CN105102635B

CN105102635B - 肺癌的分类和可行性指数

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Publication number: CN105102635B
Application number: CN201480014749.XA
Authority: CN
Inventors: S·班德拉; D·罗斯; S·萨迪斯; P·韦恩加德
Original assignee: Life Technologies Corp
Current assignee: Life Technologies Corp
Priority date: 2013-03-15
Filing date: 2014-03-14
Publication date: 2020-09-25
Anticipated expiration: 2034-03-14
Also published as: EP2971093A2; US20160265065A1; WO2014144121A2; US20140288116A1; EP3434788B1; EP3434788A1; AU2014227883B2; JP2016515380A; AU2014227883A1; AU2014227883B9; CN105102635A; WO2014144121A3; EP2971093B1; WO2014144121A9

Abstract

本发明提供用于检测来自患有肺癌的受试者的样品中的多种基因和相关变异体的组合物、试剂盒和方法。所述组合物、试剂盒和方法包括一组可杂交以鉴别基因变异体的寡核苷酸，所述寡核苷酸通常是引物和/或探针。本文中所公开的方法提供待测定且随后与可行的治疗建议相关联的肿瘤的突变状态。

Description

肺癌的分类和可行性指数

背景技术

肺癌是男性和女性中癌症死亡的主要病因。其是一种快速生长且高度致命的疾病。接近60％诊断患有肺癌的人在诊断一年内死亡，且约75％在2年内死亡。肺癌有两种主要类型：小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)。约85％的肺癌是NSCLC。NSCLC有3种亚型，其大小、形状和生物化学组成不同。全部肺癌中的约25-30％是鳞状细胞癌。腺癌(例如细支气管肺泡癌)占肺癌的约40％，且通常在肺的外部区域中发现。大细胞未分化癌占全部肺癌的约10-15％。

SCLC和NSCLC以极其不同的方式治疗。SCLC主要用单独或与放射组合的化学疗法治疗。与用于SCLC的治疗相比，手术是治愈NSCLC的唯一可靠方法。淋巴结也被移出以评估癌症的扩散。除了手术之外，化学疗法也可以用于治疗NSCLC。

数量增长的治疗方案变得可用于肺腺癌。然而，在许多情况下，治疗方案各自仅有效对抗具有特定遗传变异的肺癌。因此，可检测许多不同特定可行的遗传变异的测试对肺癌患者将具有显著价值。然而，目前可供使用的多种基因变异性分析所需的组织远超出可从典型肿瘤活检或切除术获得的组织。此外，测试不可用于许多遗传变异，且不存在可基于许多已知可行的遗传变异的全面扫描来推荐治疗的工具。

所公开的组合物、试剂盒和方法提供了利用单个肺癌样品对单个组中的肺癌进行全面基因变异性筛选。所筛选的基因变异体具有可行的治疗或已知对某些治疗并不良好反应。这形成了本文提供的可行的治疗建议框架的基础。

发明内容

本发明提供方法、组合物和试剂盒。在一个实施例中，提供一种为经诊断患有肺癌的受试者确定可行的治疗建议的方法。所述方法包含：从所述受试者获得生物样品；使用一组与以下各者杂交且扩增以下各者的探针来检测至少一种变异体：EGFR、ALK、ROS1、KRAS、BRAF、ERBB2、ERRBB4、MET、RET、FGFR1、FGFR2、FGFR3、DDR2、NRAS、PTEN、MAP2K1、TP53、STK11、CTNNB1、SMAD4、FBXW7、NOTCH1、KIT/PGDFRA、PIK3CA、AKT1和HRAS基因，从而检测至少一种变异体；基于所检测的所述至少一种变异体，为所述受试者确定可行的治疗建议。

所述方法包含：接触来自受试者的生物样品；使用一组与以下各者杂交且扩增以下各者的探针来检测至少一种变异体：EGFR、ALK、ROS1、KRAS、BRAF、ERBB2、ERRBB4、MET、RET、FGFR1、FGFR2、FGFR3、DDR2、NRAS、PTEN、MAP2K1、TP53、STK11、CTNNB1、SMAD4、FBXW7、NOTCH1、KIT/PGDFRA、PIK3CA、AKT1、BRAF和HRAS基因，从而检测至少一种变异体；基于所检测的所述至少一种变异体，为所述受试者确定可行的治疗建议。

在另一实施例中，本发明提供一种为经诊断患有肺癌的受试者确定可行的治疗建议的方法，其包含：使用一组与以下各者杂交且扩增以下各者的探针来检测来自受试者的样品中的至少一种变异体：ALK、ROS1、KRAS、BRAF、ERBB2、MET、RET、FGFR1和KIT/PDGFRA，从而检测至少一种变异体；基于所检测的所述至少一种变异体，为所述受试者确定可行的治疗建议。

在其他实施例中，提供一种测定罹患肺癌的个体对治疗的反应的可能性的方法。所述方法包含：测定从所述个体获得的样品中的至少一种基因变异体的存在或不存在，其中所述至少一种变异体是在EGFR、ALK、ROS1、KRAS、BRAF、ERBB2、ERRBB4、MET、RET、FGFR1、FGFR2、FGFR3、DDR2、NRAS、PTEN、MAP2K1、TP53、STK11、CTNNB1、SMAD4、FBXW7、NOTCH1、KIT/PGDFRA、PIK3CA、AKT1和HRAS基因中，其中至少一种变异体的存在指示所述个体很可能或不大可能对所述治疗有反应，其中所述治疗是选自：克卓替尼，当所检测的所述变异体是ALK融合体、ROS1融合体(EZR、SLC34A2、CD74和/或SDC4)、MET基因扩增时；EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKI)，当所检测的所述变异体是EGFR(L858R、外显子19缺失和/或G719X)时；非EGFR TKI治疗，当所检测的所述变异体是EGFR T790M时；MEK抑制剂，当所检测的所述变异体是KRASG12C/V/D/A/S/R/F、G13C、G13D和/或G12F时；维罗非尼，当所检测的所述变异体是BRAFV600E时；不可逆泛erb抑制剂，当所检测的所述变异体是ERBB2外显子20插入时；和PIC3CA抑制剂，当所检测的所述变异体是PIK3CA(E545K、E545G、E545a、H1047R、E542K和/或H1047L)时。

在另一实施例中，本发明提供一种检测样品中的核酸变异体的方法，其包含获得生物样品；使用引物扩增至少一种选自以下各者的基因：EGFR、ALK、ROS1、KRAS、BRAF、ERBB2、ERRBB4、MET、RET、FGFR1、FGFR2、FGFR3、DDR2、NRAS、PTEN、MAP2K1、TP53、STK11、CTNNB1、SMAD4、FBXW7、NOTCH1、KIT/PGDFRA、PIK3CA、AKT1和HRAS基因，所述引物(a)扩增至少一种选自以下各者的变异体：EGFR(L858R、外显子19缺失、G719X和/或T790M)、KRAS(G12C/V/D/A/S/R/F、G13C、G13D和/或G12F)、BRAF(L597R、D594H/N、V600E)、ERBB2外显子20插入、PIK3CA(E545K、E545G、E545a、H1047R和/或H1047L)；和(b)检测所述样品中所存在的至少一种核酸变异体。

在另一实施例中，公开一种治疗患者的肺腺癌的方法。所述方法包含：测试来自所述患者的肺肿瘤样品中的ALK、ROS1、KRAS、BRAF、ERBB2、MET、RET、FGFR1和KIT/PDGFRA基因中的至少一种中的变异体的存在，且向所述患者投与治疗有效量的治疗，其中所述治疗是：克卓替尼，当所检测的所述变异体是ALK融合体、ROS1融合体(EZR、SLC34A2、CD74和/或SDC4)或MET基因扩增时；EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKI)，当所检测的所述变异体是EGFR(L858R、外显子19缺失和/或G719X)时；MEK抑制剂，当所检测的所述变异体是KRAS G12C/V/D/A/S/R/F、G13C、G13D和/或G12F时；维罗非尼，当所检测的所述变异体是BRAF V600E时；和不可逆泛erb抑制剂，当所检测的所述变异体是ERBB2外显子20插入时。

在另一实施例中，本发明提供一种鉴别符合用克卓替尼、EGFR TKI、或不是EGFRTKI的治疗、MEK抑制剂、维罗非尼或不可逆泛erb抑制剂治疗的条件的患有肺癌的患者的方法，其包含测试来自所述患者的肺肿瘤样品的变异体的存在，所述变异体包含ALK融合体、ROS1融合体(EZR、SLC34A2、CD74和/或SDC4)、EGFR(L858R、外显子19缺失和/或T790M)、KRAS(G12C/V/D/A)，其中所述变异体中的至少一种的存在指示患者符合用所述疗法中的至少一种治疗的条件。

在某些实施例中，本发明还提供一种试剂盒，其包含一组探针，其中所述组的探针特异性地识别基因EGFR、ALK、ROS1、KRAS、BRAF、ERBB2、ERRBB4、MET、RET、FGFR1、FGFR2、FGFR3、DDR2、NRAS、PTEN、MAP2K1、TP53、STK11、CTNNB1、SMAD4、FBXW7、NOTCH1、KIT/PGDFRA、PIK3CA、AKT1和HRAS，且其中所述组的探针可识别并区分所述基因EGFR、ALK、ROS1、KRAS、BRAF、ERBB2、ERRBB4、MET、RET、FGFR1、FGFR2、FGFR3、DDR2、NRAS、PTEN、MAP2K1、TP53、STK11、CTNNB1、SMAD4、FBXW7、NOTCH1、KIT/PGDFRA、PIK3CA、AKT1和HRAS的一种或多种等位基因变异体。

本发明的某些实施例进一步提供一种组合物，其包含一组探针，其中所述组的探针特异性地识别基因EGFR、ALK、ROS1、KRAS、BRAF、ERBB2、ERRBB4、MET、RET、FGFR1、FGFR2、FGFR3、DDR2、NRAS、PTEN、MAP2K1、TP53、STK11、CTNNB1、SMAD4、FBXW7、NOTCH1、KIT/PGDFRA、PIK3CA、AKT1和HRAS，且其中所述组的探针可识别并区分所述基因EGFR、ALK、ROS1、KRAS、BRAF、ERBB2、ERRBB4、MET、RET、FGFR1、FGFR2、FGFR3、DDR2、NRAS、PTEN、MAP2K1、TP53、STK11、CTNNB1、SMAD4、FBXW7、NOTCH1、KIT/PGDFRA、PIK3CA、AKT1和HRAS的一种或多种等位基因变异体。

具体实施方式

本发明提供用于检测患有肺癌的受试者的多种基因和相关变异体的组合物、试剂盒和方法。所述组合物、试剂盒和方法包括一组可杂交以鉴别基因变异体的寡核苷酸，所述寡核苷酸通常是引物和/或探针。本文中所公开的方法提供待测定且随后与可行的治疗建议相关联的肿瘤的突变状态。在某些实施例中，提供用于确定治疗且治疗患有肺癌的受试者的方法。

所公开的组合物、试剂盒和方法的一个优点是能够通过全面地筛选肿瘤样品的多种较高和/或任选地较流行率基因变异来为经诊断患有肺癌的受试者推荐可行的治疗，所述基因变异最有可能对用于受试者的适当临床作用过程具有影响。在某些实施例中，通过确定所公开的基因变异组合的突变状态，所述方法为大于50％的肺腺癌受试者提供可行的治疗建议。这一全面筛选在单组中执行，且因此可利用单个生物样品执行，由此保留有价值的样品。

定义

“肺癌”通常是指利用恶性细胞的大小和外观分类的两种主要类型的肺癌：非小细胞(约80％病例)和小细胞(约20％病例)肺癌。肺腺癌是非小细胞肺癌(NSCLC)的最常见亚型；其他亚型包括鳞状细胞肺癌、细支气管肺泡癌、大细胞癌、类癌瘤、腺样囊性癌症、圆柱瘤和粘液表皮样癌。在一个实施例中，肺癌根据I-IV期分级，其中I为早期且IV为最晚期。

“预后”是指例如总体存活率、长期死亡率和无疾病存活率。在一个实施例中，长期死亡率是指在肺癌诊断之后在5年内的死亡。不过，在1、2或3年内的预后也由于是超出5年的预后而涵盖在内。

其他形式的癌症包括癌瘤、肉瘤、腺癌、淋巴瘤、白血病等，包括实体和淋巴性癌症、头颈癌(例如口腔癌、咽癌和舌癌)、肾癌、乳癌、肾癌、膀胱癌、结肠癌、卵巢癌、前列腺癌、胰脏癌、胃癌、脑癌、头颈癌、皮肤癌、子宫癌、睾丸癌、食道癌和肝癌(liver cancer)(包括肝癌(hepatocarcinoma))；淋巴瘤，包括非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma)(例如伯基特氏(Burkitt's)、小细胞和大细胞淋巴瘤)和霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin'slymphoma)；白血病和多发性骨髓瘤。

术语“标记物”或“生物标记物”是指细胞中所表达的、癌细胞表面上所表达的或与非癌细胞相比由癌细胞所分泌的分子(通常是蛋白质、核酸、碳水化合物或脂质)，且其适用于诊断癌症，用于提供预后，以及用于药物对癌细胞的优选靶向。时常，此类标记物是与非癌细胞相比在肺癌或其他癌症细胞中过度表达的分子，例如相较于正常细胞1倍过度表达、2倍过度表达、3倍过度表达或更多。另外，标记物可以是在癌细胞中不适当地合成的分子，例如与在正常细胞上表达的分子相比含有缺失、添加或突变的分子。可替代地，此类生物标记物是与非癌细胞相比在癌细胞中表达不足的分子，例如1倍表达不足、2倍表达不足、3倍表达不足或更多。另外，标记物可以是在癌症中不适当地合成的分子，例如与在正常细胞上表达的分子相比含有缺失、添加或突变的分子。

熟练的业内人士应了解，标记物可与其他标记物或测试组合用于本文中所公开的用途(例如癌症的预测、诊断或预后)中的任一个。

“生物样品”包括组织切片，如活检和尸检样品，以及为了组织学目的获取的冷冻切片。此类样品包括血液和血液级分或产品(例如血清、血小板、红细胞等)、痰液、支气管肺泡灌洗术、经培养细胞(例如原代培养物、外植体和经转化细胞)、粪便、尿液等。生物样品通常从真核生物体获得，最优选地是哺乳动物，如灵长类动物，例如黑猩猩或人类；牛；犬；猫；啮齿动物，例如豚鼠、大鼠、小鼠；兔；或鸟；爬行动物；或鱼。

“活检”是指移出组织样品以便诊断或预后评估的过程，且是指组织样本自身。所属领域中已知的任何活检技术均可应用于本发明的诊断和预后方法。所应用的活检技术将取决于待评估的组织类型(例如肺等)、肿瘤的大小和类型以及其他因素。代表性活检技术包括(但不限于)切除活检、切取活检、针活检、手术活检和骨髓活检。“切除活检”是指移出整个肿瘤块体，围绕所述肿瘤块体有较小边缘的正常组织。“切取活检”是指从肿瘤内移出楔形组织。通过内窥镜检查或放射照相引导进行的诊断或预后可能需要“核心针活检”或“细针抽吸活检”，其通常从目标组织内获得细胞悬浮液。活检技术例如论述在《哈里森内科学原理》(Harrison's Principles of Internal Medicine),卡斯珀(Kasper)等人编,第16版,2005,第70章,和整个第V部分中。

术语“过度表达(overexpress/overexpression)”或“过度表达的”可互换地指与正常细胞相比通常在癌细胞中以可检测地更大水平翻译或转录的蛋白质或核酸(RNA)。所述术语包括与正常细胞相比因转录、转录后加工、翻译、翻译后加工、细胞定位(例如细胞器、细胞质、细胞核、细胞表面)以及RNA和蛋白质稳定性所致的过度表达。过度表达可以使用检测mRNA(即，RT-PCR、PCR杂交)或蛋白质(即，ELISA、免疫组织化学技术)的常规技术检测。过度表达可以是与正常细胞相比10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。在某些情况下，过度表达是与正常细胞相比1倍、2倍、3倍、4倍或更高水平的转录或翻译。

术语“表达不足(underexpress/underexpression)”或“表达不足的”或“下调”可互换地指与正常细胞相比在癌细胞中以可检测地较低水平翻译或转录的蛋白质或核酸。所述术语包括与对照相比因转录、转录后加工、翻译、翻译后加工、细胞定位(例如细胞器、细胞质、细胞核、细胞表面)以及RNA和蛋白质稳定性所致的表达不足。表达不足可以使用检测mRNA(即，RT-PCR、PCR杂交)或蛋白质(即，ELISA、免疫组织化学技术)的常规技术检测。表达不足可以是与对照相比10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更小。在某些情况下，表达不足是与对照相比1倍、2倍、3倍、4倍或更低水平的转录或翻译。

术语“有差异地表达的”或“有差异地调节的”通常是指与至少一种其他样品相比在一种样品中(在本发明的上下文中通常是与非癌性组织的样品相比在癌症患者中)过度表达(上调)或表达不足(下调)的蛋白质或核酸。

“治疗性治疗”和“癌症疗法”是指化学疗法、激素疗法、放射线疗法、免疫疗法和生物制剂与小分子靶向疗法。

本文中“治疗有效量或剂量”或“足够量或剂量”意指投与其以便产生效应的剂量。确切剂量将取决于治疗目的，且将是由所属领域的技术人员使用已知技术可确定的(参见例如,利伯曼(Lieberman),《医药学剂量形式》(Pharmaceutical Dosage Forms)(第1-3卷,1992)；劳埃德(Lloyd),《医药学混配的艺术、科学和技术》(The Art,Science andTechnology of Pharmaceutical Compounding)(1999)；皮卡(Pickar),《剂量计算》(Dosage Calculations)(1999)；和《雷明顿：医药科学和实践》(Remington:The Scienceand Practice of Pharmacy),第20版,2003,根纳罗(Gennaro)编,利平科特·威廉姆斯和威尔金斯公司(Lippincott,Williams&Wilkins))。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换地使用以指氨基酸残基的聚合物。这些术语适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人造化学模拟剂，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。

术语“氨基酸”是指天然存在和合成的氨基酸、以及以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传码编码的氨基酸、以及后来被修饰的那些氨基酸，例如羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸以及O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在氨基酸相同的基本化学结构(即与氢、羧基、氨基以及R基团结合的α碳)的化合物，例如高丝氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亚砜、蛋氨酸甲基锍。此类类似物具有被修饰的R基团(例如正亮氨酸)或被修饰的肽主链，但保持与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构但以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的化合物。

氨基酸可在本文中以其通常已知的三字母符号或IUPAC-IUB生物化学命名委员会(Biochemical Nomenclature Commission)所推荐的单字母符号提及。同样地，核苷酸可通过其通常接受的单字母代码提及。

关于氨基酸序列，技术人员将认识到改变、添加或缺失编码序列中的单个氨基酸的或较小百分比的氨基酸的核酸、肽、多肽或蛋白质序列的个别取代、缺失或添加是“经保守修饰的变异体”，其中所述变化引起氨基酸经化学上类似的氨基酸取代。提供功能上类似的氨基酸的保守取代表在所属领域中众所周知。所述经保守修饰的变异体另外为且不排除本发明的多晶型变异体、种间同系物和等位基因。

以下八组各自含有彼此是保守取代的氨基酸：1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)。参见例如，克赖顿(Creighton),《蛋白质》(Proteins)(1984)。

当提及蛋白质、核酸、抗体或小分子化合物时，短语“特异性地(或选择性地)结合”是指通常在蛋白质或核酸与其他生物制剂的异质群体中决定蛋白质或核酸(如本发明的差异表达基因)的存在的结合反应。在抗体的情况下，在指定的免疫分析条件下，指定抗体可以至少两倍背景且更通常超过10到100倍背景结合于特定蛋白质。在此类条件下，特异性结合于抗体需要针对其对特定蛋白质的特异性所选择的抗体。举例来说，多克隆抗体可以经选择以仅获得与所选抗原而不与其他蛋白质特异性免疫反应的那些多克隆抗体。这一选择可以通过去掉与其他分子交叉反应的抗体来实现。多种免疫分析形式可以用于选择与特定蛋白质特异性免疫反应的抗体。举例来说，固相ELISA免疫分析常规地用于选择与蛋白质特异性免疫反应的抗体(参见例如，哈洛(Harlow)和莱恩(Lane),《抗体实验指南》(Antibodies,A Laboratory Manual)(1988)关于可以用于测定特异性免疫反应的免疫分析形式和条件的描述)。

在用于调节标记物蛋白的测试化合物的分析的情形下，短语“功能效应”包括测定间接或直接受到本发明的生物标记物的影响的参数，例如化学或表型。因此，功能效应尤其包括配体结合活性、转录活化或抑制、细胞增殖的能力、迁移的能力。“功能效应”包括体外、体内和离体活性。

“测定功能效应”意指针对增大或减小间接或直接受到本发明的生物标记物的影响的参数的化合物的分析，例如测量物理和化学或表型效应。此类功能效应可以通过所属领域的技术人员已知的任何手段测量，例如光谱特征的变化(例如荧光、吸光度、折射率)；水动力(例如形状)、色谱；或蛋白质的溶解度特性；配体结合分析，例如结合于抗体；测量诱导型标记物或标记物的转录活化；测量酶活性的变化；增加或减少细胞增殖、细胞凋亡、细胞周期停滞的能力，测量细胞表面标记物的变化。功能效应可以通过所属领域的技术人员已知的许多手段评估，例如显微镜用于定量或定性测量形态特征的变化，测量在胎盘组织中表达的其他基因的RNA或蛋白质水平的变化，测量RNA稳定性，鉴别下游或报导基因表达(CAT、荧光素酶、P-gal、GFP等)，例如经由化学发光、荧光、比色反应、抗体结合、诱导型标记物等。

标记物的“抑制剂”、“活化剂”和“调节剂”用于指使用癌症生物标记物的体外和体内分析所鉴别的活化性、抑制性或调节性分子。抑制剂是例如结合以部分或完全阻断活性、降低、阻止、延时活化、灭活、钝化或下调癌症生物标记物的活性或表达。“活化剂”是增加、打开、启动、促进、增加活化、敏化、激动或上调癌症生物标记物的活性的化合物，例如激动剂。抑制剂、活化剂或调节剂还包括癌症生物标记物的经基因修饰型式(例如具有改变活性的型式)以及天然存在和合成配体、拮抗剂、激动剂、抗体、肽、环肽、核酸、反义分子、核酶、RNAi和siRNA分子、小有机分子等。针对抑制剂和活化剂的此类分析包括例如在体外、在细胞或细胞提取物中表达癌症生物标记物，施加推定的调节剂化合物，且接着测定对活性的功能效应，如上文所述。

将包含用潜在活化剂、抑制剂或调节剂处理的癌症生物标记物的样品或分析与无抑制剂、活化剂或调节剂的对照样品进行对比来检查抑制程度。指定对照样品(未用抑制剂处理)的相对蛋白质活性值为100％。当活性值相对于对照是约80％、优选地50％、更优选地25-0％时，实现了癌症生物标记物的抑制。当活性值相对于对照(未用活化剂处理)是110％、更优选地150％、更优选地200-500％(即，相对于对照两倍到五倍更高)、更优选地1000-3000％更高时，实现了癌症生物标记物的活化。

如本文所用的术语“测试化合物”或“药物候选物”或“调节剂”或语法等效者描述待针对直接或间接调节癌症生物标记物的能力测试的天然存在或合成的任何分子，例如蛋白质、寡肽(例如长度为约5到约25个氨基酸，优选地长度为约10到20个或12到18个氨基酸，优选地长度为12、15或18个氨基酸)、小有机分子、多糖、肽、环肽、脂质、脂肪酸、siRNA、聚核苷酸、寡核苷酸等。测试化合物可呈测试化合物文库形式，如提供充分多样性范围的组合性或随机化文库。测试化合物任选地与融合搭配物连接，例如靶向化合物、救援化合物、二聚化合物、稳定化合物、可定位化合物和其他功能部分。常规地，具有适用特性的新化学实体通过以下方式生成：鉴别具有一些理想的特性或活性(例如抑制活性)的测试化合物(称为“主导化合物”)，形成主导化合物的变异体，且评估那些变异体化合物的特性和活性。通常，所述分析采用高通量筛选(HTS)方法。

在一些实施例中，提供包括一组探针的试剂盒。“探针(probe或probes)”是指长度为至少八(8)个核苷酸的聚核苷酸，且其因探针中的至少一个序列与目标区域中的序列的互补性而与目标序列形成杂合结构。聚核苷酸可由DNA和/或RNA构成。在某些实施例中，探针经可检测地标记，如本文中更详细地论述。探针的大小可显著变化。一般来说，探针的长度是例如至少8到15个核苷酸。其他探针是例如至少20、30或40个核苷酸长。其他探针稍微更长，为至少例如50、60、70、80、90个核苷酸长。其他探针还更长，且是至少例如100、150、200个或更多个核苷酸长。探针也可以是落在前述范围内的任何特定长度。优选地，探针不含与在聚合酶链反应期间用于引发目标序列的序列互补的序列。

术语“互补”或“互补性”用于提及通过碱基配对规则相关的聚核苷酸(即，核苷酸序列)。举例来说，序列“A-G-T”与序列“T-C-A”互补。互补可以“部分”，其中仅一些核酸的碱基根据碱基配对规则匹配。可替代地，可能存在核酸之间的“完整”或“完全”互补性。核酸链间的互补程度对核酸链间杂交的效率及强度具有显著影响。

“寡核苷酸”或“聚核苷酸”是指单链或双链脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的聚合物，其可以是未经修饰的RNA或DNA或经修饰的RNA或DNA。

“扩增检测分析”是指界定扩增子的引物对和匹配的探针，其中引物对侧接目标核酸区(通常为目标基因)，且其中探针结合于扩增子。

一组探针通常是指一组引物(通常是引物对)和/或可检测标记的探针，其用于检测用于本发明的可行的治疗建议的目标遗传变异。作为一个非限制性实例，用于检测EGFR、ALK、ROS1、KRAS、BRAF、ERBB2、ERRBB4、MET、RET、FGFR1、FGFR2、FGFR3、DDR2、NRAS、PTEN、MAP2K1、TP53、STK11、CTNNB1、SMAD4、FBXW7、NOTCH1、KIT/PGDFRA、PIK3CA、AKT1和HRAS的变异体的一组引物包括至少一个引物和通常一对用于上述基因中的每一种的扩增引物，其用于扩增跨越上述基因中的特定基因变异体区域的核酸区域。作为另一非限制性实例，用于EGFR、ALK、ROS1、KRAS、BRAF、ERBB2、ERRBB4、MET、RET、FGFR1、FGFR2、FGFR3、DDR2、NRAS、PTEN、MAP2K1、TP53、STK11、CTNNB1、SMAD4、FBXW7、NOTCH1、KIT/PGDFRA、PIK3CA、AKT1和HRAS的一组扩增检测分析包括一组引物对和用于上述基因中的每一种的匹配的探针。引物对用于扩增反应以界定跨越上述基因中的每一种的目标遗传变异区域的扩增子。所述组的扩增子通过一组匹配的探针检测。在一个例示性实施例中，本发明是一组TaqMan^TM(加利福尼亚州普莱森顿的罗氏分子系统公司(Roche Molecular Systems,Pleasanton,CA)分析，其用于检测用于本发明的方法的一组目标遗传变异。举例来说，在一个实施例中，本发明是一组Taqman分析，其检测EGFR、ALK、ROS1、KRAS、BRAF、ERBB2、ERRBB4、MET、RET、FGFR1、FGFR2、FGFR3、DDR2、NRAS、PTEN、MAP2K1、TP53、STK11、CTNNB1、SMAD4、FBXW7、NOTCH1、KIT/PGDFRA、PIK3CA、AKT1和HRAS基因。

在一个实施例中，所述组探针是一组用于生成扩增子的引物，所述扩增子通过核酸测序反应(如下一代测序反应)检测。举例来说，在这些实施例中，可使用AmpliSEQ^TM(加利福尼亚州卡尔斯巴德的生命技术/离子激流公司(Life Technologies/Ion Torrent,Carlsbad,CA))或TruSEQ^TM(加利福尼亚州圣地亚哥的伊路米那公司(Illumina,San Diego,CA))技术。

经修饰的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸是指可以代替核酸中天然存在的碱基使用的分子，且包括(但不限于)经修饰嘌呤和嘧啶；稀有碱基；可转化核苷；嘌呤和嘧啶的结构类似物；经标记、经衍生和经修饰的核苷和核苷酸；结合的核苷和核苷酸；序列修饰剂；末端修饰剂；间隔子修饰剂；和具有主链修饰的核苷酸，包括(但不限于)核糖经修饰的核苷酸、氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、膦酰胺酸酯、甲基膦酸酯、甲基亚磷酰胺、甲基膦酰胺酸酯、5'-P-氰基乙基亚磷酰胺、亚甲基膦酸酯、二硫代磷酸酯、肽核酸、非手性和中性核苷酸间键。

在一些实施例中，提供一种包括所提供的一组探针的试剂盒，其中所述组探针特异性地与编码EGFR、ALK、ROS1、KRAS、BRAF、ERBB2、ERRBB4、MET、RET、FGFR1、FGFR2、FGFR3、DDR2、NRAS、PTEN、MAP2K1、TP53、STK11、CTNNB1、SMAD4、FBXW7、NOTCH1、KIT/PGDFRA、PIK3CA、AKT1和HRAS或其突变蛋白质的聚核苷酸杂交。

“杂交(Hybridize/hybridization)”是指核酸之间的结合。杂交的条件可以根据待结合的核酸的序列同源性改变。因此，如果受试核酸之间的序列同源性较高，那么使用严格条件。如果序列同源性较低，那么使用温和条件。当杂交条件严格时，杂交特异性增加，且杂交特异性的这一增加引起非特异性杂交产物的产率的降低。然而，在温和杂交条件下，杂交特异性减小，且杂交特异性的这一减小引起非特异性杂交产物的产率的增加。

“严格条件”是指探针将与其目标子序列(通常在核酸的复杂混合物中)但不与其他序列杂交的条件。严格条件与序列相关，并且会随情况不同而不同。更长序列在更高温度下特异性地杂交。有关核酸杂交的详尽指导可见于迪杰森(Tijssen),《生物化学和分子生物学技术-核酸探针杂交》(Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes),“杂交原理和核酸分析策略综述(Overview ofprinciples of hybridization and the strategy of nucleic oacid assays)”(1993)中。通常，选择严格条件比所定义的离子强度pH值下的特定序列的热熔点(T_m)低约5℃-10℃。T_m是50％的与目标互补的探针与目标序列在平衡(当目标序列过量存在时，在T_m下，在平衡下占据50％探针)下杂交的温度(在所定义的强度、pH值和核浓度下)。严格条件也可以用添加去稳定化剂(如甲酰胺)来达成。对于选择性或特异性杂交，阳性信号是至少两倍背景、优选地10倍背景杂交。例示性严格杂交条件可以如下：50％甲酰胺、5×SSC和1％SDS，在42℃下孵育，或5×SSC、1％SDS，在65℃下孵育，在0.2×SSC和0.1％SDS中在65℃下洗涤。

如果核酸所编码的多肽实质上相同，那么在严格条件下并不彼此杂交的所述核酸仍实质上相同。这在例如使用由遗传密码准许的最大密码简并形成核酸拷贝时出现。在此类情况下，核酸通常在中等严格杂交条件下杂交。例示性“中等严格杂交条件”包括在40％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS的缓冲液中在37℃下杂交，且在1×SSC中在45℃下洗涤。阳性杂交是至少两倍背景。所属领域的技术人员将易于认识到替代杂交和洗涤条件可以用于提供类似严格度的条件。测定杂交参数的其他指导原则提供于许多参考文献例如和《最新分子生物学实验方法汇编》(Current Protocols in Molecular Biology)版中。

核酸之间的杂交可以在DNA分子与DNA分子之间进行，在DNA分子与RNA分子之间杂交，以及在RNA分子与RNA分子之间杂交。

“AKT1”或“AKT”是指人类v-akt鼠类胸腺瘤病毒致癌基因同系物1、转录物变异体1；编码RAC-α丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶的聚核苷酸，且以GenBank寄存号NM_005163.2形式呈现，如2011年4月30日所更新。

“ALK”是指退行性淋巴瘤受体酪氨酸激酶，也被称作退行性淋巴瘤激酶，其是编码属于胰岛素受体超家族的受体酪氨酸激酶的基因。已发现这一基因在包括退行性大细胞淋巴瘤、成神经细胞瘤和非小细胞肺癌的一系列肿瘤中重排、突变或扩增。染色体重排是这一基因中最常见的基因变化，其引起形成肿瘤发生中的多种融合基因，包括ALK(染色体2)/EML4(染色体2)、ALK/RANBP2(染色体2)、ALK/ATIC(染色体2)、ALK/TFG(染色体3)、ALK/NPM1(染色体5)、ALK/SQSTM1(染色体5)、ALK/KIF5B(染色体10)、ALK/CLTC(染色体17)、ALK/TPM4(染色体19)和ALK/MSN(染色体X)。ALK和EML4的易位产生融合蛋白质。一种编码融合蛋白质的聚核苷酸以GenBank寄存号AB274722.1形式呈现，如2008年1月11日所更新。索达(Soda)等人“鉴别非小细胞肺癌中的转化EML4-ALK融合体基因(Identification of thetransforming EML4-ALK fusion gene in non-small-cell lung cancer)”(2007)《自然》(Nature)448(7153):561-566。“EML”是指“棘皮动物微管相关蛋白样4”。

“BRAF”是指原致癌基因B-Raf和v-Raf，也称为丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶B-Raf；编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的聚核苷酸，且以GenBank寄存号NM_004333.4形式呈现，如2011年4月24日所更新。BRAF的变异体包括编码在氨基酸位置594和600处的氨基酸取代的聚核苷酸。“氨基酸取代(amino acid substitution或amino acid substitutions)”意指用另一氨基酸代替亲本多肽序列中的特定位置处的氨基酸。举例来说，取代D594H是指变异体多肽，其中在位置594处的天冬氨酸经组氨酸置换。BRAF的其他变异体多肽包括D594N和V600E。

“EGFR”或“表皮生长因子受体”或“EGFR”是指酪氨酸激酶细胞表面受体且由四种替代转录物(以GenBank寄存号NM_005228.3、NM_201282.1、NM_201283.1和NM_201284.1形式呈现)中的一种编码。EGFR的变异体包括外显子19中的缺失、外显子20中的插入以及氨基酸取代T790M和L858R。

“ERBB2”也称为v-erb-b2有核红血球白血病病毒致癌基因同系物2，是EGFR/ErbB家族的成员，且以GenBank寄存号NM_004448.2形式呈现，如2011年5月1日所更新。ERBB2的变异体包括外显子20中的插入。

“FGFR1”或“成纤维细胞生长因子受体1”也称为fms相关酪氨酸激酶-2和CD331。编码FGFR1蛋白质的九种替代转录物以GenBank寄存号NM_023110.2、NM_001174063.1、NM_001174064.1、NM_001174065.1、NM_001174066.1、NM_001174067.1、NMJH5850.3、NM_023105.2和NM_023106.2形式呈现，均如2011年4月30日所更新。

“HRAS”或“哈维大鼠(Harvey rat)肉瘤病毒致癌基因同系物”由以GenBank寄存号NM_005343.2形式呈现的聚核苷酸编码，如2011年4月17日所更新。HRAS的变异体包括氨基酸取代Q61L和Q61R。

“KRAS”或“柯尔斯顿大鼠(Kirsten rat)肉瘤病毒致癌基因同系物”由以GenBank寄存号NM_004985.3和NM_033360.2形式呈现的两种替代转录物编码。KRAS的变异体包括氨基酸取代G12A/C/D/F/R/V。

“MET”或“MNNG HOS转化基因”编码称为肝细胞生长因子受体的蛋白质，且由以GenBank寄存号NM_000245.2和NM_001127500.1形式呈现的聚核苷酸编码。

“PIK3CA”或“磷脂酰肌醇-4,5-双磷酸酯3-激酶催化亚基α”由以NM_006218.2形式呈现的聚核苷酸编码，如2011年5月1日所更新。PIK3CA的变异体包括氨基酸取代E545A/G/K和H1047L/R。

“RET”或“在转染期间重排”编码受体酪氨酸激酶。染色体重排是这一基因中最常见的基因变化，其引起形成肿瘤发生中的多种融合基因，包括驱动蛋白家族成员5B(“KIF5B”)/RET、含卷曲螺旋域6(“CCDC6”)/RET和核受体辅活化子4(“NCOA4”)/RET。由RET编码的聚核苷酸的代表以NM_020630.4形式呈现。

“ROS1”或“c-Ros受体酪氨酸激酶”属于酪氨酸激酶胰岛素受体基因的果蝇亚科。由ROS1编码的聚核苷酸的代表以NM_002944.2形式呈现，如2013年1月28日最新更新。

“KIT/PDGFRA”是指两种基因。“KIT”也称为“原致癌基因c-Kit”或“酪氨酸-蛋白激酶Kit”编码细胞因子受体。由PDGFA编码的聚核苷酸的代表以NM_000222.2形式呈现。“PDGFA”是编码“α型血小板衍生生长因子受体”的基因。由PDGFA编码的聚核苷酸的代表以NM_006206.4形式呈现。

“突变蛋白质”或“变异体”是指分别通过一个或多个核苷酸或氨基酸的交换、缺失或插入而相对于个体群体中的野生型或最流行形式不同的聚核苷酸或多肽。所交换、缺失或插入的核苷酸或氨基酸的数量可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个，如25、30、35、40、45或50个。术语突变蛋白质还可以涵盖易位，例如编码多肽EML4和ALK的基因的融合。在一些实施例中，提供一种涵盖所提供的一组探针的试剂盒，其中所述组探针特异性地与编码AKT1、ALK、BRAF、ERBB2、EGFR、FGFR1、HRAS、KIT、KRAS、MET、PIK3CA、RET和ROS或其突变蛋白质的聚核苷酸杂交，其中所述组探针区分突变蛋白质，且突变蛋白质包括编码AKT1(E17K)、BRAF(L597R、D594H/N、V600E)、EGFR(L858R、G719X、T790M)、HRAS(Q61L/K/R、G12C/D)、KRAS(G12A/C/D/F/R/V)和PIK3CA(E545A/G/K、H1047L/R)的聚核苷酸中的一种或多种。

“拷贝数”或“拷贝数变异”是指基因组DNA的变化，其产生具有DNA的一个或多个区段的异常拷贝数的细胞。拷贝数变异对应于基因组中某些染色体上已经缺失(拷贝数丢失)或重复(拷贝数增加)的相对较大区域。

“单核苷酸多态性”或“SNP”是指当生物物种成员或人类的成对染色体之间的基因组中的单核苷酸(A、T、G或C)不同时出现的DNA序列变异。

在其他实施例中，两个或更多个探针是引物对。

“引物”或“引物序列”是指与目标核酸序列(例如待扩增的DNA模板)杂交以引发核酸合成反应的寡核苷酸。引物可以是DNA寡核苷酸、RNA寡核苷酸或嵌合序列。引物可含有天然、合成或经修饰的核苷酸。引物长度的上限和下限是凭经验确定的。引物长度的下限是在杂交时与目标核酸在核酸扩增反应条件下形成稳定双螺旋所需的最低长度。极短引物(通常是小于3-4个核苷酸长)并不与目标核酸在此类杂交条件下形成热力学上稳定的双螺旋。上限通常是由目标核酸中除预定核酸序列以外的区域中形成双螺旋的可能性来确定的。一般来说，适合的引物长度在约10到约40个核苷酸长范围内。在某些实施例中，举例来说，引物可以是10-40个、15-30个或10-20个核苷酸长。当置放在适当条件下时，引物能够充当聚核苷酸序列上合成的起始点。

引物将与待拷贝的目标聚核苷酸序列的区域完全或实质上互补。因此，在有助于杂交的条件下，引物将粘接到目标序列的互补区域上。在添加适合的反应物(包括(但不限于)聚合酶、核苷酸三磷酸酯等)后，引物通过聚合试剂延长以形成目标序列的拷贝。引物可以是单链或可替代地可以是部分地双链。

在一些实施例中，提供一种涵盖至少4个引物对和4种可检测标记的探针的试剂盒，其中所述至少4个引物对和所述至少4种可检测标记的探针不是四个引物对中的任一者。在这些非限制性实施例中，4个引物对和4种可检测标记的探针形成4种扩增检测分析。

“检测”、“可检测”和其语法等效者是指测定目标核酸序列的存在和/或量和/或身份的方式。在一些实施例中，检测进行，扩增目标核酸序列。在其他实施例中，目标核酸的测序的特征可以为“检测”目标核酸。连接于探针的标记可以包括所属领域中已知的可以通过例如化学或物理手段检测的多种不同标记中的任一个。可以连接于探针的标记可以包括例如荧光和发光材料。

“扩增(Amplifying/amplification)”和其语法等效者是指目标核酸序列中的至少一部分以模板依赖性方式复制的任何方法，包括(但不限于)线性或指数扩增核酸序列的广泛范围的技术。执行扩增步骤的例示性方式包括连接酶链式反应(LCR)、连接酶检测反应(LDR)、接合继之以Q-复制酶扩增、PCR、引物延伸、链置换扩增(SDA)、超支化链置换扩增、多重置换扩增(MDA)、基于核酸链的扩增(NASBA)、两步多重扩增、滚环扩增(RCA)、重组酶-聚合酶扩增(RPA)(英国剑桥的推斯特克斯公司(TwistDx,Cambridg,UK))和自维持序列复制(3SR)，包括多重型式或其组合，例如(但不限于)OLA/PCR、PCR/OLA、LDR/PCR、PCR/PCR/LDR、PCR/LDR、LCR/PCR、PCR/LCR(也被称作组合链式反应-CCR)等。此类技术的描述可以见于萨姆布鲁克(Sambrook)等人《分子克隆》(Molecular Cloning),第3版；奥苏贝尔(Ausbel)等人；《PCR引物：实验室手册》(PCR Primer:A Laboratory Manual),迪芬巴赫(Diffenbach)编,《冷泉港出版社》(Cold Spring Harbor Press)(1995)；《电子方案图书》(TheElectronic Protocol Book),常生物科学(Chang Bioscience)(2002),苏(Msuih)等人,《临床微生物学》(J.Clin.Micro.)34:501-07(1996)；《核酸方案手册》(The Nucleic AcidProtocols Handbook),R.瑞雷(R.Rapley)编,纽约州托托瓦的胡马纳出版社(HumanaPress,Totowa,N.J.)(2002)以及其他地方。

核酸标记物的分析可以使用所属领域中已知的技术执行，包括(但不限于)序列分析和电泳分析。序列分析的非限制性实例包括马克塞姆-吉尔伯特测序(Maxam-Gilbertsequencing)、桑格测序(Sanger sequencing)、毛细管阵列DNA测序、热循环测序(西尔(Sears)等人,《生物技术》(Biotechniques),13:626-633(1992))、固相测序(齐默曼(Zimmerman)等人,《分子细胞生物学方法》(Methods Mol Cell Biol),3:39-42(1992))、测序伴以质谱如基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF/MS；付(Fu)等人,《自然·生物技术》(Nat.Biotechnol),16:381-384(1998))和杂交测序。奇(Chee)等人,《科学》(Science),274:610-614(1996)；德尔马纳茨(Drmanac)等人,《科学》(Science),260:1649-1652(1993)；德尔马纳茨等人,《自然·生物技术》,16:54-58(1998)。电泳分析的非限制性实例包括平板凝胶电泳(如琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳)、毛细管电泳和变性梯度凝胶电泳。另外，下一代测序方法可以使用商业上可获得的试剂盒和仪器(来自公司如生命技术/离子激流公司PGM或Proton、伊路米那公司HiSEQ或MiSEQ和罗氏公司(Roche)/454下一代测序系统)执行。

在一些实施例中，回应于激发光给出荧光信号的探针的量通常与扩增反应中产生的核酸的量有关。因此，在一些实施例中，荧光信号的量与扩增反应中形成的产物的量有关。在所述实施例中，可以因此通过测量来自荧光指示剂的荧光信号的强度来测量扩增产物的量。

“可检测标记的探针”是指用于扩增反应、通常用于定量或实时PCR分析以及终点分析的分子。所述检测器探针可以用于监测目标核酸序列的扩增。在一些实施例中，扩增反应中所存在的检测器探针适用于监测随时间产生的扩增子的量。此类检测器探针包括(但不限于)5'-核酸外切酶分析(本文所述的

探针(也参见美国专利号5,538,848)各种茎环分子信标(参见例如美国专利号6,103,476和5,925,517以及亚吉(Tyagi)和克拉默(Kramer),1996,《自然·生物技术》14:303-308)、无茎或线性信标(参见例如WO 99/21881)、PNA Molecular Beacons^TM(参见例如美国专利号6,355,421和6,593,091)、线性PNA信标(参见例如库比斯塔(Kubista)等人,2001,SPIE4264:53-58)、非FRET探针(参见例如美国专利号6,150,097)、

/Amplifluor^TM探针(美国专利号6,548,250)、茎环和双螺旋蝎型探针(索利纳斯(Solinas)等人,2001,《核酸研究》(Nucleic Acids Research)29:E96和美国专利号6,589,743)、凸环探针(美国专利号6,590,091)、假结探针(美国专利号6,589,250)、环化子(cyclicon)(美国专利号6,383,752)、MGB Eclipse^TM探针(爱博克生物科学公司(Epoch Biosciences))、发夹探针(美国专利号6,596,490)、肽核酸(PNA)光探针、自组装纳米粒子探针和二茂铁修饰探针，例如描述在美国专利号6,485,901；马哈郎加(Mhlanga)等人,2001,《方法》(Methods)25:463-471；惠特科姆(Whitcombe)等人,1999,《自然·生物技术》.17:804-807；伊萨克森(Isacsson)等人,2000,《分子细胞探针》(MolecularCell Probes).14:321-328；斯万维克(Svanvik)等人,2000,《分析生物化学》(AnalBiochem.)281:26-35；沃尔夫(Wolffs)等人,2001,《生物技术》(Biotechniques)766:769-771；特索卡斯(Tsourkas)等人,2002,《核酸研究》(Nucleic Acids Research).30:4208-4215；里切利(Riccelli)等人,2002,《核酸研究》30:4088-4093；张(Zhang)等人,2002上海(Shanghai).34:329-332；麦克斯维尔(Maxwell)等人,2002,《美国化学学会杂志》(J.Am.Chem.Soc.)124:9606-9612；布劳德(Broude)等人,2002,《生物技术趋势》(TrendsBiotechnol.)20:249-56；黄(Huang)等人,2002,《毒理学化学研究》(Chem.Res.Toxicol.)15:118-126；和余(Yu)等人,2001,美国化学学会杂志14:11155-11161。

检测器探针还可以包括猝灭剂，包括(但不限于)黑洞猝灭剂(生物谷猎头(Biosearch))、爱荷华黑(Iowa Black)(IDT)、QSY猝灭剂(分子探针公司(MolecularProbes))以及二甲氨基偶氮苯甲酰(Dabsyl)和Dabcel磺酸酯/甲酸酯猝灭剂(爱博克公司(Epoch))。

检测器探针还可以包括两个探针，其中例如荧光剂在一个探针上，并且猝灭剂在另一个探针上，其中两个探针在目标上杂交在一起猝灭信号，或其中在目标上杂交通过改变荧光改变了信号特征。检测器探针还可以包含具有SO₃而非羧酸酯基团的荧光素染料的磺酸酯衍生物、荧光素的亚磷酰胺形式、CY 5的亚磷酰胺形式(商业上可例如从安玛西亚公司(Amersham)获得)。在一些实施例中，使用嵌入螯合剂标记，如溴化乙锭、

GreenI(分子探针公司)和

(分子探针公司)，由此允许在不存在检测器探针的情况下实时或终点观测扩增产物。在一些实施例中，实时观测可以包含插入检测器探针并且可以采用基于序列的检测器探针。在一些实施例中，检测器探针在扩增反应中未杂交到互补序列时被至少部分地猝灭，并且在扩增反应中杂交到互补序列时被至少部分地未猝灭。在一些实施例中，本发明教示的检测器探针的Tm是63-69℃，但是应了解，通过本发明教示的引导，常规实验可以产生具有其他Tm的检测器探针。在一些实施例中，探针可以进一步包含各种修改，如小沟结合物(参见例如美国专利号6,486,308)，用于进一步提供所要热力学特征。

在一些实施例中，检测可以基于不同被分析物质之间的迁移速率差异经由多种运动性相关分析技术中的任一种进行。例示性运动性相关分析技术包括电泳、色谱、质谱、沉降(例如梯度离心)、场流分级、多级提取技术等。在一些实施例中，运动性探针可以与扩增产物杂交，且目标核酸序列的身份经由洗脱运动性探针的迁移率依赖性分析技术测定，如例如公开的P.C.T.申请案WO04/46344(罗森布拉姆(Rosenblum)等人)和WO01/92579(文茨(Wenz)等人)所述。在一些实施例中，检测可以通过各种微阵列和相关软件实现，尤其如应用生物系统公司(Applied Biosystems)阵列系统与应用生物系统公司1700化学发光微阵列分析仪和其他商业上可获得的可自昂飞公司(Affymetrix)、安捷伦公司(Agilent)、伊路米那(Illumina)和安玛西亚生物科学公司(Amersham Biosciences)获得阵列系统(也参见格里(Gerry)等人,《分子生物学杂志》(J.Mol.Biol.)292:251-62,1999；德百里斯(DeBellis)等人,《密涅瓦生物技术》(Minerva Biotec)14:247-52,2002；和斯蒂尔斯(Stears)等人,自然·医学《Nat.Med.》9:14045,包括增刊,2003)。还应了解，检测可包含报道基团，其结合到反应产物中，作为经标记引物的一部分或归因于扩增期间经标记dNTP的结合，或例如(但不限于)经由包含报道基团的杂交标签互补序列或经由整体的或连接于反应产物的连接子臂连接于反应产物。未标记反应产物例如使用质谱的检测也在当前教示内容的范围内。

本发明的试剂盒还可包含用于执行本文所述的一种或多种方法的说明和/或本文所述的一种或多种组合物或试剂的描述。说明和/或描述可以呈印刷形式且可以包括于试剂盒插页中。试剂盒还可以包括提供此类说明或描述的互联网位置的书面描述。

在一些实施例中，提供一种包含一组探针和样品的组合物，其中所述组的探针特异性地识别基因AKT1、ALK、BRAF、ERBB2、EGFR、FGFR1、HRAS、KIT、KRAS、MET、PIK3CA、RET和ROS，且其中所述组的探针可以识别且区分基因AKT1、ALK、BRAF、ERBB2、EGFR、HRAS、KRAS、MET、PIK3CA、RET和ROS的一种或多种等位基因变异体。

所公开的基因和变异体的任何组合均可包括于试剂盒和组合物中。举例来说，基因和变异体可以选自可行性指数(AI)类别和变异体流行率的组合，如本文中更详细描述。在这点上，在所公开的组合物和试剂盒的不同实施例中，基因变异体可以选自可行性指数和百分比流行率，所述可行性指数和百分比流行率选自AI2+流行率>1％、AI2+流行率>1％、AI3+流行率>1％、AI1+流行率0.1％-1％、AI2+流行率0.1％-1％、AI3+流行率0.1％-1％和其组合。

在某些实施例中，提供为经诊断患有肺癌的受试者确定可行的治疗建议的方法。其他实施例包括测定罹患肺癌的受试者对治疗的反应的可能性的方法以及治疗患有肺癌的患者的方法。

在所述方法的一个实施例中，肺癌亚型是肺腺癌。在某些实施例中，肺癌亚型是鳞状细胞肺癌。

所述方法包含以下步骤：从患者获得样品，检测相关基因中的至少一种变异体，以及基于所检测的基因变异体确定患者的AI或治疗。

患者样品可以是包括来自受试者的肺癌的核酸的任何身体组织或体液。在某些实施例中，样品将是包含循环肿瘤细胞或无细胞DNA的血液样品。在其他实施例中，样品可以是组织，如肺组织。肺组织可以来自肿瘤组织，并且可以经新鲜冷冻或福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)。在某些实施例中，获得肺肿瘤FFPE样品。

本文提供五个类别的AI。AI1代表基于基因变异体状态对治疗建议有临床共识的类别。AI1的数据源是针对非小细胞肺癌(NSCLC)的美国国家综合癌症网络肿瘤学实施指导原则(National Comprehensive Cancer Network Practice Guidelines in Oncology，NCCN指导原则)(第2.2013版)。如果NCCN指导原则专门推荐基于基因和变异体类型的疗法，那么这一指数经指定。

AI2代表基于基因变异体状态存在针对患者中治疗反应的临床试验或临床病例报导证据的类别。

AI3是其中一种或多种临床试验在进行中的类别，其中基因变异体状态用作入选准则，即，需要特定基因和变异体作为临床试验入选准则的一部分(以便包括或排除)。

AI4是基于基因变异体状态存在治疗反应的临床前证据的类别。所述指数含有经报导以展示出与临床前治疗反应的关联的基因和事件。

AI5是其中靶向疗法可用于异常基因的类别。这一指数是基于对基因和相关变异体的要求，以便疗法被视为可行的。

肺癌变异体基于大于0.1％的流行率优先排序。流行率通过以下方式从肺癌的参考数据集测定：对发现含有本发明中所述的基因变异体中的一种的全部所测试的临床样本进行计数，并且将所述值表示为相对于全部所测试的临床样本的百分比。举例来说，本文中展示了腺癌和鳞状细胞癌中的基因变异体的0.1％到1％的流行率和大于1％的流行率(参见表1和3)，然而，所述百分比范围的任何子组或所述百分比范围以下或以上均可以用于代表与AI相关的其他基因变异体。变异体包括(但不限于)SNP、插入、缺失、易位和拷贝数变异(例如增加或丢失)。

表1

如表1中所示，本文中所公开的基因变异体和相关AI为所有原代肺腺癌中的超过50％提供治疗选择。这一类型的肺癌基因变异体的全面筛选和用于超过50％的肺腺癌患者群体的治疗建议是迄今为止尚不可获得的。本发明提供一种可以在单个分析或组中执行的基因变异体测定的方法，其允许使用从典型肺肿瘤活检或手术切除获得的珍贵的极少样品进行更多的变异体检测。应了解，本文中鉴别的基因和变异体是非限制性实例，且基因和变异体可易于添加或去除以鉴别有价值的患者变异体和治疗选择。另外，可以在本文中提供的方法中检测AI和流行率的任何组合。举例来说，在一个实施例中，可以测定所有AI类别和变异体。在另一实施例中，AI1+流行率>1％、AI2+流行率>1％、AI3+流行率>1％、AI1+流行率0.1％-1％、AI2+流行率0.1％-1％、AI3+流行率0.1％-1％和其任何组合可以在本文中所公开的方法中测定。

取决于所选标记物的流行率百分比和AI类别的组合，本发明为腺癌和鳞状细胞癌群体的许多子组提供治疗选择。如表4-10中所示，通过选择AI+流行率％的不同组合，可以为不同百分比的患病群体提供治疗选择(参见实例II)。

本发明进一步基于受试者肿瘤的基因变异体状态为患有肺癌的受试者提供可行的治疗建议。可行的治疗建议可以包括医药治疗剂、手术、光动力疗法(PTD)、激光疗法、放射、饮食指导、临床试验建议等。本文提供的可行的治疗建议(参见表2和3)是例示性的。其他可行的治疗建议可以作为额外数据、出版物、临床报告、治疗添加或去除，且临床试验变得可供使用。另外，其他信息可以用于提供可行的治疗建议，包括(但不限于)年龄、性别、家族病史、生活方式、饮食以及其他相关因素。

在某些实施例中，所述方法包含执行可行的治疗建议。因此，执行可行的治疗建议可以包括(但不限于)投与治疗有效量的一种或多种治疗剂(化学治疗剂、靶向治疗剂、抗血管增生剂等)，实现饮食方案，投与放射和/或入选一项或多项临床试验。

治疗肺癌的化学治疗剂的实例包括：顺铂(Cisplatin)或卡铂(carboplatin)、吉西他滨(gemcitabine)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、多西他赛(docetaxel)、依托泊苷(etoposide)和/或长春瑞滨(vinorelbine)。靶向治疗剂(特异性阻断癌症生长和扩散的药物)包括单克隆抗体，如(但不限于)贝伐单抗(bevacizumab；AVASTIN)和西妥昔单抗(cetuximab)；和酪氨酸激酶抑制剂(TKI)，如(但不限于)吉非替尼(gefitinib，IRESSA^TM)、埃罗替尼(erlotinib，TARCEVA^TM)、克卓替尼(crizotinib)和/或维罗非尼(vemurafenib)。

治疗肺癌的其他化学治疗剂包括(但不限于)TKI：凡德他尼(vandetanib)、托法替尼(tofacitinib)、苹果酸舒尼替尼(sunitinib malate)、索拉非尼(sorafenib)、芦可替尼(ruxolitinib)、瑞格非尼(regorafenib)、普纳替尼(ponatinib)、帕唑帕尼(pazopanib)、尼罗替尼(nilotinib)、来氟米特(leflunomide)、二甲苯磺酸拉帕替尼(lapatinibditosylate)、甲磺酸伊马替尼(imatinib mesilate)、吉非替尼、埃罗替尼、达沙替尼(dasatinib)、克卓替尼、卡博替尼(cabozantinib)、伯舒替尼(bosutinib)、阿西替尼(axitinib)、拉多替尼(radotinib)、替沃扎尼(tivozanib)、马赛替尼(masitinib)、阿法替尼(afatinib)、XL-647、特伯纳尼(trebananib)、提瓦替尼(tivantinib)、SAR-302503、里乐木单抗(rilotumumab)、雷莫芦单抗(ramucirumab)、普替德新(plitidepsin)、帕瑞替尼(pacritinib)、奥兰替尼(orantinib)、尼达尼布(nintedanib)、来那替尼(neratinib)、奈立派姆-S(nelipepimut-S)、二磷酸莫替沙尼(motesanib diphosphate)、米哚妥林(midostaurin)、立尼法尼(linifanib)、乐伐替尼(lenvatinib)、依鲁替尼(ibrutinib)、福他替尼二钠(fostamatinib disodium)、艾帕莫泰(elpamotide)、乳酸多韦替尼(dovitiniblactate)、达可替尼(dacomitinib)、西地尼布(cediranib)、巴瑞替尼(baricitinib)、阿帕替尼(apatinib)、安吉酶(Angiozyme)、X-82、WBI-1001、VX-509、瓦尼替尼(varlitinib)、TSR-011、托维突单抗(tovetumab)、特拉替尼(telatinib)、RG-7853、RAF-265、R-343、R-333、二盐酸喹杂替尼(quizartinib 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Cross))、lck抑制剂(安夫拉公司)、lck抑制剂(安进公司)、lck抑制剂(雅培公司)、薰草菌素A类似物(NIH)、LAT抑制剂(NIH)、L-000021649、KX-2-377、KST-638、KRX-211、KRX-123、KRN-383、KM-2550、kit抑制剂(安夫拉公司)、激酶抑制剂SGX-2、激酶抑制剂SGX-1、激酶抑制剂(甲基基因公司(MethylGene))、激酶抑制剂(安进公司)、激酶抑制剂(赛法隆公司(Cephalon))、KIN-4104、Ki-8751、Ki-20227、Ki-11502、KF-250706、KDR激酶抑制剂(细胞技术公司(Celltech))、KDR激酶抑制剂默克公司(Merck&Co)-2、KDR激酶抑制剂默克公司-1、Kdr激酶抑制剂(安进公司)、KDR抑制剂(雅培公司)、KDR抑制剂、LGLS、K252a、JNJ-38877605、JNJ-26483327、JNJ-17029259、JNJ-141、Janex-1、JAK3抑制剂、药典-2(Pharmacopeia-2)、Jak3抑制剂(波托拉公司(Portola))、JAK2抑制剂(默克公司)、JAK2抑制剂(迪赛弗公司)、JAK2抑制剂(安进公司)、JAK2抑制剂(雅培公司)、JAK2抑制剂CV(赛托皮亚公司(Cytopia))、癌症JAK2抑制剂(赛托皮亚公司)、JAK2抑制剂(阿斯泰克斯公司(Astex))、JAK-3抑制剂(赛尔祖姆公司)、JAK抑制剂(基因泰克公司)、JAK抑制剂(生物晶体公司(BioCryst))、JAK抑制剂(帕默金公司)、JAK 1/3抑制剂(瑞吉尔公司)、ITK抑制剂(葛兰素史克公司(GlaxoSmithKline))、ISU-101、白介素-2诱导型T细胞激酶抑制剂(威泰克斯公司(Vertex))、INSM-18、茵何滨(inherbin)(恩卡姆公司(Enkam))、IMC-1C11、舌下伊马替尼(imatinib)(科德药物公司(Kedem Pharmaceuticals))、IGF-1R抑制剂(艾洛斯特拉公司(Allostera))、IGF-1抑制剂(昂托金公司)、HMPL-010、HM-95091、HM-60781、HM-30XXX系列、Her2/neu和EGFR抗体(支点公司(Fulcrum))、HER2疫苗(免疫前沿公司(ImmunoFrontier))、HER-2结合剂(宝瑞恩公司(Borean))、Her-1/Her-2双重抑制剂(韩美公司)、Her抑制剂(迪赛弗公司)、HEM-80322、HDAC多目标抑制剂(库里斯公司(Curis))、GW-771806、GW-654652、GSK-1838705A、GNE-A、成胶质细胞瘤基因疗法(百健艾迪公司(BiogenIdec))、染料木黄酮基因疗法(UCSD)、焦点粘连激酶抑制剂(奇奈克斯公司)、FMS激酶抑制剂(赛托皮亚公司)、FLT-3单抗(英克隆公司(ImClone))、Flt-3抑制剂(依兰公司(Elan))、Flt 3/4抗癌剂(前哨公司(Sentinel))、FAK/JAK2抑制剂(赛法隆公司)、FAK抑制剂(昂托金公司)、FAK抑制剂(诺华公司)、FAK抑制剂(葛兰素史克公司)、FAK抑制剂(赛托皮亚公司)、EXEL-6309、Etk/BMX激酶抑制剂(超基因公司(SuperGen))、俄布他汀(erbstatin)、erbB-2PNV(UAB)、erbB-2抑制剂(森健特公司(Cengent))、ER-068224、ephrin-B4sol受体(瓦思基因公司(VasGene))、ephrin-B4RTK抑制剂(瓦思基因公司)、EphA2受体酪氨酸激酶抑制剂(辉瑞公司)、ENMD-981693、EHT-102、EHT-0101、EGFR/Her-2激酶抑制剂(盐野义公司(Shionogi))、EGFR-CA、EGFR激酶抑制剂(奇奈克斯公司)、EGF-染料木黄酮(韦恩公司(Wayne))、EGF-593A、EG-3306、DX-2240、DP-4577、DP-4157、DP-2629、DP-2514、达马莫德(doramapimod)、DNX-5000系列、DN-30Fab、二苯胺邻苯二甲酰亚胺、氘化埃罗替尼(康瑟特公司(CoNCERT))、树突状细胞调节剂(安提索玛公司(Antisoma))、DD-2、Jak抑制剂、DD-2、双重Jak3/Syk、DCC-2909、DCC-2157、D-69491、CYT-977、CYT-645、CX-4715、姜黄素类似物(昂克诺瓦公司)、CUDC-107、CT-100、CT-052923、CS-230、CP-724714、CP-673451、CP-564959、CP-292597、CP-127374、Cmpd-1、CL-387785、CKD-712、CHIR-200131、CH-330331、CGP-53716、CGP-52411、CGI-1746、CGEN-B2、CGEN-241、CFAK-Y15、CEP-37440、CEP-33779、CEP-28122、CEP-2563二盐酸盐、CEP-18050、CEP-17940、雷公藤红素(celastrol)、CDP-791、CB-173、癌症疫苗、bcr-abl(默洛金公司(Mologen))、癌症治疗剂(赛法隆公司)、CAB-051、c-Src激酶抑制剂(阿斯利康公司)、c-Met/Her抑制剂(迪赛弗公司(Decipher))、c-Met激酶抑制剂(赛法隆公司)、c-Met抑制剂(罗氏公司)、c-Met抑制剂(默克公司)、c-kit抑制剂(迪赛弗公司)、c-kit抑制剂(细胞公司)、c-Abl抑制剂(普莱克西康公司(Plexxikon))、c-Abl抑制剂(昂克诺瓦公司)、BVB-808、Btk抑制剂(布里斯托尔-迈尔斯·斯奎布公司)、Btk抑制剂、药环-2(Pharmacyclics-2)、BSF-466895、Brk/PTK6抑制剂(默克公司)、BreMel/rGel、BPI-703010、BPI-702001、BP-100-2.01、BMX激酶抑制剂(安夫拉公司)、BMS-817378、BMS-754807备用、BMS-743816、BMS-577098、BLZ-945、BIW-8556、BIO-106、白塞氏疾病疗法(Behcet's disease therapy)、Cr、BAY-85-3474、AZM-475271、AZD-0424、AZ-Takl、AZ-23、Axl激酶抑制剂(超基因公司)、Axl抑制剂(迪赛弗公司)、Axl抑制剂、CRT、AVL-101、AV-412、极光/FLT3激酶抑制剂(Im)、AST-6、AST-487、ARRY-872、ARRY-768、ARRY-470、ARRY-333786、艾皮克西(apricoxib)+EGFR-TKI(特嘉拉公司(Tragara))、AP-23994、AP-23485、抗癌剂(康瑟特公司)、抗癌剂(博莱科公司(Bracco))、抗癌剂Avila-4、抗癌剂Avila-3、抗癌剂Avila-2、抗癌剂ZFP(图尔基因公司(ToolGen))、抗癌剂疗法(阿瑞德公司)、抗癌剂单抗、先科-2(Xencor-2)、抗癌剂单抗(科尔坦公司(Kolltan))、抗血管生成治疗剂(迪赛弗公司)、抗Tie-1单抗(达艾克斯公司(Dyax))、抗PDGF-B单抗(米尔公司(Mill))、消炎剂(奇奈克斯公司)、消炎剂(阿维拉公司(Avila))、消炎治疗剂(维泰公司(Vitae))、抗HER2neu scFv(微麦特公司(Micromet))、抗HER2/Flt3配体(信必公司(Symbi))、抗HER2单抗(艾伯金公司(Abiogen))、抗Fit-1单抗(英克隆公司)、抗fak寡核苷酸、抗-ErbB-2单抗(安龙公司(Enzon))、抗EphA4单抗(医学免疫公司(MedImmune))、抗EGFRvIII单抗(安进公司)、抗EGFR单抗(先科公司(Xencor))、抗EGFR免疫毒素(艾瓦克斯公司(IVAX))、抗CD20/Flt3配体(信必公司)、抗癌配体(恩奇拉公司(Enchira))、抗ALK单抗(麦德姆公司)、血管生成素(瑞金龙公司(Regeneron))、AMG-Jak2-01、AMG-458、AMG-191、ALK抑制剂(药物设计公司(PharmaDesign))、ALK抑制剂(礼来公司)、ALK抑制剂、赛法隆-2、AI-1008、AHNP(支点公司)、AGN-211745、AGN-199659、AG-957、AG-1295、AEE-788和ADL-681。

ErbB酪氨酸激酶抑制剂(ERbB)包括(但不限于)凡德他尼、二甲苯磺酸拉帕替尼、吉非替尼、埃罗替尼、阿法替尼、XL-647、来那替尼、奈立派姆-S、乳酸多韦替尼、达可替尼、瓦尼替尼、RAF-265、PR-610、泊西替尼、KD-020、BMS-690514、AZD-8931、AVX-901、AVL-301、AE-37、AC-480、VM-206、西栗替尼、IDN-6439、HM-61713、依吡替尼、CUDC-101、西帕替尼、Z-650、SN-34003、SN-29966、MT-062、CST-102、ARRY-380、XL-999、凡塔蓝尼、TAK-285、SU-5271、PKI-166、药物开发号4960、药物开发号3624、木利替尼、KSB-102、GW-282974、EMD-55900、CNF-201系列、二盐酸卡奈替尼、癌症疫苗(味之素公司)、乳癌疗法(加拉帕戈斯公司)、BIBX-1382、AZD-4769(阿哥斯公司)、AP-23464、抗HER2/neu模拟剂(赛克拉赛尔公司)、抗HER-2/neu反义(泰克姆公司)、AG-18、ZM-254530、ZD-1838、VEGFR/EGFR抑制剂(安夫拉公司)、VEGF-TK抑制剂(阿斯利康公司)、V-930、RNAi癌症疗法(本尼泰克生物制药公司)、RM-6427、RB-200h、PX-104.1、药物开发号6291、药物开发号6271、药物开发号4164、药物开发号3985、药物开发号3495、培利替尼、PD-169540、PD-166285、PD-154233、PD-153035、泛HER激酶抑制剂、Ambit-2、泛HER抑制剂(苏根公司)、泛HER ACL、ON-045270、NSC-242557、NL-0031、缪勒抑制物质(Ma)、ME-103、激酶抑制剂(安进公司)、JNJ-26483327、ISU-101、INSM-18、茵何滨(恩卡姆公司)、HM-60781、HM-30XXX系列、Her2/neu和EGFR抗体(支点公司)、HER2疫苗(免疫前沿公司)、HER-2结合剂(宝瑞恩公司)、Her-1/Her-2双重抑制剂(韩美公司)、Her抑制剂(迪赛弗公司)、HEM-80322、基因疗法(UCSD)、erbB-2PNV(UAB)、erbB-2抑制剂(森健特公司)、EHT-102、EGFR/Her-2激酶抑制剂(盐野义公司)、EGFR-CA、EGFR激酶抑制剂(奇奈克斯公司)、EGF-593A、二苯胺邻苯二甲酰亚胺、氘化埃罗替尼(康瑟特公司)、D-69491、姜黄素类似物(昂克诺瓦公司)、CUDC-107、CP-724714、CP-292597、CL-387785、CGEN-B2、CAB-051、c-Met/Her抑制剂(迪赛弗公司)、BreMel/rGel、BIO-106、AV-412、AST-6、ARRY-333786、艾皮克西+EGFR-TKI(特嘉拉公司)、抗癌剂(康瑟特公司)、抗癌剂单抗、先科-2、抗HER2neuscFv(微麦特公司)、抗HER2单抗(艾伯金公司)、抗ErbB-2单抗(安龙公司)、抗EGFRvIII单抗(安进公司)、抗EGFR单抗(先科公司)、抗EGFR免疫毒素(艾瓦克斯公司)、抗癌配体(恩奇拉公司)、AHNP(支点公司)、AEE-788和ADL-681。

MEK1或MEK2(MEK)包括(但不限于)曲美替尼(Trametinib)、ARRY-438162、WX-554、司美替尼(Selumetinib)、皮马瑟替(Pimasertib)、E-6201、BAY-86-9766、TAK-733、PD-0325901、GDC-0623、BI-847325、AS-703988、ARRY-704、安卓奎诺尔(Antroquinonol)、CI-1040、SMK-17、RO-5068760、PD-98059和ER-803064。

PIK3CA相关治疗包括(但不限于)：哌立福新(perifosine)、BKM-120、ZSTK-474、XL-765、XL-147、PX-866、PKI-587、皮克立西(pictilisib)、PF-04691502、BYL-719、BEZ-235、BAY-80-6946、PWT-33597、PI3激酶/mTOR抑制剂(礼来公司)、INK-1117、GSK-2126458、GDC-0084、GDC-0032、DS-7423、CUDC-907、BAY-1082439、WX-037、SB-2343、PI3/mTOR激酶抑制剂(安进公司)、mTOR抑制剂/PI3激酶抑制剂、礼来-1、LOR-220、HMPL-518、HM-032、GNE-317、CUDC908、CLR-1401、抗癌剂(普洛吉尼斯公司(Progenies))、抗癌剂疗法、斯菲拉药物-1(Sphaera Pharma-1)、AMG-511、AEZS-136、AEZS-132、AEZS-131、AEZS-129、皮克立西、伴侣诊断剂GDC-0980、伴侣诊断剂GDC-0032、伴侣诊断剂AZD-8055、VEL-015、SF-2523、SF-2506、SF-1126、PX-2000、PKI-179、PI3K p110α抑制剂(Ast)、PI3K抑制剂、赛玛弗-2(Semafore-2)、PI3K抑制剂(英杰公司(Invitrogen))、PI3K抑制剂结合物(赛玛夫公司(Semaf))、PI3K结合物(赛玛佛公司(Semafore))、PI3-不可逆α抑制剂(路径公司(Pathway))、PI3-α/δ抑制剂(路径疗法公司(Pathway Therapeutics))、PI3-α抑制剂(路径疗法公司)、PI3激酶抑制剂(惠氏公司(Wyeth))、PI3激酶抑制剂(泰立克公司(Telik))、PI3激酶α选择性抑制剂(艾克斯卡弗瑞公司(Xcovery))、PI-620、PF-4989216、PF-04979064、PF-00271897、PDK1抑制剂(葛兰素史克公司)、ONC-201、KN-309、同工型选择性PI3a/B激酶抑制剂(赛诺菲公司)、肌醇激酶抑制剂、ICRT、HM-5016699、肝细胞癌疗法(索尼图公司(Sonitu))、GSK-1059615、成胶质细胞瘤疗法(霍夫曼罗氏公司(Hoffmann-La Roche))、EZN-4150、CU-906、CU-903、CNX-1351、抗血栓形成剂(瑟瑞利德公司(Cerylid))、4-甲基蝶啶酮。

针对于ALK的治疗包括(但不限于)：克卓替尼、伴侣诊断剂(艾伯维公司)、克卓替尼、TSR-011、RG-7853、LDK-378、AP-26113、X-396、ASP-3026、NMS-E628、DLX-521、极光激酶+ALK抑制剂(萨勒姆公司)、极光激酶+ALK抑制剂(阿斯利康公司)、ALK抑制剂(阿斯利康公司)、Alk抑制剂、赛法隆-3、ALK抑制剂(奥瑞基因发现技术公司)、LDK-378、伴侣诊断剂、克卓替尼、伴侣诊断剂(罗氏公司)、TAE-684、激酶抑制剂(赛法隆公司)、GSK-1838705A、EXEL-6309、Cmpd-1、CEP-37440、CEP-28122、CEP-18050、癌症治疗剂(赛法隆公司)、抗ALK单抗(麦德姆公司)、ALK抑制剂(药物设计公司)、ALK抑制剂(礼来公司)、ALK抑制剂和赛法隆-2。

针对于RET的治疗包括(但不限于)：凡德他尼、苹果酸舒尼替尼、索拉非尼、瑞格非尼、卡博替尼、SAR-302503、二磷酸莫替沙尼、阿帕替尼、RET激酶抑制剂(拜奥诺米克斯公司)、NMS-173、MG-516、索拉非尼珠粒(生物相容公司)、RET抑制剂、Cell T、MP-371、激酶抑制剂(甲基基因公司)、JNJ-26483327、DCC-2157和AST-487。

因此，这些和其他药剂可单独或组合使用以治疗NSCLC，且可作为如本文中所公开的可行的治疗建议包括在内。

本文还提供针对于测定对治疗的阳性或阴性的反应的可能性和/或基于在受试者样品中检测的基因变异体治疗受试者的方法。参看表2和3，在某些实施例中，可行的治疗建议是指特定治疗。举例来说，肿瘤样品中所存在的EML4-ALK融合体产生使用克卓替尼的治疗建议。相比之下，EGFR T790M突变的存在指示EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKI)将不是适当治疗，因为此变异体使得肿瘤细胞对TKI具有抗性。可行的治疗建议可以用于施以治疗或暂不治疗，取决于受试者肿瘤的变异体状态。

表2

表3

表4

表5

*双突变基因型

表6

*双突变基因型

表7

*双突变基因型

表8

*双突变基因型

表9

*双突变基因型

表10

表11

NSCLC中的高度可行分子目标

表12

报导

在另一方面中，本发明提供指示患有癌症的受试者的预后或治疗反应预测的报导。报导可以例如呈电子或纸质形式。报导可以包括基本患者信息，包括受试者识别符(例如受试者的姓名、社会保障号、医疗保险号或随机生成的号)、受试者的身体特征(例如年龄、体重或性别)、请求医师姓名、生成预后的日期以及样品收集的日期。所报导的预后可以关于特定时间段的存活可能性、对在特定时间段内的某些治疗(例如化学治疗或手术治疗)的反应的可能性和/或癌症复发的可能性。所报导的预后可以呈以下形式：特定时间段存活的百分比机率、对治疗具有利的反应(有利的反应可以定义为例如肿瘤收缩率或肿瘤生长减缓)的百分比机率或经所界定时间段的复发率(例如经五年期间20％存活机率)。在另一实施例中，所报导的预后可以是存活可能性、对治疗的反应或经一段时间的复发率的一般描述。在另一实施例中，所报导否认预后可以呈图式形式。除了基因表达水平和基因变异体/突变之外，所报导的预后还可以考虑受试者的其他特征(例如年龄、癌症阶段、性别、先前治疗、适合度、心血管健康状况和精神健康状况)。

除了预后之外，报导可以任选地包括与相关基因的表达水平或突变状态有关的原始数据。

实例

实例I

基因组学和基因变异体数据从生命技术和概略生物科学公司(LifeTechnologies and Compendia Bioscience)的ONCOMINE^TM Concepts Edition和ONCOMINE^TM Power Tools获得，其是一套网络应用程序和网络浏览器，通过系统收集、管理、本体化和分析来整合和统一高通量癌症剖析数据。另外，突变基因变异体数据还从可获自癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas，TCGA)门户的下一代测序数据的生命技术和概略生物科学公司的管理和分析获得。

从TCGA获得的数据含有来自通过不同基因组测序中心加工和标注的数据集的突变结果。TCGA中表征的所有突变数据是含有特定针对于肿瘤样本且在从同一个体获得的正常组织样本中观察不到的突变变异体的体细胞突变数据。为了获得一致的变异体注解，基于单组转录物和变异体分类规则将从TCGA获得的突变重新标注。标准注解流水线确保突变被一致地评估且在鉴别肺癌基因变异体期间经历共同的解释。在突变注解步骤中，从TCGA获得的突变对照标准转录物组重新标注。这组转录物包括来自2012年2月19日从UCSC获得的hg18和hg19基因组构建物的RefGene转录物。

结合到ONCOMINE Power Tools中的突变数据来源于多个来源，包括桑格研究所(Sanger Institute)的癌症中的体细胞突变目录(Catalogue of Somatic Mutations inCancer；COSMIC)。来源于COSMIC的突变数据保留其原始注解。

基于基因编码序列中的变异体的位置，鉴别多个临床样品中反复出现的基因突变。如果突变是改变所编码氨基酸的编码外显子中的单核苷酸多态性(SNP)，那么推断是错义突变变异体。如果多个样品中的相同基因含有相同SNP，那么此类错义突变基因变异体是反复出现的。如果核苷酸突变是由3个核苷酸可除尽的插入或缺失，那么推断框架插入/缺失突变变异体中的热点。

肺癌中的不同基因中的反复出现的热点错义突变和/或框架插入/缺失突变中的热点的频率通过以下方式表征：对发现含有基因变异体的所有所测试的临床样本进行计数，且将所述值表示为相对于所有所测试的临床样本的百分比。得到肺癌中具有流行热点错义突变的所有基因列表。

肺癌的基因拷贝数数据从ONCOMINE DNA拷贝PowerTool获得。执行最少共同区域分析以鉴别肺癌中的局灶扩增的染色体区域。鉴别2个或更多个样品中含有拷贝增加(>0.9log2拷贝数)的连续染色体区域(共同区域)。在每一共同区域内，鉴别在最高数量样品(n)中异常的基因以及在比最高数量少一个(n-1)中异常的基因。可替代地，鉴别95％的最高数量样品(n)中异常的基因。这些峰值区的频率通过以下方式测定：计算相对于所分析的样品总数具有拷贝增加的样品数量，且将这一值表示为百分比。肺癌中的最流行峰值区通常含有已知癌症基因，如MET、FGFR1、EGFR、ERBB2、KIT/PDGFRA。

进一步研究具有流行热点错义突变、局灶扩增或基因融合的基因变异体以判定其是否具有与可行性指数水平1-3相关的可行性证据。

与AI1相关的基因变异体在针对非小细胞肺癌(NSCLC)的美国国家综合癌症网络肿瘤学实施指导原则(NCCN指导原则)(第2.2013版)中鉴别。此类基因变异体是指导原则提供特定治疗建议的那些。举例来说，推荐肿瘤样本发现含有EGFR L858R变异体的患有肺腺癌的患者考虑用EGFR抑制剂(如埃罗替尼或吉非替尼)治疗。

与AI2相关的基因变异体在公共文献来源中鉴别，如美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information；NCBI)PubMed(含有生物医学文献引用的网络浏览器)。

与AI3相关的基因变异体通过搜索临床试验信息数据库(如ClinicalTrials.Gov和

TrialTrove)的进行中临床试验的入选准则中的匹配基因和变异体类型注解来鉴别。

参看表4-5，本文中所公开的方法为50％的腺癌受试者提供可行的治疗建议。一个由患有原发性肺腺癌的165个患者组成的组通过下一代测序方法表征。将基因变异体映射到这一群体上。观察到大部分患者仅具有单个在整个组以外的偏差。总起来说，约52％的受试者对于至少一种基因变异是阳性的。AI1、AI2和AI3类别组合中的基因变异体流行率展示于表4-8中。

实例II

一个由患有肺鳞状细胞癌的177个患者组成的组通过下一代测序方法表征，且根据实例I的方法，将基因变异体映射到这一群体上。TCGA鳞状细胞癌177个患者组中的AI1、AI2和AI3类别中的基因变异体的流行率展示于表9-10中。

其他基因和其证据水平和对应的可行性展示于表11-12中。

实例III

患者呈现晚期NSCLC。在一组中进行测试以测定表11中的高度可行的NSCLC生物标记物的突变状态以保留有限的肿瘤活检样品。生成概述样品突变状态和对应的可行性指数的报导。基于患者肿瘤的突变状态，测定治疗过程。

应了解，本文中所述的实例和实施例仅为了说明性目的，并且根据其的各种修改或变化应由所属领域的技术人员想到并且包括在本申请案的精神和范围以及所附权利要求书的范围内。本文所引用的所有出版物、专利和专利申请案都出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。

Claims

1.一组靶特异性引物对在制备为经诊断患有肺癌的受试者确定可行的治疗建议的试剂盒中的用途，其中

所述组包含在单个分析中与以下各者杂交且扩增以下各者的多个靶特异性引物对：EGFR、ALK、ROS1、KRAS、BRAF、ERBB2、MET、RET、FGFR1、KIT/PGDFRA、PIK3CA、AKT1和HRAS基因，

其中，所述的确定可行的治疗建议包含：

从所述受试者获得生物样品，

使用所述的一组靶特异性引物对在单个分析中来检测至少一种变异体，

基于所检测的所述至少一种变异体，为所述受试者确定可行的治疗建议。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述肺癌是腺癌或鳞状细胞癌。

3.根据权利要求1所述的用途，其中所述样品是组织。

4.根据权利要求3所述的用途，其中所述组织是肿瘤组织。

5.根据权利要求4所述的用途，其中所述样品是FFPE肿瘤组织样品。

6.根据权利要求1所述的用途，其中所述至少一种变异体是选自ALK融合体、ROS1-EZR融合体、ROS1-SLC34A2融合体、ROS1-CD74融合体、ROS1-SDC4融合体、MET基因扩增、EGFRL858R、EGFR-外显子19缺失、EGFRG719X、EGFR T790M、KRASG12C、KRASG12V、KRASG12D、KRASG12A、KRASG12S、KRASG12R、KRASG12F、KRASG13C、KRASG13D、KRASG12F、BRAFL597R、BRAFD594H、BRAFD594N、BRAFV600E、ERBB2外显子20插入、PIK3CAE545K、PIK3CA E545G、PIK3CAE545a、PIK3CAH1047R、PIK3CAE542K、PIK3CA H1047L和其组合。

7.根据权利要求1所述的用途，其中所述可行的治疗建议是治疗、避免治疗、入选临床试验或其组合的过程。

8.根据权利要求1所述的用途，其进一步包含执行所述可行的治疗建议。

9.根据权利要求1所述的用途，其中所述组的靶特异性引物对进一步包含杂交和扩增ERRBB4、FGFR2、FGFR3、DDR2、NRAS、PTEN、MAP2K1、TP53、STK11、CTNNB1、SMAD4、FBXW7和NOTCH1基因的引物对。

10.根据权利要求1所述的用途，其中所述检测是使用来自根据权利要求20所述的试剂盒的所述组的靶特异性引物对执行的。

11.一组靶特异性引物对在制备为经诊断患有肺癌的受试者确定可行的治疗建议的试剂盒中的用途，其中

所述组包含在单个分析中与以下各者杂交且扩增以下各者的靶特异性引物对：EGFR、ALK、ROS1、KRAS、BRAF、ERBB2、MET、RET、FGFR1、KIT/PGDFRA、PIK3CA、AKT1和HRAS基因，

其中所述的确定可行的治疗建议包含：

使用所述的一组靶特异性引物对在单个分析中来检测来自受试者的样品中的至少一种变异体，

12.根据权利要求1或11所述的用途，其中所述可行的治疗建议是选自

a.克卓替尼，当所检测的所述变异体是ALK融合体、ROS1-EZR融合体、ROS1-SLC34A2融合体、ROS1-CD74融合体、ROS1-SDC4融合体或MET基因扩增时；

b.EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKI)，当所检测的所述变异体是EGFRL858R、EGFR外显子19缺失和/或EGFRG719X时；

c.非EGFR TKI，当所检测的所述变异体是EGFR T790M时；

d.MEK抑制剂，当所检测的所述变异体是KRASG12C、KRASG12V、KRASG12D、KRASG12A、KRASG12S、KRASG12R、KRASG12F、KRASG13C、KRASG13D和/或KRASG12F时；

e.维罗非尼，当所检测的所述变异体是BRAF V600E时；

f.不可逆泛erb抑制剂，当所检测的所述变异体是ERBB2外显子20插入时；和

g.PIC3CA抑制剂，当所检测的所述变异体是PIK3CAE545K、PIK3CAE545G、PIK3CAE545a、PIK3CAH1047R、PIK3CAH1047L时。

13.根据权利要求1或11所述的用途，所述的确定可行的治疗建议进一步包含用所述可行的治疗建议来治疗所述受试者。

14.根据权利要求1所述的用途，其中在所述基因中的至少一种中检测变异体为所有原发性肺腺癌中的至少50％提供可行的治疗建议。

15.一组靶特异性引物对在制备用于测定罹患肺癌的个体对治疗的反应的可能性的试剂盒中的用途，其中

所述组包含在单个分析中与以下各者杂交且扩增以下各者的靶特异性引物对：EGFR、ALK、ROS1、KRAS、BRAF、ERBB2、MET、RET、FGFR1、KIT/PGDFRA、PIK3CA、AKT1和HRAS基因，和

所述的一组靶特异性引物对能够测定从所述个体获得的样品中的所述基因的至少一种变异体的存在或不存在，

其中至少一种变异体的存在指示所述个体很可能或不大可能对所述治疗有反应，

其中所述治疗是选自：

a.克卓替尼，当所检测的所述变异体是ALK融合体、ROS1-EZR融合体、ROS1-SLC34A2融合体、ROS1-CD74融合体和/或ROS1-SDC4融合体、或MET基因扩增时；

c.非EGFR TKI治疗，当所检测的所述变异体是EGFR T790M时；

e.维罗非尼，当所检测的所述变异体是BRAF V600E时；

g.PIK3CA抑制剂，当所检测的所述变异体是PIK3CAE545K、PIK3CAE545G、PIK3CAE545a、PIK3CAH1047R、PIK3CAE542K和/或PIK3CAH1047L时。

16.一组靶特异性引物对在制备用于鉴别符合用克卓替尼、EGFR TKI、或不是EGFR TKI的治疗、MEK抑制剂、维罗非尼或不可逆泛erb抑制剂治疗的条件的患有肺癌的患者的试剂盒中的用途，

其中所述的一组靶特异性引物对能够测试来自所述患者的肺肿瘤样品的变异体的存在，所述变异体包含ALK融合体、ROS1-EZR融合体、ROS1-SLC34A2融合体、ROS1-CD74融合体、ROS1-SDC4融合体、EGFRL858R、EGFR外显子19缺失、EGFRT790M、和KRASG12C、KRASG12V、KRASG12D、KRASG12A，

其中所述的一组靶特异性引物对在单个分析中杂交和扩增来自样品的ALK、ROS、EGFR和KRAS基因，并且在单个分析中来检测所述变异体中的至少一种，

其中所述变异体中的至少一种的存在指示所述患者符合用所述治疗中的至少一种治疗的条件。

17.根据权利要求16所述的用途，其中所述ALK基因融合体同工型是EML4-ALK基因融合体同工型。

18.一种试剂盒，其包含单个组中的一组靶特异性引物对，其中所述组的靶特异性引物对特异性地识别基因AKT1、ALK、BRAF、ERBB2、EGFR、FGFR1、HRAS、KIT、KRAS、MET、PIK3CA、RET和ROS，且其中所述组的靶特异性引物对可识别并区分所述基因AKT1、ALK、BRAF、ERBB2、EGFR、HRAS、KRAS、MET、PIK3CA、RET和ROS的一种或多种肺癌相关联的等位基因变异体。

19.根据权利要求18所述的试剂盒，其中所述等位基因变异体包括编码AKT1E17K、BRAFL597R、BRAFD594H、BRAFD594N、BRAFV600E、EGFRL858R、EGFRG719X、EGFRT790M、HRASQ61L、HRASQ61K、HRASQ61R、HRASG12C、HRASG12D、KRASG12A、KRASG12C、KRASG12D、KRASG12F、KRASG12R、KRASG12V和PIK3CAE545A、PIK3CAE545G、PIK3CAE545K、和PIK3CAH1047L/R的聚核苷酸中的一种或多种。

20.根据权利要求18所述的试剂盒，其中所述等位基因变异体包括编码EGFRL858R、EGFRG719X、EGFRT790M和KRASG12A、KRASG12C、KRASG12D、KRASG12F、KRASG12R和KRASG12V的聚核苷酸中的一种或多种。

21.根据权利要求18所述的试剂盒，其中所述靶特异性引物中的一种或多种经可检测地标记。

22.一种组合物，其包含一组靶特异性引物对，其中所述组的靶特异性引物对特异性地识别基因AKT1、ALK、BRAF、ERBB2、EGFR、FGFR1、HRAS、KIT、KRAS、MET、PIK3CA、RET和ROS，且其中所述组的靶特异性引物对可识别并区分所述基因AKT1、ALK、BRAF、ERBB2、EGFR、HRAS、KRAS、MET、PIK3CA、RET和ROS的一种或多种肺癌相关联的等位基因变异体。

23.根据权利要求22所述的组合物，其进一步包含样品。

24.根据权利要求23所述的组合物，其中所述样品包含来自肿瘤细胞的核酸。

25.根据权利要求1、11或15所述的用途，其中所述基因变异体是选自AI和流行率，所述AI和流行率选自AI1+流行率>1％、AI2+流行率>1％、AI3+流行率>1％、AI1+流行率0.1％-1％、AI2+流行率0.1％-1％、AI3+流行率0.1％-1％和其组合。

26.根据权利要求18所述的试剂盒，其中所述基因变异体是选自AI和流行率，所述AI和流行率选自AI1+流行率>1％、AI2+流行率>1％、AI3+流行率>1％、AI1+流行率0.1％-1％、AI2+流行率0.1％-1％、AI3+流行率0.1％-1％和其组合。

27.根据权利要求22所述的组合物，其中所述基因变异体是选自AI和流行率，所述AI和流行率选自AI1+流行率>1％、AI2+流行率>1％、AI3+流行率>1％、AI1+流行率0.1％-1％、AI2+流行率0.1％-1％、AI3+流行率0.1％-1％和其组合。

28.一种试剂盒，其包含单个组中的一组靶特异性引物对，其中所述组的靶特异性引物对与基因AKT1、ALK、BRAF、ERBB2、EGFR、FGFR1、HRAS、KIT、KRAS、MET、PIK3CA、RET和ROS特异性地杂交，且其中所述组的靶特异性引物对区分所述基因AKT1、ALK、BRAF、ERBB2、EGFR、HRAS、KRAS、MET、PIK3CA、RET和ROS的一种或多种肺癌相关联的等位基因变异体。

29.一种组合物，其包含一组靶特异性引物对，其中所述组的靶特异性引物对与基因AKT1、ALK、BRAF、ERBB2、EGFR、FGFR1、HRAS、KIT、KRAS、MET、PIK3CA、RET和ROS特异性地杂交，且其中所述组的靶特异性引物对区分所述基因AKT1、ALK、BRAF、ERBB2、EGFR、HRAS、KRAS、MET、PIK3CA、RET和ROS的一种或多种肺癌相关联的等位基因变异体。