CN104818320B - 一次性检测肺癌多重基因的引物、探针、检测体系和试剂盒 - Google Patents
一次性检测肺癌多重基因的引物、探针、检测体系和试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种检测肺癌多重基因的引物、探针、检测体系及试剂盒，其中包括用于检测肺癌EGFR基因25种突变、KRAS基因7种突变和BRAF 6种基因突变、NRAS 9种基因突变、HER2 5种基因突变，PIK3CA 2种基因突变以及ALK 5种融合基因、ROS1 13种融合基因和RET 6种融合基因的引物、探针及其分配方式。本发明的检测试剂盒采用12联PCR反应条设计，每一个12联PCR条检测一个样品的多重基因，12联条的1‑4号管内装有相应的融合检测试剂和内控试剂。本发明可以实现一次性检测肺癌的24种融合和54种突变，大大缩短了检测的时间，灵敏度高，特异性强，操作简便快捷，可为临床医生对肺癌患者选择肿瘤靶向药物治疗提供参考。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地涉及肺癌多重基因的引物、探针及检测体系。
背景技术
肺癌是恶性肿瘤中发病率和病死率最高的恶性肿瘤之一，其中非小细胞肺癌(NSCLC)占肺癌的85％左右。随着对肿瘤发病机制及其生物学行为研究的不断深入，人们越来越多的把焦点聚向特异性高、不良反应轻为特点的分子靶向治疗。近几年，在肺癌分子靶向治疗领域，研究热点主要集中在EGFR、ALK、ROS1、KRAS、BRAF等靶点上，这些基因的突变或融合状态与靶向药物的疗效相关，多基因的联合检测可进一步提高预测预后的准确性。然而，目前大多每次只能检测一个突变或一段基因的突变，检测通量低，只能逐个筛查，耗时长。同时，由于晚期患者取材较难，样本量较少，往往不能满足逐个筛查的需要，且临床上尚无能够同时、一次性完成对此9个热点基因进行检测的试剂盒。
本发明提供一种高灵敏度和高特异性的用于一次性检测多重肺癌基因的引物、探针、试剂盒及引物分配方式。该检测试剂盒利用DNA样本进行基因突变和RNA样本进行基因融合的检测，特异性和灵敏度高，检测结果重复性好，而且引入了荧光检测技术，克服了传统PCR产物遗留污染的问题，操作简便快捷，为临床EGFR、ALK、ROS1、RET、KRAS、BRAF、NRAS、HER2、PIK3CA 9种基因突变/融合的检测提供了一种快速可靠的检测方法。该方法可以实现一次性检测肺癌的多重基因，大大缩短了检测的时间，提高了肺癌基因检测的灵敏度和准确率，从而实现指导肺癌临床治疗方案制定及化疗预后。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于一次性检测多重肺癌基因的引物、探针，包括EGFR、BRAF、KRAS、ALK和ROS1等热点基因的引物、探针及分配方式，其序列如表1：
表1 引物、探针以及序列号
E-20-M2-P-HEX
K-EX4-P-C-HEX
本发明的另一目的在于提供检测多重肺癌基因的试剂盒。本试剂盒包括两个部分：RNA融合基因检测和DNA基因突变检测，包含EGFR、KRAS、BRAF、HER2、ALK、ROS1、RET等基因的特异性引物、新型探针，还包括PCR缓冲液、UNG酶等。试剂盒采用12联PCR反应条设计，其中RNA融合基因检测由12联PCR反应条的①-④号管组成，其中①号管由ALK融合基因检测试剂和内控检测试剂组成，②和③号管都由ROS1融合基因检测试剂和内控检测试剂组成，④号管由RET融合基因检测试剂和内控检测试剂组成。①-④号管融合基因检测试剂由FAM信号指示，内控检测试剂用于监控样本RNA质量及加入情况，由HEX(VIC)信号指示；DNA基因突变检测由12联PCR反应条的⑤～号管组成，其中⑤～号管的FAM和HEX信号分别指示EGFR、KRAS、BRAF、NRAS、HER2和PIK3CA的不同基因突变位点，号管由扩增EGFR非突变区的检测试剂组成，用来质控DNA的提取质量，亦由FAM和HEX信号指示。
每一样本检测需要1条12联PCR反应条。本试剂盒组成详见表2和表3。本发明通过一次性对样本DNA中基因突变和RNA中基因融合的检测，指导肺癌临床治疗方案制定和化疗预后。
表2 试剂盒组成
表3 LMG 12联PCR反应条组成成分
表4 试剂盒检测的所有融合类型信息
表5 试剂盒检测的所有突变类型信息
本发明另一方面提供一种用于一次性检测肺癌基因检测的反应体系，具体如下：
①融合基因
DEPC H2O
10×PCR 缓冲液
其中，LMG混合酶A的组成如表6：
表6 LMG混合酶A组成
| 物料 | 浓度 | 用量(μL) |
| Hs-taq酶 | 5U/μL | 0.25-0.30 |
| UNG酶 | 1U/μL | 0.02-0.06 |
| 逆转录酶 | 0.1-1.0 |
优选地，LMG混合酶A的组成为Hs-taq酶0.26μL，UNG酶0.03μL，逆转录酶0.5μL；
②突变基因
H2O
5×PCR 缓冲液
其中，LMG混合酶A的组成如表7：
表7 LMG混合酶B组成
| 物料 | 浓度 | 用量(μL) |
| Hs-taq酶 | 5U/μL | 0.20-0.25 |
| UNG酶 | 1U/μL | 0.02-0.08 |
优选地，LMG混合酶B的组成为Hs-taq酶0.20μL，UNG酶0.05μL。
本发明试剂盒的使用方法包括以下步骤：
1.提取检测样本中的DNA和RNA，包括新鲜病理组织、石蜡包埋组织或石蜡切片、全血、血液、血浆胸腔积液等组织中的DNA和RNA。
2.将DNA和RNA分别按照对应比例与混合酶混合，并加入到12联PCR反应条。
3.根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断检测结果：
本发明的有益效果是：
本发明采用特异性引物和新型探针技术，双色荧光通道检测模式，去除了内控基因，可以检更多的突变基因，涵盖更多基因，共检测ALK,ROS1，RET三个融合基因和EGFR、KRAS、NRAS、BRAF、HER2、PIK3CA六个突变基因，共计24种融合和54种突变。此方法：(1)建立了实时PCR体系，可以一次性检测肺癌多重基因，包括EGFR基因25种突变、KRAS基因7种突变，NRAS 9种和BRAF 6种基因突变、HER25种突变，PIK3CA 2种突变以及ALK 5种融合基因、ROS113种融合基因和RET 6种融合基因(见表4及表5)；可以为临床医生对肺癌患者选择肿瘤靶向药物治疗提供参考。根据各基因突变和各基因融合的发生率，本试剂盒包含的检测位点可覆盖约70％的非小细胞肺癌患者。
本发明根据所检测的多个突变/融合位点的检测难易程度、引物之间的相互影响、竞争等多方面综合因素，将115条序列(包括引物和探针)分组，分装于12联条中，其优点在于：(1)经过分组之后，同组引物之间不会互相干扰；(2)共用的上游或下游引物的设计；使得识别同样多的突变位点(例如n个)，所用的引物条数最少(只需n+1个，而通常需要2n个)，可以节约成本。(3)采用12联条，一次性检测多个突变/融合位点，且建立了12联管各管通用的扩增程序，使各管扩增程序一致、操作一致、可以节约大量时间。(4)12管中含有外控检测体系，作为对试剂、样本DNA质量、样本RNA质量以及操作本身的质控，选择的检测区域是人类基因相对保守的区段，约100bp，这样即便DNA/RNA有降解，外控仍然能够最真实地反应EGFR/KRAS/BRAF/ALK/ROS1基因有效的DNA和RNA量；(5)灵敏度高，对1％的基因突变DNA和50拷贝的融合基因RNA可以检出；(6)特异性强，10ng的野生型基因组DNA和5μg的野生型RNA不会产生非特异性信号；(7)检测时间短，检测过程只需要120分钟即可完成；(8)采用预分装，并进行封蜡处理，可提高运输过程的安全性，同时可使试验过程操作简便。
附图说明
图1为实施例1中各检测质粒的灵敏度图的一部分，其中：
图1-1 ALK融合基因—EML4 exon 13；ALK exon 20
图1-2 ROS1融合基因—CD74 exon 6；ROS1 exon 32
图1-3 RET融合基因—KIF5B exon 16；ROS1 exon 12
图1-4 EGFR基因突变—L861Q
图1-5 KRAS基因突变G12D
图1-6 BRAF基因突变V600E1
图1-7 HER2基因突变G776>VC
图1-8 NRAS基因突变Q61R
图1-9 PIK3CA-M1基因突变H1047R
图2为实施例1中各检测质粒的PCR图的一部分，其中：
图2-1 ALK融合基因—EML4 exon 13；ALK exon 20
图2-2 ROS1融合基因—CD74 exon 6；ROS1 exon 32
图2-3 RET融合基因—KIF5B exon 16；ROS1 exon 12
图2-4 EGFR基因突变—L861Q
图2-5 KRAS基因突变G12D
图2-6 BRAF基因突变V600E1
图2-7 HER2基因突变G776>VC
图2-8 NRAS基因突变Q61R
图2-9 PIK3CA基因突变H1047R
图3为实施例2中临床样本检测结果阳性PCR图的一部分，其中：
图3-1样本1 HER2基因突变
图3-2样本2 A、ALK融合基因；B、ROS1融合基因
图3-3样本3 A、ALK融合基因；B、EGFR基因突变
其中，各图的横坐标均为循环数(cycles)；纵坐标均为荧光值,Fluorescence(dR)。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明进一步阐述。应理解，这些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。除非另有定义或说明，本专利所述的科学技术术语与本领域普通技术人员所理解具有相同的含义。
实施例1
根据Cosmic数据公布的人类EGFR,KRAS,BRA,ALK和ROS1为野生型基因序列，以EGFR,KRAS,BRA,ALK和ROS1的驱动性突变位点及融合位点为基础，来设计特异性引物和新型探针(见表1以及表8)。
表8 各管分布
本实施例分别以EML4 exon 13；ALK exon 20(ALK融合基因)、CD74 exon 6；ROS1exon 32(ROS1融合基因)、KIF5B exon 16；ROS1 exon 12(RET融合基因)、L861Q(EGFR基因突变)、G12D(KRAS基因突变)、V600E1(BRAF基因突变)、G776>VC(HER2基因突变)、Q61R(NRAS基因突变)、H1047R(PIK3CA基因突变)为例来阐述本发明的荧光PCR检测上述肺癌基因。
实验分别用含上述融合基因的装甲RNA及各突变的质粒模板，其荧光PCR检测包括以下步骤：
(一)质粒、装甲RNA处理与提取：
各质粒及装甲RNA的提取采用提取试剂盒进行提取，具体提取操作步骤按试剂盒说明书操作。DNA和RNA提取结束后，立即使用紫外分光光度计检测DNA和RNA浓度与纯度。DNA和RNA OD260/OD280应介于1.8～2.1；RNA浓度应介于50～500 ng/μL。
(二)建立PCR扩增反应体系：
将上述所得模板，用作实时荧光PCR扩增的模板，按照如下扩增体系进行PCR扩增：
①融合基因
DEPC H2O
10×PCR 缓冲液
②突变基因
H2O
5×PCR 缓冲液
实时PCR反应条件为：
第一阶段：42℃5min，95℃5min，1个循环；
第二阶段：95℃25s，64℃20s，72℃20s，10个循环；
第三阶段：93℃25s，60℃35s，72℃20s，36个循环；
信号收集：第三阶段60℃时收集FAM和HEX(或VIC)信号，执行实时PCR，保存文件。
(三)检测结果的判断：根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断检测结果。
1.确认未选择校正荧光参照，按管号顺序依次选择单一检测反应管进行分析，同时选择阳性对照反应管、样本反应管和阴性对照管，然后用户可根据实际情况确定扩增曲线升起的拐点处，得到各反应管的Ct值。
2.阴性对照①～号管的FAM信号和⑤～号管的HEX信号应无扩增曲线升起，若任意一管上述信号有扩增曲线升起，则此次实验结果无效，建议重新检测；若①～④号管的HEX信号和号管的FAM及HEX信号偶尔有扩增曲线升起，此属正常现象，不影响对检测结果的判断。
3.阳性对照的①～号管的FAM、HEX信号应全部都有扩增曲线升起，且Ct值一般小于30，但可能会由于不同阈值设置而发生波动。
4.样本①～④号管ALK、ROS1和RET基因融合阴阳性判定：
(1)样本①～④号管HEX信号扩增曲线：
a)若三管Ct值均≤27，则继续分析；
b)若任意一管Ct值＞27，说明RNA可能存在片段化或降解或抑制剂或漏加，若FAM扩增信号升起且落在阳性区域，实验结果仍然可信，否则建议重新检测或重新提取RNA后再进行检测。
(2)样本①～④号管FAM信号扩增曲线：
a)若①号管FAM信号Ct值＜35，则该样本含有ALK基因融合，否则，不含ALK基因融合；
b)若②或③号管FAM信号Ct值＜35，则该样本含有ROS1基因融合，
否则，不含ROS1基因融合。
c)若④号管FAM信号Ct值＜35，则该样本含有RET基因融合，否则，不含RET基因融合。
5.样本⑤～号管基因突变阴阳性判定(如表9)：
(1)样本号管FAM信号扩增曲线：
a)若20≤号管FAM信号的Ct值≤26，则继续分析；
b)若号管FAM信号的Ct值＜20，说明加入的DNA过量，应减少DNA加入量再进行实验。但突变信号无升起或者落在阴性区，该实验结果仍然可信；
c)若号管FAM信号的Ct值＞26，说明加入的DNA可能存在片段化或降解或抑制剂或漏加，若突变信号有升起且落在强阳区域，实验结果仍然可信，否则建议增加DNA上样量或重新提取DNA后再进行检测。
(2)样本⑤～号管FAM和HEX信号扩增曲线：首先确定样本⑤～号管FAM和HEX信号各自的Ct值，然后确定该样本号管FAM和HEX信号的Ct值。由于样本中突变百分含量各不相同，所得到的突变Ct值也各不相同。根据不同的突变Ct值，把样本检测结果分为阴性、弱阳及强阳。具体判定见表9。
a)当样本突变Ct值大于或等于阴性临界值时，则该样本为阴性或低于本试剂盒的检测下限；
b)当样本突变Ct值小于阴性临界值时，进行下列判断：
i.当某个反应管的突变Ct值小于强阳性临界值时，则该样本为该反应管对应的突变阳性，即强阳；
ii.当反应管的突变Ct值大于或等于强阳性临界值时，则计算该反应管的ΔCt值。若反应管的ΔCt值小于相对应的ΔCt Cut-off值，则该样本也为该反应管对应的突变阳性，即弱阳；反之则为阴性或低于本试剂盒的检测下限。
c)ΔCt值的计算：ΔCt值＝突变Ct值-外控Ct值。突变Ct值是指样本突变信号(FAM或HEX信号)对应的Ct值；外控Ct值是指样本对应的外控信号(FAM或HEX信号)的Ct值。
6.一个样本可能同时含有2个或多个融合或突变类型。
表9 基因突变结果判定
(3)样本5～11号管FAM信号扩增曲线：
首先确定样本5～11号管FAM信号各自的Ct值，然后确定该样本12号管FAM信号的Ct值。由于样本中突变百分含量各不相同，所得到的突变Ct值也各不相同。根据不同的突变Ct值，把样本检测结果分为阴性、弱阳及强阳。具体判定见表9。
灵敏度分析：取经定量后浓度为1000个拷贝的样品RNA/DNA，进行10倍稀释，然后分别对3个浓度进行检测，每次反应加入RNA/5μL DNA。结果表明本发明的荧光PCR方法的灵敏度高，10拷贝DNA基因组即可检出，部分结果如图1。
检测结果表明，本发明的检测体系可以一次性准确检测肺癌多重基因，检测的灵敏度可达到5-10拷贝。
实施例2
运用本发明检测临床样本，2013年12月～2014年10月对1100例临床肺癌石蜡包埋组织样本进行多重肺癌基因突变检测。
一、检测样本DNA和RNA的提取：DNA和RNA的提取可使用厦门艾德生物医药科技有限公司的FFPE样品DNA/RNA共分离试剂盒(闽厦食药监械(准)字2013第1400070号),CatNo.ADx-FF03或QIAGEN石蜡组织DNA提取试剂盒，Cat NO.56404；按照提取试剂盒的说明进行操作。DNA和RNA提取结束后，立即使用紫外分光光度计检测DNA和RNA浓度与纯度。DNA和RNA OD260/OD280应介于1.8～2.1；RNA浓度应介于50～500 ng/μL。将上述提取的DNA和RNA用作肺癌基因的荧光PCR扩增模板。
二、将上述所提各DNA和RNA，分别按照如下扩增体系进行PCR扩增：
①融合基因
DEPC H2O
10×PCR 缓冲液
②突变基因
H2O
5×PCR 缓冲液
实时PCR反应条件为：
第一阶段：42℃5min，95℃5min，1个循环；
第二阶段：95℃25s，64℃20s，72℃20s，10个循环；
第三阶段：93℃25s，60℃35s，72℃20s，36个循环；
信号收集：第三阶段60℃时收集FAM和HEX(或VIC)信号，执行实时PCR，保存文件
三、检测结果的判断：根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断检测结果(判断方法参照实施例1)。
在所检测的1100例的临床样本中，共检出720例突变型，其总突变率达65.5％。其中，检出同时EGFR突变和ALK融合的比例达2.1％，同时ALK融合和ROS1融合的比例为0.3％。此外，采用直接测序法进行100例的突变例对比检测，结果表明本发明体系与直接测序法的符合率达到100％，进一步证明了本发明体系检测的准确性，结果见表2。本发明可检测肺癌多重基因，检测方便快捷，准确性高，可满足肺癌基因快速检测。该荧光PCR方法和传统测序方法结果的符合率为100％，荧光PCR灵敏度和选择性检测能力高于传统测序方法。
表9 本发明检测结果与直接测序法比较
Claims (4)
1.一次性检测肺癌多重基因的引物和探针，包括如下115条序列，且所述的序列分为13组，具体如下：
。
2.一次性检测肺癌基因检测的反应体系，包括
①融合基因
DEPC H2O
10×PCR 缓冲液
其中，LMG混合酶A的组成如下：
②突变基因
H2O
5×PCR 缓冲液
其中，LMG混合酶B的组成如下：
其中，所述的引物和探针如权利要求1所示。
3.如权利要求2所述一次性检测肺癌基因检测的反应体系，其特征在于，加入的LMG混合酶A的组成为Hs-taq酶0.26μL、UNG酶0.03μL、逆转录酶0.5μL；LMG混合酶B的组成为Hs-taq酶0.20μL、UNG酶0.05μL。
4.一种试剂盒，包括权利要求1所述的13组序列的核苷酸，这13组序列分别装入12联管内，其中，反应液①-反应液以及外控分别加入12联管中的一管，而内控加入反应液①-反应液④中。
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