CN105030863A

CN105030863A - 一种蛇床子提取物及其抗肿瘤用途

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Publication number: CN105030863A
Application number: CN201510518713.1A
Authority: CN
Inventors: 张浩杰; 陈鹏
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2015-08-20
Filing date: 2015-08-20
Publication date: 2015-11-11

Abstract

本发明公开了一种蛇床子提取物及其抗肿瘤用途，属于中药领域，具体涉及一种蛇床子提取物及含有该提取物的药物制剂，该蛇床子提取物可以用来制备治疗黑色素瘤的药物。本发明通过对蛇床子药材蒸制处理，生成更多小极性的化合物，增强细胞膜通透性，具有抑制黑色素瘤细胞的作用。本发明提供的液相分析方法可以用于建立该提取物的指纹图谱，用于控制不同产地、批次药材制备的提取物的批间差异性。

Description

一种蛇床子提取物及其抗肿瘤用途

技术领域

本发明涉及中药领域，具体涉及一种蛇床子提取物及含有该提取物的药物制剂，该蛇床子提取物可以用来制备治疗黑色素瘤的药物。

背景技术

植物蛇床子为一年生草本植物，高30～80cm。茎直立，有分枝，表面有纵沟纹，疏生细柔毛。叶互生，2～3回羽头细裂，最终裂片线状披针形，先端尖锐；基生叶有长柄，柄基部扩大成鞘状。复伞形花序顶生或腋生；总苞片8～10，线形；花白色，花柱基短圆锥形，花柱细长，反折。双悬果宽椭圆形，果棱具翅。花期4～7月，果期6～8月。生于原野、田间、路旁、溪沟边等潮湿处。

中药蛇床子为伞形科(Umbelliferae)蛇床属植物蛇床Cnidiummonnieri(L.)Cuss.的干燥成熟果实。蛇床子性温，味辛苦，有小毒。外用燥湿杀虫止痒，内服温肾壮阳，祛风燥湿。用于治疗阳痿，宫冷，寒痹腰痛，外治滴虫性阴道炎，手、足癣感染等。国内外关于蛇床子药理效应的报道很多，涉及免疫、神经、内分泌、心血管、呼吸及生殖等系统，主要表现为抗炎、抗过敏、中枢抑制、抗心律失常及抗肿瘤等作用。

蛇床子主要含香豆素类化合物，此外还有色原酮类和苯并呋喃类化合物。蛇床子挥发油中，相对含量较高的组分主要有倍半萜类，此外还有酯类和萜醇类化合物。大量研究证明蛇床子的有效成分为香豆素类化合物，其中含量最高的两种香豆素类化合物为蛇床子素(Osthole，Ost)、欧前胡素(Imperatorin，Imp)。因此Ost及Imp经常作为评价不同来源地的蛇床子药材的质量及含蛇床子中成药的质控指标。由于Ost具有许多重要的药理活性包括抗癌、抗增殖等活性，以及Imp具有抑制癫痫发作、扩张血管、抑制心肌肥大、抑制肿瘤细胞增殖、抗微生物、影响药物代谢酶活性等多种药理作用，而受到越来越多的关注。

发明内容

本发明的目的在于提供一种蛇床子提取物，该提取物的制备方法和液相分析方法，含有该提取物的药物制剂及利用该提取物制备治疗黑色素瘤药物的用途。

本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：

一种蛇床子提取物，该提取物由以下方法制备：

步骤一：蛇床子药材粉碎，水蒸汽蒸透，烘干；

步骤二：用75％乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味；

步骤三：对步骤二浓缩液依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；

步骤四：正丁醇萃取物用AB-8大孔树脂富集，先用10％乙醇冲洗8个柱体积除去多糖，再用65％乙醇洗脱6个柱体积，收集65％洗脱液，减压浓缩，喷雾干燥。

进一步地，步骤一中蒸制方法为：高压灭菌锅105℃蒸制2小时。

为了能够通过建立HPLC指纹图谱的方法控制不同产地、批次药材制备的蛇床子提取物批间差异，所述提取物的液相分析方法为：

色谱柱：DiamonsilC18柱(4.6mm×250mm，5μm)；

流动相：A为乙腈，B为0.1％磷酸溶液(三乙胺调节pH值至6.5)；

梯度洗脱程序：0.01～70min，A20％→80％；流动相流速：1.0mL·min^-1；

检测波长：240nm；柱温：30℃；进样量10μL。

药物制剂，含有治疗有效量的所述蛇床子提取物和药学上可接受的载体。

所述的蛇床子提取物在制备治疗黑色素瘤的药物中的应用。

所述的药物制剂在制备治疗黑色素瘤的药物中的应用。

本发明提取物用作药物时，可以直接使用，或者以药物制剂的形式使用。

所述药物制剂含有治疗有效量的本发明蛇床子提取物，其余为药物学上可接受的、对人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。

所述的可药用载体或赋形剂是一种或多种选自固体、半固体和液体稀释剂、填料以及药物制品辅剂。将本发明的药物制剂以单位体重服用量的形式使用。本发明提取物可通过口服或注射的形式施用于需要治疗的患者。用于口服时，可将其制成片剂、缓释片、控释片、胶囊、滴丸、微丸、混悬剂、乳剂、散剂或颗粒剂、口服液等；用于注射时，可制成灭菌的水性或油性溶液、无菌粉针、脂质体或乳剂等。

本发明的优点：本发明通过对蛇床子药材蒸制处理，生成更多小极性的化合物，增强细胞膜通透性，具有抑制黑色素瘤细胞的作用；本发明提供的液相分析方法可以用于建立该提取物的指纹图谱，用于控制不同产地、批次药材制备的提取物的批间差异。

附图说明

图1为蛇床子提取物HPLC液相色谱图。

具体实施方式

下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

主要试剂和材料：蛇床子药材购自安徽亳州中药材市场；食品级乙醇购自上海凌峰化学试剂有限公司；医药级AB-8大孔树脂购自天津波鸿树脂有限公司；乙腈为HPLC级，购于TEDIA；85％磷酸为HPLC级，购于TEDIA；色谱用纯净水为哇哈哈纯净水。人A375黑色素瘤细胞株由第三军医大学赠。DMEM培养基、0.25％胰酶购自美国Gibco公司；MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐；四甲基偶氮唑蓝、DMSO(二甲基亚砜)、BrdU购自美国Sigma公司；鼠抗BrdU多克隆抗体购自美国ABcam公司；山羊抗鼠二抗购自美国Cellsignaling公司；AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自美国Promega公司。

恒温CO₂培养箱，普通冰箱，-80℃冰箱均为美国Forma公司；超净工作台购自中国苏州净化工程公司；倒置显微镜，倒置荧光显微镜购自olympus公司；电热恒温培养箱购自中国上海跃进医疗器械厂；自动酶标仪购自日本Wako公司；紫外分光光度仪购自美国Beckman公司；J6-HC高速离心机购自美国Beckman公司；低温微量离心机购自德国Eppendorf公司；振荡摇床购自美国Forma公司。

实施例1：蛇床子提取物制备

取蛇床子药材5kg粉碎，用纱布包裹，置于高压灭菌锅中蒸制2小时，温度105℃，取出置烘干箱中烘干；烘干药材用75％乙醇热回流提取三次，每次提取2小时，每次用75％乙醇15L，合并提取液，浓缩至无醇味(3L)；浓缩液依次用石油醚(3L×3次)、乙酸乙酯(3L×3次)和水饱和的正丁醇(3L×3次)萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；正丁醇萃取物用AB-8大孔树脂富集，先用10％乙醇冲洗8个柱体积除去多糖，再用65％乙醇洗脱6个柱体积，收集65％洗脱液，减压浓缩，喷雾干燥(545g)。

实施例2：液相色谱分析

供试品溶液配制：取实施例1方法制得的提取物5mg至50ml棕色容量瓶中，加30ml20％乙腈水溶液超声溶解，冷却至室温后，继续加20％乙腈水溶液定容。

分析方法：

高效液相色谱仪：Agilent1260，二元泵；

色谱柱：DiamonsilC18柱(4.6mm×250mm，5μm)；

流动相：A为乙腈，B为0.1％磷酸溶液(三乙胺调节pH值至6.5)；

检测波长：240nm；柱温：30℃；进样量10μL。

对用10批不同产地、批次蛇床子制备的提取物进行分析，建立指纹图谱进行匹配，结果1～9号峰在10批样品色谱图中均出现。因此标定9个峰为共有指纹峰，据此建立该提取物的HPLC指纹图谱，结果见图1。

实施例3：蛇床子提取物药理试验

一、试验方法

1、细胞培养

1.1细胞复苏

将冻存在液氮罐中的A375黑色素瘤细胞取出，迅速放入37℃的温水中，轻轻摇动使其尽快融化(大约lmin)。然后吸出细胞悬液，加入到已加有2mL培养基的离心管中，轻轻吹打混匀，800r/min，离心5min，弃去上层培养基。用含有10％FBS和1％的青霉G/链霉素的DMEM培养基8mL制成细胞悬液后，接种至10cm培养盘中。然后置于5％CO₂、37℃恒温培养箱中进行培养。

1.2细胞传代

显微镜下观察细胞融合度达80％-90％时即可进行传代。先用2mLPBS洗涤细胞2次，然后加入0.25％的胰酶lmL。轻轻水平摇动培养盘，使消化液能覆盖细胞的表面，然后置于37℃温箱中消化约lmin。置于显微镜下见细胞变圆回缩，然后迅速加入1mL含有FBS的培养基终止消化。轻轻吹打至细胞分散均匀，然后根据细胞密度按照1:2或1:3传代，重新接种于新的培养盘，于5％CO₂、37℃恒温培养箱中培养。

1.3细胞冻存

取1盘处于对数生长期的细胞，胰酶消化并收集到离心管中，1000r/min离心5min,弃上清。然后加入lmL冻存液，轻轻吹散细胞制成细胞悬液，将细胞悬液加入到1.5mL的冻存管中。在冻存管上标明细胞的名称，保存时间，保存者的姓名。先将冻存管放入4℃冰箱，放置约30min。接着置于-20℃冰箱，放置约2h。然后放于-80℃超低温冰箱中过夜。第二天将冻存细胞置液氮罐中长期保存。

2、细胞计数法绘制细胞生长曲线

(1)取对数生长期A375黑色素瘤细胞，计数，调整细胞密度为2×10⁴/mL。

(2)将细胞悬液接种于12孔板中，1.5mL/孔。

(3)12h后,待细胞贴壁，换1mL无血清DMEM培养基，并分别用5μg/mL蛇床子提取物和DMSO(对于DMSO稀释的蛇床子提取物控DMSO浓度在1/1000以下，确保对细胞无害)处理，每组细胞设3个平行孔，置于5％CO₂、37℃恒温培养箱中进行培养。

(4)分别于0h、24h、48h、72h、96h终止培养，收集各组细胞,加入0.25％胰蛋白酶消化，离心，重悬。

(5)细胞计数：吸取细胞混悬液10μl,加入等体积的台酚蓝区分活细胞，吸取10μL混合液轻轻加入细胞计数板凹槽中，保证无空隙和气泡。倒置显微镜下，计数周边四个大方格内的细胞数，代入公式：原细胞混悬液浓度(细胞数/mL)＝(4个大方格的细胞数/4)×10⁴×稀释倍数。

(6)计算活细胞数目，绘制细胞生长曲线。

3、MTT法检测细胞增殖

(1)取对数生长期的A375细胞，消化，离心，重悬，计数，调整细胞悬液中细胞的密度为2×10⁴/mL。

(2)将各组细胞悬液接种于96孔培养板中，200μL每孔，每组细胞3个平行孔，同时设空白对照孔(只加入培养基)。

(3)12h待细胞贴壁后，换200μL无血清DMEM培养基，并分别用5μg/mL蛇床子提取物和DMSO处理。

(4)分别于0、1、2、3、4天终止培养。

(5)每孔加入浓度为5mg/mL的四甲基偶氮唑蓝20μL继续培养细胞4h。

(6)吸弃各小孔内的培养基，加入200μLDMSO，在微振荡器上振荡10min，使结晶物充分溶解。

(7)以空白对照孔调零，采用自动酶标仪测定各孔570nm处的吸光光度值(OD值)，以对应的OD值表示细胞增殖能力，各组取3个平行孔的平均值，以时间为横轴，以各吸光度值为纵轴绘制细胞生长曲线。

4、BrdU免疫荧光检测细胞增殖

(1)准备爬片：将爬片放入75％酒精中浸泡24h消毒处理。

(2)将无菌爬片放置24孔培养板内，取对数生长期的A375黑色素瘤细胞，消化，离心，制成细胞悬液，2×104cell/孔，接种于放有爬片的孔中。

(3)12h待细胞贴壁后，换1mL无血清DMEM培养基，并分别用5μg/mL蛇床子提取物和DMSO处理。

(4)72h后，在培养基中加入10μlBrdU(1mg/mL),37℃培养1h。

(5)取出24孔板，冷PBS洗5min×2次，4％多聚甲醛固定细胞，室温30min。

(6)PBS洗5min×3次。

(7)2mol/LHCl处理，室温10min后，37℃20min。

(8)细胞用1％Triton×-100通透处理，洗5min×3次。

(9)10％山羊血清封闭，室温，lh。

(10)加入BrdU单克隆抗体(1:300稀释)，37℃1.5h。

(11)l×PBST摇洗5min×3次。

(12)加BrdU二抗(1:300)，室温避光1h后，l×PBST洗3次。

(13)DAPI染色液染细胞核15min。

(14)PBS洗5min×3次。

(15)加1滴抗荧光淬灭封片液，中性树胶封片，荧光显微镜观察、照相。

5、统计分析

应用SPSS17.0统计分析软件，采用两独立样本t检验及单因素方差分析进行数据分析，数据用X±S表示，P<0.05为有统计学意义。

二、数据分析

细胞形态观察及计数显示，与DMSO对照组相比，蛇床子提取物处理A375细胞24h、48h、72h后，活细胞数显著降低达44.5％。结果见表1(*P<0.05,**P<0.01versusDMSOgroup)。

MTT结果显示，蛇床子提取物能显著抑制A375细胞增殖，OD值呈浓度(5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL)依赖性下降达27.3％，差异有统计学意义。结果见表2(*P<0.05,**P<0.01versusDMSOgroup)。

通过BrdU免疫荧光染色进一步证实蛇床子提取物能抑制黑色素瘤细胞增殖，5μg/mL蛇床子提取物处理A375细胞3天后，与对照(26.07±2.59％)相比，实验组BrdU阳性细胞百分比(7.55±2.76％)显著降低(P＝0.000)。

本实验检测了蛇床子提取物对黑色素瘤细胞增殖的影响，细胞计数和MTT分析结果均证明蛇床子提取物可显著抑制黑色素瘤细胞生长，且细胞数与蛇床子提取物浓度呈依赖性下降。BrdU免疫荧光染色也显示蛇床子提取物处理后BrdU阳性细胞百分比显著低于对照组，说明蛇床子提取物可抑制A375黑色素瘤细胞增殖。

表1细胞计数法测定蛇床子提取物对A375黑色素瘤细胞的抑制(×l0⁴/ml)

表2MTT法测定蛇床子提取物对A375黑色素瘤细胞活力的抑制

实施例4：片剂的制备

按实施例1方法先制得提取物，按其与赋形剂重量比为1:8的比例加入赋形剂，制粒压片。

实施例5：口服液的制备

按实施例1方法先制得提取物，按常规口服液制法制成口服液。

实施例6：胶囊剂或颗粒剂的制备

按实施例1方法先制得提取物，按其与赋形剂重量比为1:9的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂。

实施例7：注射液的制备

按实施例1方法制得提取物，加注射用水，精滤，灌封灭菌制成注射液。

实施例8：无菌粉针的制备

按实施例1方法先制得提取物，溶于无菌注射用水中，搅拌使溶，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于安瓿，低温冷冻干燥后无菌熔封得粉针剂。

Claims

1.一种蛇床子提取物，其特征在于所述提取物由以下方法制备：

步骤一：蛇床子药材粉碎，水蒸汽蒸透，烘干；

2.根据权利要求1所述的提取物，其特征在于步骤一中蒸制方法为：高压灭菌锅105℃蒸制2小时。

3.根据权利要求1所述的蛇床子提取物，其特征在于：所述提取物的液相分析方法为：

色谱柱：DiamonsilC18柱(4.6mm×250mm，5μm)；

流动相：A为乙腈，B为0.1％磷酸溶液(三乙胺调节pH值至6.5)；

梯度洗脱程序：0.01～70min，A20％→80％；

流动相流速：1.0mL·min^-1；

检测波长：240nm；柱温：30℃；进样量10μL。

4.药物制剂，其特征在于：所述制剂含有治疗有效量的权利要求1所述的蛇床子提取物和药学上可接受的载体。

5.如权利要求1所述的蛇床子提取物在制备治疗黑色素瘤的药物中的应用。

6.如权利要求4所述的药物制剂在制备治疗黑色素瘤的药物中的应用。