CN105106946B - 一种牛羊腐蹄病油乳剂疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

一种牛羊腐蹄病油乳剂疫苗及其制备方法，所述油乳剂疫苗由油相与水相按重量份比为1.5～3∶1，加入0.01％硫柳汞溶液构成，其中，所述油相由高压灭菌的药用白油、10％的Span‑80白油混合液、10％的甘露醇单油酸酯白油混合液按照1.8～2.2∶1∶1的比例构成；所述水相将4％～7％的蔗糖酯溶于含10％吐温80和10％聚氧乙烯蓖麻油衍生物水溶液，然后与抗原溶液按照1:2.5～3的比例构成；所述抗原溶液是将坏死梭杆菌经过坏死梭杆菌传代培养培养基传代，坏死梭杆菌扩大培养培养基放大培养后，进行浓缩，灭活得到每毫升菌液菌数不低于4×10¹⁰CFU的菌液。本发明还包括油乳剂疫苗的制备方法。本发明具有低粘度、良好稳定性、免疫效果好、临床不良反应小、成本低的特点。

Description

一种牛羊腐蹄病油乳剂疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种牛羊腐蹄病疫苗及其制备方法，具体涉及一种牛羊腐蹄病油乳剂疫苗及其制备方法。

背景技术

腐蹄病(Foot rot)是反刍动物的一种常见病，在我国除在东北和西北及西藏、内蒙奶牛的腐蹄病发病率相对较低外，其余地区尤其在南方，奶牛、山羊、绵羊腐蹄病广泛流行，其发病率高达8％～20％，甚至30％～50％。由于不科学的饲养管理、不良的环境条件、产后疾病、遗传等因素造成奶牛和绵羊蹄裂、蹄漏、蹄底或蹄踵溃疡等损伤，降低蹄部抵抗力，最终引发病原菌感染，加重蹄部损伤。而且牛羊腐蹄病治愈率低、淘汰率高，治疗时间长、药费高，治疗期用药导致废弃牛奶而导致经济损失严重。可见，牛羊腐蹄病是困扰奶牛、羊养殖的严重问题。

奶牛和羊腐蹄病的病原有多种，既有需氧菌又有厌氧菌及兼性菌，多数学者认为牛和羊腐蹄病的主要病原是坏死梭杆菌(Fusobacterium necrophorum)和栉瘤拟杆菌(Bacteroides nodosus)，腐蹄病的发生主要是二者共同感染而引起的。其中，坏死梭杆菌是牛羊腐蹄病的最重要病原，可引起多种器官化脓病变(如牛肝脓肿、人的Lemierre’s综合症、脑炎等疾病)和其他偶蹄动物的蹄部感染。坏死梭杆菌属于梭杆菌属(FusobacteriumKnorr 1922)是一种多形性细菌，培养特性严格厌氧，Feldman等报道，在14株从牛的肝脓肿分离出的坏死梭杆菌中，有4种不同的抗原群。

目前，国内外预防牛、羊腐蹄病的发生主要是定期采用硫酸铜、硫酸锌、多聚甲醛或福尔马林等药浴和定期修蹄，减少蹄部损伤等。治疗采用硫酸铜或碘包扎，全身注射抗生素，但由于其蹄部一直接触地面，处于感染状态，治疗效果差。国外有商品灭活疫苗，但因为腐蹄病病原复杂在不同地域使用效果差异大。油乳剂疫苗是国内外疫苗市场上产量最多的灭活疫苗，其免疫性能稳定、生物安全性高、较小的免疫剂量和较少的免疫次数就能达到延长免疫刺激时间，使机体获得足够的保护性抗体。而传统油乳剂疫苗在生产过程中将司班-80加入白油中作为油相，吐温-80、硬脂酸铝加入抗原水溶液中作为水相，二者混合乳化获得的油乳剂疫苗稳定性高，免疫后可获得持久的较高水平的免疫抗体；但是该油乳剂疫苗粘度大，免疫注射引起的应激反应较大，可形成无菌性化脓灶，在接种部位出现肿胀、硬结，或形成肉芽肿，免疫效果差；同时对动物肉制品质量也产生了不良的影响。由此可见，硬脂酸铝含量、油相、水相，油相水相比例、剪切时间、自油的品质是影响油乳剂疫苗黏度的重要因素，油乳剂疫苗存在着菌株大量培养困难、免疫效果以及引起的不良副反应等缺点。因此，探索一种具有低粘度、良好稳定性、免疫效果好、副作用小的牛羊腐蹄病油乳剂疫苗，必将对牛、羊养殖业和我国畜牧业的健康发展具有重要的意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种具有低粘度、良好稳定性、免疫效果好、临床不良反应小、成本低的牛羊腐蹄病油乳剂疫苗及其制备方法。

本发明解决其技术问题采用的技术方案是，一种牛羊腐蹄病油乳剂疫苗，由油相与水相按重量份比为1.5-3∶1(优选2∶1)，终浓度为0.005％～0.01％(优选1％)硫柳汞溶液构成，其中，所述油相由高压灭菌的药用白油、10％的Span-80白油混合液、10％的甘露醇单油酸酯白油混合液按照1.8～2.2∶1∶1(优选2∶1∶1)的比例构成；所述水相将4％～7％(优选5.7％)的蔗糖酯溶于含10％吐温80和10％聚氧乙烯蓖麻油衍生物水溶液，然后与抗原溶液按照1:2.5～3(优选1:2.8)的比例构成；所述抗原溶液是将坏死梭杆菌经过坏死梭杆菌传代培养培养基传代，坏死梭杆菌扩大培养培养基放大培养后，进行浓缩，灭活得到每毫升菌液菌数不低于4×10¹⁰CFU的菌液。

进一步，所述坏死梭杆菌传代培养培养基为牛脑心浸液培养基；所述坏死梭杆菌扩大培养培养基为改良心脑浸液培养基。

本发明进一步解决其技术问题采用的技术方案是，一种牛羊腐蹄病油乳剂疫苗的制备方法，包括以下步骤：

(1)生产用种子的制备：采用坏死梭杆菌传代培养培养基先将坏死梭杆菌进行一级种子繁殖，鉴定合格后，再进行二级种子繁殖得到二级种子；

(2)抗原溶液的制备：在发酵罐内的坏死梭杆菌扩大培养培养基中按培养基总量的5～10％接种二级种子培养，收获菌液，取样进行纯粹检验，应纯粹，同时作活菌计数，活菌数应不低于4×10⁹CFU；然后菌液浓缩，使每毫升菌液菌数不低于4×10¹⁰CFU；再灭活；

(3)油相的制备：将高压灭菌的药用白油、10％的Span-80白油混合液、10％的甘露醇单油酸酯白油混合液按照1.8～2.2∶1∶1的比例混合,35～38℃水浴片刻，充分摇匀，即得油相；

(4)水相的制备：将4％～7％的蔗糖酯溶于含10％吐温80和10％聚氧乙烯蓖麻油衍生物水溶液，然后与抗原溶液按照1:2.5～3的比例混匀，即得水相；其中，聚氧乙烯蓖麻油衍生物是由不同量环氧乙烷和蓖麻油或氢化蓖麻油反应得到的一系列物质，两种主要衍生物为聚氧乙烯35蓖麻油(EL-35)和聚氧乙烯40氢化蓖麻油(RH-40),其HLB值为13～15,主要应用于水不溶性药物或其他脂溶性药物的增溶剂和乳化剂，可防止溶血，并能很快通过尿液排泄，中国药典未收载，收录于欧洲药典和美国药典。TW-80作为增溶剂、乳化剂和稳定剂已收入多国药典,随着近年来药理学研究的深入,人们认识到吐温80是具有一定生物和药理活性的物质,并与药物临床上出现的不良反应相关，并且浓度为4％时有轻微的溶血作用。

(5)乳化：将油相与水相按重量份比为1.5～3∶1进行剪切10～15min后，在终止前加入2％硫柳汞溶液，使其最终浓度为0.005％～0.01％。

进一步，所述牛羊腐蹄病油乳剂疫苗的制备方法，包括以下步骤：

(1)种子的制备：将坏死梭杆菌接种于牛脑心浸液培养基中，在37～39℃厌氧培养48小时，取样接种心脑浸液琼脂平板，37～39℃厌氧培养48～96小时，纯粹检验合格后，作为一级种子；取一级种子接种于pH7.6心脑浸液培养基，37～39℃厌氧培养36～48小时，取样做纯粹检验，合格后作为二级种子；

(2)疫苗抗原溶液的制备：将发酵罐内的改良心脑浸液培养基预热至37～39℃，按培养基总量的5～10％接种二级种子，37～39℃培养10小时；收获菌液，取样进行纯粹检验，应纯粹，同时作活菌计数，活菌数应不低于4×10⁹CFU；用0.22μm的中空纤维超滤器将纯检合格的菌液浓缩，使每毫升菌液菌数不低于4×10¹⁰CFU；调节培养液pH至6.8～7.2，按菌液总量的0.3％加入甲醛溶液，置37℃灭活24小时，期间每隔6～8小时搅拌1次；

(3)油相的制备：将高压灭菌的药用白油、10％的Span-80白油混合液、10％的甘露醇单油酸酯白油混合液按照2∶1∶1的比例混合,37℃水浴片刻,充分摇匀，即得油相；

(4)水相的制备：将5.7％的蔗糖酯溶于含10％吐温80和10％聚氧乙烯40氢化蓖麻油水溶液，然后与疫苗抗原溶液按照1:2.8的比例混匀，即得水相；

(5)乳化：取油相2份放于胶体磨内，慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相1份，加完后再以8000r/min搅拌10～15分钟，在终止搅拌前加入2％硫柳汞溶液，使其最终浓度为0.01％。

本发明通过培养基优化，筛选出坏死梭杆菌扩大培养的条件，降低了坏死梭杆菌的培养成本；在疫苗乳化油相配方上，选用优质高效乳化剂蔗糖酯和单甘脂复配，替代硬脂酸铝，降低了注射引起的副反应，另外，高HLB值的蔗糖酯还有抑制耐热性芽孢菌的作用，这对产品的贮存也是很有利的；水相配方上，降低TW-80的用量，增加聚氧乙烯40氢化蓖麻油，降低了可能出现的临床不良反应。

本发明对地方流行的牛羊腐蹄病防治具有更好针对性，可达到有效的保护率。

附图说明

图1为粒度分布图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进一步加以说明。

实施例1：牛羊腐蹄病油乳剂疫苗的制备

1、菌种：坏死梭杆菌已在以下文献中公开：谢晶，廖党金，汪明，何万平，曹冶，赵素君，曾伟，李江凌，潘保良，叶勇刚，罗丹丹.《中国兽医杂志》，四川奶牛腐蹄病主要病原菌调查.2013，4:35-37；谢晶，廖党金，汪明，叶勇刚，曹冶，赵素君，李江凌，罗丹丹，王秋实，潘保良.奶牛源坏死梭杆菌四川株分离鉴定及生物学特性分析，《畜牧与兽医》，2013，45(3)：64-66。

坏死梭杆菌分离自四川省规模化奶牛场，为革兰氏阴性多形态杆菌，组织涂片或幼龄菌呈长丝状，人工培养超过24小时菌体形态呈较短个体、杆状或球杆状。本菌严格厌氧，在厌气肉肝汤中生长，初为均匀混浊，后变清并产生絮状沉淀。在牛心脑浸液琼脂平板上，37～39℃厌氧培养48～96小时，形成灰白色或半透明、边缘整齐、光滑菌落，在蛋黄琼脂平板上，在厌氧条件下培养，形成“煎蛋”样、脂酶阳性菌落。

2、疫苗制造及半成品检验(1)坏死梭杆菌传代培养培养基为牛脑心浸液培养基，具体配方如表1。

表1-坏死梭杆菌传代培养培养基配方(1L)

制法如下:

①牛脑、牛心浸液的制备：将去筋膜并绞碎的牛脑和牛心各500克，分别置2000ml的三角瓶内，各加蒸馏水1000ml，置4℃过夜，次日撇去浮油，分别置45℃水浴中加热1h，再煮沸30分钟，用纱布过滤(牛脑浸液不易滤清，可置4℃冰箱静置，使杂质沉淀后，吸取上清)，用蒸馏水补至1000ml，高压灭菌后备用。

②将上述成分混合后，加热溶解，冷却后以氢氧化钠溶液调整pH为7.6～7.8，分装后以116℃灭菌30～40分钟高压灭菌备用。

(3)上述心脑浸液中加入1.5％-2％琼脂即为心脑浸液琼脂。

(2)坏死梭杆菌扩大培养培养基为改良的牛脑心浸液培养基，具体配方如表2。

表2-坏死梭杆菌扩大培养培养基配方(1L)

(3)生产用种子制备

①一级种子繁殖与鉴定：将坏死梭杆菌接种于牛脑心浸液培养基中，在37～39℃厌氧培养48小时，取样接种心脑浸液琼脂平板，37～39℃厌氧培养48～96小时，纯粹检验合格后，作为一级种子。25℃厌氧保存，不超过7日。

②二级种子繁殖：取一级种子接种于pH7.6心脑浸液培养基，37～39℃厌氧培养36～48小时，取样做纯粹检验，合格后作为二级种子。25℃保存，使用期不超过2日。

(4)制苗用菌液的制备

①制苗用培养基：改良心脑浸液培养基。

②制苗用菌液培养：将发酵罐内的改良心脑浸液培养基预热至37～39℃，按培养基总量的5～10％接种二级种子，37～39℃培养10小时。收获菌液，置2～8℃保存备用。

③纯粹检验及活菌计数：培养结束后，取样进行纯粹检验，应纯粹。同时作活菌计数，活菌数应不低于4×10⁹CFU。

④浓缩：用0.22μm的中空纤维超滤器将纯检合格的菌液浓缩，使每毫升菌液菌数不低于4×10¹⁰CFU。

⑤灭活：调节培养液pH至6.8～7.2，按菌液总量的0.3％加入甲醛溶液，置37℃灭活24小时，期间每隔6～8小时搅拌1次。

⑥灭活检验：取样接种于心脑浸液琼脂平皿，37～39℃厌氧培养48～96小时，应无菌生长。

(5)疫苗的制备

①油相制备：将高压灭菌的药用白油、10％的Span-80白油混合液、10％的甘露醇单油酸酯白油混合液按照2∶1∶1的比例混合,37℃水浴片刻,充分摇匀。

②水相制备：将蔗糖酯(终浓度5.7％)溶于含10％吐温80和10％聚氧乙烯40氢化蓖麻油水溶液，然后该溶液与抗原溶液按照1:2.8的比例混匀备用。

③乳化：取油相2份放于胶体磨内，开动电机慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相1份，加完后再以8000r/min搅拌10-15分钟，在终止搅拌前加入2％硫柳汞溶液，使其最终浓度为万分之一。

④半成品检验：按现行《中国兽药典》附录进行，应无菌生长。

(5)分装：无检合格后，定量分装，并粘贴标签，置2～8℃保存。

实施例2：牛羊腐蹄病油乳剂疫苗成品对照分析

1、本实施例制备的牛羊腐蹄病油乳剂疫苗成品

(1)物理性状

外观：乳白色乳剂。

剂型：油包水型。取一只清洁的吸管，吸取少量疫苗滴入冷水中，除第1滴外，其余均不扩散。

稳定性：吸取疫苗10ml加入尖底离心管中，以4000r/min分钟离心15分钟，管底析出的水相应≤0.5ml，试验结果为0.05ml。将油乳剂放置在4℃、室温、37℃环境观察其破乳情况见下表3。

表3-油乳剂稳定性观察

黏度：用1ml吸管(下口内径为1.2mm,上口内径为2.7mm)，吸取25℃左右疫苗1ml，令其垂直自然流出，3组流出0.4ml所需要时间分别为4.7秒、4.8秒、4.7秒。用NDJ-5S旋转粘度计测油乳剂粘度，平均值为39，粘度低。

粒径测试：将水乳剂制备好后用LS-POP(6)激光粒度分布仪测定粒径大小，结果如表4、图1，粒径小于500um，符合油乳剂粒径要求。

表4-粒径分布表

(2)无菌检验：按现行《中国兽药典》附录进行，无菌生长。

(3)安全检验：用体重1.5～2.0kg家兔4只，各肌肉注射疫苗5.0ml，观察10日，均应健活，注射部位应不发生坏死。

(4)效力检验：用体重1.5～2.0kg家兔4只，各肌肉注射疫苗1.0ml，免疫21日后，连同条件相同的对照兔4只，注射致死量菌液，对照兔全部死亡，免疫兔至少保护3只为合格。

(5)甲醛、硫柳汞残留量测定：按现行《中国兽药典》附录进行，应符合兽用生物制品通则的有关规定。

2、常规方法制备的牛羊腐蹄病油乳剂疫苗的成品

油相制备：白油、司班-80和硬脂酸铝按照94ml：6ml：1.5g的比例配制。先取少量白油加热，将硬脂酸铝加入其中，充分混匀溶解，再与剩余白油及全部司班-80混合均匀，121.5P l16℃高压灭菌30min，即得到油相。

水相制备：将一定量吐温80溶于抗原溶液，使其占疫苗总体积的2.5％。

乳化：取油相2份放于胶体磨内，开动电机慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相1份，加完后再以8000r/min搅拌10-15分钟，在终止搅拌前加入2％硫柳汞溶液，使其最终浓度为万分之一。

半成品检验：按现行《中国兽药典》附录进行，应无菌生长。

分装：无检合格后，定量分装，并粘贴标签，置2～8℃保存。

经检验常规方法制备的牛羊腐蹄病油乳剂疫苗的成品：

(1)物理性状

外观：乳白色乳剂。

剂型：油包水型。取一只清洁的吸管，吸取少量疫苗滴入冷水中，除第1滴外，其余均不扩散。

稳定性：吸取疫苗10ml加入尖底离心管中，以4000r/min分钟离心15分钟，管底析出的水相应≤0.5ml，试验结果为0.1ml。将油乳剂放置在4℃、室温、37℃环境观察其破乳情况见下表3。

表5-油乳剂稳定性观察

黏度：用1ml吸管(下口内径为1.2mm,上口内径为2.7mm)，吸取25℃左右疫苗1ml，令其垂直自然流出，2组流出0.4ml所需要时间分别为5.7秒、6.1秒。用NDJ-5S旋转粘度计测油乳剂粘度，平均值为52，粘度低。

(2)无菌检验：按现行《中国兽药典》附录进行，无菌生长。

(3)安全检验：用体重1.5～2.0kg家兔4只，各肌肉注射疫苗5.0ml，观察10日，均应健活，注射部位应不发生坏死。

(4)效力检验：用体重1.5～2.0kg家兔4只，各肌肉注射疫苗1.0ml，免疫21日后，连同条件相同的对照兔4只，注射致死量菌液，对照兔全部死亡，免疫兔至少保护3只为合格。

(5)甲醛、硫柳汞残留量测定：按现行《中国兽药典》附录进行，应符合兽用生物制品通则的有关规定。

由成品对照结果可知，本实施例制备的牛羊腐蹄病油乳剂疫苗成品的性能优于常规方法制备的油乳剂疫苗成品。

实施例3：免疫保护试验

对照组15只，不免疫，实验组15只绵羊每只皮下接种灭活苗2ml，第22天二免。第35天分别用7×10⁹/只、3.5×10⁸/只和3.5×10⁷/只不同剂量菌液对相应的实验组与对照组绵羊进行攻毒，观察7天，记录绵羊蹄部感染情况。根据攻毒后绵羊蹄部损伤积分，当攻毒剂量为7×10⁹/只时，免疫组蹄部损伤总积分降低4分，保护效率为26.67％；当攻毒剂量为3.5×10⁸/只时，免疫组蹄部损伤总积分降低6分，保护效率为40％，当攻毒剂量为3.5×10⁷/只时，对照组发病率为40％，免疫组发病率为0。

Claims (4)

1.一种牛羊腐蹄病油乳剂疫苗，其特征在于，由油相与水相按重量份比为1.5～3∶1，终浓度为0.005％～0.01％硫柳汞溶液构成，其中，所述油相由高压灭菌的药用白油、10％的Span-80白油混合液、10％的甘露醇单油酸酯白油混合液按照1.8～2.2∶1∶1的比例构成；所述水相将4％～7％的蔗糖酯溶于含10％吐温80和10％聚氧乙烯蓖麻油衍生物水溶液，然后与抗原溶液按照1:2.5～3的比例构成；所述抗原溶液是将坏死梭杆菌经过坏死梭杆菌传代培养培养基传代，坏死梭杆菌扩大培养培养基放大培养后，进行浓缩，灭活得到每毫升菌液菌数不低于4×10¹⁰CFU的菌液，

所述坏死梭杆菌传代培养培养基为牛脑心浸液培养基；所述坏死梭杆菌扩大培养培养基为改良的心脑浸液培养基，

所述改良的心脑浸液培养基的配方如下：牛脑浸出液100ml，牛心浸出液100ml，胨20g，酵母浸出粉3g，胰酪蛋白胨10g，亚硫酸钠0.1g，葡萄糖2g，半胱氨酸0.5g，氯化钠5g，磷酸氢二钠2.5g，氯化血红素0.5mg/ml、1ml，1％维生素K11ml，蒸馏水加至1000ml，pH7.6-7.8。

2.根据权利要求1所述的牛羊腐蹄病油乳剂疫苗，其特征在于，由油相与水相按重量份比为2∶1，终浓度为0.01％硫柳汞溶液构成，其中，所述油相由高压灭菌的药用白油、10％的Span-80白油混合液、10％的甘露醇单油酸酯白油混合液按照2∶1∶1的比例构成；所述水相将5.7％的蔗糖酯溶于含10％吐温80和10％聚氧乙烯蓖麻油衍生物水溶液，然后与抗原溶液按照1:2.8的比例构成。

3.一种如权利要求1～2之一所述的牛羊腐蹄病油乳剂疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)生产用种子的制备：采用坏死梭杆菌传代培养培养基先将坏死梭杆菌进行一级种子繁殖，鉴定合格后，再进行二级种子繁殖得到二级种子；

(2)抗原溶液的制备：在发酵罐内的坏死梭杆菌扩大培养培养基中按培养基总量的5～10％接种二级种子培养，收获菌液，取样进行纯粹检验，应纯粹，同时作活菌计数，活菌数应不低于4×10⁹CFU；然后菌液浓缩，使每毫升菌液菌数不低于4×10¹⁰CFU；再灭活；

(3)油相的制备：将高压灭菌的药用白油、10％的Span-80白油混合液、10％的甘露醇单油酸酯白油混合液按照1.8～2.2∶1∶1的比例混合,35～38℃水浴片刻，充分摇匀，即得油相；

(4)水相的制备：将5％～6％的蔗糖酯溶于含10％吐温80和10％聚氧乙烯蓖麻油衍生物水溶液，然后与抗原溶液按照1:2.5～3的比例混匀，即得水相；

(5)乳化：将油相与水相按重量份比为2～3∶1进行剪切10～15min后，在终止前加入2％硫柳汞溶液，使其最终浓度为0.005％～0.01％。

4.根据权利要求3所述的牛羊腐蹄病油乳剂疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)种子的制备：将坏死梭杆菌接种于牛脑心浸液培养基中，在37～39℃厌氧培养48小时，取样接种心脑浸液琼脂平板，37～39℃厌氧培养48～96小时，纯粹检验合格后，作为一级种子；取一级种子接种于pH7.6心脑浸液培养基，37～39℃厌氧培养36～48小时，取样做纯粹检验，合格后作为二级种子；

(2)疫苗抗原溶液的制备：将发酵罐内的改良的心脑浸液培养基预热至37～39℃，按培养基总量的5～10％接种二级种子，37～39℃培养10小时；收获菌液，取样进行纯粹检验，应纯粹，同时作活菌计数，活菌数应不低于4×10⁹CFU；用0.22μm的中空纤维超滤器将纯检合格的菌液浓缩，使每毫升菌液菌数不低于4×10¹⁰CFU；调节培养液pH至6.8～7.2，按菌液总量的0.3％加入甲醛溶液，置37℃灭活24小时，期间每隔6～8小时搅拌1次；所述改良的心脑浸液培养基的配方如下：牛脑浸出液100ml，牛心浸出液100ml，胨20g，酵母浸出粉3g，胰酪蛋白胨10g，亚硫酸钠0.1g，葡萄糖2g，半胱氨酸0.5g，氯化钠5g，磷酸氢二钠2.5g，氯化血红素0.5mg/ml、1ml，1％维生素K11ml，蒸馏水加至1000ml，pH7.6-7.8，

(3)油相的制备：将高压灭菌的药用白油、10％的Span-80白油混合液、10％的甘露醇单油酸酯白油混合液按照2∶1∶1的比例混合,37℃水浴片刻,充分摇匀，即得油相；

(4)水相的制备：将5.7％的蔗糖酯溶于含10％吐温80和10％聚氧乙烯40氢化蓖麻油水溶液，然后与疫苗抗原溶液按照1:2.8的比例混匀，即得水相；

(5)乳化：取油相2份放于胶体磨内，慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相1份，加完后再以8000r/min搅拌10～15分钟，在终止搅拌前加入2％硫柳汞溶液，使其最终浓度为0.01％。