CN1049524A - 一种水解植物蛋白的生产方法及用该方法制得的产品 - Google Patents

Abstract

一种生产水解植物蛋白的方法及其产品，该方法 采用酶水解蛋白后再用轻缓的酸解性，制得的产品含 有不可检测量一氯丙醇，并且具有香味显著增强的特 性。

Description

本发明是关于一种生产含有不可检测量-氯丙醇之水解植物蛋白的方法，用该法生产的水解植物蛋白纯度高、口味柔和并且具有香味显著增强的特性。

通常，传统的水解植物蛋白（简称HVPs）的制备方法是采用盐酸在回流条件下，进一步说是采用6M盐酸于109℃、常压下通过酸解进行的。据证实在这种条件下水解植物蛋白会产生甘油氯化作用（由存在于粗蛋白质中残留脂肪物质所致），生成一氯丙醇（MCPs）和二氯丙醇（DCPs）。由于MCP和DCP具有一些有争议的特性，在食品中存在是不理想的。在标准方法的蒸发或浓缩步骤中DCP很容易被除去，遗憾的是MCP无法除去，而且还富集在最终的产品中，因此，必须采取附加操作步骤以便从最终产品中除去MCP。

按传统的酸解方法制备HVPs，通过采用硫酸或磷酸来代替盐酸便可以避免MCP和DCP的形成，但是，用硫酸或磷酸水解生产的HVPs质量差，产品具有苦味。

在传统的酸解过程中，一个突出的问题就是由于甘油的氯化作用产生了MCP，而甘油是由存在于粗蛋白质中残留的脂肪物质衍生而来的。例如，蛋白质含量约为75%并且还含有5.0-9.5%脂肪和其它脂类物质的活性小麦谷蛋白是以单、二和三甘油脂、磷脂和糖脂之复杂混合物的形式作为甘油的丰富来源的。据信影响MCP形成的众多因素包括高浓度氯离子的存在、大量过剩的酸、高回流温度以及较长的反应时间，一般认为结合甘油比未结合甘油更容易形成MCPs。

人们已经知道许多有关利用酶来水解食用植物蛋白的方法，但是都不是以提高风味为目的的。根据现有技术的披露，一般是致力于生产功能得到改进的蛋白质，如US4，636，388号专利所示，在酶水解时抑制苦味肽的形成，尤其是该专利公开了一种特别适于采用酶水解法生产的低灰份蛋白质产物，即将分散的蛋白质形成凝胶，再洗涤使之在液体中呈粒状，以便使非蛋白质部分脱离凝胶进入液体中，然后将液体与凝胶分离，再将予处理过的产物进行酶分解，最好是采用真菌蛋白酶和胰酶进行水解。

US4，757，007公开并要求保护的是一种用蛋白酶部分水解大豆蛋白，然后用5%三氯乙酸水溶液分离该水解产物来制备水解大豆蛋白产品的方法，低溶解度的水解蛋白部分具有很好的乳化特性，而高溶解度的水解蛋白部分则具有极佳的发泡特性。

在US3，830，942号专利中，制备了一种可溶性蛋白产品，该产品特别适用于高酸性食品，所制备的不溶性蛋白产品可用于制作富含蛋白的焙烤类食品，该专利公开了生产这两种蛋白产品的方法，该方法包括形成脱脂油籽物料水溶液，调整浆液pH值至油籽物料的等电点，加热浆液以提高温度，加酶至浆液内，在物料水解期间搅拌该混合物，然后分离水解蛋白产品和未水解的蛋白产品。

虽然酶水解和酸解一般是分开进行的，但有一篇专利已经报道将酸解和酶水解结合起来制备蛋白质水解产物。在苏联未决专利申请442，800号中，披露了一种制备非肠道进食的蛋白质的方法，该方法包括使蛋白质原料经过酶裂解，接着于二氧化碳气氛中用5.0%硫酸（4.0N）进行酸解，然后使该水解产物通过阴离子交换柱，用氢氧化铝处理，再通过含有阳离子交换树脂的柱，酸解在大约100℃下进行大约7小时。

多年来，人们进行了多方面的努力以生产出可用作不同目的的水解植物蛋白产品，可是，迟至今日，没有一种方法可以生产出由于通过控制酸解工艺参数而防止了MCP和DCP产生，从而降低了或者不含有MCP和DCP，并且风味大大增强了的水解植物蛋白。

本发明是关于含有不可检测量MCP的水解植物蛋白生产的，该结果是通过将植物蛋白水解的两种方法即酶水解和轻缓的酸解结合为一整体方法得到的。由该方法制得的水解产物纯度高，口味柔和，香味大大增强，并且含有大量谷氨酸一钠，其高达25%（重量，按干物质计）。

生产含有不可检测量MCP之水解植物蛋白的方法首先是将蛋白质物料加入到至少含一种蛋白酶的水溶液中进行水解，将生成的已水解的可溶性蛋白与不溶物分离，接着加入酸并加热该混合物，生成酸化水解产物，最后将其中和。

据信，酶水解过程通过将蛋白质从大部分粗蛋白的非蛋白质组分中溶解出来，有利于减少MCP和DCP的形成。这样就可以大大减少含有脂肪物质之有效甘油的量，从而减少了在随后酸解过程中形成MCP所需的关键物质的量。酶对蛋白质的另一水解作用是释放小的肽和氨基酸。

酸解过程由于采用轻缓的酸解条件，所以也有利于减少MCP含量，酸解或脱酰氨基发生的条件与传统方法中所采用的条件相比要温和的多，特别是与传统的水解方法相比，进行轻缓酸解时酸的浓度相当低，而且温度低时间短。通过控制水解条件，使脱酰氨基反应优先发生，即酰胺键被水解，而肽键水解受到抑制或被降低到最低程度。据信这些条件与通过酶水解把脂肪含量降低结合起来，是造成最终产品中没有MCPs形成的原因。

本发明方法包括一系列水解植物蛋白的步骤，以生产出含有不可检测量之MCP的产品，术语“不可检测量”是指采用灵敏度为2ppm这样低的量的气相色谱法（GC）检测，检测不出的量。

具体地讲，将植物蛋白加入到至少含一种蛋白酶的水溶液中进行水解，所说的植物蛋白可以是任意一种有效的植物蛋白，例如（但不限于）：油籽蛋白（大豆、花生、葵花籽、棉籽）、血浆蛋白或叶蛋白。用于生产带有原有浓郁香味特性之美味的优选蛋白质有小麦谷蛋白，这是由于它的高谷氨酸含量，最有代表性的是谷氨酰胺。

将蛋白质加入到至少含一种胞内蛋白酶的水溶液中，该溶液可以呈酸性，中性或碱性。蛋白酶的选择取决于一系列具体酶/底物的综合参数，例如（a）pH值多大才能达到最佳的蛋白质水解活性;（b）肽键特性，即最适合于满足最终产品要求的特性以及（c）底物是否需要脱除苦味。对于小麦谷蛋白来说优选的酶是中性胞内蛋白酶，具体地说就是Prozyme6（商品名），（Amano  International  Enzyme，Troy，Virgina）。

用酶水解蛋白质时温度约为25°-75℃，pH值约为5.5-8.5，中性酶含量按底物重量计约为0.1%-2.0%，不过，上述条件将根据蛋白质-蛋白酶的结合情况而发生变化，例如，pH值要根据所用酶的种类而定，当采用酸性酶时，pH值应为约1.5-4.0，当采用碱性酶时，pH值则变为约7.0-12.0，上述所说的pH值范围是根据采用中性蛋白酶来确定的。

就采用小麦谷蛋白和中性蛋白酶Prozyme6的优选条件来说，酶水解时温度约为40°-50℃，最好为45℃，pH值约为6.5-7.0，优选的Prozyme6的用量约为0.5%-1.0wt%，酶水解反应的时间取决于许多因素，具体地说就是酶的浓度，pH值，反应温度、底物量以及所要求的水解程度，作为优选的实施方案，建议反应时间为约4小时。

在本发明的方法中，底物量也起着重要作用，按每批料总重量计，理想的用量约为1.0%-30%，最佳用量约为22%-26%，该用量特别高，一般来说按传统方法是不能达到的，为了达到理想的量，是将底物加到酶中，而不是象传统方法那样将酶加到底物中。

将酶水解设计成完成大部分肽键水解，这对于释放风味活性肽和氨基酸是必需的，并且不会从谷氨酰胺中释放出谷氨酸或谷氨酸一钠，也不会对键合在肽上的谷氨酰胺之酰胺键起作用，如上所述，有很多商购的胞内蛋白酶和蛋白外切酶可以被用来获得理想的结果，具体的蛋白外切酶如Debitrase（帝国生物技术公司，Rosemont，Illinois），其中含有亮氨酸氨肽酶，当需要从存在于水解植物蛋白内的疏水肽中除去苦味时可以采用之。

必须指出，胞内蛋白酶对于最初的酶水解反应来说是绝对必要的，所以，如果只用一种蛋白酶，就必须是一种胞内蛋白酶，如果采用一种以上的多种酶来进行水解植物蛋白时，就可以是胞内蛋白酶和蛋白外切酶的任意混合物，两者即可以同时使用也可以按先后次序使用。

要说明的一点是，通过向水溶液中加酸，可在所要求的阶段中止酶解过程，尽管这一步骤是优选方法中的一个步骤，但并不是必需的一步，没有这一步操作，也可以将水解的可溶性蛋白质与不溶性部分分离开，不过加入食用级有机或无机酸使水溶液pH值至约2.0-4.0，便会中止酶解反应，从而准确控制反应终点，并使得水解产物达到微生物学稳定性。在所要求的时间加入食用级酸也有助于更好地分离水解的可溶性蛋白与不溶性部分，只要当水解产物达到要求的溶解度和水解程度，就可以加入酸，具体地说，从经济观点考虑，溶解度应该达到至少60%，较好的应至少为90%，水解度应该约为10%-70%，较好的约为20%-50%。

然后采用任何合适的传统方法如过滤或离心分离或将两者结合，将水解植物蛋白与不溶性部分分离。

接着加入食用级酸并加热使水解的可溶性蛋白进行轻缓的酸解，所用的酸可以是单一的无机酸或将其与有机酸结合起来，设计的轻缓的酸解条件要最大限度地提高游离氨基酸和肽的脱酰氨基作用，同时尽可能减少焦谷氨酸的形成，这是通过优化过量氢离子浓度而得以实现的。具体地说，在滴定水解蛋白之后，过量氢离子浓度约为0.5-2.0摩尔，较好的约为1.0摩尔，在该操作步骤中可采用的食用级酸的例子有盐酸、磷酸、硫酸或它们的任意混合物。另外，可以用各种有机酸如苹果酸来部分取代上述无机酸，本发明优先选用的酸是盐酸，脱酰胺氨基进行时的温度约为75℃-100℃，最好为约95℃，由脱酰氨基所得到的酸化水解产物接着被中和至pH值约为5.0-7.0，可以采用任意一种已知的试剂，优选的试剂为食用级50%氢氧化钠。

如果需要，可以将生成的经中和的水解产物进一步加工，以便使其变成更实用的产品，水解产物可以经过脱色和脱臭加工，按常规是用活性碳来进行的，然后将脱色、脱臭的水解产物进一步浓缩，可以采用目前已知的任何一种方法进行浓缩，如喷雾干燥，真空盘架式干燥或采用蒸发，例如用降薄膜式蒸发器。

在轻度酸脱酰氨基期间，由最初酶解过程所生成的谷氨酰胺全部被转变成谷氨酸一钠（MSG），因此，要根据酶解过程和采用的底物来确定存在于最终产品中谷氨酸一钠的量，例如，当所采用的植物蛋白为小麦谷蛋白而且酶解过程使其全部转变时，则最终产品中MSG的含量按干物质重量计可高达约20%-25%。

以下为本发明的实施例，这些实施例绝对不是对本发明的限制。

实施例1

酶水解：

将每种试样置于配有14升容器且为标准构造的新布鲁斯威克科学MICROFERM型发酵器（New  Brunswick  scientific  MICROFERM  fermenter）中进行酶水解，对于酶解小麦谷蛋白的一般方法是将应被装入的总水量之65%-90%的水装入反应容器内，将反应容器升温，使pH电极达到标准位置，并将自动滴定仪装入4.0M氢氧化钠。滴定仪调至标的pH值，准备好酶溶液（将10%的酶，溶于D.I.水中，w/w）。

将2400克小麦谷蛋白（Manildra  Milling  Corp.，Shawnee  Mission，Kansas  66205）加入到含有24克Prozyme  6（Amano  Enzymes，美国试剂：Mitsubishi  International  Corp.，纽约，纽约10022）的7500克水中连续搅拌15-20分钟，保持pH7，于45℃下酶水解达4小时。

4小时后，迅速用20波美度（10.0N）食用级盐酸（HCL）将水解产物滴定至pH为2，再将酸化的水解产物泵送至浸入冰水的管子，送入收集容器并立即使其冷却。于离心机中以16，000×G的力离心全部水解产物达15分钟回收可溶相，通过冷冻干燥浓缩被回收的上层清液，以备脱酰氨基用。

轻缓的酸脱酰氨基

秤量9.63克冷冻干燥过的上层清液（0.1%水份）装入50ml量瓶内，加入10M  HCl至刻度50ml（当要求过量1.0M  HCl时，使用9.04克10M  HCl;过量1.5M  HCl时，用11.94克10M  HCl;过量2.0M  HCl时，则用14.84克10M  HCl）。将试样转移至125ml  wheaton血清瓶（wheaton目录编号223748），于水浴振动器内保温1小时，该试样再用50%食用级氢氯化钠（NaOH，J.F.Henry化学公司，Union，New  Jersey  07083）进行中和。结果列表如下：

表1

试样  HCl   水浴温度（℃） DH(%)  DEAMID(%) GLU(g/l) PG(g/l)

1    1.0M       95         44.8    67.7       11.5     2.5

2    2.0M       95         48.3    106.0      12.6     1.75

3    1.5M       85          NA     NA         10.1     3.1

4    1.0M       75         34.6    54.9       6.0      5.3

5    2.0M       75         39.4    65.6       8.1      3.6

DH＝水解度，全部被水解之肽键百分数;

Deamid＝以释放的总氨计，脱酰氨基百分数;

GLU＝游离谷氨酸（MSG）;

PG＝游离焦谷氨酸;

NA＝不可得

实施例2

酶水解

按照实施例1的操作步骤进行酶水解。

轻缓的酸脱酰氨基

本实施例的关键是把实施例1的脱酰氨基反应过程放大到1升。将686.7克水和183.3克10M  HCl（1.0M过量）装入反应器内，加热至95℃，然后将200克水解产物（20%w/v）干粉通过侧门装入反应器内，大约需要5分钟，将冷凝器置于侧门处，于95℃恒温下反应1小时，然后将反应容器上的热源移走，并将反应容器放入冰浴中快速冷却至50℃以下以便停止反应，将160克50%的NaOH加入到容器内，使试样pH值达到7，中和反应是在冰浴中低于25℃下进行的，以保持MSG含量，然后于室温下将1100克中和的脱酰氨基产物用11克Darcok  B活性碳（美国Norit公司，jacksonville，佛罗里达）处理2小时，脱酰氨基产物再用装有Whatman  42无灰滤纸的Buchaer漏斗进行过滤，滤液在真空盘架式干燥器中于50℃、25mmHg下浓缩2小时，得到的产品浓度大约为70%（固体），用水稀释成固体浓度大约为40%的均匀溶液以便作分析，用对2ppm即灵敏的标准气相色谱法测量MCP的含量，结果表明有不可检测量的MCP。以干基计，MSG在最终产品中的含量为5%。

实施例3

酶水解

按照实施例1所述的步骤进行酶水解。

轻缓的酸脱酰氨基

重复进行实施例2的操作步骤，试验一下采用2.0M过量HCl对于脱酰氨基和MCP形成所产生的作用。将200克（干重）水解产物装入含有570克水和300克10M  HCl（2.0M过量）的反应器内，于95℃下反应1小时后，将脱酰氨基产物冷却并用232克50%  NaOH中和，608克中和过的脱酰氨基产物用6.1克Darco  S-51活性碳于室温下处理2小时，接着将脱酰氨基产物过滤、浓缩、约45%固体的均匀溶液采用气相色谱法进行分析，其结果是含有不可检测量的MCP。

实施例4

酶水解

按照实施例1所述的步骤对试样进行酶水解。

轻缓的酸脱酰氨基

重复进行同样的脱酰氨基操作，不过增加了酶水解产物的浓度以便试验一下其对脱酰氨基和MCP形成的作用，将400克水解产物（40%w/v）加入到含有250.6克10M  HCl（1.0M过量）的490.0克水（底物密度为1.14）的溶液中，于95℃下反应1小时后，将脱酰氨基产物冷却并用220克50%NaOH中和，647克中和过的脱酰氨基产物用6.5克Darco  S-51活性碳于室温下处理2小时，经过滤和浓缩后，将固体含量约为45%的溶液用气相色谱进行分析，其结果为含有不可检测量的MCP。

实施例5

酶水解

重复进行实施例1的操作步骤，不同的是采用混合中性蛋白酶，首先将24克Prozyme  6和33.7克（0.5%酶/底物干基）Neutrase酶液（如标准的）（NOVO  Industries，Danbury，Connecticut）加入到盛有水的反应容器内。

轻缓的酸脱酰氨基

重复进行实施例2的操作步骤，将200克水解产物加到含有183.3克10M  HCl（1.0M过量）和686.7克水的溶液中，于95℃下反应1小时，冷却后的脱酰氨基产物用156克50%NaOH中和，400克脱酰氨基产物于室温下用4克Darco  KB活性碳处理2小时，经过滤和冷凝后，约为40%固体的溶液经气相色谱分析，结果为含有不可检测量的MCP。

实施例6

酶水解

重复实施例1所述的酶水解步骤，不同的是采用混合酶，而且酶是按顺序地加入，进行这一操作的目的是检验肽链外切酶对于释放MSG的作用，将24克prozyme  6首先加入盛有水的反应器内，重复上述操作步骤，然后将2400克小麦谷蛋白加到容器内，30分钟后，将13.0克Debitrase  4500.10（帝国生物技术公司，Rosemont  Illinois）加入反应器内，自加入Debitrase后起使反应进行4小时，即总的反应时间为4.5小时。

轻缓的酸脱酰氨基

重复进行实施例2的操作步骤，将200克水解产物加到含有183.3克10M  HCl（1.0M过量）和686.7克水（底物密度为1.07）的溶液中，于95℃下反应1小时后，冷却的脱酰氨基产物用159克50%NaOH进行中和，618克中性脱酰氨基产物于室温下用6.2克Dacro  S-51活性碳处理2小时，约为40%固体的溶液经气相色谱分析，结果为含有不可检测量的MCP，按干物质重量计，最终产品中MSG含量为10%。

实施例7

酶水解

重复进行实施例1所述酶水解的一般操作步骤，不同的是采用不同的酶，以便改变酶水解反应进行时的时间和温度，用36克Debitrase  4060.50（1.5%酶/底物干基）代替prozyme  6，在38℃下进行水解6小时。

轻缓的酸脱酰氨基

将200克水解产物加到含有183.3克10M  HCl（1.0M过量）和686.7克水的溶液中，于95℃下反应1小时后，加入153克50%NaOH中和冷却的脱酰氨基产物，600克中和过的脱酰氨基产物于室温下用6.0克Darco  S-51活性碳处理2小时，含40%固体的试样经分析，产物MCP含量是不可检测的。

Claims (31)

1、一种生产含有不可检测量一氯丙醇之水解植物蛋白的方法，包括：

(a)将植物蛋白加入到至少含一种蛋白酶的水溶液中进行水解；

(b)将水解的可溶性蛋白与不溶性部分进行分离；

(c)将酸加入到水解的可溶性蛋白中，并加热混合物使水解产物基本上脱除酰氨基；

(d)中和脱酰氨基的水解产物。

2、根据权利要求1所述的方法，还包括将酸加到（a）步的水溶液中以中止酶反应。

3、根据权利要求1所述的方法，还包括将（d）步得到的水解产物进行脱臭和脱色。

4、根据权利要求3所述的方法，还包括浓缩经脱臭和脱色的水解产物。

5、根据权利要求1所述的方法，其中（a）步的蛋白酶是胞内蛋白酶。

6、根据权利要求5所述的方法，其中的胞内蛋白酶是酸性、中性或碱性的。

7、根据权利要求1所述的方法，其中（a）步中的植物蛋白选自由油籽蛋白、血浆蛋白、叶蛋白组成的一组蛋白质或它们的混合物。

8、根据权利要求7所述的方法，其中的植物蛋白是小麦谷蛋白。

9、根据权利要求1所述的方法，其中（a）步的水解是在温度约为25°～75℃、pH值约为5.5～8.5的条件下进行的。

10、根据权利要求9所述的方法，其中（a）步的水解是在温度约为40°～50℃、pH值约为6.5～7.0的条件下进行的。

11、根据权利要求1所述的方法，其中（b）步的分离采用的是过滤、离心分离法或两者结合使用。

12、根据权利要求1所述的方法，其中在（c）步中，滴定水解蛋白之后，加入的酸使氢离子浓度过量约0.5～2.0摩尔。

13、根据权利要求12所述的方法，其中（c）步中加入的酸使氢离子浓度过量1.0摩尔。

14、根据权利要求1所述的方法，其中（c）步的反应是在温度约为75°～100℃下进行的。

15、根据权利要求14所述的方法，其中（c）步的反应是在温度约为95℃下进行的。

16、根据权利要求1所述的方法，其中（d）步的中和反应是在pH值约为5.0～7.0下进行的。

17、根据权利要求1所述的方法，其中（a）步中的水解反应是通过按顺序加入至少两种蛋白酶而得以实现的。

18、根据权利要求1所述的方法，其中（a）步中的水解反应是通过同时加入至少两种蛋白酶而得以实现的。

19、一种生产含有不可检测量一氯丙醇之水解植物蛋白的方法，包括：

（a）将植物蛋白加到至少含一种蛋白酶的水溶液中进行水解;

（b）向（a）步水溶液中加入酸以中止酶反应;

（c）将水解的可溶性蛋白与不溶性部分进行分离;

（d）向水解的可溶性蛋白中加入酸，并加热以生成脱酰氨基水解产物;

（e）中和脱酰氨基水解产物;

（f）将（e）步得到的水解产物进行脱色和脱臭;

（g）将（f）步得到的水解产物进行浓缩。

20、根据权利要求19所述的方法，其中（a）步的植物蛋白选自由油籽蛋白、血浆蛋白、叶蛋白组成的一组蛋白质或者它们的混合物。

21、根据权利要求20所述的方法，其中（a）步的植物蛋白是小麦谷蛋白。

22、根据权利要求19所述的方法，其中（f）步的脱色和脱臭是采用活性碳进行的。

23、根据权利要求19所述的方法，其中（b）步所用的酸为食用级无机酸。

24、根据权利要求19所述的方法，其中（b）步所用的酸为食用级无机酸与有机酸的混合物。

25、根据权利要求19所述的方法，其中（d）步所用的酸为食用级无机酸。

26、根据权利要求19所述的方法，其中（d）步所用的酸为食用级无机酸与有机酸的混合物。

27、根据权利要求24所述的方法，其中食用级无机酸或有机酸选自于由盐酸、磷酸、硫酸、柠檬酸、苹果酸组成的一组酸或它们的混合酸。

28、根据权利要求1所述的方法加工得到的产品。

29、根据权利要求19所述的方法加工得到的产品。

30、一种水解植物蛋白，其特征在于含有不可检测量一氯丙醇，纯度高，口味柔和并且具有香味明显增强的特征。

31、根据权利要求30所述的水解植物蛋白，其特征在于按干物质重量计，含有含量高达25%的谷氨酸一钠。