2～3次，收集析出的晶体，继续在50‐100℃下烘干12h，得到(R)‐(‐)‐扁桃酸。精制处理时的烘干温度优选为70‐80℃，溶剂优选为水、甲醇、乙醇、异丙醇、乙酸乙酯、甲苯、二氯甲烷和正己烷中的任意一种。
实施例
本实施例涉及一种对由生物法合成的(R)‐(‐)‐扁桃酸进行分离纯化的方法，其包括如下步骤：
(1)、获取含有(R)‐(‐)‐扁桃酸的反应液10L，该反应液为申请号为201510334809.2的发明专利所记载的反应液；
(2)、对步骤(1)所得反应液进行离心分离，弃去沉淀后取上清液，在60℃下旋转蒸发以除去甲醇，收集剩余的溶液，依次采用硅藻土过滤和活性炭吸附后得到处理液；
(3)、取步骤(2)所得的处理液，缓缓加入11％(v/v)的盐酸(即盐酸的体积与处理液的体积之比为11％)并以300rpm的速度不断搅拌，使pH值达到2‐3，将温度调节至25℃，真空抽滤收集析出的晶体留用，其余的液体作为酸化液；
(4)、取步骤(3)所得酸化液，在75℃下进行旋转蒸发，将酸化液的体积浓缩至原体积的30％，然后再次将温度调至25℃，真空抽滤收集析出的晶体留用，对剩余的溶液继续重复上述旋转蒸发和真空抽滤，再次收集析出的晶体留用；
(5)、合并步骤(3)和步骤(4)所得晶体，在75℃下烘干处理6h，待晶体干燥后，使用乙醇重新溶解晶体，在50℃的温度采用旋转蒸发将溶解了晶体的乙醇溶液的体积浓缩至原体积的30％，然后调节温度值25℃，真空抽滤收集析出的晶体留用，剩余的液体在50℃的温度下继续采用旋转蒸发浓缩至原体积的30％，真空抽滤收集析出的晶体留用，将两次真空抽滤收集的晶体合并，在75℃下烘干12h，得到纯化后的(R)‐(‐)‐扁桃酸。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用本发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种对由生物法合成的(R)‐(‐)‐扁桃酸进行分离纯化的方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)、将扁桃腈流加入含有用于分泌J2315腈水解酶的E.coli工程菌的转化液中，在pH为6.0‐9.0和温度为20‐40℃的条件下反应20‐24h，停止流加并继续反应2‐6h，得到反应液；
(2)、对步骤(1)所得反应液进行前处理以去除不溶物，得到处理液；
(3)、对步骤(2)所得处理液进行酸化处理，收集析出的晶体并得到酸化液；
(4)、对步骤(3)所得酸化液进行浓缩处理和结晶处理，收集析出的晶体；
(5)、合并步骤(3)和步骤(4)所得晶体，进行精制处理后得到(R)‐(‐)‐扁桃酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在步骤(1)中，将所述扁桃腈以第一流加速度流加10‐12h，在剩余的反应时间内以第二流加速度进行流加，所述第一流加速度大于所述第二流加速度；或者，所述pH为7‐8.5；或者，所述温度为25‐37℃；
优选地，所述第一流加速度为10‐40gL‐1h‐1，所述第二流加速度为5‐20gL‐1h‐1；或者，所述pH为7.9‐8.1；或者，所述温度为30℃；
进一步优选地，所述第一流加速度为15‐35gL‐1h‐1，所述第二流加速度为7.5‐17.5gL‐1h‐1；
更进一步优选地，所述第一流加速度为20‐30gL‐1h‐1，所述第二流加速度为10‐15gL‐1h‐1；
最优选地，所述第一流加速度为24gL‐1h‐1，所述第二流加速度为12gL‐1h‐1。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述转化液的制备方法包括如下步骤：
a、将所述E.coli工程菌在发酵培养基中进行扩增培养并诱导表达，离心以得到静息细胞；
b、收集所述静息细胞，并将其悬浮在pH为6.0‐9.0的缓冲液中，得到所述转化液。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：在步骤a中，所述发酵培养基的组分及含量如下：酵母膏16‐60gL‐1、蛋白胨12‐80gL‐1、甘油1‐500mlL‐1、K2HPO424.75gL‐1、KH2PO43.47gL‐1、MgSO41gL‐1。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：在步骤b的转化液中，所述静息细胞的浓度大于10gL‐1；或者，步骤b中的缓冲液为NaH2PO4/Na2HPO4缓冲液、KH2PO4/K2HPO4缓冲液中和Tris‐HCl缓冲液的任意一种；或者，步骤b的转化液中还含有助溶剂，所述助溶剂为体积分数为1‐25％的甲醇、乙醇、异丙醇和正己烷中的任意一种或几种；
优选地，在步骤b的转化液中，所述静息细胞的浓度为10‐100gL‐1；或者，步骤b中的缓冲液的浓度为20‐200mM；或者，所述助溶剂为体积分数为5‐10％的甲醇、乙醇、异丙醇和正己烷中的任意一种或几种；
更优选地，在步骤b的转化液中，所述静息细胞的浓度为10‐50gL‐1；
最优选地，在步骤b的转化液中，所述静息细胞的浓度为10‐20gL‐1。
6.根据权利要求1至5中任一所述的方法，其特征在于：步骤(2)中的前处理步骤为过滤、吸附、旋转蒸发、离心和萃取中的任意一种或几种；
优选地，在步骤(2)中，所述过滤为采用硅藻土过滤；或者，所述吸附为采用活性炭吸附。
7.根据权利要求1至5中任一所述的方法，其特征在于：步骤(3)中的酸化处理为使用酸将所述处理液的pH值调至1‐7；或者，步骤(3)中的晶体的收集方式为过滤收集或离心收集；
优选地，所述酸为盐酸、磷酸和醋酸中的任意一种或几种；或者，所述处理液的pH值调至1‐5；或者，所述酸的添加体积与所述处理液的体积之比为5％‐30％；；或者，所述过滤收集为真空抽滤收集；
最优选地，所述处理液的pH值调至2‐4；或者，所述酸的添加体积与所述处理液的体积之比为10％‐15％。
8.根据权利要求1至5中任一所述的方法，其特征在于：步骤(4)中的浓缩处理为在55‐100℃的温度下采用旋转蒸发将所述酸化液的体积浓缩至10‐60％，步骤(4)中的结晶处理为将经过浓缩处理的酸化液的温度降至0‐50℃；
优选地，所述酸化液的体积浓缩至20‐40％；或者，所述浓缩处理的温度为65‐85℃；或者，所述旋转蒸发的次数为1‐5次；或者，经过浓缩处理的酸化液的温度降至10‐30℃；
更优选地，或者，所述旋转蒸发的次数为2‐3次。
9.根据权利要求1至5中任一所述的方法，其特征在于：所述精制处理包括如下步骤：将步骤(5)所得晶体在50‐100℃烘干，采用溶剂溶解，并进行步骤(4)的浓缩处理和结晶处理2～3次，收集析出的晶体，继续在50‐100℃下烘干12h，得到所述(R)‐(‐)‐扁桃酸。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述精制处理的烘干温度为70‐80℃；或者，所述溶剂为水、甲醇、乙醇、异丙醇、乙酸乙酯、甲苯、二氯甲烷和正己烷中的任意一种。
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