CN104975012A - 星斑川鲽微卫星分子标记位点及引物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了星斑川鲽11个微卫星分子标记位点以及其多态性引物，所获引物的扩增结果具有高度的多态性和稳定性，为星斑川鲽的遗传多样性以及种群间的亲缘关系的鉴定提供资料，弥补现有技术的不足。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学DNA分子标记技术领域，具体涉及星斑川鲽微卫星分子标记的开发。
背景技术
星斑川鲽(Platichthys stellatus)又称星突江鲽，隶属鲽形目鲽科川鲽属，为广盐、冷水性种类，分布在中国、朝鲜、韩国、日本、俄罗斯及美国太平洋沿岸海域，在我国吉林省的图们江也有分布。由于星斑川鲽营养价值高，口感独特，味道鲜美，所以市场价值高，在国内外市场深受欢迎。目前，国内外有关星斑川鲽的研究报道还比较少，主要集中在生物学地位、生态分布以及种群资源量。另外，日本和法国学者利用同工酶分析了野生群体星斑川鲽的种群遗传结构，还有一些学者对其生理、生化等方面进行了研究，但目前对于星斑川鲽微卫星方面的研究则不多，在NCBI上公布的星斑川鲽的SSR序列只有158条，这在一定程度上限制了星斑川鲽的遗传育种和品质改良。
微卫星标记(SSRs：simple sequence repeats)或短串联重复(Short tandem repeats，STRS)，是一种广泛应用的遗传学领域的DNA分子标记。SSRs是广泛存在真核生物基因组中的简单重复DNA片段，一般每个重复单位仅1-6个碱基，重复数为10-20次，其中动物体中以双核苷酸(CA/GT)n最为常见。微卫星具有多态性高，提供的遗传信息多，PCR扩增效果重复性好，以及在基因组中分散分布等优点，常用于生物的遗传多样性分析，遗传图谱和杂交育种等。由于微卫星研究所用DNA的数量少，对样品要求低，因此，微卫星分析在遗传学领域具有广泛的应用性。
发明内容
本发明的目的是提供星斑川鲽11个微卫星分子标记位点以及其多态性引物，为星斑川鲽的遗传多样性以及种群间的亲缘关系的鉴定提供资料，弥补现有技术的不足。
本发明利用高通量测序技术从星斑川鲽DNA基因组中筛选出11个微卫星位点，其核苷酸序列分别是PTS：1-11，其序列为SEQ ID：1-11。
微卫星序列还包括在严格条件下与上述的核苷酸序列杂交的，包含相同微卫星重复的核苷酸序列分子。
本发明微卫星引物是从序列SEQ ID：1-11的微卫星两端的侧翼序列上设计的正向、反向引物。微卫星引物序列分别是SEQ ID：12-33
微卫星位点，位点序列和对应的引物信息如表1：
表1
| 位点 | 微卫星序列 | 正向引物序列 | 反向引物虚列 |
| PTS1 | PTS ID NO：1 | PTS ID NO：12 | PTS ID NO：13 |
| PTS2 | PTS ID NO：2 | PTS ID NO：14 | PTS ID NO：15 |
| PTS3 | PTS ID NO：3 | PTS ID NO：16 | PTS ID NO：17 |
| PTS4 | PTS ID NO：4 | PTS ID NO：18 | PTS ID NO：19 |
| PTS5 | PTS ID NO：5 | PTS ID NO：20 | PTS ID NO：21 |
| PTS6 | PTS ID NO：6 | PTS ID NO：22 | PTS ID NO：23 |
| PTS7 | PTS ID NO：7 | PTS ID NO：24 | PTS ID NO：25 |
| PTS8 | PTS ID NO：8 | PTS ID NO：26 | PTS ID NO：17 |
| PTS9 | PTS ID NO：9 | PTS ID NO：28 | PTS ID NO：19 |
| PTS10 | PTS ID NO：10 | PTS ID NO：30 | PTS ID NO：31 |
| PTS11 | PTS ID NO：11 | PTS ID NO：32 | PTS ID NO：33 |
本发明的微卫星多态性引物用于星斑川鲽遗传多样性检测，包括以下步骤：
1)基因组DNA的提取：采用天根海洋动物组织DNA提取试剂盒
2)微卫星PCR扩增：采用FAM、HEM、TAMRA荧光标记的微卫星引物扩增星斑川鲽基因组DNA，获得其扩增产物。
3)扩增产物电泳：在毛细管电泳基因分析仪上电泳，用GS500LIZ作分子量内标，个体扩增产物用peak Scanner Software(v1.0)对毛细管电泳数据初步处理。
4)遗传多样性分析：根据每个个体微卫星扩增产物的分子量的大小取定基因型，利用PopGene 32计算遗传多样性参数。
本发明从星斑川鲽基因组DNA中筛选出11个微卫星位点，并根据这些位点在微卫星位点两端的侧翼序列设计特异性引物，使用所获得引物的扩增结果具有多态性和稳定性，可适用于星斑川鲽种群遗传多样性检测，个体鉴定以及分子辅助育种领域。
具体实施方式
实施例一、微卫星分子标记的筛选
本发明根据构建的星斑川鲽脑组织的转录组文库中进行的SSR分析，对比转录组文库中的Unigene筛选得到了50个的微卫星分子标记的位点，并根据相关位点，设计了50对的筛选引物，在星斑川鲽的30个个体中进行验证。
实施例二、微卫星引物的验证
以星斑川鲽基因组为模板，用50对引物进行温度梯度PCR以摸索出最佳退火温度，1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果。在已摸索出最佳退火温度的引物中挑选出12对重新合成FAM、HEM、TAMRA标记的荧光标记引物。20μL体系PCR：ddH2O13μL；HF Buffer 4μL；dNTPs(2.5mM)1.6μL；上游引物(10mM)0.5μL；下游引物(10mM)0.5μL；DNA模板0.28μL；Thermo Scientific Phusion DNA polymerase(2U/μL)0.12μL。PCR程序：98℃ 30s，(98℃ 10s，Tm 30s，72℃ 20s)x30 cycle，72℃ 10min.用ABI3730xl全自动DNA测序仪(上海派森诺生物科技有限公司)测序。用PeakScanner Software(v1.0)对毛细管电泳数据初步处理。软件PopGene 32进行遗传指标(等位基因(na：Observed number of alleles)、有效等位基因(ne：Effective number of alleles)、观测杂合度(Observed heterozygosity)、期望杂合度(Expected heterozygosity)、香农遗传指数(Shannon′s Information index(I))、Nei氏多样性指数(Nei′s gene diversity index(Nei))、多态信息含量(polymorphism information content(PIC)))计算。
实施例三、星斑川鲽微卫星引物在相近物种遗传多样性中的应用
1.首先，采用天根(TIANGEN)生物公司的海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒提取星斑川鲽的基因组DNA。利用分光光度法和1％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的浓度和质量。
2.用FAM、HEM、TAMRA荧光标记的引物PCR扩增，20μL体系PCR：ddH2O13μL；HF Buffer 4μL；dNTPs(2.5mM)1.6μL；上游引物(10mM)0.5μL；下游引物(10mM)0.5μL；DNA模板0.28μL；Thermo Scientific Phusion DNA polymerase(2U/μL)0.12μL。PCR程序：98℃ 30s，(98℃ 10s，Tm 30s，72℃ 20s)x30 cycle，72℃ 10min.用毛细管电泳(上海派森诺生物科技有限公司)检测。
3.用Peak Scanner Software(v1.0)对毛细管电泳数据初步处理。软件PopGene 32进行遗传指标测定。(等位基因(na：Observed number of alleles)、有效等位基因(ne：Effective number of alleles)、观测杂合度(Observed heterozygosity)、期望杂合度(Expected heterozygosity)、香农遗传指数(Shannon′s Information index(I))、Nei氏多样性指数(Nei′s gene diversity index(Nei))、多态信息含量(polymorphism informationcontent(PIC)))计算。
表2：11个微卫星位点的重复单位、引物的相关信息
其中Tm是微卫星的退火温度，na为等位基因数，ne为有效等位基因数，Obs_Het观望杂合度，Exp-Het为期望杂合度。PIC为多态信息含量，I是香农指数，Nei为Nei氏多样性指数，PIC为多态信息含量。
本发明的11对引物对30个星斑川鲽基因组DNA进行扩增，遗传多样性分析结果表明每个微卫星位点的等位基因数目从3到6不等，平均等位基因数为4.4545，平均有效等位基因数是2.4384，平均观望杂合度0.5273，平均期望杂合度为0.5736。本发明的微卫星引物可用于星斑川鲽遗传多样性检测，数量性状遗传图谱，遗传连锁左图、以及家系和个体鉴定。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (8)
1.星斑川鲽微卫星位点，其特征在于具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.11中任一的碱基序列，它们分别标记编号为PT1、PT2、PT3、PT4、PT5、PT6、PT7、PT8、PT9、PT10、PT11。
2.星斑川鲽微卫星位点，其特征在于选自任一在严格条件下与权利要求1中的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
3.权利要求1所述星斑川鲽微卫星位点的组合，其特征在于选自星斑川鲽微卫星位点PT1、PT2、PT3、PT4、PT5、PT6、PT7、PT8、PT9、PT10、PT11的两种或多种。
4.在权利要求1所述的微卫星两端的侧翼序列上设计的星斑川鲽微卫星引物，其特征在于：所述的微卫星引物序列为SEQ ID NO：12-33。
5.权利要求4所述星斑川鲽微卫星引物的组合，其特征在于选自SEQ ID NO：12-33的两种或多种。
6.权利要求1-3任一所述的星斑川鲽微卫星位点或其组合在星斑川鲽的种群遗传多样性检测、个体鉴定或分子辅助育种方面的应用。
7.权利要求4或5所述星斑川鲽微卫星位点的引物或其组合在星斑川鲽的种群遗传多样性检测、个体鉴定或分子辅助育种方面的应用。
8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于星斑川鲽的遗传多样性检测包括以下步骤：
1)基因组DNA的提取：采用天根海洋动物组织DNA提取试剂盒
2)微卫星PCR扩增：采用FAM、HEM、TAMRA荧光标记的微卫星引物扩增星斑川鲽基因组DNA，获得其扩增产物。
3)扩增产物电泳：在毛细管电泳基因分析仪上电泳，用GS500LIZ作分子量内标，个体扩增产物用peak Scanner Software(v1.0)对毛细管电泳数据初步处理。
4)遗传多样性分析：根据每个个体微卫星扩增产物的分子量的大小取定基因型，利用PopGene 32计算遗传多样性参数。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
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Granted publication date: 20190308 Termination date: 20190701 |