CN102617376A - 一种钙离子选择性螯合剂的合成方法 - Google Patents

Abstract

一种钙离子选择性螯合剂的合成方法，涉及一种生物药剂的合成方法，以1，2-双（2-胺基苯氧）乙烷为原料经酯化和酸化两步反应，合成了2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸(2a，BAPTA)，化合物2a的结构经IR、1HNMR表征。通过调整配比及催化剂用量为1，2-双（2-胺基苯氧）乙烷、溴乙酸甲酯和二异丙基乙胺的摩尔比值为1:5.2:5.2，2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸甲酯（1a，BAPTA的甲酯）的收率为86%纯度97.45%。化学提纯方法，BAPTA纯度可达99%，该纯度下收率可达94%。该方法降低了生产成本，优化了工艺步骤并提高了品质与收率。

Description

一种钙离子选择性螯合剂的合成方法

技术领域

本发明涉及一种生物药剂的合成方法，特别是涉及一种钙离子选择性螯合剂的合成方法。

背景技术

2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸2a（O,O'-Bis(2-aminophenyl)ethyleneglycol-N,N,N',N'-tetraacetic acid），简称BAPTA，是一种无毒的钙离子选择性螯合剂与指示剂。它基本的螯合单位和EDTA类似，只是两个脂肪氮被芳香氮所替代。因此，BAPTA在生理pH下不会被质子化。BAPTA的pKa3为5.47，pKa4为6.36。这个特点显示了去质子化的步骤并不包含在Ca的螯合步骤中。由于不受质子的干扰，它的螯合率比EGTA要高很多。

1980年Tsien等提出了对钙离子最佳选择性结构的基础上向EDTA中引入芳香发色团（即BAPTA），苯环的引入保持了对钙离子的高选择性，在生理条件下完全离子化，因而与钙离子络合不受PH值变化的影响，结合钙离子的速度也大大提高了。(Tsien R Y. Biochemistry, 1980, 19(11): 2396) 然而，它的衍生物在细胞浆中可以很容易地水解，它可以与钙离子形成螯合物从而有效缓解血浆浓度的变化。这种螯合物与内皮细胞接触可以增加环前列腺素在动脉内皮细胞中的释放率。而且向芳环中引入卤素可以极大地增强环前列腺素与自由羧酸钙离子的作用，这种作用可以使增加的环前列腺素离解，进而与钙离子螯合。环前列腺素，它是一种抗血凝剂有助于血管扩张，以增加活性血小板的数量来防止血管破损处形成血栓。因为减少了动脉肌细胞中胆固醇的含量，从而降低动脉硬化的发生概率。(Heilporn S, Broeders F, Daloze D. Bull. Soc. Chim. Belg, 1994, 103(7): 309)

2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸酯可以透过细胞膜已成为研究细胞Ca²⁺生理功能的有利工具，杨丽萍等提出2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸甲酯1a可在不损伤细胞膜的情况下而进入细胞，在细胞内水解出游离的BAPTA，在生理pH条件下与细胞内游离Ca²⁺结合，似有使红细胞骨骼蛋白构象起稳定作用而提高红细胞抗高温的能力(YANG Li-Ping，TU Hui-Ping，FU Hong-Yan. Journalof East China Normal University(Narural Science), 1996, (1): 45)

下面的合成路线是已发表并公开的反应路线，其产品收率化合物2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸甲酯1a是71%，2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸2a收率无报道。

第一步反应

    

第二步反应

    

上述方法存在步骤繁琐、产品纯度和收率低的问题。为了降低成本，提高纯度和收率，需要改进工艺步骤。而且上述化合物用于生物医药方面，其纯度必须要达到一定的标准才能保证使用品质。

发明内容

本发明的目的在于提供一种钙离子选择性螯合剂的合成方法，该方法提出一种工艺方法的改进，省去用磷酸洗涤至中性这一步骤，并采用化学提纯的方法，化合物2a纯度可达99%，且在该纯度下的收率可达到94%。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种钙离子选择性螯合剂的合成方法，即2-双、即2-胺基苯氧，乙烷-N,N,N',N'-四乙酸甲酯、即1a，BAPTA的甲酯，的合成方法，该方法包括首先将液态原料溴乙酸甲酯和二异丙基乙胺以及乙氰干燥脱去其中的水分，其次将整个反应装置去除水分；原料配比为1，2-双、即2-胺基苯氧乙烷，溴乙酸甲酯和二异丙基乙胺的摩尔比值为1:5.2:5.2，反应终点体系为中性；具体步骤为：第一步：溶剂乙氰与原料溴乙酸甲酯以及二异丙基乙胺经活化的分子筛浸泡24小时以上，分子筛在使用前在400℃下用茂福炉烘干4小时；实验装置干燥，通入高纯氮气除去其中空气与水分；将1，2-双、即2-胺基苯氧，乙烷与溴乙酸乙酯为1.5当量、催化剂无水碘化钠和二异丙基乙胺混合为1.2当量，混合，将他们溶解在乙氰中；混合物在氮气的保护下加热回流搅拌20h；反应结束后，冷却，用甲苯稀释，过滤，用大量甲苯洗涤滤饼，最后将甲苯合并在一起；先将混合相用水洗，然后用硫酸镁干燥，减压蒸去甲苯，再用乙醇把得到的固体进行重结晶得白色晶体经红外、核磁氢谱鉴定为化合物1a，重结晶两次的晶体，经HPLC验证纯度达到97.45 %；第二步：将化合物1a溶解在微热的乙醇中，加入4当量的KOH的浓溶液，皂化成化合物2a的钾盐；反应在微热条件下进行一小时后，蒸掉乙醇，然后向里面加入蒸馏水；用盐酸将pH值调至2，抽滤、用水洗涤、干燥可以得到白色固体化合物，经红外、氢谱鉴定为化合物2a，而产物反复纯化与洗涤后，经HPLC验证纯度达到99 %。

所述的一种钙离子选择性螯合剂的合成方法，其所述的方法为使用化学提纯法对粗产品进行分离、提纯处理的方法，该方法提纯先用15%的氢氧化钾溶液溶解，再用0.33M的盐酸溶液使之沉淀，最后用超纯水洗涤。

附图说明

图1为本发明化合物1a的红外光谱；

图2为本发明化合物1a的¹H-NMR谱图；

图3为本发明化合物2a的红外光谱；

图4为本发明化合物2a的¹H-NMR谱图。

注：本发明的图1—图4为产物状态的分析示意图，图中文字或影像不清晰并不影响对本发明技术方案的理解。

具体实施方式

化合物1a的合成方法包括下述步骤：

1.化合物1a合成的反应步骤：

第一步：向500ml四口瓶中通氮气后加入称量好19.52g(80mmol)1，2-双（2-胺基苯氧）乙烷、3.344g(62.4mmol)无水碘化钠、72ml(416mmol)二异丙基乙胺和120ml的乙氰。

第二步：缓慢升温、搅拌。内浴温度升至55℃，逐滴匀速加入溴乙酸甲酯38.4ml(416mmol)。

第三步：滴加结束后使体系内充满氮气后封闭，再次升温至体系内温度80℃后，回流20小时。

2.  化合物1a合成的后处理步骤

第四步：回流结束后，向四口瓶中加入140ml甲苯，搅拌30分钟，然后静置30分钟。静置结束后将上层清夜倒入一500ml的烧杯中，向四口瓶中加入50ml的甲苯，搅拌30分钟，然后静置30分钟。

第五步：净置结束后将上层清夜倒入原先的烧杯中，再向四口瓶中加入50ml的甲苯，搅拌30分钟，然后静置30分钟，重复2遍

第六步：搅拌结束后将四口瓶中的固液混合物进行抽滤，将抽滤后的滤液倒入原先的烧杯中。将烧杯中的滤液分成三份，每份用30ml的蒸馏水在分液漏斗中洗涤五次，总共用了450ml的蒸馏水。将洗后的滤液放入500ml的烧杯中，向烧杯中加入40g无水硫酸镁，搅拌30分钟，然后抽滤，抽滤后得到的滤液转移到500ml的梨形瓶中。

3.化合物1a合成的产品分离步骤

第七步：旋蒸出乙氰和甲苯馏分得到棕色固体。向梨形瓶中加入35ml无水乙醇，先将瓶放入恒温水浴中，调节外浴温度升至78℃，搅拌，瓶内变为棕色透明液，常温冷却2小时后，再放入冰水中冷却，3小时后抽滤，取得滤饼为微黄晶体，然后将滤饼洗涤两次，每次用20ml乙醇，最后得到白色晶体。

第八步：将上一步的白色晶体放入一干净的梨形瓶中，向里面加入30ml的无水乙醇，将瓶放入恒温水浴中，调节外浴温度升至78℃，搅拌，瓶内变为黄色透明液，常温冷却2小时后，再放入冰水中冷却，3小时后抽滤，取得滤饼为白色晶体。重复2遍，得到1a质量为36.7g，产率为86%，熔点为93-96℃。

IR(KBr)，R/cm^-1:υ(═C─H) 3004(m); υ(C─H) 2955 (m)；υ（C=O）1744(s)；υ(C─N) 1259(s) ；υ(C─O─C) 1197(s)；δ(C─H) 1420(m)；δ(═C─H) 745(s)；             ¹H NMR(500MHz,CDCl₃),δ：3.55（s,12H）；4.15（s,8H）；4.27（s,4H）；6.84（m,4H）；7.26（m，4H）。

化合物2a的合成方法包括下述步骤：

1. 化合物2a的反应步骤：

第一步：称得1a36.7g固体产物加入到250ml三口烧瓶及110ml无水乙醇，缓慢升温，待内浴温度升到63℃，此时白色固体全部溶解在乙醇中，逐滴加入102ml 15%的NaOH溶液。

第二步：滴加后且此温度下搅拌1小时后，将三口瓶中的溶液转移到单口烧瓶中进行简单蒸馏，外浴温度调节至105℃，剩余物是透明溶液。

第三步：将单口烧瓶中的剩余物转入500ml烧杯中，再用30ml水洗涤烧瓶后合并到烧杯中，此时测得烧杯中液体的pH值是12。打开磁力搅拌，边搅拌边用恒压滴加0.33mol/L的盐酸， 当pH值为3.5-4时烧杯中透明液开始浑浊，渐渐析出白色沉淀，当滴定到pH值为2到2.5时，已有大量固体析出，停止滴加和搅拌，总共用掉900ml盐酸溶液。

第四步：将烧杯中的浑浊液倒入已装好滤纸的布氏漏斗中抽滤。将滤饼和转子倒入盛有250ml蒸馏水的烧杯中，用玻璃棒搅拌15分钟，然后抽滤，取滤饼用真空干燥箱在26℃条件下烘干。然后称量，得到白色粉末29.7g，收率90.4%，熔点为151℃-156℃，纯度经HPLC验证可达到93 %。

2. 化合物2a的纯化：

第五步：用电子天平称取20.3g的2a放入100ml的干净烧杯中，配制15%的氢氧化钾溶液60ml（10.56gKOH，60ml蒸馏水）待用。

第六步：向装有2a的烧杯中滴加15%的氢氧化钾溶液，固体开始溶解，待基本溶解后，停止滴加，总共用了50ml的KOH溶液，用PH试纸测的烧杯中的溶液的PH为13。将烧杯中的溶液用布式漏斗抽滤，将滤液倒入一500ml的干净烧杯中，再用20ml的蒸馏水涮洗抽滤瓶，最后将涮洗液一并倒入烧杯中，然后边搅拌边向烧杯里面滴加0.33mol/L的盐酸。

第七步：当pH值为4时开始出现浑浊，当pH为2-2.5时有大量白色固体析出，此时停止滴加盐酸，总共用了540ml的盐酸，用布式漏斗抽滤得到白色固体。将抽滤后得到的固体放入一500ml的烧杯中，向里面加入250ml的蒸馏水，用玻璃棒搅拌15min后抽滤。

第八步：将抽滤后的白色固体放入100ml的干净烧杯中，向烧杯中滴加15%的氢氧化钾溶液，固体开始溶解。待全部溶解，停止滴加，总共用了47ml的KOH溶液，用PH试纸测的烧杯中的溶液的PH为13，将烧杯中的溶液用布式漏斗抽滤，将滤液倒入一500ml的干净烧杯中，再用20ml的蒸馏水涮洗抽滤瓶，最后将涮洗液一并倒入烧杯中，然后边搅拌边向烧杯里面滴加0.33mol/L的盐酸。当pH值为4时开始出现浑浊，当pH为2-2.5时有大量白色固体析出，此时停止滴加盐酸，总共用了480ml的盐酸，用布式漏斗抽滤得到白色固体。

第九步：将抽滤后得到的固体放入一500ml的烧杯中，向里面加入250ml的蒸馏水，用玻璃棒搅拌15min后抽滤。重复2遍，最后抽滤得到白色固体，干燥后为白色粉末，质量为19.1g，收率94%，熔点为150-155℃，纯度经HPLC验证可达到99 %。

IR(KBr),R/cm^-1: υ(O─H) 3427(m)；υ(═C─H) 3160(m); υ(C─H) 2953 (m)；υ(C=O) 1698(s)；υ(C─N) 1242(s)；υ(C─O─C) 1210(s)；δ(C─H) 1399(m)；δ(═C─H) 751(s)；¹H NMR(500MHz,CDCl₃),δ：4.00(s,8H)；4.23（s,4H）；6.73（m,2H）；6.82(m,4H)；6.94(m,2H)。

Claims (2)

1.一种钙离子选择性螯合剂的合成方法，即2-双、即2-胺基苯氧，乙烷-N,N,N',N'-四乙酸甲酯、即1a，BAPTA的甲酯，的合成方法，其特征在于，该方法包括首先将液态原料溴乙酸甲酯和二异丙基乙胺以及乙氰干燥脱去其中的水分，其次将整个反应装置去除水分；原料配比为1，2-双、即2-胺基苯氧乙烷，溴乙酸甲酯和二异丙基乙胺的摩尔比值为1:5.2:5.2，反应终点体系为中性；具体步骤为：第一步：溶剂乙氰与原料溴乙酸甲酯以及二异丙基乙胺经活化的分子筛浸泡24小时以上，分子筛在使用前在400℃下用茂福炉烘干4小时；实验装置干燥，通入高纯氮气除去其中空气与水分；将1，2-双、即2-胺基苯氧，乙烷与溴乙酸乙酯为1.5当量、催化剂无水碘化钠和二异丙基乙胺混合为1.2当量，混合，将他们溶解在乙氰中；混合物在氮气的保护下加热回流搅拌20h；反应结束后，冷却，用甲苯稀释，过滤，用大量甲苯洗涤滤饼，最后将甲苯合并在一起；先将混合相用水洗，然后用硫酸镁干燥，减压蒸去甲苯，再用乙醇把得到的固体进行重结晶得白色晶体经红外、核磁氢谱鉴定为化合物1a，重结晶两次的晶体，经HPLC验证纯度达到97.45 %；第二步：将化合物1a溶解在微热的乙醇中，加入4当量的KOH的浓溶液，皂化成化合物2a的钾盐；反应在微热条件下进行一小时后，蒸掉乙醇，然后向里面加入蒸馏水；用盐酸将pH值调至2，抽滤、用水洗涤、干燥可以得到白色固体化合物，经红外、氢谱鉴定为化合物2a，而产物反复纯化与洗涤后，经HPLC验证纯度达到99 %。

2.根据权利要求1所述的一种钙离子选择性螯合剂的合成方法，其特征在于，所述的方法为使用化学提纯法对粗产品进行分离、提纯处理的方法，该方法提纯先用15%的氢氧化钾溶液溶解，再用0.33M的盐酸溶液使之沉淀，最后用超纯水洗涤。

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