CN105002235B

CN105002235B - 一种利用酶制备葡磷酰胺及其类似物的方法

Info

Publication number: CN105002235B
Application number: CN201510406637.5A
Authority: CN
Inventors: 潘自国; 李宏; 岳昌林; 于自勋; 刘新红
Original assignee: JIANGSU JIUXU PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: JIANGSU JIUXU PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2015-07-10
Filing date: 2015-07-10
Publication date: 2019-02-22
Anticipated expiration: 2035-07-10
Also published as: CN105002235A

Abstract

本发明涉及利用酶制备葡磷酰胺及其类似物的方法，所述方法以糖类及IPM类似物为原料，利用专属酶如β‑D‑葡萄糖苷酶、β‑D‑半乳糖苷酶、β‑D‑甘露糖苷酶、β‑L‑阿拉伯糖苷酶等进行糖苷化反应。其中，糖类可以是单糖如β‑D‑葡萄糖、β‑D‑半乳糖、β‑D‑甘露糖、β‑L‑阿拉伯糖，也可以是低聚糖类如低聚半乳糖等。本发明所述方法中，终产物通过提纯结晶而得到。采用本发明的技术方案能提高反应构型选择性，不需要按常规的多步化学反应，只需要一步酶化反应即得，专属性高，并能提高反应收率。

Description

一种利用酶制备葡磷酰胺及其类似物的方法

技术领域

本发明涉及化合物生物合成领域，具体涉及利用酶制备葡磷酰胺及其类似物的方法。

背景技术

癌症是人类健康的严重威胁，在癌症治疗中，需要用到更多的毒副作用小而疗效好的化学药物，氮芥、鬼臼毒素及磷酸二酰胺等都属于哺乳动物的细胞毒素，但有的因毒性太大，有的难以进入癌细胞，从而影响疗效。异磷酰胺氮芥(Isophosphormide mustard、IPM帕利伐米、N,N'-双-(2-氯乙基)磷酸二酰胺)为环磷酰胺和异环磷酰胺的代谢物，有抗肿瘤活性，但尝试直接使用IPM作为抗癌药，没有成功，因为IPM不稳定，不能将单体用于人体治疗。IPM结构式如下：

专利US5622936描述了IPM和单糖：葡萄糖、半乳糖、甘露糖多聚半乳糖、多聚糖等的反应，首先糖基保护后和IPM反应，再脱保护，成糖苷，如葡磷酰胺、半乳糖-IPM、甘露糖-IPM、多聚糖-IPM。但合成产物纯度不高，一般为含有异构体的混合物。在生物、医药等对异构体纯度要求较高的领域受到严重地限制。其披露的反应历程如下：

糖和IPM的化学合成

葡磷酰胺(Glc-β-IPM)的化学合成方法

但是目前未见利用酶法制备葡磷酰胺及其类似物的制备方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种葡磷酰胺及其类似物的制备方法，是针对上述现有技术中存在的问题而进行的，用以提高反应收率，得到构型单一的化合物。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种利用酶制备葡磷酰胺及其类似物的方法，所述方法的合成路线如下：

其中，R₁、R₂相同或不同，各自独立地表示H、未经取代的C₁～C₄的烷基或卤素，优选R₁、R₂各自独立地表示氯、溴或碘。

其中，所述糖来源于β-D-葡萄糖、β-D-半乳糖、β-D-甘露糖、β-L-阿拉伯糖或低聚糖等，所述低聚糖包括低聚半乳糖等。

其中，所述糖苷酶选自β-D-葡萄糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、β-D-甘露糖苷酶或β-L-阿拉伯糖苷酶等。

进一步地，所述β-D-葡萄糖苷酶来源于米曲霉(Aspergillus oryzae)、桧状青霉(Penicillium piceum)；所述β-D-半乳糖苷酶来源于细菌中的环状芽孢杆菌(B.circulans)、宋氏志贺氏菌(Shigella sonne)、嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)、乳酸菌(Lactobacillus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、黄青霉(P.chrysogenum)、霉菌中的米曲霉(Aspergillus oryzae)、黑曲霉(A.Niger)；热带假丝酵母(Candida tropicalis)；放线菌中的天蓝色链霉菌(S.coelicolor)、酵母中的脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)和乳酸克鲁维酵母(K.lactis)；所述β-D-甘露糖苷酶来源于古细菌热泉高温神袍菌(Thermotoga thermarum)、多形拟杆菌(Bacteroidesthetaiotaomicron)；β-L-阿拉伯糖苷酶来源于灰略红链酶菌(Streptomyces griseus)。

具体而言，本发明所述的方法可包括如下步骤：

(1)按重量份计，将化合物Ⅰ和化合物Ⅱ按5～6：2混合，并向其中加入磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液；

(2)向步骤(1)所得溶液中加入相应的糖苷酶，并置于10～30℃水浴中开始反应，反应结束后超滤机超滤出酶成分，浓缩超滤液，纯化产物，即得葡磷酰胺及其类似物。

本发明所述的上述方法，其中，糖苷酶的加入量为相当于化合物Ⅱ(如IPM)的用量比为1:10～20。

其中，磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液的加入量为使化合物Ⅱ的质量体积比浓度为20％-40％(以g/ml计)，所述缓冲溶液的pH值优选为6.0-7.5。

上述糖苷酶反应可以在10～30℃范围内进行，当使用热稳定的糖苷酶时，可以在更高的反应温度下进行。优选在15～25℃反应10～20h，更优选的，所述酶成糖苷反应的反应温度为20～25℃，反应时间为15～18h。

作为本发明的另一种技术方案，上述糖苷酶反应(步骤2)可以在含有糖苷酶的缓冲溶液内进行，所述糖苷酶由相应酶菌发酵得到的含酶菌体细胞的发酵液提供(缓冲溶液加入含糖苷酶的菌体细胞，所述含酶菌体细胞由糖苷酶菌产生菌发酵得到)，优选所述缓冲溶液的pH为6.0～7.5。

优选的，所述含酶菌体细胞的发酵液通过下述步骤得到：

(1)对糖苷酶产生菌进行种子培养，得到种子菌种；

(2)采用发酵培养基对种子菌种进行发酵产酶培养，得到含酶菌体细胞的发酵液。

其中，糖苷酶产生菌的菌株需要先用斜面培养基进行活化培养获得活化菌种，活化菌种再经种子培养获得种子菌种，再将种子菌种接入到发酵培养基进行发酵产酶培养。上述斜面培养、种子培养及发酵培养均可按照本领域常规方法进行。

优选的，所述种子培养基按g/L计，包括：乳糖5～15，蛋白胨1～10，酵母提取物5～15，NaCl 2～6，X-gal 0.025～0.045，pH 6.5～7.5，琼脂15～25。

发酵培养基按g/L计，包括：乳糖5～15，蛋白胨1～10，酵母提取物5～15，氯化钙0.5～1.5，硫酸锰0.0005～0.001，硫酸镁0.2～0.4，磷酸二氢钾0.01～0.1，硫酸亚铁0.01～0.1，pH6.5～7.5。

上述培养基中，所涉及的所有原料均为已知的市售产品。

上述发酵产酶培养的培养温度可以为15～60℃，摇床转速可以为150～200r/min，培养时间可以为5～20h。

上述缓冲溶液可以为质量浓度为0.2～0.4％的磷酸盐缓冲溶液，所述磷酸盐缓冲溶液中还包括体积分数为1％～5％的乙醇，其中乙醇作为助溶剂，有利于提高化合物II的溶解性。当本发明采用以发酵液的形式提供糖苷酶时，发酵液的用量可依据其中糖苷酶的含量给出，以最终使糖苷酶的加入量为相当于化合物II(如IPM)的用量比为1:10～20。

本发明所述的方法，在酶反应制备生成产物糖苷后，还需要对反应液进行分离纯化，所述分离纯化方法如下：在糖苷反应结束后经柱层析分离纯化得到粗品，粗品经重结晶获得高纯度的产物糖苷，具体的分离操作为本领域的常规技术手段，本发明对此不作特别限定。

利用本发明的方法制备葡磷酰胺及其类似物时，由于不使用有机溶剂，因此能够减少高温反应时有机溶剂的爆炸风险，由于不使用含重金属的催化剂，因此减少了重金属的危害。另外，由于利用酶进行专属化成苷反应，能提高成品的构型选择性，从而提高反应收率，减少杂质的生成。

具体实施方式

下面基于具体实施例来说明本发明的葡磷酰胺及其类似物的制备方法，但本发明并不被限制于所列举的实施例。需要说明的是，本发明中使用的原料β-D-葡萄糖、β-D-半乳糖、β-D-甘露糖、β-L-阿拉伯糖或低聚糖等购自Sigma公司，糖苷化反应酶(β-葡萄糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、β-甘露糖苷酶、β-L-阿拉伯糖苷酶)所用到的微生物购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，IPM购自Syngene公司。高效液相色谱仪为岛津公司所制造，型号为LC-20A。

本发明所述的方法可具体为(实施方式之一)：将IPM及其类似物和所用糖加入含酶菌体细胞(或直接加入糖苷酶)的缓冲溶液中，含酶菌体细胞可由按本发明所述方法得到的含酶菌体细胞的发酵液提供，采用高效液相色谱(High Performance LiquidChromatography，简称HPLC)跟踪转化率，得到含有产物的反应液，反应结束后，超滤机超滤，浓缩(温度不超过30℃)，采用柱层析进行过柱分离，收集含糖苷类组分，浓缩(温度不超过30℃)，得到产物糖苷的粗品，粗品经重结晶后得到产物，采用氢谱、碳谱对产物进行检测，确认产物的结构，并计算含量和摩尔收率。

实施例1

本实施例涉及一种利用酶制备β-D-葡磷酰胺的方法。

具体步骤如下：

(1)称取10g的IPM和25g的β-D-葡萄糖，加入浓度为0.3％的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液(pH6.0)使IPM的质量体积浓度为20％(以g/ml计)；

(2)向步骤(1)所得溶液中加入相当于IPM0.05倍量的β-D-葡萄糖苷酶，并置于20～30℃水浴中开始反应,然后每隔4h取样一次，当β-D-葡萄糖含量为5％以下时，停止反应，超滤机超滤出酶成分，浓缩滤液，纯化产物，经验证核实，所得产物确系β-D-葡磷酰胺。

本实施例中，β-D-葡磷酰胺的产率为85％，纯度为99.2％。

实施例2

本实施例提供了一种β-D-甘露糖-IPM的合成方法，具体如下：

(1)称取10g的IPM和30g的β-D-甘露糖，加入浓度为0.4％的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液(pH6.5)使IPM的质量体积浓度为25％(以g/ml计)；

(2)向步骤(1)所得溶液中加入相当于IPM0.1倍量的β-D-甘露糖苷酶，并置于20～30℃水浴中开始反应,然后每隔4h取样一次，当IPM含量为5％以下时，停止反应，超滤机超滤出酶成分，浓缩滤液，纯化产物，经验证核实，所得产物确系β-D-甘露糖-IPM。

本实施例中，β-D-甘露糖-IPM的产率为76％，纯度为99.4％。

实施例3

本实施例提供了一种β-D-半乳糖-IPM的合成方法，具体如下：

(1)称取10g的IPM和30g的β-D-半乳糖，加入浓度为0.4％的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液(pH7.5)使IPM的质量体积浓度为40％(以g/ml计)；

(2)向步骤(1)所得溶液中加入相当于IPM0.05倍量的β-D-半乳糖苷酶，并置于20～30℃水浴中开始反应,然后每隔4h取样一次，当β-D-半乳糖含量为5％以下时，停止反应，超滤机超滤出酶成分，浓缩滤液，纯化产物，经验证核实，所得产物确系β-D-半乳糖-IPM。

本实施例中，β-D-半乳糖-IPM的产率为80.3％，纯度为99.3％。

实施例4

本实施例提供了一种β-L-阿拉伯糖-IPM的合成方法，具体如下：

(1)称取10g的IPM和25g的β-L-阿拉伯糖，加入浓度为0.2％的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液(pH7.5)使IPM的质量体积浓度为30％(以g/ml计)；

(2)向步骤(1)所得溶液中加入相当于IPM0.06倍量的β-L-阿拉伯糖苷酶，并置于20～30℃水浴中开始反应,然后每隔4h取样一次，当IPM含量为5％以下时，停止反应，超滤机超滤出酶成分，浓缩滤液，纯化产物，经验证核实，所得产物确系β-L-阿拉伯糖-IPM。

本实施例中，β-L-阿拉伯糖-IPM的产率为85.2％，纯度为99.0％。

实施例5

本实施例提供了一种低聚半乳糖-IPM的合成方法，具体如下：

(1)称取10g的IPM和25g的低聚半乳糖，加入浓度为0.2％的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液(pH7.5)使IPM的质量体积浓度为40％(以g/ml计)；

(2)向步骤(1)所得溶液中加入相当于IPM0.07倍量的β-D-半乳糖苷酶，并置于20～30℃水浴中开始反应,然后每隔4h取样一次，当IPM含量为5％以下时，停止反应，超滤机超滤出酶成分，浓缩滤液，纯化产物，经验证核实，所得产物确系低聚半乳糖-IPM。

本实施例中，低聚半乳糖-IPM的产率为87.2％，纯度为98.4％。

实施例6

与实施例1相比，区别点仅在于，本实施例中，步骤(2)为：向步骤(1)所得溶液中加入含有糖苷酶的缓冲溶液进行反应。

其中，糖苷酶由相应酶菌发酵得到的含酶菌体细胞的发酵液提供，所述缓冲溶液的pH为6.0，所述缓冲溶液为质量浓度为0.3％的磷酸盐缓冲溶液，其中含有2％体积的乙醇。

所述含酶菌体细胞的发酵液通过下述步骤得到：

(1)对糖苷酶产生菌进行种子培养，得到种子菌种；

(2)采用发酵培养基对种子菌种进行发酵产酶培养，培养温度为25℃，摇床转速为180r/min，培养时间为12h，得到含酶菌体细胞的发酵液。

其中，种子培养基按g/L计，包括：乳糖10，蛋白胨5，酵母提取物10，NaCl 4，X-gal0.03，pH 7，琼脂20。

发酵培养基按g/L计，包括：乳糖10，蛋白胨8，酵母提取物10，氯化钙1，硫酸锰0.0008，硫酸镁0.3，磷酸二氢钾0.05，硫酸亚铁0.05，pH7。

本实施例中，葡磷酰胺的收率为88.3％，纯度为99.2％。

实施例7

与实施例1相比，区别点仅在于，本实施例中，

糖苷酶由相应酶菌发酵得到的含酶菌体细胞的发酵液提供，所述缓冲溶液的pH为6.0。所述缓冲溶液为质量浓度为0.4％的磷酸盐缓冲溶液，其中含有1％体积的乙醇。

所述含酶菌体细胞的发酵液通过下述步骤得到：

(1)对糖苷酶产生菌进行种子培养，得到种子菌种；

(2)采用发酵培养基对种子菌种进行发酵产酶培养，培养温度为15℃，摇床转速为150r/min，培养时间20h，得到含酶菌体细胞的发酵液。

其中，种子培养基按g/L计，包括：乳糖5，蛋白胨1，酵母提取物5，NaCl 2，X-gal0.025，pH 6.5，琼脂15。

发酵培养基按g/L计，包括：乳糖5，蛋白胨1，酵母提取物5，氯化钙0.5，硫酸锰0.0005，硫酸镁0.2，磷酸二氢钾0.01，硫酸亚铁0.01，pH6.5。

本实施例中，葡磷酰胺的收率为84.2％，纯度为99.0％。

实施例6

与实施例1相比，区别点仅在于，本实施例中，糖苷酶由相应酶菌发酵得到的含酶菌体细胞的发酵液提供，所述缓冲溶液的pH为7.0。所述缓冲溶液为质量浓度为0.3％的磷酸盐缓冲溶液，其中含有5％体积的乙醇。

所述含酶菌体细胞的发酵液通过下述步骤得到：

(1)对糖苷酶产生菌进行种子培养，得到种子菌种；

(2)采用发酵培养基对种子菌种进行发酵产酶培养，培养温度30℃，摇床转速为200r/min，培养时间5h，得到含酶菌体细胞的发酵液。

其中，种子培养基按g/L计，包括：乳糖15，蛋白胨10，酵母提取物15，NaCl 6，X-gal0.045，pH7.5，琼脂25。

发酵培养基按g/L计，包括：乳糖15，蛋白胨10，酵母提取物15，氯化钙1.5，硫酸锰0.001，硫酸镁0.4，磷酸二氢钾0.1，硫酸亚铁0.1，pH7.5。

本实施例中，葡磷酰胺的收率为90.2％，纯度为99.4％。

利用本发明的方法制备葡磷酰胺及其类似物时，由于不大量使用化学合成的方法，减少了重金属催化剂的危害。另外，利用糖苷酶对糖和IPM类似物进行选择性成苷，所以能够减少高温反应时有机溶剂的爆炸风险，提高产品构型的选择性，减少杂质的生成，从而提高反应收率。本发明的制备方法产物单一，工艺简单，适于工业化生产。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的构思和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims

1.一种利用酶制备葡磷酰胺及其类似物的方法，其特征在于，所述方法的合成路线如下：

其中，R₁、R₂相同或不同，各自独立地表示H、未经取代的C₁～C₄的烷基或卤素；

所述糖选自β-D-葡萄糖、β-D-半乳糖、β-D-甘露糖、β-L-阿拉伯糖或低聚糖；

包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：R₁、R₂各自独立地表示氯、溴或碘。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述糖苷酶选自β-D-葡萄糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、β-D-甘露糖苷酶或β-L-阿拉伯糖苷酶。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述β-D-葡萄糖苷酶来源于米曲霉(Aspergillus oryzae)、桧状青霉(Penicillium piceum)；所述β-D-半乳糖苷酶来源于细菌中的环状芽孢杆菌(B.circulans)、宋氏志贺氏菌(Shigella sonne)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、乳酸菌(Lactobacillus)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、黄青霉(P.chrysogenum)、霉菌中的米曲霉(Aspergillus oryzae)、黑曲霉(A.Niger)；热带假丝酵母(Candida tropicalis)；放线菌中的天蓝色链霉菌(S.coelicolor)、酵母中的脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)和乳酸克鲁维酵母(K.lactis)；所述β-D-甘露糖苷酶来源于古细菌热泉高温神袍菌(Thermotogathermarum)、多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron)；β-L-阿拉伯糖苷酶来源于灰略红链酶菌(Streptomyces griseus)。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：按重量计，所述糖苷酶的加入量和化合物Ⅱ的用量比为1:10～20。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述反应在10～30℃范围内进行。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述反应在15～25℃反应10～20h。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述反应的反应温度为20～25℃，反应时间为15～18h。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法步骤(2)在含糖苷酶的缓冲溶液中进行，所述糖苷酶由相应酶菌发酵得到的含酶菌体细胞的发酵液提供。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述缓冲溶液的pH为6.0～7.5。

11.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述含糖苷酶菌体细胞的发酵液通过下述步骤得到：

(1)对糖苷酶产生菌进行种子培养，得到种子菌种；

12.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述种子培养基按g/L计，包括：蛋白胨1～10，酵母提取物5～15，乳糖5～15，NaCl 2～6，X-gal 0.025～0.045，pH 6.5～7.5，琼脂15～25；

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于：所述发酵培养的培养温度为15～60℃，摇床转速为150～200r/min，培养时间为5～20h。