CN105001180B - 一种钙离子选择性螯合剂及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种新型的下式(I)钙离子选择性螯合剂及其制备方法和用途，所述化合物具有优良的抗缺血和抗缺氧的能力，同时，其还作为OATP1B1转运蛋白的转运底物而具备了优良的跨细胞膜能力，对于BAPTA衍生物的研究具有非常重要的意义和潜在价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种药物化合物及其制备方法和用途，更特别地涉及一种新型的钙离子选择性螯合剂及其制备方法和用途，属于药物化学领域。
背景技术
在细胞死亡的多个原因中，缺血、缺氧是人体急性细胞大面积死亡的主要原因，这导致了多种严重疾病的发生，如缺血性中风、心肌梗塞导致脑细胞、心肌细胞死亡等。
近年来，由于科学家的深入研究和大量努力，对于与缺血、缺氧相关的细胞死亡机制的研究也有了一定的进展，这为研制、开发能够避免细胞死亡的药物指引了方向，也提供了理论基础和现实依据。
在细胞死亡过程中，细胞内钙过量在导致细胞死亡一个重要原因。因此，降低细胞内游离钙的浓度，减轻和/或消除钙过量，在理论上可以减轻细胞损伤，从而减少梗塞坏死的程度，这是减少死亡率和致残程度的重要途径。
BAPTA(1,2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N’,N’-四乙酸)是一种无毒的钙离子选择性螯合剂与指示剂，它的螯合单位和EDTA(乙二胺四乙酸)是类似的，同时BAPTA在生理pH下不容易被质子化，也正由于其不受质子的干扰的有点，从而使得它对钙离子的螯合率要远优异于EGTA(乙二醇双-(2-氨基乙基)四乙酸)。
所述BAPTA最初是由1980年Tsien等(Tsien R Y等，Biochemistry，1980,19(11)：2396)在对钙离子最佳选择性结构的基础上向EDTA中引入芳香发色团而得到的，通过苯环的引入而保持了对钙离子的高选择性，在生理条件下可以完全离子化，因而与钙离子络合不受pH值变化的影响，结合钙离子的速度也得以大大提高。
但另一方面，虽然BAPTA是一种性能优良的钙离子络合剂，但也正由于其具有高离解性能，从而使其不能透过细胞膜进入细胞内部发挥药效。为了克服该缺陷，曾经使用微注射法引入细胞，但这只是基础理论研究，实验方法非常困难，使用也极为不便，无法得以实际应用，更有其是无法在医药治疗领域得到应用。
此外，虽然Tsien、杨利苹等多位学者对于BAPTA衍生物进行了一定的研究试图改善其脂溶性，使其更容易透过细胞膜。
此外，CN103288664A公开了一种BAPTA衍生物，该化合物具有良好的各种药物活性抑制作用，例如能够抑制异丙肾上腺引起的血清肌酸激酶活性的升高等，从而可用来治疗多种疾病。
如上所述，虽然现有技术中已经存在了多种BAPTA衍生物，但对于新型BAPTA衍生物仍存在继续研发的必要和需求，这在药物领域具有非常重要的药理和药动学意义及经济价值，而且也正是本发明得以完成的基础所在和动力所倚。
发明内容
如上所述，为提供一种新型的钙离子选择性螯合剂及其制备方法和用途，本发明人对此进行了深入的研究，在付出大量创造性劳动后，从而完成了本发明。
具体而言，第一方面，本发明涉及一种下式(I)所示新型钙离子选择性螯合剂，其结构式如下：
其中，R1、R2各自独立地选自H、卤素、C1-5烷基、C1-5烷氧基 或羟基。
在本发明的所述式(I)化合物中，除非另有规定，自始至终，C1-5烷基的含义是指具有1至5个碳原子的支链或者直链的烷基，其包括了C1烷基、C2烷基、C3烷基、C4烷基或C5烷基，非限定性地例如可以为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基等等。
在本发明的所述式(I)化合物中，除非另有规定，自始至终，C1-5烷氧基的含义是指上述C1-5烷基与氧原子相连后得到的基团。
在本发明的所述式(I)化合物中，除非另有规定，自始至终，卤素是指卤族元素，非限定性地例如可以为氟、氯、溴或碘。
在本发明的所述式(I)化合物中，所述式(I)化合物最优选为下式(II)化合物：
第二方面，本发明涉及所述式(I)的新型钙离子选择性螯合剂的制备方法，所述制备方法如下：
在有机溶剂中，于催化剂和芳香酸促进剂存在下，下式(III)化合物与下式(IV)化合物反应，从而得到所述式(I)化合物，
其中，R1、R2如上所定义。
其中，当R1、R2为H时，所得到的化合物即为上式(II)化合物。
在本发明所述式(I)的新型钙离子选择性螯合剂的制备方法中，作为原料的式(III)化合物属于已知化合物，其制备方法例如可见CN103288664A，具体合成方法在此不再一一赘述。
在本发明所述式(I)的新型钙离子选择性螯合剂的制备方法中，所述催化剂是按照如下制备方法制得的：
(1)将SBA-15介孔分子筛在500-550℃下煅烧20-40分钟，然后自然冷却至室温，得到一次处理分子筛；
(2)将一次处理分子筛放置于500℃的水蒸气气氛中放置60-80分钟，得到二次处理分子筛；
(3)将二次处理分子筛和离子液体加入到溶剂中，于40-50℃下充分搅拌混合4-8小时，然后过滤，将所得固体物用去离子水洗涤2-3次，然后真空干燥，即得所述催化剂。
其中，在步骤(1)中，所述SBA-15介孔分子筛是公知物质，在此不再一一赘述；将其在500-550℃下煅烧20-40分钟，例如可在500℃、520℃、540℃或550℃下煅烧20分钟、30分钟或40分钟。
其中，在步骤(2)中，通过将一次处理分子筛放置在高温水蒸气气氛中，从而可使用高温水蒸气对分子筛的内部孔道进行进一步的处理。
其中，在步骤(3)中，所述离子液体选自1-(4-二乙酰基碘苯基)-3-甲基咪唑四氟硼酸盐、1-甲基-3-磺酸丙基咪唑硫酸氢盐、1-正丁基-3-甲基咪唑磷酸二氢盐、N,N,N’,N’-四甲基-N,N’-二磺酸丙基丙二胺硫酸氢盐、1-正丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐中的任意一种，最优选为 N,N,N’,N’-四甲基-N,N’-二磺酸丙基丙二胺硫酸氢盐。
其中，在步骤(3)中，所述溶剂为乙酸乙酯、氯仿、丙酮、苯、甲苯等中的任何一种，该溶剂的用量并没有特别的限定，只要便于操作和后处理即可，熟练技术人员可进行合适选择。
其中，在步骤(3)中，所述二次处理分子筛与离子液体的质量比为1:0.4-0.6，例如为1:0.4、1:0.5或1:0.6。
在本发明所述式(I)的新型钙离子选择性螯合剂的制备方法中，所述有机溶剂为第一组分与第二组分构成的双组分混合溶剂，其中第一组分与第二组分的体积比为1:2-3，例如可为1:2、1:2.5或1:3。
其中，第一组分为N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、甲苯、苯中的任意一种，最优选为DMSO；
其中，第二组分为聚乙烯醇200(PEG-200)、15-冠-6或三丁基胺中的任意一种，最优选为PEG-200。
其中，该有机溶剂的用量并没有特别的限定，只要便于后续的操作和后处理即可，本领域熟练技术人员可进行合适选择，在此不再一一赘述。
在本发明所述式(I)的新型钙离子选择性螯合剂的制备方法中，所述芳香酸促进剂为苯甲酸、苯乙酸、对巯基苯甲酸或3-硝基苯甲酸中的任意一种，最优选为3-硝基苯甲酸。
在本发明所述式(I)的新型钙离子选择性螯合剂的制备方法中，所述式(III)化合物与式(IV)化合物的摩尔比为1:6-8，例如可为1:6、1:7或1:8。
在本发明所述式(I)的新型钙离子选择性螯合剂的制备方法中，以摩尔(mol)计的所述式(III)化合物与以克(g)计的所述催化剂的比为1:1-2mol/g，即每1mol所述式(III)化合物使用1-2g所述催化剂，例如可为1:1mol/g、1:1.5mol/g或1:2mol/g。
在本发明所述式(I)的新型钙离子选择性螯合剂的制备方法中，所述式(III)化合物与芳香酸促进剂的摩尔比为1:0.2-0.6，例如可为1:0.2、1:0.4或1:0.6。
在本发明所述式(I)的新型钙离子选择性螯合剂的制备方法中， 反应温度为50-70℃，例如可为50℃、60℃或70℃。
在本发明所述式(I)的新型钙离子选择性螯合剂的制备方法中，反应时间为4-8小时，例如可为4小时、6小时或8小时。
第三方面，本发明涉及上述式(I)化合物(尤其是式(II)化合物)或其药学上可接受的盐在制备治疗临床上大面积细胞死亡性疾病的药物中的用途。
其中，所述临床上大面积细胞死亡性疾病非限定性的例如可以为脑梗塞、心肌梗塞、肝坏死、肾缺血性坏死或坏死性胰腺炎等。
第四方面，本发明涉及上式(I)化合物(尤其是式(II)化合物)或其药学上可接受的盐在制备与OATP1B1转运蛋白相关疾病药物中的用途。
其中，所述与OATP1B1转运蛋白相关疾病例如可为高胆红血素症、肝胆结石或肝癌等。
第五方面，本发明涉及包含上式(I)化合物(尤其是式(II)化合物)或其药学上可接受的盐的药物组合物。
其中，所述药物组合物除包含上式(I)化合物或其药学上可接受的盐外，还可包含药学上公知的各种赋形剂和药用载体等，这些赋形剂和/或药用载体都是本领域中的公知物质，在此不再一一赘述。
上述“式(I)化合物(尤其是式(II)化合物)或其药学上可接受的盐”中的“药学上可接受的盐”是指可形成的任意盐，例如可为无机酸盐，如盐酸盐、硫酸盐、氢溴酸盐、硝酸盐、碳酸盐、碳酸氢盐、磷酸盐、磷酸氢盐、亚磷酸盐、氢碘酸盐等，可为有机酸盐如乙酸盐、丙酸盐、异丁酸盐、马来酸盐、乳酸盐、苯甲酸盐、琥珀酸盐、扁桃酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐等。这些都属于本领域技术人员公知的成盐形式，在此不再一一赘述。
如上所述，本发明提供了一种新型的钙离子选择性螯合剂及其制备方法和用途，所述钙离子选择性螯合剂具有优异的生物活性，可用来治疗多种疾病，从而在医药领域具有良好的应用前景和工业化潜力；此外，通过对催化剂、芳香酸促进剂以及有机溶剂等的选择与组合，本发明的所述制备方法可以以良好的产率获得目的产物，同样在医药领域具有良好的工业化生产潜力。
附图说明
附图1是硫酸雌酮与OATP1B1的亲和性曲线。
附图2是本发明式(II)化合物对OATP1B1转运蛋白的抑制浓度图。
具体实施方式
下面通过具体的实例对本发明进行详细说明，但这些例举性实施方式的用途和目的仅用来例举本发明，并非对本发明的实际保护范围构成任何形式的任何限定，更非将本发明的保护范围局限于此。
制备例1：催化剂C1的制备
(1)将SBA-15介孔分子筛在500℃下煅烧40分钟，然后自然冷却至室温，得到一次处理分子筛；
(2)将一次处理分子筛放置于500℃的水蒸气气氛中放置60分钟，得到二次处理分子筛；
(3)将二次处理分子筛和离子液体N,N,N’,N’-四甲基-N,N’-二磺酸丙基丙二胺硫酸氢盐加入到适量乙酸乙酯中(其中，所述二次处理分子筛与N,N,N’,N’-四甲基-N,N’-二磺酸丙基丙二胺硫酸氢盐的质量为1:0.4)，于40℃下充分搅拌混合8小时，然后过滤，将所得固体物用去离子水洗涤2-3次，然后真空干燥，即得催化剂C1。
制备例2：催化剂C2的制备
(1)将SBA-15介孔分子筛在520℃下煅烧30分钟，然后自然冷却至室温，得到一次处理分子筛；
(2)将一次处理分子筛放置于500℃的水蒸气气氛中处理70分钟，得到二次处理分子筛；
(3)将二次处理分子筛和离子液体N,N,N’,N’-四甲基-N,N’-二磺酸丙基丙二胺硫酸氢盐加入到适量氯仿中(其中，所述二次处理分子筛与N,N,N’,N’-四甲基-N,N’-二磺酸丙基丙二胺硫酸氢盐的质量比为1:0.5)，于45℃下充分搅拌混合6小时，然后过滤，将所得固体物用去离子水洗涤2-3次，然后真空干燥，即得催化剂C2。
制备例3：催化剂C3的制备
(1)将SBA-15介孔分子筛在550℃下煅烧20分钟，然后自然冷却至室温，得到一次处理分子筛；
(2)将一次处理分子筛放置于500℃的水蒸气气氛中处理80分钟，得到二次处理分子筛；
(3)将二次处理分子筛和离子液体N,N,N’,N’-四甲基-N,N’-二磺酸丙基丙二胺硫酸氢盐加入到适量苯中(其中，所述二次处理分子筛与N,N,N’,N’-四甲基-N,N’-二磺酸丙基丙二胺硫酸氢盐的质量比为1:0.6)，于50℃下充分搅拌混合4小时，然后过滤，将所得固体物用去离子水洗涤2-3次，然后真空干燥，即得催化剂C3。
制备例4-7：催化剂C4-C7的制备
除分别将步骤(3)中的离子液体替换为如下表中的离子液体外，其它操作均不变，从而按照与制备例1-3的相同方式进行了制备例4-7，所使用离子液体、对应关系和所得催化剂命名见下表。
制备例8-13：催化剂C8-C13的制备
制备例8-10：除未进行步骤(1)外，其它操作均与制备例1-3相同(即将SBA-15介孔分子筛未进行煅烧处理，而是直接进行步骤(2)的水蒸气气氛处理和步骤(3))，从而分别按照制备例1-3的相同方法，进行了制备例8-10，将所得催化剂顺次命名为C8、C9和C10。
制备例11-13：除未进行步骤(2)外，其它操作均与制备例1-3相同(即将SBA-15介孔分子筛未进行水蒸气气氛处理，而是在进行步骤(1)的煅烧处理后，直接进行步骤(3))，从而分别按照制备例1-3的相同方法，进行了制备例11-13，将所得催化剂顺次命名为C11、C12和C13。
实施例1：式(II)化合物的制备
室温下，向由体积比为1:2的DMSO与PEG-200组成的适量双组分有机溶剂中，加入下式(III)化合物、催化剂C1和芳香酸促进剂3-硝基苯甲酸，充分搅拌混合，然后滴加加入下式(IV)化合物，滴加完毕后，升温至50℃，并在该温度下搅拌反应8小时；其中，式(III)化合物与式(IV)化合物的摩尔比为1:6、以摩尔(mol)计的所述式(III)化合物与以克(g)计的所述催化剂C1的比为1:1mol/g、式(III)化合物与芳香酸促进剂间硝基苯甲酸的摩尔比1:0.2；
反应完成后，将反应体系冷却至室温，加入足量二氯甲烷，充分搅拌、静置分层，分离出二氯甲烷层，将该二氯甲烷层用去离子水充分洗涤2-3次，弃去水层，有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液真空浓缩，将所得残留物过300-400目硅胶柱色谱，以体积比为1:0.2的丙酮-正丁醇为洗脱液，从而得到所述式(II)化合物，产率为95.7％。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ(ppm)：1.28-1.34(m,8H),1.43-1.48(m,16H),2.75-2.84(t,16H),3.38-3.47(t,8H),4.29-4.35(t,8H),4.45(s,8H),4.62-4.67(t,4H),6.96-7.06(m,4H),7.35-7.44(m,4H)。
实施例2：式(II)化合物的制备
室温下，向由体积比为1:2.5的DMSO与PEG-200组成的适量双组分有机溶剂中，加入实施例1中的所述式(III)化合物、催化剂C2和芳香酸促进剂3-硝基苯甲酸，充分搅拌混合，然后滴加加入实施例1中的所述式(IV)化合物，滴加完毕后，升温至60℃，并在该温度下搅拌反应6小时；其中，式(III)化合物与式(IV)化合物的摩尔 比为1:7、以摩尔(mol)计的所述式(III)化合物与以克(g)计的所述催化剂C2的比为1:1.5mol/g、式(III)化合物与芳香酸促进剂间硝基苯甲酸的摩尔比1:0.4；
反应完成后，将反应体系冷却至室温，加入足量二氯甲烷，充分搅拌、静置分层，分离出二氯甲烷层，将该二氯甲烷层用去离子水充分洗涤2-3次，弃去水层，有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液真空浓缩，将所得残留物过300-400目硅胶柱色谱，以体积比为1:0.2的丙酮-正丁醇为洗脱液，从而得到所述式(II)化合物，产率为96.1％。
核磁数据同实施例1。
实施例3：式(II)化合物的制备
室温下，向由体积比为1:3的DMSO与PEG-200组成的适量双组分有机溶剂中，加入实施例1中的所述式(III)化合物、催化剂C3和芳香酸促进剂3-硝基苯甲酸，充分搅拌混合，然后滴加加入实施例1中的所述式(IV)化合物，滴加完毕后，升温至70℃，并在该温度下搅拌反应4小时；其中，式(III)化合物与式(IV)化合物的摩尔比为1:8、以摩尔(mol)计的所述式(III)化合物与以克(g)计的所述催化剂C3的比为1:2mol/g、式(III)化合物与芳香酸促进剂间硝基苯甲酸的摩尔比1:0.6；
反应完成后，将反应体系冷却至室温，加入足量二氯甲烷，充分搅拌、静置分层，分离出二氯甲烷层，将该二氯甲烷层用去离子水充分洗涤2-3次，弃去水层，有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液真空浓缩，将所得残留物过300-400目硅胶柱色谱，以体积比为1:0.2的丙酮-正丁醇为洗脱液，从而得到所述式(II)化合物，产率为95.8％。
核磁数据同实施例1。
由实施例1-3可见，当采用本发明的反应体系时，可以高产率得到目的产物，从而为该新型化合物的制备提供了一种全新的方法，在工业上尤其是医药中间体合成领域具有良好的应用前景和工业化生茶潜力。
实施例4-7：式(II)化合物的制备
除使用如下的催化剂外，其它操作均不变，从而按照实施例1-3的相同方式，进行了实施例4-7，所使用催化剂、对应实施例和产物产率见下表。
由此可见，在催化剂的制备过程中，SBA-15介孔分子筛所负载的离子液体种类对于最终的产物产率有着显著的影响。其中，N,N,N’,N’-四甲基-N,N’-二磺酸丙基丙二胺硫酸氢盐具有最好的效果，这是非显而易见的。
实施例8-13：式(II)化合物的制备
除使用如下的催化剂外，其它操作均不变，从而按照实施例1-3的相同方式，进行了实施例8-13，所使用催化剂、对应实施例和产物产率见下表。
由此可见，SBA-15介孔分子筛的前处理同样对产物产率有着显著的影响，当未进行煅烧处理以及未进行水蒸气气氛处理时，都将导致产率有显著降低，但未进行水蒸气气氛处理时，产物产率下降更为明显。
实施例14-19：有机溶剂的考察
除将其中的双组分有机溶剂中的第一组分和第二组分进行改变外，其它操作均不变，从而按照实施例1-3的相同方法实施了实施例14-19，所使用的有机溶剂、对应实施例和产物产率见下表。
由此可见，在溶剂体系中，只有采用DMSO与PEG-200的双组分混合溶剂体系，才能取得本发明的优异效果。而当改变第一组分和第二组分时，都将导致产率有明显的降低。
实施例20-28：芳香酸促进剂的考察
实施例20-22：除分别将实施例1-3中的3-硝基苯甲酸替换为苯甲酸外，其它操作均不变，从而分别得到了实施例20-22。
实施例23-25：除分别将实施例1-3中的3-硝基苯甲酸替换为苯乙酸外，其它操作均不变，从而分别得到了实施例23-25。
实施例26-28：除分别将实施例1-3中的3-硝基苯甲酸替换为对巯基苯甲酸外，其它操作均不变，从而分别得到了实施例26-28。
结果见下表。
由此可见，芳香酸促进剂的种类同样对产物产率有着显著的影响，而3-硝基苯甲酸具有最好的效果，即使与其非常类似的苯甲酸、对巯基苯甲酸，其产率也有着明显的降低，甚至对巯基苯甲酸的产率要显著低于苯乙酸。
由上述所有实施例可见，本发明的制备方法中，通过催化剂的特定制备工艺、有机溶剂、芳香酸促进剂的种类选择等，从而相互之间产生了协同效果，从而取得了良好的产物产率。而当改变其中的任何一种要素时，都将导致产物产率有显著的降低。
生物学活性测试
1、小鼠缺氧实验
将每12只昆明小鼠份为一组，进行三组平行实验，来分别测试本发明的上述式(II)化合物、BAPTA以及专利文献CN103288664A中实施例化合物1,2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸四(二乙氨基乙醇酯)的活性。
具体实验方法为：以5mg/kg的给药剂量静脉注射1小时后，测试小鼠在密闭环境中逐渐耗氧至缺氧状态下的存活时间，同时另外以未注射药物的12只昆明小鼠一组作为空白对照，将空白对照组的平均存活时间折算为100％，从而对三组小鼠进行了缺氧测试，实验结果如下：
2、小鼠急性脑缺血实验
将每6只昆明小鼠份分为一组，进行三组平行实验，来分别测试本发明的上述式(II)化合物、、BAPTA以及专利文献CN103288664A中实施例化合物1,2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸四(二乙氨基乙醇酯)的活性。
具体实验方法为：以10mg/kg的给药剂量静脉注射1小时后，迅速断头造模，并记录呼吸次数以及呼吸维持时间，同时另外以未注射药物的6只昆明小鼠一组作为空白对照，将空白对照的呼吸次数以及呼吸维持时间折算为100％，从而对三组小鼠进行了急性脑缺血测试，实验结果如下：
通过上述缺血和缺氧实验可以看出，本发明式(II)化合物具有优异的抗缺血和抗缺氧的能力，不仅优于经典的钙离子选择性螯合剂BAPTA，也显著地优于现有技术中的其它的BAPTA衍生物，例如CN103288664A中的实施例化合物。
发明人进一步深入地研究了本发明化合物的药理作用，通过药物转运蛋白的体外模型实验，进一步表征了本发明化合物的优异跨细胞膜性能，从而揭示了本发明化合物具有优异活性的原理，也为BAPTA衍生物的研究提供了一种全新的构思。
3、肝脏摄入型转运蛋白OATP1B1吸收实验
A、OATP1B1转运蛋白的功能确认
将OATP1B1-HEK293细胞加于24孔盘内，放置于37℃、5％CO2条件下培养48h后，开始给药实验确证细胞功能。
OATP1B1转运蛋白的标准转运底物是硫酸雌酮，将放射性比活度为1.687TBq/mmol的3H-硫酸雌酮配置成50nmol/L的浓度溶于DPBS缓冲液中，另外分别加入100nM、300nM、1μM、3μM、10μM、30μM的非同位素标记的硫酸雌酮作为抑制剂，将无OATP1B1转运蛋白表达的空白HEK293细胞(MOCK细胞)做为阴性对照，试验结果见附图1。
由Eadie-Hofstee法线性回归，计算出OATP1B1标准转运底物硫酸雌酮Michaelis-Menten方程，Km值为0.5392μM，Vmax值为20.569pmol/mg蛋白质/分钟。Km值小于1μM，说明硫酸雌酮与OATP1B1亲和性非常好，同时也证明了OATP1B1-HEK293细胞系的功能良好。
B、本发明化合物与OATP1B1转运蛋白亲和性实验
以50nM 3H-硫酸雌酮(给药OATP1B1)作为阳性对照100％，分别添加1μM、3μM、10μM、30μM、100μM、300μM、600μM的本发明化合物(II)，测定阳性底物的吸收变化，实验结果见附图2。
回归计算出本发明式(II)化合物对于OATP1B1的IC50值约为4.62 μM，证明对于OATP1B1具有非常理想的抑制作用。进一步进行常规的Km、Vmax变化实验，通过Eadie-Hofstee方法线性回归确定本发明式(II)化合物对于OATP1B1摄入3H-硫酸雌酮的影响，发现本发明式(II)化合物引起OATP1B1摄入3H-硫酸雌酮的Km值产生了显著的变化：从0.5392μM增大至2.5714μM，而Vmax值未产生显著的变化，这可以证明本发明式(II)化合物是OATP1B1转运蛋白的竞争性抑制剂，即它是OATP1B1的转运底物。
C、现有技术化合物与OATP1B1转运蛋白亲和性实验
采用上述B中的相同的实验方法，验证了BAPTA以及专利文献CN103288664A中实施例化合物1,2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸四(二乙氨基乙醇酯)与OATP1B1转运蛋白亲和性，结果发现：BAPTA对于OATP1B1的IC50值为约为50μM，可以认为是没有显著的抑制作用；而CN103288664A中实施例化合物对于OATP1B1的IC50值为约为15μM，抑制作用也远远低于本发明式(II)化合物。
通过上述的进一步OATP1B1转运蛋白的竞争性抑制实验，证明了现有技术中的两种化合物均不是OATP1B1的转运底物。
通过与OATP1B1转运蛋白的亲和性实验结果，可与显而易见地看出本发明式(II)化合物作为OATP1B1转运蛋白的转运底物，相对于现有技术中的BAPTA以及CN103288664A中的实施例化合物，可以更容易的跨越细胞膜，这一结果证实了本发明式(II)化合物具有优良的跨越细胞膜的能力，解决了现有技术中迫切需要解决的技术问题，同时也解释了本发明化合物为何能够具有优良的抗缺血缺氧活性，这是意想不到的优异的效果。
综上所述，由上述所有实施例可明确看出，本发明提供了一种新的钙离子选择性螯合剂及其制备方法和用途，本发明的化合物具有优良的抗缺血缺氧的能力，同时，其还作为OATP1B1转运蛋白的转运底物具备了优良的跨细胞膜能力，对于BAPTA衍生物的研究具有非常重要的意义和潜在价值。
应当理解，这些实施例的用途仅用于说明本发明而非意欲限制本发明的保护范围。此外，也应理解，在阅读了本发明的技术内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动、修改和/或变型，所有的这 些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种下式(I)所示钙离子选择性螯合剂的制备方法，
所述制备方法如下：在有机溶剂中，于催化剂和芳香酸促进剂存在下，下式(III)化合物与下式(IV)化合物反应，从而得到所述式(I)化合物，
其中，R1、R2各自独立地选自H、卤素、C1-5烷基、C1-5烷氧基或羟基；
所述催化剂是按照如下制备方法制得的：
(1)将SBA-15介孔分子筛在500-550℃下煅烧20-40分钟，然后自然冷却至室温，得到一次处理分子筛；
(2)将一次处理分子筛放置于500℃的水蒸气气氛中放置60-80分钟，得到二次处理分子筛；
(3)将二次处理分子筛和离子液体加入到溶剂中，于40-50℃下充分搅拌混合4-8小时，然后过滤，将所得固体物用去离子水洗涤2-3次，然后真空干燥，即得所述催化剂；
所述离子液体选自1-(4-二乙酰基碘苯基)-3-甲基咪唑四氟硼酸盐、1-甲基-3-磺酸丙基咪唑硫酸氢盐、1-正丁基-3-甲基咪唑磷酸二氢盐、N,N,N’,N’-四甲基-N,N’-二磺酸丙基丙二胺硫酸氢盐、1-正丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐中的任意一种；
所述有机溶剂为第一组分与第二组分构成的双组分混合溶剂，其中第一组分与第二组分的体积比为1:2-3；
其中，第一组分为N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、甲苯、苯中的任意一种；
其中，第二组分为聚乙烯醇200、15-冠-6或三丁基胺中的任意一种；
所述芳香酸促进剂为苯甲酸、苯乙酸、对巯基苯甲酸或3-硝基苯甲酸中的任意一种。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述离子液体为N,N,N’,N’-四甲基-N,N’-二磺酸丙基丙二胺硫酸氢盐。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：其中，第一组分为二甲基亚砜；第二组分为聚乙烯醇200。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述芳香酸促进剂为3-硝基苯甲酸。
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| NMR-sensitive fluorinated and fluorescent intracellular calcium ion indicators with high dissociation constants;ROBERT E. LONDON，等;《American Journal of Physiology》;19941231;第266卷(第5期);第C1313页、第C1314页图1 * |
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